Next: 13. Fonction de la Up: No Title Previous: 11. Théorie et pratique Sous-sections 12.1 Introduction 12.2 Matériel et méthodes o 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides o 12.2.2 Animaux o 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ 12.2.3.1 Prélavage commun 12.2.3.2 Premier protocole de lavage 12.2.3.3 Second protocole de lavage 12.2.3.4 Troisième protocole de lavage 12.2.3.5 Post-lavage commun o 12.2.4 Analyses des préparations histologiques 12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte o 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs o o o o 12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat 12.3.3 Diencéphale 12.3.4 Mésencéphale 12.3.5 Rhombencéphale 12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes 12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire 12.6 Discussion o 12.6.1 Aspects méthodologiques o 12.6.2 Colocalisations o 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula o 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques 12.6.4.1 Implication de 2 12.6.4.2 4 ne semble pas impliquée 12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que 12.6.4.4 Implication de 12.7 Conclusion 3 3 12. Localisation des ARN messagers codant pour les sous-unités des nAChRs dans le système nerveux [ZOLI M, LE NOVÈRE N, HILL JA, CHANGEUX JP (1995). Developmental regulation of nicotinic ACh receptor subunit mRNAs in the rat central and peripheral nervous systems. Journal of Neuroscience 15 : 1912-1939. LE NOVÈRE N, Zoli M, CHANGEUX JP (1996). Neuronal nicotinic receptor 6 subunit mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. European Journal of Neuroscience 8 : 2428-2439. Voir aussi: PICCIOTTO MR, ZOLI M, LÉNA C, BESSIS A, LALLEMAND Y, LE NOVÈRE N, VINCENT P, MERLO-PICH E, BRÛLET P, CHANGEUX JP (1995). Abnormal avoidance learning in mice lacking functional high-affinity nicotine receptor in the brain. Nature 374 : 65-67. MARUBIO LM, ARROYO-JIMENEZ MM, CORDERO-ERAUSQUIN M, LÉNAéna C, LE NOVÈRE N, DE KERCHOVE d'EXAERDE A, HUCHET M, DAMAJ MI, CHANGEUX JP. Reduced nicotineelicited antinociception in mice lacking the neuronal nicotinic alpha-4 subunit. Soumis pour publication. ] 12.1 Introduction De nombreuses études d'hybridation in situ ont été réalisées afin de détecter les sous-unités du nAChR présentes dans le système nerveux du rat adulte [134,80,335,334,90,299,284,53] et embryonnaire [161,372]. Cependant, la distribution de l'ARNm d' 6 n'avait pas été décrite en détail. Ici, je présente une étude détaillée de la distribution de l'ARNm d' 6 dans le système nerveux central du rat adulte. Les motifs de marquage, ainsi que la codistribution d' 6 avec les autres sous-unités du nAChR nous amène à penser que les nAChRs contenant cette sousunité contribuent à certains des effets pharmacologiques documentés de la nicotine. 12.2 Matériel et méthodes La méthode d'hybridation in situ avec oligonucléotides radio-marqués est décrite en détail dans [354]. Voir le chapitre 5 pour les fondements théoriques de l'expérience. 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides Après analyse des structures secondaires de l'ARNm par le programme STEMLOOP de la suite WISCONSIN du GCG [85], les séquences des sondes sont choisies dans des régions uniques en séquence au sein de la famille, dépourvues de structures secondaires putatives, contenant à peu près 50-60 %GC. Les oligonucléotides furent synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Cyclone (Biosearch inc.) ou commandés à la société Genset (Paris, France). Les sondes sont décrites dans le tableau 12.1. Tableau 12.1 : Oligodésoxynucléotides utilisés dans cette étude. La température de fusion est calculée pour la condition de lavage la plus stringente, à l'aide de l'équation 3 de [336] (0,1 M NaCl, 0 % formamide) (mais voir le chapitre 5 pour un type de calcul plus exact). Les séquences des sous-unités peuvent être retrouvées dans la Ligand Gated Ion Channel Database (voir le chapitre 2) à l'URL: http://www.pasteur.fr/units/neubiomol/LGIC.html ou à partir de GenEMBL (les d'accession sont dans le tableau) cibl accessi positi Séquence de l'oligodésoxynucléotide %G T e on on C m 2rn L1007 1425 7 5'CTCCAGCATCCATGTTAGTCTCTAGCCAATGGTATG 51 AGGGGCTGA-3' 75, 6 3rn L3162 1040 1 5'CCCAAGTGGGCATGGTGTGTGTGGTTGGAGTTCTAT 53 AGTGCAC-3' 76, 2 3rn L3162 1138 1 5'GCGCCGTAGAAGGTCCTCGTCTTAGGAGTGTCCCCC 62 TCACCACTG-3' 83, 5 3rn L3162 215 1 5'GGACACCTCAAACTGGATGATGACTGGATGGGACA 51 CATTAGCCAC-3' 75, 6 3rn L3162 623 1 5'CTCCCAGTAGTCCTTGCGGTTCATGGAGGAGCCGAT 58 GAGGACCAG-3' 80, 6 4rn M1568 1389 1 5'GCTGCTTCTTGGGAGCTGGGCACATGCTGGACACTC 62 AGGGACCTG-3' 83, 5 5'GAAGTCCAGTTGGTCCACACGGCTGTGCATGCTCA CCAAGTCAAT-3' 4rn 5rn J05231 1076 5'CCGAGATTTAGGTCCAGCCCCACTCTCGGCTTCTTC 56 TCTCTGAGT-3' 79, 2 6rn L0822 325 7 5'TCAAAGTGCACCGTGACGGGATCAGAAACGTTTTC 56 CACTGGCCGG-3' 79, 2 6rn L0822 1575 7 5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACGATTATAAAC 49 ACCCAGAGGA-3' 74, 2 6m m 6m m 7rr 5'TCAAGATGCACCGTGACGGGATCGGAGACATTCTC CACCGGCCGG-3' 5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACAATTATAAAT ACCCAAAGGA-3' 5'CCTGCACTCAGCTCCACACTGGCCAGGCTGCAGCG 70 CCGAG-34 5'- 58 7rr ATCATGTGTTGGGGAGCAGGCCAAACGGCCACATA CGACCCCAGA-34 2rn L3162 1341 2 5'AGCCAAGCCCTGCACTGATGCAGGGTTGACAAAGC 55 AGGTACATGG-3' 78, 5 2rn L3162 1455 2 5'TCGCATGTGGTCCGCAATGAAGCGTACGCCATCCA 60 CTGCTTCCCG-3' 82 2rn L3162 1315 2 5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCCGCAGGACCT 55 TCACCGAAGA-3' 78, 5 5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCTGCAGGACCT TGGCGGAAGA-3' 2m m 5'TCGCATATGGTCCGCAATGAAGCGTACACCGTCCA CAGCTTCCCG-3' 2m m J04636 1306 5'CAGAACTCTTTCTCCATCGCTGGCGGGAGTCTGTTT 53 CCTTTTGCC-3' 77 3rn J04636 431 5'ATTCTTCCGGATTCCAGCGTAATTTTTGGTCTGTGC 42 ATTCCTGCT-3' 69, 4 4rn J05232 1020 5'ACCAGGCTGACTTCAAGACCGGGACGCTTCATGAA 55 GAGGAAGGTG-3' 78, 5 4rn J05232 1259 5'AGCTGACACCCTCTAATGCTTCCTGTAGATCTTCCC 53 GGAACCTCC-3' 78, 5 5'AGGGTGTGCAGCTCATCCTGGACCCCCTCCAAGGA 65 GCGCT-3' 83, 4 3rn TH Les oligonucléotide sont marqués en 3' avec du [35S]-dATP ou du [33P]-dATP (NEN, Boston, MA) et de la désoxynucleotidyl-transférase terminale (Boehringer Mannheim, Allemagne), en suivant les spécifications du fabriquant, à une activité spécifique de 200-600 KBq/pmol. Les sondes marquées sont précipitées dans l'éthanol, séparées des nucléotides non incorporés avec des NucTrap push columns (Stratagene, La Jolla, CA), précipitées de nouveau dans l'éthanol et resuspendues dans de l'eau distillée. 12.2.2 Animaux Six rats Sprague-Dawley adultes (Iffacredo, Lyon, France), pesant 300-400 g, ont été utilisés. Les animaux sont tués par injection d'hydrate de chloral (1 ml de solution à 35 %); le cerveau est rapidement disséqué et congelé dans de la carbo-glace. Les tissus sont stockés à -80 °C jusqu'à la coupe. Plusieurs âges embryonnaires et post-natals ont été examinés: E10, E11, E12, E13, E15, E17, E19, P0 and P4. Les embryons ont été datés selon [250], E0 dénotant le jour suivant l'accouplement et P0 le jour suivant la naissance. Pour chaque stade, entre deux et cinq animaux ont été utilisés. Pour le prélèvement des embryons, les mères ont été anesthésiées à l'éther. 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ Les tissus congelés sont coupés au cryostat (coupes de 14 µm d'épaisseur), montés à chaud sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et stockées à -80 °C (moins de 2 semaines). La procédure est mené selon le protocole de [363], modifié selon [372] et le protocole suivant. Brièvement, les coupes sont fixées avec du para-formaldéhyde 4 % durant 5 min à température ambiante, lavées dans du PBS, acétylées, et stockées dans de l'éthanol 80 % à 4 °C. Les coupes sont alors délipidées dans de l'éthanol et du chloroforme (5 min), pré-hybridées durant 2-4 h à 37 °C et hybridées durant 20 h à 37 °C sous des lamelles de parafilm. La composition du milieu de pré-hybridation (et d'hybridation) est: 50 % formamide 0,6 M NaCl 10 mM di-thiothreitol 10 % sulfate de dextran 1 mM EDTA Solution de DENHARDT 1x (50x = o 1 % sérum-albumine bovine o 1 % Ficoll o 1 % polyvinyl-pyrrolidone ) 0,1 mg/ml poly-A (Boehringer Mannheim, Allemagne) 0,5 mg/ml ARNt de levure (Sigma) 0,05 mg/ml ADN de sperme de hareng (Promega, Madison, WI) 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 Les sondes sont ajoutées au mélange d'hybridation à la concentration de 0,55 nM (correspondant à 15 fmol/coupe ou 3000-25000 Bq/30 µl/coupe selon les marquages). 12.2.3.1 Prélavage commun Après retrait du parafilm les coupes sont initialement rincées dans de la solution saline citrate standard (SSC) 2x (0,3 M NaCl, 0,03 M citrate de sodium) à température ambiante (2 fois 5 min). 12.2.3.2 Premier protocole de lavage Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités durant l'ontogenèse. Les coupes sont lavées quatre fois 15 min dans du SSC 2x , 50 % formamide à 42 °C puis deux fois 30 min dans du SSC 1x à température ambiante. 1 mM de di-thiothréitol est ajouté à chaque solution. 12.2.3.3 Second protocole de lavage Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez le rat adulte ainsi que chez les souris recombinées 2-/-. Les coupes sont lavées trois fois durant 15 min dans du SSC 1x à température ambiante, puis 15 min dans du SSC 0,5x à 55 °C (cela dépend des oligonucléotides). Les sondes utilisées dans cette étude ont la même longueur et approximativement le même contenu en GC. Les températures de fusion des différent duplex oligonucléotide/ARNm, calculées en utilisant l'équation 3 de [336], sont similaires dans les mêmes conditions d'hybridation (0,6 M NaCl, 50 % formamide). La température du lavage le plus stringent est égale à la Tm -20 °C (dans 0,01 M NaCl, 0 % formamide), afin de corriger les petites différences de contenu en GC entre les différentes sondes. Nous avons préalablement montré que cette température de lavage donne un rapport signal/bruit optimal, avec un signal spécifique à peu près maximum et un faible signal non-spécifique. Les coupes sont alors rincées 15 min dans du SSC 0,5x à température ambiante. 12.2.3.4 Troisième protocole de lavage Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez les souris recombinées 4-/-. Les deux étapes de lavage réalisées dans du 0,5x SSC sont désormais réalisées dans du 1x SSC. La température de fusion des différent duplex oligonucléotide/ARNm est désormais calculée selon la méthode décrite au paragraphe 11.3.2. 12.2.3.5 Post-lavage commun Après un court rinçage dans de l'eau glacé, et un gradient d'alcool elles sont séchées et exposées à un film [3H]-Hyperfilm (Amersham) puis à une émulsion photographique (NTB2, Kodak, Rochester, NY). Dans le cas des cerveaux de rats adultes nous avons utilisé un facteur de correction défini au paragraphe 11.4.1 afin de comparer quantitativement différentes expériences. 