ÉTUDE des étapes précoces du cycle DE réplicatiON du virus d

GAËL VIDRICAIRE
ÉTUDE DES ÉTAPES PRÉCOCES
DU CYCLE DE RÉPLICATION DU VIRUS
D’IMMUNODÉFICIENCE HUMAINE DE TYPE 1
DANS LES CELLULES TROPHOBLASTIQUES :
Vers une compréhension de la transmission materno-fœtale
Thèse présentée
à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en microbiologie-immunologie
pour l’obtention du grade de Philosophiæ doctor (Ph.D.)
BIOLOGIE MÉDICALE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2006
© Gaël Vidricaire, 2006
ii
Résumé
Plus de deux millions d’enfants dans le monde vivent actuellement avec le virus
d’immunodéficience humaine de type 1 (le VIH-1). De plus, les femmes, particulièrement
celles en âge de procréer, sont plus vulnérables à cette infection. Or, 90% des infections par
ce rétrovirus chez l’enfant sont attribuables à la transmission de la mère à l’enfant (TME).
Quoique des traitements antirétroviraux soient disponibles pour la prévenir, seulement une
infime proportion des femmes séropositives y a accès encore aujourd’hui. On estime donc
que la transmission verticale du VIH-1 est un problème de santé public alarmant, non
seulement pour les générations d’aujourd’hui, mais aussi pour celles de demain.
La contamination fœtale est l’une des voies par laquelle la TME peut se produire.
Cependant, les mécanismes qui y sont associés demeurent peu connus, particulièrement en
ce qui concerne l’infection directe des trophoblastes, éléments structuraux du placenta. Afin
d’éclaircir ce sujet, nous avons étudié, dans cette thèse, les évènements précoces du cycle
réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes, première étape conduisant à l’infection d’une
cellule cible.
Nous avons découvert que le mécanisme d’infection des trophoblastes est inhabituel pour
ce rétrovirus. En effet, le VIH-1, au contact de ces cellules, est internalisé par celles-ci et se
retrouve alors dans les endosomes. Nous avons établi que l’endocytose du VIH-1 se fait par
une voie indépendante de la clathrine, des cavéoles et de la dynamine-2, mais requérant
toutefois que le cholestérol membranaire soit libre. Nous avons suivi le parcours
intracellulaire des particules virales et noté qu’elles se rendaient principalement aux
endosomes tardifs, transit contrôlé par les protéines Rab5 et Rab7. Quoique ce transport
entraîne la dégradation d’une grande partie des virions, il est de façon étonnante essentiel à
leur processus infectieux dans les trophoblastes. Finalement, l’accès du VIH-1 au
cytoplasme cellulaire se fait en l’absence des protéines de l’enveloppe virale, la gp120 et la
gp41, suggérant que le virus fusionne dans les endosomes grâce à la machinerie cellulaire
présente. Les données présentées dans cette thèse décrivent donc une nouvelle voie
d’infection pour le VIH-1. La compréhension de ce processus est essentielle si l’on veut
mieux contrôler un jour la transmission mère-enfant du VIH-1 durant la grossesse et/ou
trouver des solutions alternatives aux antirétroviraux existants.
iii
Abstract
More than two million children under fifteen years of age are currently living with the
human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) worldwide and 90% of these infections are
associated with mother-to-child transmission (MTCT) of this retrovirus. Women,
particularly those of child-bearing age, are highly susceptible to HIV-1 infection. In spite of
available antiretroviral treatments to prevent MTCT, only a minority of infected women
have access to these treatments. Hence, vertical transmission of HIV-1 is an alarming
public health issue for both current and future generations.
One of the postulated models for how HIV-1 is transmitted by the mother is foetal
contamination. However, the mechanisms underlying such an event are poorly understood.
In particular, the process whereby HIV-1 may directly infect trophoblasts, the structural
cells of the placenta, is unknown. In this thesis, we have studied the early events associated
with HIV-1 life cycle in trophoblasts, the first step towards infecting a target cell.
Our data demonstrate that the mechanism whereby HIV-1 infects trophoblasts is unusual
for this retrovirus. Upon contact with these cells, HIV-1 is rapidly and massively
endocytosed. We have tracked the step-by-step movements of incoming particles and found
that HIV-1 traffics primarily towards late endosomes, via Rab5 and Rab7. Surprisingly,
although this transit leads to the degradation of the majority of the internalized virions, it is
necessary for HIV-1 to establish a productive infection in these cells. In addition, we found
that endocytosis of HIV-1 in these placental cells relies on a clathrin-, caveolae- and
dynamin-independent pathway that requires free membrane cholesterol. Finally, viral entry
occurs in the absence of the viral envelope glycoproteins, gp120 and gp41, suggesting that
HIV-1 undergoes fusion within the endosomes via the host cell machinery.
