Système HS (heat shoc)

TP 1 de génétique appliquée :
Recombinaison mitotique
Introduction
La recombinaison mitotique est un phénomène qui a lieu dans les cellules somatiques, entre deux
chromosomes homologues (après la réplication). Dans ce TP, nous allons étudier différents
phénotypes issue de la recombinaison mitotique. Celle-ci peut être induite par une enzyme
particulière, la flippase, ainsi que des séquences particulières appelées frt, au niveau desquelles la
flippase va induire des recombinaisons (système flp/frt). En croisant différentes souches
transgéniques de drosophiles, on va créer des individus, au niveau desquels la flippase va s’exprimer
et initier des recombinaisons mitotiques, que l’on pourra identifier grâce à phénotypes particuliers
observables (mosaïque).
Pour chaque croisement, on connait le génotype des parents. On peut alors en déduire le génotype
de la descendance, et alors prédire les phénotypes de celle-ci. On s’intéressera alors aux descendants
au niveau desquels les recombinaisons mitotiques sont possibles grâce à l’expression de la flippase.
On observera leur phénotype puis on l’interprétera d’après leur génotype. On dégagera également
l’intérêt des techniques d’induction de la recombinaison mitotique employées, et de leur utilité en
génétique.
L’expérience est séparée en deux parties, d’une part, un travail sur le phénotype des yeux, d’autre
part sur les soies. Pour le travail sur les yeux, on induit les recombinaisons grâce au promoteur
eyeless et au système GAL4-UAS. Eyeless n’est actif que dans les yeux, ce qui nous permet de réaliser
des recombinaisons mitotiques juste dans les yeux, le système GAL4-UAS permet la révélation de
l’action de la flippase. La deuxième partie sur le phénotype des soies utilise des promoteurs HS (heat
choc). On induit alors les recombinaisons mitotiques, cette fois sur toute la drosophile, par simple
incubation à 37°C.
Pour les deux expériences, on cherche à faire exprimer la flippase pour qu’elle initie des
recombinaisons entre les séquences frt. Les recombinaisons vont engendrer un phénotype
particulier, et ceci grâce à l’introduction de gènes particuliers de façon a ce que les recombinaisons
mitotiques les touches. On élabore des structures sur les chromosomes, qui vont permettre, plus ou
moins directement, l’élaboration d’un phénotype particulier.
Système GAL4-UAS
On utilise le système GAL4 et le gène lacZ précédé par un promoteur de type AUS (induit par GAL4).
Gal 4 est sur le chromosome qui contient les séquences FPS, et ne se verra transcrit que s’il y a
recombinaison mitotique au niveau de ces séquences. S’il est transcrit, Gal4 ira activer la
transcription de lacZ grâce au promoteur AUS, situé sur un autre chromosome.
Flippase
Eyeless
Facteur de
terminaison
P(actine)
Gal4
FRT
FRT
Chromosome 2
LacZ
AUS
Sur le chromosome 2, le promoteur de l’actine est un promoteur constitutif. La transcription a lieu
continuellement. La transcription est cependant stoppée très rapidement au niveau du terminateur
situé entre les deux séquences FRT. Dans les yeux, la flipase va s’exprimer, grâce au promoteur
eyeless, et va agir au niveau des séquences FRT, situées sur le chromosome 2, en effectuant des
crossing-over. La partie du génome situé entre les 2 FRT est alors remplacé par un fragment sans
séquence terminatrice (fragment correspondant de l’autre chromosome 2). La transcription n’est
alors pas stoppée et on va alors avoir transcription du gène Gal4. GalA va alors activer sur le
chromosome le portant, la transcription du gène lacZ : on va alors avoir production de la
βgalactosidase. On aura production de Bgal exclusivement dans les cellules où il y aura eu
recombinaison mitotique, donc dans les cellules des yeux. Dans les autres cellules, la Bgal ne sera pas
synthétisée.
Premier croisement : 4410 x 5618
Souche 4410 : Chromosome X : (w, P {ey-Gal4})
Chromosome 2 : (P {UAS-lacZ) / Cyo (balanceur))
Souche 5618 : Chromosome X : (w, P {ey-FLP3})
Chromosome 2 : +
CROISEMENT 1a:
4410
CROISEMENT 1b :
5618
Seuls les individus marqués d’un point rouge nous intéressent : on a le gène FLP, précédé par eyeless,
qui permettra des recombinaisons mitotiques seulement dans l’œil. On a le gène gal4 qui va pouvoir
être transcrit grâce aux recombinaisons mitotiques, qui vont supprimer les terminateurs de
transcription. Gal4 pourra induire la transcription du promoteur UAS, ce qui permettra la
transcription de LacZ et donc de repérer l’emplacement des clones cellulaires concernée par la
recombinaison mitotique, en ajoutant du Xgal.