12.2.4 Analyses des préparations histologiques Deux oligonucléotides ou plus [tableau 12.1] ont été utilisés pour caractériser la spécificité du marquage. Par la suite, un seul oligonucléotide/ARNm a été utilisé durant la cartographie (46, 47, 51, 58, 59, 62, 131 and 133). Chaque niveau anatomique a été analysé au cours d'au moins trois (et jusqu'à cinq) expériences indépendantes. L'analyse des motifs de marquage a été mené à la fois sur les films et les émulsions. Les coupes ont été contre-colorées au bleu de toluidine préalablement à l'identification des structures. Les définitions des aires anatomiques sont basées sur différents atlas, dont [251,250,169,314,292,111]. Une quantification relative des niveaux d'ARNm codant pour les différentes sous-unités dans les noyaux dopaminergiques du mésencéphale a été réalisée sur les autoradiogrammes à l'aide de l'analyseur d'image Vidas (Kontron, Munich, Allemagne). Deux expériences différentes ont été quantifiées. Six niveaux anatomiques ont été analysés dans l'un des cerveaux (Bregma -4,7 à -6,3 mm) et quatre dans l'autre (Bregma -4,8 à -6,1 mm). Après une procédure de seuillage, qui permet la rétention du signal spécifique, le MGV et l'aire retenue sont mesurés. La densité optique intégrée totale TOT est alors calculée à partir de la densité optique intégrée de chaque niveau: Après correction (COR) pour S (pour la sous-unité i, ), les résultats sont exprimés par rapport aux valeurs de 2 ( ) dans chaque expérience. 2 fut arbitrairement choisie comme référence car elle est exprimée partout, de manière relativement homogène dans le cerveau de rat adulte. La détermination des valeurs de Kd et Bmax pour les sondes 11.3.2. 3 est décrite au paragraphe Le comptage des cellules sur les émulsions photographiques a été réalisé au niveau Bregma 5,3 mm. La reconnaissance des neurones est basée sur la contre-coloration des coupes au bleu de toluidine. Deux champs rectangulaires (380x250 µm) sont analysés dans chaque région. Les champs sont localisés dans la SNc et le centre de la VTA. Un neurone est considéré positif quand il est recouvert par une densité de grains au minimum de trois fois la densité du bruit de fond. 12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs L'hybridation in situ avec oligonucléotides a été choisi afin de minimiser la reconnaissance croisée des différentes sous-unités du nAChR et de permettre des comparaisons quantitatives entre plusieurs expériences. Pour une discussion générale sur les différentes méthodes d'hybridation in situ et sur les fondements théoriques de l'hybridation des oligonucléotides voir le chapitre 11. Les oligonucléotides peuvent être choisis dans des régions de séquences hautement spécifiques, ce qui n'est pas toujours le cas pour les sondes ARNc. Par exemple, les sondes utilisées dans les études antérieures du nAChR étaient souvent dirigées contre la séquence codante toute entière, et donc contre certaines parties hautement conservées. Afin de produire des sondes plus efficaces, les auteurs les ont souvent hydrolysées en fragments de 50-200 nucléotides, une pratique qui peut engendrer du signal non-spécifique mais également des reconnaissances croisées avec les autres membres de la même famille de gène. L'hybridation in situ avec oligonucléotides est hautement reproductible dans (presque) tous les tissus et avec (presque) toutes les sondes. En effet, le contrôle des paramètres de l'expérience (i.e., concentration de la sonde, activité spécifique et température de fusion) permet la détermination de caractéristiques quantitatives comme le KD apparent et le Bmax. Pour la sous-unité 3, une étude de saturation a été menée sur l'habénula médiale avec plusieurs sondes. Dans les conditions expérimentales décrites plus haut (en particulier, le lavage le plus stringent effectué à Tm - 20 degC dans 0,5x SSC durant 15 min), la sonde 46 donne un KD de 0,075 nM avec un Bmax de 0,13 fmol/cm2 et la sonde 109 donne un KD de 0,17 nM avec un Bmax de 0,19 fmol/cm2 . De manière générale, nous avons vérifié que dans cette étude les différences de marquage obtenues avec les différentes sondes dirigées contre le même ARNm étaient < 50 %. 12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat Le signal pour l'ARNm codant 6 est détecté dans un nombre restreint de structures [résumé dans le tableau 12.2]. L'intervalle d'intensité du marquage varie énormément, de difficilement détectable à très fort. Le télencéphale ne montre aucun signal spécifique [Figure 12.1]. Figure 12.1 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des ARNm d' 2 (S=4687), (S=4092), 3 (S=2710) et 3 (S=2568), 4 (S=5071), 5 (S=1845), 6 (S=1623), 2 4 (S=1563) sur des coupes adjacentes de télencéphale. Bregma +1,70 mm. Dans toutes les autres subdivisions principales du CNS, quelques noyaux montrent des niveaux détectables d'ARNm 6. Tableau 12.2: Distribution et quantification relative des ARNm codant pour les sous-unités dans le cerveau de rat. (+) difficilement détectable, + signal faible, ++ signal modéré, +++ signal fort. 2 3 4 5 6 7 2 3 4 Télencéphale bulbe olfactif + ++ + ++ - ++ ++ - + noyau olfactif antérieur - (+) ++ (+) - ++ ++ - - layer II-III - - + + - + ++ - - layer IV - + + + - + ++ - - layer V - - ++ + - ++ ++ - - layer VI - - ++ ++ - ++ ++ - - formation hippocampale - + + + - +++ ++ - - striatum - - - - - - + - - septum - - + - - + + - - noyau supra-optique - - + - - +++ + - - noyau ventro-médial - - + - - - ++ - - reste - - + - - - + - - - +++ - ++ - - + - +++ habénula médiale partie dorsale - - + - - - ++ - - habénula médiale partie ventro-latérale - +++ ++ + - - ++ - +++ habénula médiale partie ventro-médiale - +++ (+) - (+) - ++ +++ +++ habénula latérale - - - - (+) - + + - noyau réticulé - - + - ++ - ++ + - noyau antéro-ventral - + +++ - - - +++ - - isocortex hypothalamus Diencéphale glande pinéale habénula thalamus reste - - +++ - - - +++ - - noyaux dopaminergiques - (+) ++ ++ +++ - ++ +++ - noyau mésencéphalique du trijumeau - - + - + - ++ +++ - partie apicale ++ - - ++ - + - - - partie centrale - - - - + + (+) - - partie latérale - - - - + + (+) - - partie rostrale ++ - - ++ - + - - - noyaux vestibulaires - - + + - ++ + - - cervelet - + - + - - + + + locus coeruleus - (+) - - +++ - ++ +++ (+) noyaux moteurs - + + + - - ++ - - noyau du tractus solitaire - ++ (+) + - - ++ - ++ area postrema - ++ ++ + - - ++ - + rétine - + + ? ++ ? ++ ++ + ganglions autonomes - +++ - ++ - ++ ++ - +++ ganglions somato-sensoriels - (+) - - + - +++ ++ - ganglions vestibulocochléaires - - ++ ? ++ ? ++ ++ - Mésencéphale n. interpédonculaire Rhombencéphale Périphérie 12.3.3 Diencéphale Dans le diencéphale, trois noyaux sont marqués par les sondes différentes. 6, mais avec des intensités Le noyau thalamique réticulé montre un gradient à la fois rostro-caudal et dorso-ventral du marquage 6 [Figure 12.2]. L'intensité du marquage est modeste, même dans la partie rostrodorsale. 2 et 4 sont également présentes dans le noyau réticulé bien qu'à des niveaux moindres. La sous-unité 3 est présente mais est difficilement détectable avec un seul oligonucléotide. En revanche si l'on place deux sondes en tandem, le marquage apparaît nettement. Figure 12.2 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des ARNm d' 2 (S=4687), (S=3000), 3 (S=2568), 4 (S=46848), 5 (S=1845), 6 (S=1623), 2 3 (l'expérience qui est représentée résulte de l'utilisation groupée de deux sondes. Le facteur S est donc difficilement calculable et de plus, le bruit de fond est très élevé) et (S=1563) sur des coupes adjacentes de diencéphale antérieur. Bregma -1,4 mm. Le marquage 4 6 est restreint à une petite partie de l'habénula médiale [Figure 12.3], dans quelques cellules longeant le ventricule. Cette distribution correspond à celle de Cependant, l'intensité du marquage 3. 3 est plus forte. La distribution de l'ARNm d' 6 (ou de 3) semble complémentaire de celle d' 4. Au contraire, le marquage pour 3 et 4 est détecté à des niveaux très forts à travers toute la partie ventrale du noyau, alors que le marquage 5 est restreint à la partie ventro-latérale du noyau et celui de niveaux modérés dans tout le noyau. 2 est présent à des Dans le noyau de l'habénula latérale, nous détectons une faible marquage pour pour 2 et 6 ainsi que 3. Figure 12.3 : panneaux supérieurs, photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des sous-unités 3 (S=3469), 4 (S=4010), 5 (S=2735), 6 (S=3227), 2 (S=4092), 3 (S=2710) et 4 (S=3617) sur des coupes adjacentes de noyau habénulaire. Les têtes de flèche et les flèches indiquent l'habénula médiale et latérale, respectivement. Note: A cette échelle, le marquage 6 est difficilement détectable. panneaux inférieurs, micro-photographies en fond noir d'émulsion montrant la distribution d' 3 (S=15462), d' 4 (S=7953), d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes adjacentes d'habénula médiale. La contre-coloration au bleu de toluidine (TB) est reportée dans le dernier panneau de la ligne intermédiaire. Note: Les distributions de sont complémentaires. Bregma -3.3 mm. 6/ 3 et La partie caudale du noyau supra-mammillaire est légèrement marquée par les sondes ainsi que par les sondes 5 et 2. Le marquage pour 4 est absent ou très faible. 4 6 12.3.4 Mésencéphale Le mésencéphale présente trois structures contenant du signal spécifique pour l'ARNm d' 6. Les noyaux dopaminergiques du mésencéphale expriment une grande variété d'ARNm codant les sous-unités du nAChR[Figure 12.6]. Le marquage pour 6 est très fort dans la substance noire (A9), pars compacta (SNc), la VTA (A10) et l'aire rétrorubrale (A8) [Figure 12.4]. Figure 12.4 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution de l'ARNm d' 6 (S=1623) à 8 niveaux (bregma -4,8, -5,2, -5,3, -5,7, -6,1 et -6,4 mm) du mésencéphale ventral. Les têtes de flèche, les flèches et les doubles têtes de flèches indiquent respectivement l'aire tegmentale ventrale, la substance noire pars compacta et le noyau interpédonculaire. Des cellules dispersées montrant un marquage de forte intensité pour 6 sont également présentes dans la zone péri-ventriculaire mésencéphalique et dans la substance noire pars reticulata (SNr), correspondant peut-être au système dopaminergique péri-ventriculaire et aux neurones dopaminergiques de la SNr. Les neurones de la SNc et de la VTA sont marqués de manière homogène. La sous-unité très importants [Figure 12.5]. 