Collectively, the data presented in this thesis describe a novel infection pathway for HIV-1.
An understanding of this unique process is essential if we are to learn how to control
MTCT and/or find alternate solutions to existing antiretroviral drugs.
iv
Avant-propos
Le sujet de recherche qu’on m’a proposé au début de mes études doctorales m’a tout de
suite plu. La transmission verticale du VIH-1 est une question qui m’interpellait à la fois
comme femme, mère et chercheure. De plus, il s’agissait d’un nouveau projet pour le
laboratoire, donc tout était à faire. Ceci comportait un certain risque mais également un
beau défi.
Je n’aurais pu accomplir ce travail de recherche seule et je tiens à remercier plusieurs
personnes qui m’ont grandement épaulée. D’abord, mon directeur de thèse, le Dr Michel J.
Tremblay, qui a pris le risque de m’accepter dans son laboratoire alors que je n’avais pas
poursuivi un trajet académique régulier. La rigueur scientifique et les très grandes qualités
de gestionnaire du Dr Tremblay en font un patron exceptionnel. Je tiens aussi à souligner sa
générosité et sa très grande disponibilité. De plus, l’immense liberté qu’il m’a donnée et la
confiance qu’il m’a accordée m’ont été fort précieuses. Bref, j’ai eu la chance d’évoluer
dans un environnement scientifique incomparable.
Je me dois de remercier les Dr Benoît Barbeau et Sachiko Sato pour leurs suggestions, leurs
commentaires et leurs conseils judicieux, tant au plan technique et scientifique que
personnel. Je souligne également l’aide offerte par tous les membres de l’équipe du Dr
Tremblay, dont certains ont déjà quitté son laboratoire, mais avec qui j’ai beaucoup discuté
tout au long de mes études.
Je voudrais aussi souligner toute l’affection et le support moral que m’a prodigués toute ma
famille, particulièrement mon mari, Serge Leclerc, mes enfants, Arnaud et Alexia sans qui
je n’aurais pas su y arriver.
Finalement, je remercie sincèrement les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC)
pour leur support financier tout au long de mes études.
v
Je présente une thèse avec insertion d’articles. Cette thèse inclut les cinq articles suivants :
i)
ii)
iii)
iv)
v)
Vidricaire, G., Tardif, M.R., Tremblay, M.J. The low viral production in
trophoblastic cells is due to a high endocytic internalization of the human
immunodeficiency virus type 1 and can be overcome by the pro-inflammatory
cytokines tumor necrosis factor-α and interleukin-1. (2003) The Journal of
Biological Chemistry; Vol. 278, No. 18, pp. 15832–15841.
Vidricaire, G., Gauthier, S., Tremblay, M.J. HIV-1 infection of human trophoblasts
is independent of gp120/CD4 interactions but relies on heparan sulfate
proteoglycans. (2005). Cet article a été soumis pour publication à la revue
scientifique Journal of Virology.
Vidricaire, G., Imbeault, M., Tremblay, M.J. Endocytic host cell machinery plays a
dominant role in intracellular trafficking of incoming human immunodeficiency
virus type 1 in human placental trophoblasts. (2004) Journal of Virology;
78(21):11904-15.
Vidricaire, G., Tremblay, M.J. HIV-1 infection of human polarized trophoblasts is
associated with internalization via clathrin/caveolae-independent endocytosis and
free cholesterol. (2005) Cet article a été soumis pour publication à la revue
scientifique Traffic.
Vidricaire, G., Tremblay, M.J. Rab5 and Rab7 but not ARF6 govern the early
events of HIV-1 infection in polarized human placental cells. (2005). Journal of
Immunology; 175(10):6517-6530.
Gaël Vidricaire est l’auteure principale de tous ces articles. Les résultats présentés à la
figure 2 de l’article 1 ont été obtenus par Mélanie Tardif, alors que ceux présentés à la
figure 6B de l’article 2 ont été générés par Sonia Gauthier. De plus, pour l’article 3,
Michael Imbeault a effectué la programmation permettant l’analyse des images obtenues
par microscopie confocale par le logiciel Metamorph et a contribué à produire les images
par le logiciel Photoshop. Outre ces trois cas, le design expérimental, l’ensemble des
expériences et la rédaction scientifique de chacun des articles ont été réalisés en totalité par
l’auteure de cette thèse. Michel J. Tremblay en a assuré la supervision scientifique.
