12.3 Distribution des sous-unités chez l`adulte

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Sous-sections
 12.1 Introduction
 12.2 Matériel et méthodes
o 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides
o 12.2.2 Animaux
o 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ
 12.2.3.1 Prélavage commun
 12.2.3.2 Premier protocole de lavage
 12.2.3.3 Second protocole de lavage
 12.2.3.4 Troisième protocole de lavage
 12.2.3.5 Post-lavage commun
o 12.2.4 Analyses des préparations histologiques
 12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte
o 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs
o 12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat
o 12.3.3 Diencéphale
o 12.3.4 Mésencéphale
o 12.3.5 Rhombencéphale
 12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes
 12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire
 12.6 Discussion
o 12.6.1 Aspects méthodologiques
o 12.6.2 Colocalisations
o 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula
o 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques
 12.6.4.1 Implication de 2
 12.6.4.2 4 ne semble pas impliquée
 12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que 3
 12.6.4.4 Implication de 3
 12.7 Conclusion
12. Localisation des ARN messagers codant
pour les sous-unités des nAChRs dans le
système nerveux
[ZOLI M, LE NOVÈRE N, HILL JA, CHANGEUX JP (1995). Developmental regulation of
nicotinic ACh receptor subunit mRNAs in the rat central and peripheral nervous systems.
Journal of Neuroscience 15 : 1912-1939.

LE NOVÈRE N, Zoli M, CHANGEUX JP (1996). Neuronal nicotinic receptor 6 subunit
mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. European
Journal of Neuroscience 8 : 2428-2439.
Voir aussi:
PICCIOTTO MR, ZOLI M, LÉNA C, BESSIS A, LALLEMAND Y, LE NOVÈRE N, VINCENT P,
MERLO-PICH E, BRÛLET P, CHANGEUX JP (1995). Abnormal avoidance learning in mice
lacking functional high-affinity nicotine receptor in the brain. Nature 374 : 65-67.
MARUBIO LM, ARROYO-JIMENEZ MM, CORDERO-ERAUSQUIN M, LÉNAéna C, LE NOVÈRE
N, DE KERCHOVE d'EXAERDE A, HUCHET M, DAMAJ MI, CHANGEUX JP. Reduced nicotine-
elicited antinociception in mice lacking the neuronal nicotinic alpha-4 subunit. Soumis pour
publication. ]
12.1 Introduction
De nombreuses études d'hybridation in situ ont été réalisées afin de détecter les sous-unités du
nAChR présentes dans le système nerveux du rat adulte [134,80,335,334,90,299,284,53] et
embryonnaire [161,372]. Cependant, la distribution de l'ARNm d' 6 n'avait pas été décrite en
détail. Ici, je présente une étude détaillée de la distribution de l'ARNm d' 6 dans le système
nerveux central du rat adulte. Les motifs de marquage, ainsi que la codistribution d' 6 avec
les autres sous-unités du nAChR nous amène à penser que les nAChRs contenant cette sous-
unité contribuent à certains des effets pharmacologiques documentés de la nicotine.
12.2 Matériel et méthodes
La méthode d'hybridation in situ avec oligonucléotides radio-marqués est décrite en détail
dans [354]. Voir le chapitre 5 pour les fondements théoriques de l'expérience.
12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides
Après analyse des structures secondaires de l'ARNm par le programme STEMLOOP de la suite
WISCONSIN du GCG [85], les séquences des sondes sont choisies dans des régions uniques en
séquence au sein de la famille, dépourvues de structures secondaires putatives, contenant à
peu près 50-60 %GC. Les oligonucléotides furent synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN
Cyclone (Biosearch inc.) ou commandés à la société Genset (Paris, France). Les sondes sont
décrites dans le tableau 12.1.
Tableau 12.1 : Oligodésoxynucléotides utilisés dans cette étude. La température de fusion est
calculée pour la condition de lavage la plus stringente, à l'aide de l'équation 3 de [336] (0,1 M
NaCl, 0 % formamide) (mais voir le chapitre 5 pour un type de calcul plus exact). Les
séquences des sous-unités peuvent être retrouvées dans la Ligand Gated Ion Channel
Database (voir le chapitre 2) à l'URL:
http://www.pasteur.fr/units/neubiomol/LGIC.html ou à partir de GenEMBL (les
d'accession sont dans le tableau)
cibl
accessi
positi
Séquence de l'oligodésoxynucléotide
%G
T

e
on
on
C
m
2rn
L1007
7
1425
5'-
CTCCAGCATCCATGTTAGTCTCTAGCCAATGGTATG
AGGGGCTGA-3'
51
75,
6
3rn
L3162
1
1040
5'-
CCCAAGTGGGCATGGTGTGTGTGGTTGGAGTTCTAT
AGTGCAC-3'
53
76,
2
3rn
L3162
1
1138
5'-
GCGCCGTAGAAGGTCCTCGTCTTAGGAGTGTCCCCC
TCACCACTG-3'
62
83,
5
3rn
L3162
1
215
5'-
GGACACCTCAAACTGGATGATGACTGGATGGGACA
CATTAGCCAC-3'
51
75,
6
3rn
L3162
1
623
5'-
CTCCCAGTAGTCCTTGCGGTTCATGGAGGAGCCGAT
GAGGACCAG-3'
58
80,
6
4rn
M1568
1
1389
5'-
GCTGCTTCTTGGGAGCTGGGCACATGCTGGACACTC
AGGGACCTG-3'
62
83,
5
4rn
5'-
GAAGTCCAGTTGGTCCACACGGCTGTGCATGCTCA
CCAAGTCAAT-3'
5rn
J05231
1076
5'-
CCGAGATTTAGGTCCAGCCCCACTCTCGGCTTCTTC
TCTCTGAGT-3'
56
79,
2
6rn
L0822
7
325
5'-
TCAAAGTGCACCGTGACGGGATCAGAAACGTTTTC
CACTGGCCGG-3'
56
79,
2
6rn
L0822
7
1575
5'-
GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACGATTATAAAC
ACCCAGAGGA-3'
49
74,
2
6m
m
5'-
TCAAGATGCACCGTGACGGGATCGGAGACATTCTC
CACCGGCCGG-3'
6m
m
5'-
GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACAATTATAAAT
ACCCAAAGGA-3'
7rr
5'-
CCTGCACTCAGCTCCACACTGGCCAGGCTGCAGCG
CCGAG-34
70
5'-
58