3 est détectée à des niveaux plus faibles bien que toujours Figure 12.5 : Microphotographies en fond noir d'émulsion montrant les distributions de l'ARNm d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes adjacentes de SNc et VTA. Note: les distributions très similaires des deux ARNm dans ces régions. Bregma -5,3 mm. Barre d'échelle µm. Abréviations: D = dorsal, L = latéral. Afin de déterminer si les ARNms des sous-unités 6 et 3 sont localisés dans les cellules dopaminergiques, nous avons compté les neurones marqués par les sondes dirigées contre les deux sous-unités du nAChR ainsi que celle dirigée contre la tyrosine hydroxylase (TH), l'enzyme de biosynthèse des catécholamines, après contre-coloration des coupes avec du bleu de toluidine. Approximativement le même pourcentage de neurones (80%) de la SN et de la VTA contiennent du marquage spécifique pour les ARNm d' 6, de 3 et de la TH [Table 12.3]. Tableau 12.3 : Décompte des neurones positifs pour la TH, 6 et 3 dans la SNc et la VTA. Les résultats (moyenne de deux comptage par marquage ±SD) sont exprimés en pourcentage du nombre total de neurones. SNc Tyrosine hydroxylase VTA 76,6 ± 2,3 86,4 ± 1,2 6 83,8 ± 2,3 80,9 ± 1,8 3 83,4 ± 2,3 83,0 ± 3,4 Cela montre qu'au moins 50 % des neurones TH+ (c.-à-d. dopaminergiques) contiennent également les arnm d' 6 et de 3. Cependant, le recouvrement au niveau régional des zones marquées par les différentes sondes suggère que les trois ARNm sont présents dans la même population neuronale. Du signal pour les ARNm d' 4, 5 et 2 est également visible dans les noyaux dopaminergiques, mais à des niveaux plus modérés. [Figure 12.6]. Figure 12.6 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des \textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623), 2 (S=3000), 3 (S=1828) et 4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de mésencéphale ventral. Les têtes de flèche et les flèches indiquent respectivement la substance noire, pars compacta, et la VTA. Les petites croix indiquent un morceau de cervelet qui a migré accidentellement vers la partie ventrale du cerveau durant la congélation. Bregma -5,6 mm. 12.3.5 Rhombencéphale Dans le rhombencéphale, le locus c ruleus est le seul noyau marqué par les sondes 6 (Figure 12.7). L'intensité du marquage est extrêmement forte, au même niveau que celle des cellules dopaminergiques du mésencéphale. Les ARNm de plusieurs autres sous-unités sont trouvé dans ce noyau, 2 et difficilement détectables. 3 à des niveaux modérés, 3 à un faible niveau, 4 et 5 Figure 12.7 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des \textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623), 2 (S=3000), 3 (S=1828) et 4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de rhombencéphale. 12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes Des lignées de souris n'exprimant plus les sous-unités 2 [256] et recombinaison homologue. Dans les souris dont le gène codant 4 ont été engendrées par 2 a été inactivé, L'hybridation in situ montre une diminution du signal 2 de moitié chez les hétérozygotes et une disparition totale chez les mutantes homozygotes [Figure 12.8]. L'hybridation in situ des ARNms codant les autres sous-unités ne montre aucune différence significative entre les animaux 2+/+ et 2-/-. Figure 12.8 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris sous-unités 4 et 2-/-. L'expression des 4 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et homozygotes. Bregma -2 mm Dans le cerveau des souris 4-/-, une sonde dirigée contre la délétion du gène 4 ne donne plus aucun signal (comme pour les souris 2-/-, le signal est diminué de moitié dans le cerveau des animaux hétérozygotes) [Figure 12.9]. En revanche, avec une sonde dirigée contre une partie du gène en 3' de la délétion, on peut noter une persistance du marquage. Cela montre que le messager est toujours présent même si il n'y a plus formation de protéine fonctionnelle. Aucune modification d'expression significative des sous-unités non-recombinées n'est décelable dans le cerveau de ces souris. Figure 12.9 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris 4-/-. L'expression des sous-unités 3,6 et 2 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et homozygotes. Deux images de l'hybridation in situ d' 4 dans le cerveau des homozygotes sont montrées. L'image supérieure a été réalisée avec une sonde reconnaissant une partie du transcrit en aval de la délétion, alors que l'image inférieure a été réalisée avec une sonde complémentaire de la délétion. Bregma -2 mm, excepté pour 6: Bregma -3 mm. 12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire La distribution des ARNm codant les différentes sous-unités varie d'une sous-unité à l'autre mais est bien définie pour chaque sous-unité. Michele ZOLI et moi-même avons observé la mise en place de cette distribution durant le développement embryonnaire et peri-natal. Deux sous-unités ( 3 et 4) ainsi que deux sous-unités ( 2 et 4) ont été particulièrement étudiées. L'expression observée apparaît très tôt (dès le début de la neurogenèse), et suit la différenciation neuronale . Le marquage est réparti uniformément dans les neurones postmitotiques. Puis, alors que 4 et 2 restent exprimées très largement mais à un niveau modéré, l'expression de 3 et 4 se restreint à quelques noyaux particuliers où elle atteint des niveaux très élevés. La mise en place de l'expression de la sous-unité 4 suit la progression caudo-rostrale des terminaisons cholinergiques. Une distribution de type adulte des transcrits est acquise dès le début de la vie postnatale. Trois principaux motifs développementaux ont été identifiés: (1)- Dans la majorité des cas étudiés (rhombencéphale, moelle épinière [Figures 12.10 et 12.11], ganglions somato-sensoriels[Figure 12.12]) les quatre sous-unités sont initialement exprimées puis, durant le développement prénatal subséquent, le niveau d'expression de certaines de ces sous-unités devient progressivement indécelable ( 4 dans les ganglions autonomes, 3 et 4 dans la majeure partie du cerveau et la moelle épinière, les ganglions des racines dorsales, 3, 4 et 4 et 4 dans 4 dans les ganglions somato-sensoriels). Figure 12.10 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 13 et 15 du rat. Les barres d'échelle mesurent 1 mm. Panneaux supérieurs, les têtes de flèches pointent les ganglions des racines dorsales. Panneaux médians, les flèches pointent le ganglion du trijumeau et les têtes de flèches les ganglions des racines dorsales. Panneaux inférieurs, Les flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le ganglion sphénopalatin et les doubles têtes de flèches le ganglion otique. Btel: télencéphale basal, Cx: cortex, Di: diencéphale, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Rh: rhombencéphale, SC: moelle épinière (spinal cord), Te: télencéphale. Figure 12.11 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 17 du rat. Coupes coronales, Les flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le ganglion otique et les doubles têtes de flèche l'habénula médiale. La barre d'échelle mesure 1 mm. Coupes sagitales, les petites flèches pointent l'épiphyse, les grosses flèches le noyau ventro-médial de l'hypothalamus, les têtes de flèche l'habénula médiale et les doubles têtes de flèches le ganglion sympathique lombaire. Btel: télencéphale basal, Cx: cortex, Hy: hypothalamus, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Th: thalamus. Figure 12.12 : Expression de 3, 4, 2 et 4 dans les ganglions périphériques. La barre d'échelle mesure 100 µm. Les flèches pointent le ganglion glosso-pharyngé inférieur, les têtes de flèches le ganglion glosso-pharyngé supérieur et les têtes de flèche doubles le ganglion cervical supérieur. 2 est présent partout, 4 nulle part et 3 comme 4 sont présents dans les ganglions autonomes mais pas dans le ganglion somato-sensoriel. (2)- Certaines sous-unités sont initialement exprimées et le reste durant tout le développement ( 3, 4, 2 et 4 dans la rétine, 3, 2 et dans les ganglions vestibulo-cochléaires). 4 dans les ganglions autonomes, 4 et (3)- Dans le cas du néo-cortex, 3 et 2 sont initialement exprimées (E12-E13) puis disparaît (E15) et est remplacée par 4 (E17-E19)[Figure 12.13]. 2 3 Figure 12.13: Expression d' 3, 4 et 2 dans le cortex du rat aux jours embryonnaires E13, E15 et E19. CP: cortical plate, cx: cortical neuroépithélium, SP: cortical subplate, ICx: intermediate cortical layer 12.6 Discussion Depuis le premier report de l'existence de la sous-unité 6 [180] la connaissance de la signification fonctionnelle de cette sous-unité n'a que peu progressé. Ici nous montrons que l'ARNm d' 6 est restreint à quelques noyaux spécifiques dans le cerveau. La quantité d'ARNm 6 est particulièrement haute dans les noyaux catécholaminergiques (les noyaux A6, A8, A9 et A10) et modérée ou faible dans le noyau réticulé du thalamus, l'habénula latérale et médiale et le noyau supra-mammillaire. Cette distribution correspond à celle mentionnée dans le tableau de [90] et au marquage immuno-cytochimique observé par [136]. En plus, d'autres noyaux sont positifs, comme le noyau interpédonculaire et le noyau mésencéphalique du trijumeau. Au contraire de ce qui est rapporté par [135], aucun marquage n'a été détecté dans l'aire prétectale antérieure. 12.6.1 Aspects méthodologiques Pour cette étude nous avons utilisé l'hybridation in situ avec oligonucléotides, une méthode largement utilisée dans le champ des LGIC [221,366,218,219,259,260,341,353,372], bien que différente de la méthode avec ARNc qui a été utilisée pour cartographier les sous-unités du nAChR dans le CNS des mammifères adultes [335,281,334,80,90,284,299]. De manière générale, nos études réalisées avec oligonucleotides sont en bon accord avec les études précédentes réalisées avec ARNc (avec quelques exceptions notables, comme 5 dans l'habénula médiale). Cependant une différence claire avec les résultats précédents est observée quand on s'intéresse à 3 et 6. En particulier, nous voyons un fort signal 6 et presque pas de signal 3 dans quelques régions précédemment supposées riches en ARNm 3, à savoir les noyaux catécholaminergiques [335]. Cette différence ne peut être expliquée sur la base des sensibilités différentes des deux types de méthodes, puisque dans la plupart des structures du cerveau notre cartographie d' 3 correspond avec les précédentes [335]. 3 et 6 sont phylogénétiquement très proches (voir le chapitre 9). Les séquences de leurs ARNm sont très proches. Puisque, selon l'étude présentée ici, 6 est presque 20 fois plus exprimée qu' 3 dans certaines régions, il est possible qu'une sonde ARNc dirigée contre la séquence entière d' 3 révèle également les ARNm d' 6 (particulièrement si la sonde a subi une hydrolyse alcaline avant l'expérience). 12.6.2 Colocalisations Nos travaux montrent que les ARNm d' 6 et 3 possèdent une distribution similaire dans le cerveau. Quelques expériences exploratoires indiquent que cela serait également le cas en périphérie. Par exemple, dans la rétine post-natale et dans les ganglions somato-sensoriels (comme le ganglion du trijumeau), co-localisation d' 6 et de 6 et 3 sont tous les deux détectés. Dans le cerveau, la 3 est réalisée dans la plupart de leur zones d'expression [Tableau 12.2]. Le marquage pour 3 est parfois d'une intensité inférieure (noyau thalamique réticulé, noyau interpédonculaire, locus c ruleus, noyaux dopaminergiques) et parfois d'une intensité supérieure (habénula médiale, noyau mésencéphalique du trijumeau) à celui d' 6. Une exception est le noyau supra-mammillaire où l'ARNm d' 6 est détecté mais non celui de Dans ce noyau, le marquage pour 6 est très bas, et les niveaux d'ARNm de être au-dessous du seuil de détection de la technique. 