Ces cinq articles présentés dans cette thèse correspondent de façon intégrale aux articles qui
ont été soumis pour publication ou, le cas échéant, qui sont déjà publiés.
vi
Table des matières
Chapitre 1.
INTRODUCTION ..........................................................................................1
Section 1 Le virus d’immunodéficience humaine ..............................................................1
1.1
Préambule ...............................................................................................................1
1.2
Historique................................................................................................................2
1.3
Classification du VIH .............................................................................................3
1.4
L’origine du VIH ....................................................................................................4
1.5
Épidémiologie.........................................................................................................5
1.5.1
Statistiques mondiales.....................................................................................5
1.5.2
Féminisation de l’épidémie du SIDA .............................................................8
1.6
Structure et cycle réplicatif du VIH-1...................................................................11
1.6.1
Organisation génomique du VIH-1...............................................................11
1.6.2
Morphologie d’un virus mature ....................................................................11
1.6.3
Le cycle réplicatif du VIH-1.........................................................................14
1.6.3.1 Entrée virale : attachement et fusion.........................................................14
1.6.3.2 Décapsidation et transcription inverse......................................................15
1.6.3.3 Import nucléaire........................................................................................17
1.6.3.4 Intégration nucléaire, transcription et traduction......................................18
1.6.3.5 Assemblage et bourgeonnement ...............................................................19
1.7
Les modes de transmission du VIH ......................................................................21
1.7.1
Relation sexuelle...........................................................................................22
1.7.2
Transmission par le sang...............................................................................22
1.7.3
Transmission materno-fœtale .......................................................................22
1.8
Tropisme viral.......................................................................................................22
1.9
Autres récepteurs cellulaires du VIH-1 ................................................................23
1.9.1
Les lectines de type C : .................................................................................25
1.9.2
Les glycosphingolipides (GSL) ....................................................................26
1.9.3
Les protéoglycanes (PG) : les HSPG............................................................26
1.9.4
Autres molécules d’attachement ...................................................................28
1.10 Cellules cibles de l’infection à VIH-1 ..................................................................29
1.10.1
Les lymphocytes T CD4+ .............................................................................34
1.10.1.1
Mise en contexte ...................................................................................34
1.10.1.2
Particularité du cycle réplicatif .............................................................34
1.10.1.3
Dynamique d’infection des lymphocytes T CD4+ ...............................36
1.10.2
Les cellules dendritiques...............................................................................38
1.10.2.1
Types, propriétés et fonctions...............................................................38
1.10.2.2
Le VIH-1 et les cellules dendritiques ...................................................39
1.10.2.3
Les cellules de Langerhans ...................................................................43
1.10.2.4
Les cellules dendritiques folliculaires...................................................43
1.10.3
Les macrophages...........................................................................................44
1.10.4
Les cellules endothéliales .............................................................................46
1.10.5
Le système nerveux central...........................................................................47
1.10.6
Les cellules épithéliales ................................................................................50
1.10.6.1
Structure et fonctions ............................................................................50
1.10.6.2
Épithéliums génitaux féminins : endocol, exocol et vagin ...................54
vii
1.10.6.3
Épithéliums uro-génitaux masculins : prépuce, gland, verge et
épithélium de l’urètre............................................................................56
1.10.6.4
Tractus gastro-intestinal supérieur et inférieur, rectum et anus............56
1.10.6.5
Épithélium de la cavité orale et du pharynx .........................................59
1.11 La pathogénèse du VIH-1 .....................................................................................60
1.11.1
Histoire naturelle de l’infection à VIH-1......................................................60
1.11.2
Primo-infection et phase aiguë .....................................................................63
1.11.2.1
La transmission .....................................................................................63
1.11.2.2
La dissémination ...................................................................................65
1.11.3
La phase chronique .......................................................................................68
1.12 Autres types cellulaires contribuant à la pathogénèse virale ................................69
1.12.1
Les lymphocytes T CD8+ .............................................................................69
1.12.2
Les lymphocytes T dits «régulateurs» (Treg) ...............................................70
1.12.3
Les cellules NK (Natural Killer Cells) .........................................................71
1.12.4
Les lymphocytes B........................................................................................71
1.12.5
Les mastocytes, basophiles, neutrophiles et érythrocytes.............................72
1.13 Les réservoirs du VIH-1 .......................................................................................73
1.14 Les traitements et les vaccins anti-VIH ................................................................74
1.14.1
Les traitements..............................................................................................74
1.14.2
Les vaccins anti-VIH ....................................................................................75
Section 2 Le placenta........................................................................................................77
2.1
Le développement placentaire ..............................................................................77
