L`apoptose
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1 L'apoptose I) Introduction 1) La nécrose 2) L’apoptose II) Changement structuraux de l’apoptose 1) Mise en évidence des cellules apoptotiques 1) Techniques morphologiques standards 2) Cytométrie en flux 3) Marquage des coupures d’ADN par la terminale transférase 2) Evénements morphologiques tardifs 2.1) Au niveau du cytoplasme 2.2) Au niveau du noyau 2.3) La phagocytose 3) Induction de l’apoptose par les agents externes ou des extraits cellulaires 3.1) Expérience avec des extraits cytoplasmiques 3.2) Induction de l’apoptose par Fas-L 3.3) Rôle des mitochondries dans l’apoptose III) Activation des mécanismes biochimiques 1) Les protéases 2) Les DNAses 3) Modification de la surface cellulaire IV) Régulation de l’apoptose : signaux et effecteurs 1) Différents facteurs 2) Contrôle de l’apoptose 2.1) Gènes suppresseurs de l’apoptose 2.2) Gènes activateurs 2 I) Introduction - Il existe deux modes de mort cellulaire : la nécrose et l’apoptose. 1) La nécrose - La nécrose, accidentelle, survient suite à un dommage causé aux membranes cellulaires ou aux activités biologiques. - La nécrose concerne un groupe de cellules et occasionne des effets sur l’organisme entier, par la libération du contenu cellulaire dans l’espace intercellulaire : réaction inflammatoire. 2) L’apoptose - L’apoptose est une mort cellulaire programmée. - L’apoptose est un ensemble de processus qui touche les cellules individuellement. - Elle s’accompagne de transformations morphologiques modifiant la forme et l’organisation des structures internes. - L’apoptose se déroule en trois phases : induction, phase effectrice, dégradation. II) Changement structuraux de l’apoptose 1) Mise en évidence des cellules apoptotiques 1) Techniques morphologiques standards - Au microscope optique : Par coloration à l’hématoxyline – éosine et fluorochromes, les cellules paraissent plus denses avec des noyaux comportant des mottes très colorées. - Au microscope électronique : Le marquage en surface à l’aide de particules métalliques met en évidence de petits bourgeonnements qui émergent de la surface et un gonflement des mitochondries. Caractéristiques morphologiques de la cellule apoptotique : - Elles ont un volume plus petit. - Le matériel chromatinien est sous forme de masses colorées isolées. - Il existe de nombreux bourgeonnements de la membrane cellulaire. 2) Cytométrie en flux - La cytométrie est une méthode de fractionnement cellulaire qui utilise des techniques de coloration de la cellule permettant de différencier les stades du cycle cellulaire. - En cas d’apoptose, il existe un pic supplémentaire, avant G1 et plus petit que G1. G1 Nb de cellules Cellules apoptotiques G2 3 3) Marquage des coupures d’ADN par la terminale transférase Principe : - L’ADN est le siège de coupures qui surviennent tardivement et qui peuvent être mises en évidence par marquage. - La purification et le fractionnement mettent en évidence des oligomères de nucléosomes, caractéristiques de l’apoptose. 2) Evénements morphologiques tardifs Le premier événement est la perte des contacts avec les cellules voisines. La cellule prend un aspect arrondi. Il y a modification des interactions via les récepteurs membranaires. 2.1) Au niveau du cytoplasme : - Diminution de volume cellulaire : l’apoptose induit une compaction globale. - Réorganisation du cytosquelette, ainsi qu’une activité RNAsique tardive et des mécanismes de protéolyse. - Dans la mitochondrie, il y a formation de pores. 2.2) Au niveau du noyau : - La chromatine se condense et se localise en périphérie du noyau. - La lamina nucléaire est dissociée, dépolymérisée, puis protéolysée. - L’ADN inter nucléosomique est coupé. - Puis, le noyau se fragmente en morceaux entourés de membrane. - Disparition de centres fibrillaires des nucléoles. 2.3) La phagocytose - La cellule entière se retrouve sous forme de nombreux fragments ou corps apoptotiques qui seront phagocytés. - L’apoptose touche des cellules isolées et préserve l’architecture tissulaire. 3) Induction de l’apoptose par des extraits cellulaires ou des agents externes 3.1) Expérience avec des extraits cytoplasmiques - La programmation de la mort cellulaire s’accompagne de la synthèse de facteurs intracellulaires que l'on retrouve dans les extraits protéiques cytoplasmiques S / M. 3.2) Induction de l’apoptose par Fas-L - Fas est une protéine membranaire qui appartient à la famille des récepteurs au TNF, et est présente à la surface de nombreuses cellules comme les thymocytes ou les hépatocytes. - L’injection de Fas-L (le ligand de Fas) ou l'exposition de cellules en culture à des anticorps dirigés contre le récepteur, induit massivement l’apoptose. 4 3.3) Rôle des mitochondries dans l’apoptose - Les remaniements structuraux de la membrane interne entraînent une perte de l’étanchéité de la membrane et par conséquent, la perte du gradient électrochimique des protons. - Les éléments membranaires sont relargués et notamment le cytochrome c et la phosphorylation oxydative ne se fait plus ; il y a fuite de Ca2+ qui induit l'activation des caspases. III) Activation des mécanismes biochimiques 1) Les protéases - L’action des protéases précède celles des DNAses. - La polyADP ribosylpolymérase (PARP), enzyme de réparation, est la première cible de la caspase 3. - Les caspases regroupent une dizaine de protéases synthétisées sous forme inactive qui fonctionnent en cascade d’autoactivation. - Les cibles des caspases sont : l’histone H1, l’actine, la kératine, la lamine, les enzymes du métabolisme de l’ADN ou de l’ARN, Rb, les cyclines de cycle cellulaire. 2) Les DNAses Les DNAses sont présentes dans le noyau et le cytoplasme. Leur activation suit celle des caspases et certaines DNAses sont activées par les caspases. 5 3) Modification de la surface cellulaire Le premier événement est une perte de l’asymétrie de la composition en phospholipides de la membrane, qui est liée à l’activité des caspases. Elle entraîne la reconnaissance par les cellules voisines IV) Régulation de l’apoptose : signaux et effecteurs 1) Différents facteurs Activateurs Absence de facteurs de croissance, tels que NFG, FGF, CSF Absence des hormones Famille du TNF Le facteur de transcription AP-1 Les glucocorticoïdes, le Ca, les rétinoïdes, le NO Inhibiteurs Présence de facteurs de croissance, tels que NFG, FGF, CSF Les hormones, comme ACTH, oestrogènes, androgènes Les cytokines, comme IL2, 4 et 5 Le facteur de transcription NFKB Les éléments de la matrice extra cellulaire 2) Contrôle de l’apoptose 2.1) Gènes suppresseurs de l’apoptose - Le gène Bcl 2 est un gène suppresseur qui empêche l’apoptose induite par divers mécanismes : irradiation, glucocorticoïdes, anticorps anti CD3 dans le thymocyte. - Ainsi, dans certaines cellules cancéreuses, le gène Bcl 2 est surexprimé et les cellules échappent à la mort cellulaire. - La tyrosine kinase abl peut empêcher l’apoptose induite par la déplétion en facteurs de croissance. 2.2) Gènes activateurs - ICE (interleukin 1 conversion enzyme) est inhibée par Bcl 2. - Myc induit l’apoptose. - P 53 bloque le cycle en G0 et entraîne l’apoptose.