3. 3 pourraient La sous-unité 6 possède tous les résidus qui ont été identifiés comme faisant partie de composant principal du site de liaison (voir le tableau 7.1 et l'alignement 7.2). La sous-unité 6 est donc une << vrai >> sous-unité , qui peut être engagée dans la liaison de l'ACh. In vitro, 6 de poulet forme des récepteurs fonctionnels avec la sous-unité 4 d'homme [130] ou de poulet[116]. La colocalisation extensive d' 6 et de 3 rapportée ici, supporte l'idée que ces sous-unités pourraient s'assembler au sein d'hétéro-oligomers. Une possibilité est que 3, comme 5, soit un troisième type de sous-unité (en sus des types et << standards >>). Ces sous-unités, comme la sous-unité 1 musculaire ne participeraient pas au site de liaison de l'ACh et n'existeraient donc que dans des hétéro-oligomères comportant au moins 3 sous-unités différentes (voir les paragraphes 7.2 et 9.4.2). Dans le système nerveux, des nAChRs ont été identifiés composés de et 4 2 5 [63] 3 4 5 [63,330,297] 3 2 4 5 [62]. De manière similaire, on peut faire l'hypothèse qu'il pourrait exister dans le système nerveux des récepteurs comme 6 2 3. 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula Dans l'habénula latérale, la distribution de l'ARNm d' 6 est très similaire à celle des ARNm de 2 et 3, bien qu'il n'y ait aucune preuve directe de leur colocalisation dans les mêmes cellules. Comme l'habénula latérale envoie des projections à la substance noire [154], et inversement celle-ci envoie des projections à l'habénula latérale [305,196], des nAChRs composés de 6 2( 3) pourraient être présents dans les deux branches de cette voie bidirectionnelle. Si l'on considère les sous-unités du nAChR, l'habénula médiale peut être subdivisée en trois sous-noyaux: dorsal, ventro-médial et ventro-latéral [Figure 12.14]. 6 et 3 sont localisées dans le sous-noyau ventro-médial, avec un gradient de la ligne médiane vers la partie latérale (voir aussi [80]). La distribution plus restreinte d' 6 relativement à 3 peut être due à une moindre quantité d'ARNm, et donc à un niveau plus faible du signal. Le seuil de sensibilité couperait alors le gradient d'expression plus près de la ligne médiane. Goldner et coll. [136] ont également trouvé par immuno-cytochimie la sous-unité 6 dans l'habénula médiale. La seule photographie présentée par les auteurs montre 6 localisée dans la région ventromédiale. La distribution de l'ARNm d' 4 est complémentaire de celle d' 6 et 3. La sousunité 4 est détectée à un niveau très faible dans le sous-noyau ventro-médial, à un niveau intermédiaire dans le sous-noyau dorsal et à un niveau important dans le sous-noyau ventrolatéral (voir aussi [335,157]). Contrairement à [334], nous trouvons un marquage pour l'ARNm d' 5 dans l'habénula médiale. Sa distribution est restreinte au sous-noyau ventro-latéral. Un marquage fort pour 3 et 4 est détecté dans les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral équivalent à celui décrit dans [335,90,157]. Le marquage pour 2 est présent de manière à peu près uniforme dans l'ensemble du noyau. Les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral correspondent aux deux tiers ventraux de l'habénula médiale, qui sont formés de neurones cholinergiques [192,357]. De fait, la distribution des sous-unités 3 et 4 se superpose à celle des neurones exprimant la choline acétyl-transférase (voir les Figures 2 et 8b de [238]). Le sous-noyau ventro-latéral semble plus riche en choline acétyl-transférase que le sousnoyau ventro-médial [163]. Finalement, le sous-noyau dorsal contient de forts niveaux de substance P [64]. Figure 12.14 : Schéma de la distribution des sous-unités du nAChR dans l'habénula médiale. Les combinaisons de sous-unités pour lesquelles des témoignages électrophysiologiques (en ovocytes après expression hétérologue) et, pour certaines, biochimiques (coprécipitation à partir de tissu natif) ont été obtenue sont indiquées pour chaque sous-noyau. La localisation des récepteurs putatifs 6 et 2 ou 4 avec ou sans 3 est également représentée (encadrée). D, dorsal; VL, ventro-latéral; VM, ventro-médial. L'habénula médiale était supposée, pour ce qui est du nAChR, être un noyau homogène, contenant plusieurs isoformes différentes de récepteur dans les même cellules. Les différents courants nicotiniques enregistrés à partir de neurones habénulaires étaient donc assignés à de multiples isoformes de récepteurs présentes dans une classe de cellules homogènes [224,225,61]. Les données présentées plus haut, en particulier celles montrant la ségrégation des ARNm d' 4/ 5 et d' 6/ 3, suggèrent que les isoformes de nAChR sont, au moins partiellement, cellule-spécifiques. Sur la base des résultats présents et antérieurs (en cultures de cellules transfectées et par immuno-précipitation) on peut inférer les isoformes qui pourraient être présentes dans les différents sous-noyaux [Figure 12.14]. 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques Le locus c ruleus et les noyaux A8, A9 et A10 présentent les plus forts niveaux d'expression de l'ARNm d' 6 dans le CNS. Ces noyaux contiennent de forts niveaux de TH et sont responsables de la majeure partie de l'innervation noradrénergique et dopaminergique du cerveau. L'action potentiatrice de la nicotine sur la libération de dopamine [347,132,9] est transmise par les récepteurs localisés sur les terminaisons (stimulation rapide), et par les récepteurs localisés sur les soma dopaminergiques du mésencéphale (stimulation à long terme). Les deux ensembles de récepteurs pourraient être identiques ou différents. 12.6.4.1 Implication de 2 L'ARNm codant 4 n'est pas détecté dans les cellules dopaminergiques [91,90,185]. [257] ont montré qu'aucun courant nicotinique somatique ne persistait dans les cellules dopaminergiques des souris 2-/-. [55] ont clairement montré l'existence de récepteurs à haute affinité pour la nicotine en autoradiographie dans les soma dopaminergiques et dans les terminaisons. [256] ont montré que l'inactivation de la sous-unité 2 entraîne une disparition complète des récepteurs à haute affinité pour la nicotine en autoradiographie. Au moins une partie, si ce n'est la totalité des nAChRs de la cellule dopaminergique nécessite donc la sous-unité 12.6.4.2 2. 4 ne semble pas impliquée La pharmacologie de l'accroissement de libération de dopamine entraîné par la nicotine indique que le(s) récepteur(s) impliqué(s) n'est pas 4 2 [263,137,285]. Dans les synaptosomes striataux, Grady et coll. [137] ont trouvé un ordre d'efficacité cytisine = nicotine > DMPP=ACh. Dans des tranches de striatum, [285] ont trouvé l'ordre d'efficacité cytisine > nicotine = DMPP. Ces spectres pharmacologiques ne correspondent pas aux propriétés des récepteurs contenant 4 2 [203]. De plus, 100 nM de bungarotoxine neuronale bloque la potentiation endogène de la libération de dopamine par la nicotine [296]. A cette concentration, la toxine est capable d'inhiber l'action de 2 [204]. 12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que 3 2 mais pas celle de 4 3 Plus haut nous montrons que le marquage pour 6 est à peu près 20 fois plus intense que celui pour 3 dans les cellules dopaminergiques ainsi que celles du locus c ruleus. Goldner et coll. [136] ont également observé par immuno-cytochimie un fort marquage pour 6 dans les noyaux catécholaminergiques A6,9,10. On peut donc faire l'hypothèse que la pharmacologie observée pour la potentiation de la libération de dopamine résulte d'un récepteur contenant 6. Signalons que Clarke et Reuben [56] trouvent que les caractéristiques pharmacologiques des libérations de dopamine dans le striatum et de noradrénaline dans l'hippocampe diffèrent. On possède peu de données sur la pharmacologie des récepteurs contenant 6. Cependant, l'identité de séquence protéique entre 3 et 6 est très forte (61 % d'identité sur la longueur totale, les différences étant principalement localisées dans le peptide signal et la partie variable de la boucle cytoplasmique, voir les Figures 7.2 et 10.4). Il est important de noter que tous les acides aminés identifiés comme faisant partie du site de liaison de l'ACh [Table 7.1] sont conservés; en particulier les << boucles >> A et C dans leur entièreté [122] sont 100 % identiques entre les deux sous-unités. La contribution des sous-unités 3 et 6 au site de liaison pourrait donc être similaire, et pourrait rendre compte des données pharmacologiques initialement reportées12.1. 12.6.4.4 Implication de 3 Bien que les niveaux d'expression des protéines puissent ne pas être parallèle aux niveaux d'ARNm, la forte expression de 3 dans les neurones positifs pour la TH supporte l'idée que cette sous-unité contribue à la réponse des neurones catécholaminergiques à la nicotine. A ce stade il n'existe pas de preuve directe de l'existence d'oligomères contenant 6 et 3 dans ces cellules. Cependant, la co-localisation extensive des sous-unités 6, 2 et 3 indique que la formation d'un oligomère contenant ces trois sous-unités pourrait rendre compte de la libération des catécholamines par la nicotine. 