2.1.1
Généralités ....................................................................................................77
2.1.2
Formation du placenta ..................................................................................78
2.1.2.1 L’implantation ..........................................................................................78
2.1.2.2 La réaction déciduale ................................................................................80
2.1.2.3 La voie du cytotrophoblaste villeux..........................................................81
2.1.2.4 La voie du cytotrophoblaste extravilleux..................................................84
2.2
La structure du placenta........................................................................................85
2.3
Les fonctions placentaires.....................................................................................87
2.3.1
Les échanges materno-fœtaux ......................................................................87
2.3.2
Fonction endocrine .......................................................................................88
2.3.3
L’immunotolérance.......................................................................................88
Section 3 La transmission verticale des virus...................................................................89
3.1
Les virus transmissibles de la mère à l’enfant ......................................................89
3.2
La transmission verticale du VIH-1......................................................................92
3.2.1
Épidémiologie...............................................................................................92
3.2.2
Traitements et prévention de la transmission verticale.................................93
3.2.3
Facteurs de risque .........................................................................................94
3.2.4
La transmission mère-enfant intra-partum ...................................................96
3.2.5
La transmission mère-enfant in utero ...........................................................97
3.2.5.1 La voie trans-annexielle............................................................................97
3.2.5.2 La voie trans-placentaire...........................................................................98
3.2.5.3 Le rôle des microlésions ...........................................................................98
3.2.5.4 La transcytose ...........................................................................................99
3.2.5.5 L’infection directe des trophoblastes........................................................99
3.2.5.6 Contexte de l’entrée virale dans les trophoblastes..................................101
viii
Section 4 L’endocytose...................................................................................................108
4.1
Mise en contexte .................................................................................................108
4.2
Les mécanismes d’endocytose............................................................................114
4.2.1
La phagocytose ...........................................................................................114
4.2.2
La macropinocytose....................................................................................116
4.2.3
L’endocytose dépendante de la clathrine....................................................118
4.2.4
L’endocytose par les cavéoles ....................................................................123
4.2.5
L’endocytose par les radeaux lipidiques de type cavéolaire.......................126
4.2.6
L’endocytose par les radeaux lipidiques indépendante de la dynamine .....127
4.2.7
L’endocytose indépendante de la clathrine, des cavéoles, des radeaux
lipidiques et de la dynamine .......................................................................................129
4.2.8
Les voies d’endocytose dans les cellules épithéliales polarisées................130
4.3
Le transport intracellulaire : la voie endolysosomale .........................................131
4.3.1
Mise en contexte .........................................................................................131
4.3.2
Les endosomes de triage .............................................................................133
4.3.3
Les MVB/ECV ...........................................................................................136
4.3.4
Les endosomes tardifs.................................................................................138
4.3.5
Les lysosomes .............................................................................................141
4.3.6
Les endosomes de recyclage.......................................................................142
4.4
La voie endolysosomale des cellules épithéliales simples..................................145
Section 5 Les objectifs de recherche...............................................................................148
5.1
Objectifs généraux ..............................................................................................148
5.2
Objectifs particuliers...........................................................................................149
Section 6 Le modèle expérimental utilisé.......................................................................152
Chapitre 2.
PARAMÈTRES DÉFINISSANT LA SUSCEPTIBILITÉ À L’INFECTION
DES TROPHOBLASTES PAR LE VIH-1 ........................................................................156
Section 1 Premier article scientifique .............................................................................156
1.1
Title page ............................................................................................................156
1.2
Résumé................................................................................................................156
1.3
Abstract...............................................................................................................157
Section 2 .............................................................................................................................158
2.1
Introduction.........................................................................................................158
2.2
Material and Methods .........................................................................................162
2.3
Results.................................................................................................................166
2.4
Discussion...........................................................................................................171
2.5
Acknowledgements.............................................................................................175
2.6
References...........................................................................................................176
Section 3 Figure legends.................................................................................................182
Section 4 Tables..............................................................................................................185
Section 5 Figures ............................................................................................................186
Chapitre 3.