On observe les larves issues de ces croisements. On va révélée la présence de recombinaisons
mitotiques en révélant la présence de βgalactosidase, en « colorant » au Xgal. Pour ce faire, on suit
un protocole particulier, permettant cette révélation.
On constate une coloration au niveau des disques imaginaux des yeux. Seulement les yeux sont
colorés : on a orienté les recombinaisons dans l’œil grâce au promoteur eyeless : FLP est activée, la
recombinaison entre les deux FRT a lieu, ce qui permet la transcription de Gal4. Gal4 va induire la
transcription de LacZ.
Remarque : on utilise un balanceur pour inhiber les recombinaisons méiotiques. Ici, cette
caractéristique n’est pas utile, mais la souche utilisée la possède.
Deuxième croisement : 5618 x 2296
Souche 5618 : Chromosome X : w, P (ey-FLP)
Chromosome 2 : P(FRT en 80B)
Souche 2296 : Chromosome X : w
Chromosome 2 : P(white) 70C (= mini white w+), P{FRT}80B / Tm6 (Balanceur)
Mâle 5618 (w, ey-FLP / Y ; FRT80 / FRT80)
[œil blanc]
x
F1 :
et
Mâles :
(w / Y ; FRT80 / TM)
[œil blanc]
Femelle : (w / eyFLP ; FRT80 / TM)
[œil blanc]
et
Femelle 2296 (w / w ; w+, FRT80 / Tm6)
[œil rouge]
(w / Y ; FRT80 / FRT80, w+)
[œil rouge]
(w / w, eyFLT ; w+, FRT80 / FRT80)
[œil rouge]*
FRT
w+
Chr 2
FRT
Chr 2
Après la réplication, voici le génotype de la
cellule de l’œil. Chaque chromosome s’est
répliqué, on a alors 2 chromatides
appareillées avec w+ et 2 autres sans w+.
La cellules exprime la flippase.
Pendant la mitose, les centromères se retrouvent sur la plaque équatoriale et chaque chromatides
ira dans l’une ou l’autre des cellules. On aura donc formation de cellules filles hétérozygotes comme
la cellule mère.
Dans le cas de CO mitotique, on va avoir un échange au niveau des séquences FRT, entre les
chromatides sœurs.
FRT
w+
FRT
w+
Lors de l’anaphase, on aura alors 1 chance sur 2 d’avoir formation de 2 cellules filles différentes et
homozygotes : une sera w+ et l’autre ne portera pas l’allèle w+. On a alors, dans le cas de CO
mitotiques, formation d’une cellule rouge (qui ne redonnera que des rouges par la suite) et d’une
cellule blanche (qui ne donnera que des blanches par la suite) après la mitose. La séparation des
chromatides à l’anaphase peut redonner des hétérozygotes, qui auront alors le phénotype rouge (dû
à w+). Statistiquement, on doit trouver ¾ de cellules rouges et ¼ de cellules blanches.
Refaire schéma pour ca
Observation des mouches : Quand on observe les yeux des drosophiles femelles, on constate alors
que l’œil est principalement rouge, mais que certaines zones sont blanches. On confirme plus ou
moins l’hypothèse, car la majorité de l’œil est rouge et une petite partie est blanche. Cependant il
semble y avoir plus de facettes rouges que prévu. On peut penser qu’il n’y pas eu recombinaison
mitotique dans toute les cellules, les cellules sont donc restées rouges, ce qui expliquerait le nombre
plus important que prévu de facettes rouges.
Croisement 3 : 5621 x 1988
On veut ici contre-sélectionner les clones rouges issus de la recombinaison mitotique. On associe à
l’allèle w+, un allèle létal à l’état homozygote. Lors d’un CO mitotique, on aura alors formation
d’homozygote sans w+ et d’homozygote w+/w+. w+ étant associé de très près au gène létal, il n’y
aura pas de clone rouge visible, les cellules mourant. Le gène létal est le gène rps.
F1
Les seuls qui nous intéressent sont marqués d’un point rouge. Il présente le promoteur eyeless qui
permet l’expression dans les yeux, le gène white à l’état homozygote qui va donc s’exprimer, frt80 à
l’état homozygote qui permet la recombinaison par la flippase. Il contient aussi le gène rps, associé à
w+ (miniwhite). Les clones cellulaires issus de la recombinaison mitotique ayant l’allèle rps
homozygote et donc de phénotype [rouge] (car homozygote W) moment. On ne les observera donc
pas, au profit des clones mitotiques [blancs].