12.7 Conclusion La présence de forts niveaux d'ARNm codant la sous-unité 6 dans les neurones contenant de la dopamine pourrait être d'une importance physiologique considérable, puisque la libération de dopamine induite par la nicotine est supposée être à la base de ses propriétés locomotrices et addictives [54,312,66]. Plus généralement, il a été postulé que les neurones catécholaminergiques du locus c ruleus et des noyaux A8, A9 et A10 contrôlent directement la dépendance physique aux drogues à accoutumance [88,174,232,295,149]. Le design de drogues dirigées spécifiquement contre les sous-types de récepteur responsables de ces comportements est un challenge important de la neuro-pharmacologie moderne. Afin d'atteindre ce but, la constitution moléculaire exacte de ces récepteurs doit être établie. Nous proposons que des récepteurs 6 2 3 sont des candidats probable pour la médiation de la libération de catécholamines induite par la nicotine. Footnotes ... reportées12.1 Les données présentées dans [130] et [116] sont difficiles à interpréter dans le cadre de la comparaison 3, 6. En effet, dans [130], les auteurs étudient des récepteurs contenant 6gg 4hs et les comparent à 3gg 4gg et 3gg 4hs. Les différences observées entre ces deux derniers récepteurs sont aussi importantes qu'entre eux et le premier. Quant à [116], il rapporte la comparaison entre mais pas 6gg 4gg et 3gg 6gg 4gg 3gg 4gg Next: 13. Fonction de la Up: No Title Previous: 11. Théorie et pratique Nicolas Le Novère 1999-06-19 Next: 13. Fonction de la Up: No Title Previous: 11. Théorie et pratique Sous-sections 12.1 Introduction 12.2 Matériel et méthodes o 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides o 12.2.2 Animaux o 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ 12.2.3.1 Prélavage commun 12.2.3.2 Premier protocole de lavage 12.2.3.3 Second protocole de lavage 12.2.3.4 Troisième protocole de lavage 12.2.3.5 Post-lavage commun 12.2.4 Analyses des préparations histologiques 12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte o 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs o o o o o 12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat 12.3.3 Diencéphale 12.3.4 Mésencéphale 12.3.5 Rhombencéphale 12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes 12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire 12.6 Discussion o 12.6.1 Aspects méthodologiques o 12.6.2 Colocalisations o 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula o 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques 12.6.4.1 Implication de 2 12.6.4.2 4 ne semble pas impliquée 12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que 12.6.4.4 Implication de 12.7 Conclusion 3 3 12. Localisation des ARN messagers codant pour les sous-unités des nAChRs dans le système nerveux [ZOLI M, LE NOVÈRE N, HILL JA, CHANGEUX JP (1995). Developmental regulation of nicotinic ACh receptor subunit mRNAs in the rat central and peripheral nervous systems. Journal of Neuroscience 15 : 1912-1939. LE NOVÈRE N, Zoli M, CHANGEUX JP (1996). Neuronal nicotinic receptor 6 subunit mRNA is selectively concentrated in catecholaminergic nuclei of the rat brain. European Journal of Neuroscience 8 : 2428-2439. Voir aussi: PICCIOTTO MR, ZOLI M, LÉNA C, BESSIS A, LALLEMAND Y, LE NOVÈRE N, VINCENT P, MERLO-PICH E, BRÛLET P, CHANGEUX JP (1995). Abnormal avoidance learning in mice lacking functional high-affinity nicotine receptor in the brain. Nature 374 : 65-67. MARUBIO LM, ARROYO-JIMENEZ MM, CORDERO-ERAUSQUIN M, LÉNAéna C, LE NOVÈRE N, DE KERCHOVE d'EXAERDE A, HUCHET M, DAMAJ MI, CHANGEUX JP. Reduced nicotineelicited antinociception in mice lacking the neuronal nicotinic alpha-4 subunit. Soumis pour publication. ] 12.1 Introduction De nombreuses études d'hybridation in situ ont été réalisées afin de détecter les sous-unités du nAChR présentes dans le système nerveux du rat adulte [134,80,335,334,90,299,284,53] et embryonnaire [161,372]. Cependant, la distribution de l'ARNm d' 6 n'avait pas été décrite en détail. Ici, je présente une étude détaillée de la distribution de l'ARNm d' 6 dans le système nerveux central du rat adulte. Les motifs de marquage, ainsi que la codistribution d' 6 avec les autres sous-unités du nAChR nous amène à penser que les nAChRs contenant cette sousunité contribuent à certains des effets pharmacologiques documentés de la nicotine. 12.2 Matériel et méthodes La méthode d'hybridation in situ avec oligonucléotides radio-marqués est décrite en détail dans [354]. Voir le chapitre 5 pour les fondements théoriques de l'expérience. 12.2.1 Synthèse et marquage des oligo-désoxynucléotides Après analyse des structures secondaires de l'ARNm par le programme STEMLOOP de la suite WISCONSIN du GCG [85], les séquences des sondes sont choisies dans des régions uniques en séquence au sein de la famille, dépourvues de structures secondaires putatives, contenant à peu près 50-60 %GC. Les oligonucléotides furent synthétisés à l'aide d'un synthétiseur d'ADN Cyclone (Biosearch inc.) ou commandés à la société Genset (Paris, France). Les sondes sont décrites dans le tableau 12.1. Tableau 12.1 : Oligodésoxynucléotides utilisés dans cette étude. La température de fusion est calculée pour la condition de lavage la plus stringente, à l'aide de l'équation 3 de [336] (0,1 M NaCl, 0 % formamide) (mais voir le chapitre 5 pour un type de calcul plus exact). Les séquences des sous-unités peuvent être retrouvées dans la Ligand Gated Ion Channel Database (voir le chapitre 2) à l'URL: http://www.pasteur.fr/units/neubiomol/LGIC.html ou à partir de GenEMBL (les d'accession sont dans le tableau) cibl accessi positi e on on Séquence de l'oligodésoxynucléotide %G T C m 2rn L1007 1425 7 5'CTCCAGCATCCATGTTAGTCTCTAGCCAATGGTATG 51 AGGGGCTGA-3' 75, 6 3rn L3162 1040 1 5'CCCAAGTGGGCATGGTGTGTGTGGTTGGAGTTCTAT 53 AGTGCAC-3' 76, 2 3rn L3162 1138 1 5'GCGCCGTAGAAGGTCCTCGTCTTAGGAGTGTCCCCC 62 TCACCACTG-3' 83, 5 3rn L3162 215 1 5'GGACACCTCAAACTGGATGATGACTGGATGGGACA 51 CATTAGCCAC-3' 75, 6 3rn L3162 623 1 5'CTCCCAGTAGTCCTTGCGGTTCATGGAGGAGCCGAT 58 GAGGACCAG-3' 80, 6 4rn M1568 1389 1 5'GCTGCTTCTTGGGAGCTGGGCACATGCTGGACACTC 62 AGGGACCTG-3' 83, 5 5'GAAGTCCAGTTGGTCCACACGGCTGTGCATGCTCA CCAAGTCAAT-3' 4rn 5rn J05231 1076 5'CCGAGATTTAGGTCCAGCCCCACTCTCGGCTTCTTC 56 TCTCTGAGT-3' 79, 2 6rn L0822 325 7 5'TCAAAGTGCACCGTGACGGGATCAGAAACGTTTTC 56 CACTGGCCGG-3' 79, 2 6rn L0822 1575 7 5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACGATTATAAAC 49 ACCCAGAGGA-3' 74, 2 5'TCAAGATGCACCGTGACGGGATCGGAGACATTCTC CACCGGCCGG-3' 6m m 5'GCCCCACAGTTCCAAACACACAGACAATTATAAAT ACCCAAAGGA-3' 6m m 7rr 5'CCTGCACTCAGCTCCACACTGGCCAGGCTGCAGCG 70 CCGAG-34 7rr 5'ATCATGTGTTGGGGAGCAGGCCAAACGGCCACATA 58 CGACCCCAGA-34 2rn L3162 1341 2 5'AGCCAAGCCCTGCACTGATGCAGGGTTGACAAAGC 55 AGGTACATGG-3' 78, 5 2rn L3162 1455 2 5'TCGCATGTGGTCCGCAATGAAGCGTACGCCATCCA 60 CTGCTTCCCG-3' 82 2rn L3162 1315 2 5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCCGCAGGACCT 55 TCACCGAAGA-3' 78, 5 2m 5'TGACAAAGCAGGTACATGGGTCAGCTGCAGGACCT TGGCGGAAGA-3' m 5'TCGCATATGGTCCGCAATGAAGCGTACACCGTCCA CAGCTTCCCG-3' 2m m 3rn J04636 1306 5'CAGAACTCTTTCTCCATCGCTGGCGGGAGTCTGTTT 53 CCTTTTGCC-3' 3rn J04636 431 5'ATTCTTCCGGATTCCAGCGTAATTTTTGGTCTGTGC 42 ATTCCTGCT-3' 69, 4 4rn J05232 1020 5'ACCAGGCTGACTTCAAGACCGGGACGCTTCATGAA 55 GAGGAAGGTG-3' 78, 5 J05232 1259 5'AGCTGACACCCTCTAATGCTTCCTGTAGATCTTCCC 53 GGAACCTCC-3' 78, 5 5'AGGGTGTGCAGCTCATCCTGGACCCCCTCCAAGGA 65 GCGCT-3' 83, 4 4rn TH 77 Les oligonucléotide sont marqués en 3' avec du [35S]-dATP ou du [33P]-dATP (NEN, Boston, MA) et de la désoxynucleotidyl-transférase terminale (Boehringer Mannheim, Allemagne), en suivant les spécifications du fabriquant, à une activité spécifique de 200-600 KBq/pmol. Les sondes marquées sont précipitées dans l'éthanol, séparées des nucléotides non incorporés avec des NucTrap push columns (Stratagene, La Jolla, CA), précipitées de nouveau dans l'éthanol et resuspendues dans de l'eau distillée. 12.2.2 Animaux Six rats Sprague-Dawley adultes (Iffacredo, Lyon, France), pesant 300-400 g, ont été utilisés. Les animaux sont tués par injection d'hydrate de chloral (1 ml de solution à 35 %); le cerveau est rapidement disséqué et congelé dans de la carbo-glace. Les tissus sont stockés à -80 °C jusqu'à la coupe. Plusieurs âges embryonnaires et post-natals ont été examinés: E10, E11, E12, E13, E15, E17, E19, P0 and P4. Les embryons ont été datés selon [250], E0 dénotant le jour suivant l'accouplement et P0 le jour suivant la naissance. Pour chaque stade, entre deux et cinq animaux ont été utilisés. Pour le prélèvement des embryons, les mères ont été anesthésiées à l'éther. 12.2.3 Procédure d'hybridation in situ Les tissus congelés sont coupés au cryostat (coupes de 14 µm d'épaisseur), montés à chaud sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et stockées à -80 °C (moins de 2 semaines). La procédure est mené selon le protocole de [363], modifié selon [372] et le protocole suivant. Brièvement, les coupes sont fixées avec du para-formaldéhyde 4 % durant 5 min à température ambiante, lavées dans du PBS, acétylées, et stockées dans de l'éthanol 80 % à 4 °C. Les coupes sont alors délipidées dans de l'éthanol et du chloroforme (5 min), pré-hybridées durant 2-4 h à 37 °C et hybridées durant 20 h à 37 °C sous des lamelles de parafilm. La composition du milieu de pré-hybridation (et d'hybridation) est: 50 % formamide 0,6 M NaCl 10 mM di-thiothreitol 10 % sulfate de dextran 1 mM EDTA Solution de DENHARDT 1x (50x = o 1 % sérum-albumine bovine o 1 % Ficoll o 1 % polyvinyl-pyrrolidone ) 0,1 mg/ml poly-A (Boehringer Mannheim, Allemagne) 0,5 mg/ml ARNt de levure (Sigma) 0,05 mg/ml ADN de sperme de hareng (Promega, Madison, WI) 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 Les sondes sont ajoutées au mélange d'hybridation à la concentration de 0,55 nM (correspondant à 15 fmol/coupe ou 3000-25000 Bq/30 µl/coupe selon les marquages). 12.2.3.1 Prélavage commun Après retrait du parafilm les coupes sont initialement rincées dans de la solution saline citrate standard (SSC) 2x (0,3 M NaCl, 0,03 M citrate de sodium) à température ambiante (2 fois 5 min). 12.2.3.2 Premier protocole de lavage Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités durant l'ontogenèse. Les coupes sont lavées quatre fois 15 min dans du SSC 2x , 50 % formamide à 42 °C puis deux fois 30 min dans du SSC 1x à température ambiante. 1 mM de di-thiothréitol est ajouté à chaque solution. 12.2.3.3 Second protocole de lavage Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez le rat adulte ainsi que chez les souris recombinées 2-/-. Les coupes sont lavées trois fois durant 15 min dans du SSC 1x à température ambiante, puis 15 min dans du SSC 0,5x à 55 °C (cela dépend des oligonucléotides). Les sondes utilisées dans cette étude ont la même longueur et approximativement le même contenu en GC. Les températures de fusion des différent duplex oligonucléotide/ARNm, calculées en utilisant l'équation 3 de [336], sont similaires dans les mêmes conditions d'hybridation (0,6 M NaCl, 50 % formamide). La température du lavage le plus stringent est égale à la Tm -20 °C (dans 0,01 M NaCl, 0 % formamide), afin de corriger les petites différences de contenu en GC entre les différentes sondes. Nous avons préalablement montré que cette température de lavage donne un rapport signal/bruit optimal, avec un signal spécifique à peu près maximum et un faible signal non-spécifique. Les coupes sont alors rincées 15 min dans du SSC 0,5x à température ambiante. 12.2.3.4 Troisième protocole de lavage Ce lavage a été utilisé durant l'étude de la distribution des sous-unités chez les souris recombinées 4-/-. Les deux étapes de lavage réalisées dans du 0,5x SSC sont désormais réalisées dans du 1x SSC. La température de fusion des différent duplex oligonucléotide/ARNm est désormais calculée selon la méthode décrite au paragraphe 11.3.2. 12.2.3.5 Post-lavage commun Après un court rinçage dans de l'eau glacé, et un gradient d'alcool elles sont séchées et exposées à un film [3H]-Hyperfilm (Amersham) puis à une émulsion photographique (NTB2, Kodak, Rochester, NY). Dans le cas des cerveaux de rats adultes nous avons utilisé un facteur de correction défini au paragraphe 11.4.1 afin de comparer quantitativement différentes expériences. 