LE RÔLE DE LA GP120 ET DE LA GP41 DANS LE CYCLE
REPLICATIF DU VIH-1....................................................................................................195
Section 1 Deuxième article scientifique .........................................................................195
1.1
Title page ............................................................................................................195
1.2
Résumé................................................................................................................196
1.3
Abstract...............................................................................................................196
ix
Section 2 .............................................................................................................................197
2.1
Introduction.........................................................................................................197
2.2
Material and methods..........................................................................................201
2.3
Results.................................................................................................................206
2.4
Discussion...........................................................................................................212
2.5
Acknowledgements.............................................................................................218
2.6
References...........................................................................................................219
Section 3 Figure legends.................................................................................................225
Section 4 Tables..............................................................................................................228
Section 5 Figures ............................................................................................................229
Chapitre 4.
PARCOURS INTRACELLULAIRE DU VIH-1 DANS LES
TROPHOBLASTES ...........................................................................................................237
Section 1 Troisième article scientifique..........................................................................237
1.1
Title page ............................................................................................................237
1.2
Résumé................................................................................................................237
1.3
Abstract...............................................................................................................238
Section 2 .............................................................................................................................238
2.1
Introduction.........................................................................................................238
2.2
Material and Methods .........................................................................................241
2.3
Results.................................................................................................................244
2.4
Discussion...........................................................................................................250
2.5
Acknowledgements.............................................................................................255
2.6
References...........................................................................................................256
Section 3 Figure legends.................................................................................................259
Section 4 Figures ............................................................................................................262
Chapitre 5.
LA VOIE D’ENDOCYTOSE DU VIH-1 DANS LES TROPHOBLASTES ..
....................................................................................................................270
Section 1 Quatrième article scientifique.........................................................................270
1.1
Title page ............................................................................................................270
1.2
Résumé................................................................................................................270
1.3
Abstract...............................................................................................................271
Section 2 .............................................................................................................................272
2.1
Introduction.........................................................................................................272
2.2
Material and Methods .........................................................................................276
2.3
Results.................................................................................................................281
2.4
Discussion...........................................................................................................291
2.5
Acknowledgements.............................................................................................295
2.6
References...........................................................................................................296
Section 3 Figure legends.................................................................................................302
Section 4 Figures ............................................................................................................306
Chapitre 6.
LE ROLE DU RAB5 ET DE RAB7 DANS LES ETAPES PRECOCES DU
CYCLE REPLICATIF DU VIH-1 .....................................................................................314
Section 1 Cinquième article scientifique ........................................................................314
1.1
Title page ............................................................................................................314
1.2
Résumé................................................................................................................314
1.3
Abstract...............................................................................................................315
x
Section 2 .............................................................................................................................316
2.1
Introduction.........................................................................................................316
2.2
Material and Methods .........................................................................................321
2.3
Results.................................................................................................................325
2.4
Discussion...........................................................................................................334
2.5
References...........................................................................................................341
2.6
Footnotes.............................................................................................................346
Section 3 Figure legends.................................................................................................347
Section 4 Tables..............................................................................................................350