Cellule somatique
des disques
imaginaux qui
donneront les yeux
Recombinaisons
mitotiques possibles
grâce aux 2
séquences frt et à la
flp qui s’exprime
Meurt car
homozygote rps
[rouge]
[blanc]
On retrouve les
génotypes
parentaux
On contre-sélectionne les individus
obtenus après recombinaison mitotique,
homozygotes pour rps et présentant un
phénotype rouge
Système HS (heat shoc)
Ce sont les promoteurs des gènes codant pour des protéines impliquées dans une réponse cellulaire
de défense contre stress (augmentation de température, manque d’oxygène. Ces protéines sont
nommées HSP (heat choc protéin) et vont engendrer des phénomènes visant à préservée la cellule
en cas de stress important, pour permettre une survie (dans la limite du possible). Elles vont, par
exemple, stabiliser les complexes protéiques comme les microfilaments pour éviter une
désorganisation de la structure cellulaire. Ce sont des facteurs de transcriptions, les HSF, dont le taux
augmente lors d’un stress, qui ciblent les régions régulatrices des promoteurs des protéines HSP. Ils
permettent alors l’expression des gènes sous contrôle de ce type de promoteur.
HSF
HRE
Gène HSP
ADN
Promoteur HSP : contient HRE (Heat
Response element) sur lequel se fixe
HSF
Protéine HSP
Ici on détourne ce système de promoteur pour induire l’expression d’un gène rapporteur : le gène de
la Flippase, flp. On place le promoteur juste devant le gène de la flippase. Pour induire la synthèse de
la flippase, on va augmenter la température, ce qui va alors activer les HSF.
HSF
HRE
Gène Flippase
Promoteur HSP : HSF va s’y fixer
dans le cas d’un choc thermique, ce
qui va activer le promoteur et
permettre la transcription du gène
de la flippase
Protéine HSP
ADN
Avec FLP activée, on augmente événements de recombinaisons mitotiques.
On dispose de différentes souches de drosophiles. La souche 1740 contient, sur X, le gène sn et Frt 19
(zone de recombinaisons induites par la flippase). L’allèle sn, est responsable, si celui-ci est à l’état
homozygote, d’un phénotype particulier [soie frisée, courte et épaisse]. La souche 5132 contient, sur
X, Frt 19 et HsFlp (configuration décrite ci-dessus).
1740
5132
5132
1740
On incube les larves à une température qui déclenche l’activation des promoteurs HSP (37°C). Les
recombinaisons mitotiques pourront alors se faire pendant le développement larvaire (larve stade 3)
et on aura la possibilité de voir apparaitre des soies frisées partout sur la drosophile adulte. Ici ce
sont sur les cellules somatiques en multiplication au niveau de la F1 que se font les recombinaisons
et pas au niveau des cellules germinales chez les parents. C’est le stade 3 qui est choisi, car on se
situe avant la différentiation des soies.
A partir du génotype des individus encadrés précédemment, qui ont subit une recombinaison
mitotique, on déduit les génotypes des cellules de la lignée somatique. Sur les chromosomes des
cellules somatiques, les loci des différents gènes sont importants. En effet, le gène sn doit se trouver
à l’opposé du centromère, par rapport à Frt, pour que le crossing-over ait une conséquence. La
position de HsFrt est cependant peu importante, mais ici, le locus de ce gène se trouve entre celui de
Frt et le centromère.
Frt
sn
Frt
1
sn
2
Réplication
HS FLP
Frt
3
HS FLP
HS FLP
Frt
sn
Frt
sn
Frt
4
Recombinaison
1
[sn]
sn
3
2
Homozygotes pour sn
sn
Frt
HS FLP
2
HS FLP
Frt
1
Frt
3
Frt
4
4
[+]
Hétérozygotes pour sn
Frt
sn
[+]
HS FLP
Frt
Frt
1
4
[+]
HS FLP
Frt
2
sn
3
Après avoir décrits les différents clones cellulaires attendus, on va étudier le phénotype de
drosophiles ayant été exposées plus ou moins longtemps à 37°C, pendant leur stade larvaire. On
observe des drosophiles, de 6 tubes différents, issues de ce croisement. Les tubes A, B, C, D, F et E
contiennent respectivement des drosophiles dont les larves, au stade 3, ont été exposées 5, 10, 20,
30, 45 et 60 minutes.
On va dans un premier temps, compter le nombre d’individu possédant un phénotype mosaïque, en
fonction du tube. On va pouvoir apprécier l’action de la durée d’exposition sur le nombre d’individu
mosaïque. On regroupe les résultats des deux groupes de TP dans le tableau suivant.