12.2.4 Analyses des préparations histologiques Deux oligonucléotides ou plus [tableau 12.1] ont été utilisés pour caractériser la spécificité du marquage. Par la suite, un seul oligonucléotide/ARNm a été utilisé durant la cartographie (46, 47, 51, 58, 59, 62, 131 and 133). Chaque niveau anatomique a été analysé au cours d'au moins trois (et jusqu'à cinq) expériences indépendantes. L'analyse des motifs de marquage a été mené à la fois sur les films et les émulsions. Les coupes ont été contre-colorées au bleu de toluidine préalablement à l'identification des structures. Les définitions des aires anatomiques sont basées sur différents atlas, dont [251,250,169,314,292,111]. Une quantification relative des niveaux d'ARNm codant pour les différentes sous-unités dans les noyaux dopaminergiques du mésencéphale a été réalisée sur les autoradiogrammes à l'aide de l'analyseur d'image Vidas (Kontron, Munich, Allemagne). Deux expériences différentes ont été quantifiées. Six niveaux anatomiques ont été analysés dans l'un des cerveaux (Bregma -4,7 à -6,3 mm) et quatre dans l'autre (Bregma -4,8 à -6,1 mm). Après une procédure de seuillage, qui permet la rétention du signal spécifique, le MGV et l'aire retenue sont mesurés. La densité optique intégrée totale TOT est alors calculée à partir de la densité optique intégrée de chaque niveau: Après correction (COR) pour S (pour la sous-unité i, ), les résultats sont exprimés par rapport aux valeurs de 2 ( ) dans chaque expérience. 2 fut arbitrairement choisie comme référence car elle est exprimée partout, de manière relativement homogène dans le cerveau de rat adulte. La détermination des valeurs de Kd et Bmax pour les sondes 11.3.2. 3 est décrite au paragraphe Le comptage des cellules sur les émulsions photographiques a été réalisé au niveau Bregma 5,3 mm. La reconnaissance des neurones est basée sur la contre-coloration des coupes au bleu de toluidine. Deux champs rectangulaires (380x250 µm) sont analysés dans chaque région. Les champs sont localisés dans la SNc et le centre de la VTA. Un neurone est considéré positif quand il est recouvert par une densité de grains au minimum de trois fois la densité du bruit de fond. 12.3 Distribution des sous-unités chez l'adulte 12.3.1 Optimisation de la procédure d'hybridation avec ODNs L'hybridation in situ avec oligonucléotides a été choisi afin de minimiser la reconnaissance croisée des différentes sous-unités du nAChR et de permettre des comparaisons quantitatives entre plusieurs expériences. Pour une discussion générale sur les différentes méthodes d'hybridation in situ et sur les fondements théoriques de l'hybridation des oligonucléotides voir le chapitre 11. Les oligonucléotides peuvent être choisis dans des régions de séquences hautement spécifiques, ce qui n'est pas toujours le cas pour les sondes ARNc. Par exemple, les sondes utilisées dans les études antérieures du nAChR étaient souvent dirigées contre la séquence codante toute entière, et donc contre certaines parties hautement conservées. Afin de produire des sondes plus efficaces, les auteurs les ont souvent hydrolysées en fragments de 50-200 nucléotides, une pratique qui peut engendrer du signal non-spécifique mais également des reconnaissances croisées avec les autres membres de la même famille de gène. L'hybridation in situ avec oligonucléotides est hautement reproductible dans (presque) tous les tissus et avec (presque) toutes les sondes. En effet, le contrôle des paramètres de l'expérience (i.e., concentration de la sonde, activité spécifique et température de fusion) permet la détermination de caractéristiques quantitatives comme le KD apparent et le Bmax. Pour la sous-unité 3, une étude de saturation a été menée sur l'habénula médiale avec plusieurs sondes. Dans les conditions expérimentales décrites plus haut (en particulier, le lavage le plus stringent effectué à Tm - 20 degC dans 0,5x SSC durant 15 min), la sonde 46 donne un KD de 0,075 nM avec un Bmax de 0,13 fmol/cm2 et la sonde 109 donne un KD de 0,17 nM avec un Bmax de 0,19 fmol/cm2 . De manière générale, nous avons vérifié que dans cette étude les différences de marquage obtenues avec les différentes sondes dirigées contre le même ARNm étaient < 50 %. 12.3.2 Distribution des ARNms codant 2-7 et 2-4 dans le cerveau de rat Le signal pour l'ARNm codant 6 est détecté dans un nombre restreint de structures [résumé dans le tableau 12.2]. L'intervalle d'intensité du marquage varie énormément, de difficilement détectable à très fort. Le télencéphale ne montre aucun signal spécifique [Figure 12.1]. Figure 12.1 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des ARNm d' 2 (S=4687), (S=4092), 3 (S=2710) et 3 (S=2568), 4 (S=5071), 5 (S=1845), 6 (S=1623), 2 4 (S=1563) sur des coupes adjacentes de télencéphale. Bregma +1,70 mm. Dans toutes les autres subdivisions principales du CNS, quelques noyaux montrent des niveaux détectables d'ARNm 6. Tableau 12.2: Distribution et quantification relative des ARNm codant pour les sous-unités dans le cerveau de rat. (+) difficilement détectable, + signal faible, ++ signal modéré, +++ signal fort. 2 3 4 5 6 7 2 3 4 Télencéphale bulbe olfactif + ++ + ++ - ++ ++ - + noyau olfactif antérieur - (+) ++ (+) - ++ ++ - - isocortex layer II-III - - + + - + ++ - - layer IV - + + + - + ++ - - layer V - - ++ + - ++ ++ - - layer VI - - ++ ++ - ++ ++ - - formation hippocampale - + + + - +++ ++ - - striatum - - - - - - + - - septum - - + - - + + - - noyau supra-optique - - + - - +++ + - - noyau ventro-médial - - + - - - ++ - - reste - - + - - - + - - - +++ - ++ - - + - +++ habénula médiale partie dorsale - - + - - - ++ - - habénula médiale partie ventro-latérale - +++ ++ + - - ++ - +++ habénula médiale partie ventro-médiale - +++ (+) - (+) - ++ +++ +++ habénula latérale - - - - (+) - + + - noyau réticulé - - + - ++ - ++ + - noyau antéro-ventral - + +++ - - - +++ - - reste - - +++ - - - +++ - - noyaux dopaminergiques - (+) ++ ++ +++ - ++ +++ - noyau mésencéphalique du trijumeau - - + - + - ++ +++ - partie apicale ++ - - ++ - + - - - partie centrale - - - - + + (+) - - partie latérale - - - - + + (+) - - partie rostrale ++ - - ++ - + - - - hypothalamus Diencéphale glande pinéale habénula thalamus Mésencéphale n. interpédonculaire Rhombencéphale noyaux vestibulaires - - + + - ++ + - - cervelet - + - + - - + + + locus coeruleus - (+) - - +++ - ++ +++ (+) noyaux moteurs - + + + - - ++ - - noyau du tractus solitaire - ++ (+) + - - ++ - ++ area postrema - ++ ++ + - - ++ - + rétine - + + ? ++ ? ++ ++ + ganglions autonomes - +++ - ++ - ++ ++ - +++ ganglions somato-sensoriels - (+) - - + - +++ ++ - ganglions vestibulocochléaires - - ++ ? ++ ? ++ ++ - Périphérie 12.3.3 Diencéphale Dans le diencéphale, trois noyaux sont marqués par les sondes différentes. 6, mais avec des intensités Le noyau thalamique réticulé montre un gradient à la fois rostro-caudal et dorso-ventral du marquage 6 [Figure 12.2]. L'intensité du marquage est modeste, même dans la partie rostrodorsale. 2 et 4 sont également présentes dans le noyau réticulé bien qu'à des niveaux moindres. La sous-unité 3 est présente mais est difficilement détectable avec un seul oligonucléotide. En revanche si l'on place deux sondes en tandem, le marquage apparaît nettement. Figure 12.2 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des ARNm (S=3000), d' 2 (S=4687), 3 (S=2568), 4 (S=46848), 5 (S=1845), 6 (S=1623), 2 3 (l'expérience qui est représentée résulte de l'utilisation groupée de deux sondes. Le facteur S est donc difficilement calculable et de plus, le bruit de fond est très élevé) et (S=1563) sur des coupes adjacentes de diencéphale antérieur. Bregma -1,4 mm. 4 Le marquage 6 est restreint à une petite partie de l'habénula médiale [Figure 12.3], dans quelques cellules longeant le ventricule. Cette distribution correspond à celle de Cependant, l'intensité du marquage 3. 3 est plus forte. La distribution de l'ARNm d' 6 (ou de 3) semble complémentaire de celle d' 4. Au contraire, le marquage pour 3 et 4 est détecté à des niveaux très forts à travers toute la partie ventrale du noyau, alors que le marquage 5 est restreint à la partie ventro-latérale du noyau et celui de niveaux modérés dans tout le noyau. 2 est présent à des Dans le noyau de l'habénula latérale, nous détectons une faible marquage pour pour 2 et 6 ainsi que 3. Figure 12.3 : panneaux supérieurs, photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des sous-unités 3 (S=3469), 4 (S=4010), 5 (S=2735), 6 (S=3227), 2 (S=4092), 3 (S=2710) et 4 (S=3617) sur des coupes adjacentes de noyau habénulaire. Les têtes de flèche et les flèches indiquent l'habénula médiale et latérale, respectivement. Note: A cette échelle, le marquage 6 est difficilement détectable. panneaux inférieurs, micro-photographies en fond noir d'émulsion montrant la distribution d' 3 (S=15462), d' 4 (S=7953), d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes adjacentes d'habénula médiale. La contre-coloration au bleu de toluidine (TB) est reportée dans le dernier panneau de la ligne intermédiaire. Note: Les distributions de sont complémentaires. Bregma -3.3 mm. 6/ 3 et 4 La partie caudale du noyau supra-mammillaire est légèrement marquée par les sondes ainsi que par les sondes 12.3.4 Mésencéphale 5 et 2. Le marquage pour 4 est absent ou très faible. 6 Le mésencéphale présente trois structures contenant du signal spécifique pour l'ARNm d' 6. Les noyaux dopaminergiques du mésencéphale expriment une grande variété d'ARNm codant les sous-unités du nAChR[Figure 12.6]. Le marquage pour 6 est très fort dans la substance noire (A9), pars compacta (SNc), la VTA (A10) et l'aire rétrorubrale (A8) [Figure 12.4]. Figure 12.4 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution de l'ARNm d' 6 (S=1623) à 8 niveaux (bregma -4,8, -5,2, -5,3, -5,7, -6,1 et -6,4 mm) du mésencéphale ventral. Les têtes de flèche, les flèches et les doubles têtes de flèches indiquent respectivement l'aire tegmentale ventrale, la substance noire pars compacta et le noyau interpédonculaire. Des cellules dispersées montrant un marquage de forte intensité pour 6 sont également présentes dans la zone péri-ventriculaire mésencéphalique et dans la substance noire pars reticulata (SNr), correspondant peut-être au système dopaminergique péri-ventriculaire et aux neurones dopaminergiques de la SNr. Les neurones de la SNc et de la VTA sont marqués de manière homogène. La sous-unité très importants [Figure 12.5]. 