7rr
ATCATGTGTTGGGGAGCAGGCCAAACGGCCACATA
CGACCCCAGA-34
2rn
L3162
2
1341
5'-
AGCCAAGCCCTGCACTGATGCAGGGTTGACAAAGC
AGGTACATGG-3'
55
78,
5
2rn
L3162
2
1455
5'-
TCGCATGTGGTCCGCAATGAAGCGTACGCCATCCA
CTGCTTCCCG-3'
60
82
2rn
L3162
2
1315
5'-
TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCCGCAGGACCT
TCACCGAAGA-3'
55
78,
5
2m
m
5'-
TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCTGCAGGACCT
TGGCGGAAGA-3'
2m
m
5'-
TCGCATATGGTCCGCAATGAAGCGTACACCGTCCA
CAGCTTCCCG-3'
3rn
J04636
1306
5'-
CAGAACTCTTTCTCCATCGCTGGCGGGAGTCTGTTT
CCTTTTGCC-3'
53
77
3rn
J04636
431
5'-
ATTCTTCCGGATTCCAGCGTAATTTTTGGTCTGTGC
ATTCCTGCT-3'
42
69,
4
4rn
J05232
1020
5'-
ACCAGGCTGACTTCAAGACCGGGACGCTTCATGAA
GAGGAAGGTG-3'
55
78,
5
4rn
J05232
1259
5'-
AGCTGACACCCTCTAATGCTTCCTGTAGATCTTCCC
GGAACCTCC-3'
53
78,
5
TH
5'-
AGGGTGTGCAGCTCATCCTGGACCCCCTCCAAGGA
GCGCT-3'
65
83,
4
Les oligonucléotide sont marqués en 3' avec du [35S]-dATP ou du [33P]-dATP (NEN,
Boston, MA) et de la désoxynucleotidyl-transférase terminale (Boehringer Mannheim,
Allemagne), en suivant les spécifications du fabriquant, à une activité spécifique de 200-600
KBq/pmol. Les sondes marquées sont précipitées dans l'éthanol, séparées des nucléotides non
incorporés avec des NucTrap push columns (Stratagene, La Jolla, CA), précipitées de nouveau
dans l'éthanol et resuspendues dans de l'eau distillée.
12.2.2 Animaux

Six rats Sprague-Dawley adultes (Iffacredo, Lyon, France), pesant 300-400 g, ont été utilisés.
Les animaux sont tués par injection d'hydrate de chloral (1 ml de solution à 35 %); le cerveau
est rapidement disséqué et congelé dans de la carbo-glace. Les tissus sont stockés à -80 °C
jusqu'à la coupe.
Plusieurs âges embryonnaires et post-natals ont été examinés: E10, E11, E12, E13, E15, E17,
E19, P0 and P4. Les embryons ont été datés selon [250], E0 dénotant le jour suivant
l'accouplement et P0 le jour suivant la naissance. Pour chaque stade, entre deux et cinq
animaux ont été utilisés. Pour le prélèvement des embryons, les mères ont été anesthésiées à
l'éther.
12.2.3 Procédure d'hybridation in situ
Les tissus congelés sont coupés au cryostat (coupes de 14 µm d'épaisseur), montés à chaud
sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et stockées à -80 °C (moins de 2
semaines). La procédure est mené selon le protocole de [363], modifié selon [372] et le
protocole suivant. Brièvement, les coupes sont fixées avec du para-formaldéhyde 4 % durant
5 min à température ambiante, lavées dans du PBS, acétylées, et stockées dans de l'éthanol
80 % à 4 °C. Les coupes sont alors délipidées dans de l'éthanol et du chloroforme (5 min),
pré-hybridées durant 2-4 h à 37 °C et hybridées durant 20 h à 37 °C sous des lamelles de
parafilm. La composition du milieu de pré-hybridation (et d'hybridation) est:
 50 % formamide
 0,6 M NaCl
 10 mM di-thiothreitol
 10 % sulfate de dextran
 1 mM EDTA
 Solution de DENHARDT 1x (50x =
o 1 % sérum-albumine bovine
o 1 % Ficoll
o 1 % polyvinyl-pyrrolidone )
 0,1 mg/ml poly-A (Boehringer Mannheim, Allemagne)
 0,5 mg/ml ARNt de levure (Sigma)
 0,05 mg/ml ADN de sperme de hareng (Promega, Madison, WI)
 20 mM Tris-HCl, pH 7,5
Les sondes sont ajoutées au mélange d'hybridation à la concentration de 0,55 nM
(correspondant à 15 fmol/coupe ou 3000-25000 Bq/30 µl/coupe selon les marquages).
12.2.3.1 Prélavage commun
Après retrait du parafilm les coupes sont initialement rincées dans de la solution saline citrate
standard (SSC) 2x (0,3 M NaCl, 0,03 M citrate de sodium) à température ambiante (2 fois
5 min).
12.2.3.2 Premier protocole de lavage
Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités durant l'ontogenèse.