Pourcentage de femelles mosaïques
E
F
D
C
B
A
Groupe 1
72,7
45,5
43,9
31,3
17
Pas de comptage
Groupe 2
69,00
60
55
21
8
3
Le comptage des témoins semble avoir été omis pour les deux groupes. Cependant, ceux n’ayant pas
été exposé au choc thermique, il n’y a aucune raison pour que la flippase ait été synthétisée et que
des recombinaisons mitotiques aient eu lieu. On devrait donc observer 0 individu mosaïque. On ne
peut cependant pas exclure le fait de trouver un pourcentage infime d’individu mosaïque dans ce
pool de drosophile, car une des larves aurait pu être confrontée à un stress d’une origine
indépendante de la volonté du manipulateur.
On constate premièrement que selon le groupe de TP, on ne trouve pas les mêmes résultats. Il y a
donc une variation en fonction de l’expérimentateur, qui vient surement du manque d’attention de
certains manipulateurs qui bâcleraient le travail. Il est vrai qu’observer une drosophile sous toutes
ses coutures pour déterminer si c’est un individu mosaïque peut s’avérer être un exercice fastidieux.
Le constat de ce comptage est que le nombre d’individu mosaïque augmente avec la durée
d’exposition à 37°C. En théorie, si on exposait suffisamment longtemps les larves, on aurait 100% des
individus qui seraient mosaïques. Le fait que certains le soient, et d’autre non, vient du fait que la
réponse individuelle au choc thermique de chacune des larves est différente. Les drosophiles, qui au
bout de 5 minutes d’exposition, ont un phénotype mosaïque déclenchent très rapidement la
synthèse de HSF. Par contre celles qui ne sont pas mosaïque au bout d’une heure d’exposition
nécessitent d’avoir plus de temps pour déclenché cette synthèse et donc l’activation du promoteur
HS. On comprend alors que, plus le temps d’exposition est important, plus la quantité d’individus
mosaïque sera grande.
Dans un second temps, on va s’intéresser au nombre de soies frisées sur un individu mosaïque. En
effet c’est également un moyen d’estimer l’action de la durée d’exposition sur le phénotype
mosaïque, donc sur les recombinaisons mitotiques et l’activité du promoteur HS. On s’intéresse aux
individus de deux tubes, les tubes E et D, exposés respectivement 60 et 30 minutes.
E (60
min)
D (30
min)
Nombre de
soies
nombre de
mouche
16
13
14
6
61
25
29
9
11
11
6
7
6
6
3
9
6
6
5
5
5
3
On peut calculer les moyennes : Pour E, on a donc 164 soies frisées pour 43 mouches, ce qui fait 3,81
soies par mouches. Pour D, on a 37 soies pour 18 mouches, ce qui fait 2,05 soies frisées par mouche.
On constate bien que le nombre de recombinaisons mitotique augmentent en fonction du temps
croissant d’exposition des larves à 37°C. Cependant ces résultats sont moins appréciables que ceux
obtenus pour le comptage des mouches mosaïques, ils sont plus durs à interpréter : ici on met plurôt
en évidence des variations entre les cellules d’un même individu et non les différences entre deux
individus.
Il n’y aura jamais des individus 100% mosaïque : le maximum est d’un quart. En effet, si on regarde le
schéma de mitose présentée précédemment dans ce contexte, statistiquement, seulement ¼ des
cellules filles sont homozygotes pour sn, donc présentant ce phénotype, dans le cas d’une
recombinaison mitotique au niveau de la cellule qui donnera l’ensemble des cellules impliquées.
Conclusion
On a pu mettre en évidence les recombinaisons mitotiques à travers ce TP et comment les induire au
niveau d’un organe spécifique ou selon un taux particulier. Les techniques utilisées ont permis
d’approcher la façon de travailler en génétique moléculaire. En utilisant un promoteur particulier, on
peut faire exprimer n’importe quel gène, dans une drosophile et alors faire des animaux
transgéniques. Le promoteur eyeless permet de faire exprimer le gène souhaité dans l’œil. Le
promoteur HS permet d’induire la transcription du gène situé juste derrière lui (gène rapporteur)
selon les besoins de l’expérimentateur. Par exemple, le promoteur UAS peut être induit par la
protéine GAL4 que l’on peut faire exprimer d’une des deux façons citées précédemment.
Déterminer le lignage d’une cellule, c’est-à-dire la portion de territoire qui descend d’elle par
divisions successives ;
Etudier l’expression d’un gène après son stade de létalité : en effet si une mutation dans un gène est
létale pour l’organisme à un stade très précoce on ne pourra pas savoir, autrement que par analyse
clonale, quel est son rôle ensuite c’est-à-dire quel sera le phénotype cellulaire chez le mutant à un
stade plus tardif.