3 est détectée à des niveaux plus faibles bien que toujours Figure 12.5 : Microphotographies en fond noir d'émulsion montrant les distributions de l'ARNm d' 6 (S=1857) et de 3 (S=3512) sur des coupes adjacentes de SNc et VTA. Note: les distributions très similaires des deux ARNm dans ces régions. Bregma -5,3 mm. Barre d'échelle µm. Abréviations: D = dorsal, L = latéral. Afin de déterminer si les ARNms des sous-unités 6 et 3 sont localisés dans les cellules dopaminergiques, nous avons compté les neurones marqués par les sondes dirigées contre les deux sous-unités du nAChR ainsi que celle dirigée contre la tyrosine hydroxylase (TH), l'enzyme de biosynthèse des catécholamines, après contre-coloration des coupes avec du bleu de toluidine. Approximativement le même pourcentage de neurones (80%) de la SN et de la VTA contiennent du marquage spécifique pour les ARNm d' 6, de 3 et de la TH [Table 12.3]. Tableau 12.3 : Décompte des neurones positifs pour la TH, 6 et 3 dans la SNc et la VTA. Les résultats (moyenne de deux comptage par marquage ±SD) sont exprimés en pourcentage du nombre total de neurones. SNc Tyrosine hydroxylase VTA 76,6 ± 2,3 86,4 ± 1,2 6 83,8 ± 2,3 80,9 ± 1,8 3 83,4 ± 2,3 83,0 ± 3,4 Cela montre qu'au moins 50 % des neurones TH+ (c.-à-d. dopaminergiques) contiennent également les arnm d' 6 et de 3. Cependant, le recouvrement au niveau régional des zones marquées par les différentes sondes suggère que les trois ARNm sont présents dans la même population neuronale. Du signal pour les ARNm d' 4, 5 et 2 est également visible dans les noyaux dopaminergiques, mais à des niveaux plus modérés. [Figure 12.6]. Figure 12.6 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des \textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623), 2 (S=3000), 3 (S=1828) et 4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de mésencéphale ventral. Les têtes de flèche et les flèches indiquent respectivement la substance noire, pars compacta, et la VTA. Les petites croix indiquent un morceau de cervelet qui a migré accidentellement vers la partie ventrale du cerveau durant la congélation. Bregma -5,6 mm. 12.3.5 Rhombencéphale Dans le rhombencéphale, le locus c ruleus est le seul noyau marqué par les sondes 6 (Figure 12.7). L'intensité du marquage est extrêmement forte, au même niveau que celle des cellules dopaminergiques du mésencéphale. Les ARNm de plusieurs autres sous-unités sont trouvé dans ce noyau, 2 et difficilement détectables. 3 à des niveaux modérés, 3 à un faible niveau, 4 et 5 Figure 12.7 : Photographies en fond clair d'autoradiogrammes montrant la distribution des \textsc{arn}ms d' 2 (S=4687), d' 3 (S=2469), 4 (S=4648), 5 (S=4179), 6 (S=1623), 2 (S=3000), 3 (S=1828) et 4 (S=4060) sur des coupes adjacentes de rhombencéphale. 12.4 Distribution des sous-unités dans le cerveau des souris recombinantes Des lignées de souris n'exprimant plus les sous-unités 2 [256] et recombinaison homologue. Dans les souris dont le gène codant 4 ont été engendrées par 2 a été inactivé, L'hybridation in situ montre une diminution du signal 2 de moitié chez les hétérozygotes et une disparition totale chez les mutantes homozygotes [Figure 12.8]. L'hybridation in situ des ARNms codant les autres sous-unités ne montre aucune différence significative entre les animaux 2+/+ et 2-/-. Figure 12.8 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris sous-unités 4 et 2-/-. L'expression des 4 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et homozygotes. Bregma -2 mm Dans le cerveau des souris 4-/-, une sonde dirigée contre la délétion du gène 4 ne donne plus aucun signal (comme pour les souris 2-/-, le signal est diminué de moitié dans le cerveau des animaux hétérozygotes) [Figure 12.9]. En revanche, avec une sonde dirigée contre une partie du gène en 3' de la délétion, on peut noter une persistance du marquage. Cela montre que le messager est toujours présent même si il n'y a plus formation de protéine fonctionnelle. Aucune modification d'expression significative des sous-unités non-recombinées n'est décelable dans le cerveau de ces souris. Figure 12.9 : Distribution des sous-unités dans le cerveau de souris 4-/-. L'expression des sous-unités 3,6 et 2 n'est montrée que dans les cerveau des souris sauvages et homozygotes. Deux images de l'hybridation in situ d' 4 dans le cerveau des homozygotes sont montrées. L'image supérieure a été réalisée avec une sonde reconnaissant une partie du transcrit en aval de la délétion, alors que l'image inférieure a été réalisée avec une sonde complémentaire de la délétion. Bregma -2 mm, excepté pour 6: Bregma -3 mm. 12.5 Distribution des sous-unités durant le développement embryonnaire La distribution des ARNm codant les différentes sous-unités varie d'une sous-unité à l'autre mais est bien définie pour chaque sous-unité. Michele ZOLI et moi-même avons observé la mise en place de cette distribution durant le développement embryonnaire et peri-natal. Deux sous-unités ( 3 et 4) ainsi que deux sous-unités ( 2 et 4) ont été particulièrement étudiées. L'expression observée apparaît très tôt (dès le début de la neurogenèse), et suit la différenciation neuronale . Le marquage est réparti uniformément dans les neurones postmitotiques. Puis, alors que 4 et 2 restent exprimées très largement mais à un niveau modéré, l'expression de 3 et 4 se restreint à quelques noyaux particuliers où elle atteint des niveaux très élevés. La mise en place de l'expression de la sous-unité 4 suit la progression caudo-rostrale des terminaisons cholinergiques. Une distribution de type adulte des transcrits est acquise dès le début de la vie postnatale. Trois principaux motifs développementaux ont été identifiés: (1)- Dans la majorité des cas étudiés (rhombencéphale, moelle épinière [Figures 12.10 et 12.11], ganglions somato-sensoriels[Figure 12.12]) les quatre sous-unités sont initialement exprimées puis, durant le développement prénatal subséquent, le niveau d'expression de certaines de ces sous-unités devient progressivement indécelable ( 4 dans les ganglions autonomes, 3 et 4 dans la majeure partie du cerveau et la moelle épinière, les ganglions des racines dorsales, 3, 4 et 4 et 4 dans 4 dans les ganglions somato-sensoriels). Figure 12.10 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 13 et 15 du rat. Les barres d'échelle mesurent 1 mm. Panneaux supérieurs, les têtes de flèches pointent les ganglions des racines dorsales. Panneaux médians, les flèches pointent le ganglion du trijumeau et les têtes de flèches les ganglions des racines dorsales. Panneaux inférieurs, Les flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le ganglion sphénopalatin et les doubles têtes de flèches le ganglion otique. Btel: télencéphale basal, Cx: cortex, Di: diencéphale, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Rh: rhombencéphale, SC: moelle épinière (spinal cord), Te: télencéphale. Figure 12.11 : Expression de 3, 4, 2 et 4 aux jours embryonnaires 17 du rat. Coupes coronales, Les flèches pointent le ganglion du trijumeau, les têtes de flèches pointent le ganglion otique et les doubles têtes de flèche l'habénula médiale. La barre d'échelle mesure 1 mm. Coupes sagitales, les petites flèches pointent l'épiphyse, les grosses flèches le noyau ventro-médial de l'hypothalamus, les têtes de flèche l'habénula médiale et les doubles têtes de flèches le ganglion sympathique lombaire. Btel: télencéphale basal, Cx: cortex, Hy: hypothalamus, Me: mésencéphale, MO: medulla oblongata, Po: pons, Th: thalamus. Figure 12.12 : Expression de 3, 4, 2 et 4 dans les ganglions périphériques. La barre d'échelle mesure 100 µm. Les flèches pointent le ganglion glosso-pharyngé inférieur, les têtes de flèches le ganglion glosso-pharyngé supérieur et les têtes de flèche doubles le ganglion cervical supérieur. 2 est présent partout, 4 nulle part et 3 comme 4 sont présents dans les ganglions autonomes mais pas dans le ganglion somato-sensoriel. (2)- Certaines sous-unités sont initialement exprimées et le reste durant tout le développement ( 3, 4, 2 et 4 dans la rétine, 3, 2 et dans les ganglions vestibulo-cochléaires). 4 dans les ganglions autonomes, 4 et (3)- Dans le cas du néo-cortex, 3 et 2 sont initialement exprimées (E12-E13) puis disparaît (E15) et est remplacée par 4 (E17-E19)[Figure 12.13]. 2 3 Figure 12.13: Expression d' 3, 4 et 2 dans le cortex du rat aux jours embryonnaires E13, E15 et E19. CP: cortical plate, cx: cortical neuroépithélium, SP: cortical subplate, ICx: intermediate cortical layer 12.6 Discussion Depuis le premier report de l'existence de la sous-unité 6 [180] la connaissance de la signification fonctionnelle de cette sous-unité n'a que peu progressé. Ici nous montrons que l'ARNm d' 6 est restreint à quelques noyaux spécifiques dans le cerveau. La quantité d'ARNm 6 est particulièrement haute dans les noyaux catécholaminergiques (les noyaux A6, A8, A9 et A10) et modérée ou faible dans le noyau réticulé du thalamus, l'habénula latérale et médiale et le noyau supra-mammillaire. Cette distribution correspond à celle mentionnée dans le tableau de [90] et au marquage immuno-cytochimique observé par [136]. En plus, d'autres noyaux sont positifs, comme le noyau interpédonculaire et le noyau mésencéphalique du trijumeau. Au contraire de ce qui est rapporté par [135], aucun marquage n'a été détecté dans l'aire prétectale antérieure. 12.6.1 Aspects méthodologiques Pour cette étude nous avons utilisé l'hybridation in situ avec oligonucléotides, une méthode largement utilisée dans le champ des LGIC [221,366,218,219,259,260,341,353,372], bien que différente de la méthode avec ARNc qui a été utilisée pour cartographier les sous-unités du nAChR dans le CNS des mammifères adultes [335,281,334,80,90,284,299]. De manière générale, nos études réalisées avec oligonucleotides sont en bon accord avec les études précédentes réalisées avec ARNc (avec quelques exceptions notables, comme 5 dans l'habénula médiale). Cependant une différence claire avec les résultats précédents est observée quand on s'intéresse à 3 et 6. En particulier, nous voyons un fort signal 6 et presque pas de signal 3 dans quelques régions précédemment supposées riches en ARNm 3, à savoir les noyaux catécholaminergiques [335]. Cette différence ne peut être expliquée sur la base des sensibilités différentes des deux types de méthodes, puisque dans la plupart des structures du cerveau notre cartographie d' 3 correspond avec les précédentes [335]. 3 et 6 sont phylogénétiquement très proches (voir le chapitre 9). Les séquences de leurs ARNm sont très proches. Puisque, selon l'étude présentée ici, 6 est presque 20 fois plus exprimée qu' 3 dans certaines régions, il est possible qu'une sonde ARNc dirigée contre la séquence entière d' 3 révèle également les ARNm d' 6 (particulièrement si la sonde a subi une hydrolyse alcaline avant l'expérience). 12.6.2 Colocalisations Nos travaux montrent que les ARNm d' 6 et 3 possèdent une distribution similaire dans le cerveau. Quelques expériences exploratoires indiquent que cela serait également le cas en périphérie. Par exemple, dans la rétine post-natale et dans les ganglions somato-sensoriels (comme le ganglion du trijumeau), co-localisation d' 6 et de 6 et 3 sont tous les deux détectés. Dans le cerveau, la 3 est réalisée dans la plupart de leur zones d'expression [Tableau 12.2]. Le marquage pour 3 est parfois d'une intensité inférieure (noyau thalamique réticulé, noyau interpédonculaire, locus c ruleus, noyaux dopaminergiques) et parfois d'une intensité supérieure (habénula médiale, noyau mésencéphalique du trijumeau) à celui d' 6. Une exception est le noyau supra-mammillaire où l'ARNm d' 6 est détecté mais non celui de Dans ce noyau, le marquage pour 6 est très bas, et les niveaux d'ARNm de être au-dessous du seuil de détection de la technique. 3. 3 pourraient La sous-unité 6 possède tous les résidus qui ont été identifiés comme faisant partie de composant principal du site de liaison (voir le tableau 7.1 et l'alignement 7.2). La sous-unité 6 est donc une << vrai >> sous-unité , qui peut être engagée dans la liaison de l'ACh. In vitro, 6 de poulet forme des récepteurs fonctionnels avec la sous-unité 4 d'homme [130] ou de poulet[116]. La colocalisation extensive d' 6 et de 3 rapportée ici, supporte l'idée que ces sous-unités pourraient s'assembler au sein d'hétéro-oligomers. Une possibilité est que 3, comme 5, soit un troisième type de sous-unité (en sus des types et << standards >>). Ces sous-unités, comme la sous-unité 1 musculaire ne participeraient pas au site de liaison de l'ACh et n'existeraient donc que dans des hétéro-oligomères comportant au moins 3 sous-unités différentes (voir les paragraphes 7.2 et 9.4.2). Dans le système nerveux, des nAChRs ont été identifiés composés de et 4 2 5 [63] 3 4 5 [63,330,297] 3 2 4 5 [62]. De manière similaire, on peut faire l'hypothèse qu'il pourrait exister dans le système nerveux des récepteurs comme 6 2 3. 12.6.3 Les ARNms des sous-unités du nAChR dans les noyaux de l'habénula Dans l'habénula latérale, la distribution de l'ARNm d' 6 est très similaire à celle des ARNm de 2 et 3, bien qu'il n'y ait aucune preuve directe de leur colocalisation dans les mêmes cellules. Comme l'habénula latérale envoie des projections à la substance noire [154], et inversement celle-ci envoie des projections à l'habénula latérale [305,196], des nAChRs composés de 6 2( 3) pourraient être présents dans les deux branches de cette voie bidirectionnelle. Si l'on considère les sous-unités du nAChR, l'habénula médiale peut être subdivisée en trois sous-noyaux: dorsal, ventro-médial et ventro-latéral [Figure 12.14]. 6 et 3 sont localisées dans le sous-noyau ventro-médial, avec un gradient de la ligne médiane vers la partie latérale (voir aussi [80]). La distribution plus restreinte d' 6 relativement à 3 peut être due à une moindre quantité d'ARNm, et donc à un niveau plus faible du signal. Le seuil de sensibilité couperait alors le gradient d'expression plus près de la ligne médiane. Goldner et coll. [136] ont également trouvé par immuno-cytochimie la sous-unité 6 dans l'habénula médiale. La seule photographie présentée par les auteurs montre 6 localisée dans la région ventromédiale. La distribution de l'ARNm d' 4 est complémentaire de celle d' 6 et 3. La sousunité 4 est détectée à un niveau très faible dans le sous-noyau ventro-médial, à un niveau intermédiaire dans le sous-noyau dorsal et à un niveau important dans le sous-noyau ventrolatéral (voir aussi [335,157]). Contrairement à [334], nous trouvons un marquage pour l'ARNm d' 5 dans l'habénula médiale. Sa distribution est restreinte au sous-noyau ventro-latéral. Un marquage fort pour 3 et 4 est détecté dans les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral équivalent à celui décrit dans [335,90,157]. Le marquage pour 2 est présent de manière à peu près uniforme dans l'ensemble du noyau. Les sous-noyaux ventro-médial et ventro-latéral correspondent aux deux tiers ventraux de l'habénula médiale, qui sont formés de neurones cholinergiques [192,357]. De fait, la distribution des sous-unités 3 et 4 se superpose à celle des neurones exprimant la choline acétyl-transférase (voir les Figures 2 et 8b de [238]). Le sous-noyau ventro-latéral semble plus riche en choline acétyl-transférase que le sousnoyau ventro-médial [163]. Finalement, le sous-noyau dorsal contient de forts niveaux de substance P [64]. Figure 12.14 : Schéma de la distribution des sous-unités du nAChR dans l'habénula médiale. Les combinaisons de sous-unités pour lesquelles des témoignages électrophysiologiques (en ovocytes après expression hétérologue) et, pour certaines, biochimiques (coprécipitation à partir de tissu natif) ont été obtenue sont indiquées pour chaque sous-noyau. La localisation des récepteurs putatifs 6 et 2 ou 4 avec ou sans 3 est également représentée (encadrée). D, dorsal; VL, ventro-latéral; VM, ventro-médial. L'habénula médiale était supposée, pour ce qui est du nAChR, être un noyau homogène, contenant plusieurs isoformes différentes de récepteur dans les même cellules. Les différents courants nicotiniques enregistrés à partir de neurones habénulaires étaient donc assignés à de multiples isoformes de récepteurs présentes dans une classe de cellules homogènes [224,225,61]. Les données présentées plus haut, en particulier celles montrant la ségrégation des ARNm d' 4/ 5 et d' 6/ 3, suggèrent que les isoformes de nAChR sont, au moins partiellement, cellule-spécifiques. Sur la base des résultats présents et antérieurs (en cultures de cellules transfectées et par immuno-précipitation) on peut inférer les isoformes qui pourraient être présentes dans les différents sous-noyaux [Figure 12.14]. 12.6.4 Les ARNms des sous-unités dans les noyaux catécholaminergiques Le locus c ruleus et les noyaux A8, A9 et A10 présentent les plus forts niveaux d'expression de l'ARNm d' 6 dans le CNS. Ces noyaux contiennent de forts niveaux de TH et sont responsables de la majeure partie de l'innervation noradrénergique et dopaminergique du cerveau. L'action potentiatrice de la nicotine sur la libération de dopamine [347,132,9] est transmise par les récepteurs localisés sur les terminaisons (stimulation rapide), et par les récepteurs localisés sur les soma dopaminergiques du mésencéphale (stimulation à long terme). Les deux ensembles de récepteurs pourraient être identiques ou différents. 12.6.4.1 Implication de 2 L'ARNm codant 4 n'est pas détecté dans les cellules dopaminergiques [91,90,185]. [257] ont montré qu'aucun courant nicotinique somatique ne persistait dans les cellules dopaminergiques des souris 2-/-. [55] ont clairement montré l'existence de récepteurs à haute affinité pour la nicotine en autoradiographie dans les soma dopaminergiques et dans les terminaisons. [256] ont montré que l'inactivation de la sous-unité 2 entraîne une disparition complète des récepteurs à haute affinité pour la nicotine en autoradiographie. Au moins une partie, si ce n'est la totalité des nAChRs de la cellule dopaminergique nécessite donc la sous-unité 12.6.4.2 2. 4 ne semble pas impliquée La pharmacologie de l'accroissement de libération de dopamine entraîné par la nicotine indique que le(s) récepteur(s) impliqué(s) n'est pas 4 2 [263,137,285]. Dans les synaptosomes striataux, Grady et coll. [137] ont trouvé un ordre d'efficacité cytisine = nicotine > DMPP=ACh. Dans des tranches de striatum, [285] ont trouvé l'ordre d'efficacité cytisine > nicotine = DMPP. Ces spectres pharmacologiques ne correspondent pas aux propriétés des récepteurs contenant 4 2 [203]. De plus, 100 nM de bungarotoxine neuronale bloque la potentiation endogène de la libération de dopamine par la nicotine [296]. A cette concentration, la toxine est capable d'inhiber l'action de 2 [204]. 12.6.4.3 6 est plus probablement impliquée que 3 2 mais pas celle de 4 3 Plus haut nous montrons que le marquage pour 6 est à peu près 20 fois plus intense que celui pour 3 dans les cellules dopaminergiques ainsi que celles du locus c ruleus. Goldner et coll. [136] ont également observé par immuno-cytochimie un fort marquage pour 6 dans les noyaux catécholaminergiques A6,9,10. On peut donc faire l'hypothèse que la pharmacologie observée pour la potentiation de la libération de dopamine résulte d'un récepteur contenant 6. Signalons que Clarke et Reuben [56] trouvent que les caractéristiques pharmacologiques des libérations de dopamine dans le striatum et de noradrénaline dans l'hippocampe diffèrent. On possède peu de données sur la pharmacologie des récepteurs contenant 6. Cependant, l'identité de séquence protéique entre 3 et 6 est très forte (61 % d'identité sur la longueur totale, les différences étant principalement localisées dans le peptide signal et la partie variable de la boucle cytoplasmique, voir les Figures 7.2 et 10.4). Il est important de noter que tous les acides aminés identifiés comme faisant partie du site de liaison de l'ACh [Table 7.1] sont conservés; en particulier les << boucles >> A et C dans leur entièreté [122] sont 100 % identiques entre les deux sous-unités. La contribution des sous-unités 3 et 6 au site de liaison pourrait donc être similaire, et pourrait rendre compte des données pharmacologiques initialement reportées12.1. 12.6.4.4 Implication de 3 Bien que les niveaux d'expression des protéines puissent ne pas être parallèle aux niveaux d'ARNm, la forte expression de 3 dans les neurones positifs pour la TH supporte l'idée que cette sous-unité contribue à la réponse des neurones catécholaminergiques à la nicotine. A ce stade il n'existe pas de preuve directe de l'existence d'oligomères contenant 6 et 3 dans ces cellules. Cependant, la co-localisation extensive des sous-unités 6, 2 et 3 indique que la formation d'un oligomère contenant ces trois sous-unités pourrait rendre compte de la libération des catécholamines par la nicotine. 12.7 Conclusion La présence de forts niveaux d'ARNm codant la sous-unité 6 dans les neurones contenant de la dopamine pourrait être d'une importance physiologique considérable, puisque la libération de dopamine induite par la nicotine est supposée être à la base de ses propriétés locomotrices et addictives [54,312,66]. Plus généralement, il a été postulé que les neurones catécholaminergiques du locus c ruleus et des noyaux A8, A9 et A10 contrôlent directement la dépendance physique aux drogues à accoutumance [88,174,232,295,149]. Le design de drogues dirigées spécifiquement contre les sous-types de récepteur responsables de ces comportements est un challenge important de la neuro-pharmacologie moderne. Afin d'atteindre ce but, la constitution moléculaire exacte de ces récepteurs doit être établie. Nous proposons que des récepteurs 6 2 3 sont des candidats probable pour la médiation de la libération de catécholamines induite par la nicotine. Footnotes ... reportées12.1 Les données présentées dans [130] et [116] sont difficiles à interpréter dans le cadre de la comparaison 3, 6. En effet, dans [130], les auteurs étudient des récepteurs contenant 6gg 4hs et les comparent à 3gg 4gg et 3gg 4hs. Les différences observées entre ces deux derniers récepteurs sont aussi importantes qu'entre eux et le premier. Quant à [116], il rapporte la comparaison entre mais pas 6gg 4gg et 3gg 6gg 4gg 3gg 4gg Next: 13. Fonction de la Up: No Title Previous: 11. Théorie et pratique Nicolas Le Novère 1999-06-19