Section 5 Figures ............................................................................................................351
Chapitre 7.
DISCUSSION ET PERSPECTIVES..........................................................359
Section 1 .............................................................................................................................359
1.1
Paramètres définissant la susceptibilité à l’infection des trophoblates par le
VIH-1 ..................................................................................................................359
1.2
L’infection des trophoblastes se produit indépendamment de la gp124 et de la
gp41 ....................................................................................................................365
1.3
L’entrée du VIH-1 se produit par endocytose ....................................................366
1.4
Caractérisation de la voie d’endocytose menant à l’internalisation du VIH-1 ...367
1.5
Le parcours intracellulaire du VIH-1 dans les trophoblastes..............................377
1.6
Le rôle de Rab5 et de Rab7 dans l’entrée virale .................................................380
1.7
La fusion virale intra-endosomale ......................................................................387
1.8
La transcytose et le recyclage du VIH-1.............................................................393
1.9
Autres mécanismes de transmission verticale du VIH-1 ....................................400
1.10 L’infection précoce des cellules trophoblastiques ..............................................401
1.11 Modèles expérimentaux de la transmission verticale .........................................404
Section 2 Conclusion ......................................................................................................406
BIBLIOGRAPHIE..............................................................................................................408
xi
Liste des tableaux
Tableau 1
Tableau 2
Tableau 3
Tableau 4
Tableau 5
Tableau 6
Tableau 7
Susceptibilité des différents types cellulaires à l’infection et au transfert du
VIH-1 et molécules d’attachement impliquées.................................................31
Les infections virales transmissibles par la mère à son fœtus/nouveau-né.......91
Sommaire des résultats publiés sur la susceptibilité des trophoblastes à
l’infection par le VIH-1 in vitro......................................................................104
Sommaire des résultats publiés sur l’expression du CD4, du CCR5 et du
CXCR4 par les trophoblastes..........................................................................106
Inhibiteurs de l’endocytose et leurs modes d’action.......................................111
Sommaire des mécanismes d’endocytose et de leurs propriétés ....................112
Comparaison entre les propriétés connues de l’endocytose indépendante de la
clathrine et des cavéoles et de la dynamine et celles de l’endocytose du VIH-1
dans les JAR....................................................................................................375
xii
Liste des figures
Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
Figure 7
Figure 8
Figure 9
Figure 10
Figure 11
Figure 12
Figure 13
Figure 14
Figure 15
Figure 16
Figure 17
Figure 18
Figure 19
Figure 20
Figure 21
Figure 22
Figure 23
Figure 24
Figure 25
Figure 26
Figure 27
Adultes et enfants vivant avec le VIH-1. Estimations fin 2004..........................8
Pourcentage d'adultes (15-49 ans) vivant avec le VIH qui sont de sexe féminin,
1985–2004 ........................................................................................................10
Statistiques et caractéristiques régionales du VIH et du SIDA pour les femmes,
fin 2002 et 2004 ................................................................................................10
Organisation génomique du VIH-1 (A) et morphologie d’un virus mature (B)...
..........................................................................................................................13
Cycle de réplication du VIH-1..........................................................................21
Processus infectieux dans les lymphocytes T CD4+ ........................................38
Comparaison entre un épithélium simple et un épithélium stratifié .................53
Histoire naturelle de l’infection à VIH-1..........................................................62
La primo-infection ............................................................................................67
Diagramme d’un fœtus à terme in utero incluant une vue du placenta ............78
L’implantation de l’embryon dans l’endomètre. ..............................................80
Principaux stades du développement placentaire humain ................................83
Principales voies de différenciation du cytotrophoblaste .................................85
Diagramme de l’organisation des tissus placentaires .......................................87
Mécanismes de transmission transplacentaire du VIH-1................................103
Les mécanismes d’endocytose........................................................................110
L’endocytose classique par les puits de clathrine...........................................122
La voie endolysosomale..................................................................................133
La biogenèse des vésicules intraluminales par les complexes ESCRT ..........138
Schéma d’un endosome tardif.........................................................................141
Les endosomes de recyclage...........................................................................144
Voies de transport endosomal dans les cellules épithéliales polarisées..........147
La culture cellulaire sur cupule avec membrane poreuse de 0,4 μm ..............154
Modèle de recherche et principales techniques expérimentales .....................155
Le transit intracellulaire du VIH-1 par les endosomes EEA1(-) et EEA1(+).383
Le devenir du récepteur de l’EGF, du CMH-II et du VSV dans les MVB/ECV..
........................................................................................................................390
TIR-FM (Total internal reflection fluorescence microscopy) ........................395
xiii
Liste des abréviations
3TC
ADNc
AP-2
APOBEC3G
ARN Pol II
ARNm
ARV
ASLV
AT-2
AZT
CA
Ca2+
CD
CD62L
CDC
CDK9
Cellules NK
CMH-I ou II
CRD
CSF
CSPG
CTLA-4
Ctx
CypA
d4T
DAF
DC-SIGN
DC-SIGNR
ddC
ddI
ddl
DRM
dUTP
EDC
EEA1
EGF
EGFR
ECV
Env
ESCRT-1
FasL
Fc
FcγR
2'-3'-dideoxy-3'-thiacytidine
ADN complémentaire
Adaptor protein 2
Apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G
ARN polymérase II
ARN messager
AIDS-associated retrovirus
Avian sarcoma-leukosis virus
Aldrithiol-2
Azidothymidine
Capside
Calcium
Cluster determinant
L-sélectine
Centers for disease control
Cyclin-dependent kinase 9
Cellules « natural killer »
Complexe majeur d’histocompatibilité de type I ou II
Carbohydrate recognition domain
Colony-stimulating factor
Chondroitine sulfate proteoglycan
Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4
Toxine cholérique
Cyclophiline A
2',3'-didehydro-3'-deoxythymidine
Decay accelerating factor
Dendritic cell (DC)-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3)
grabbing nonintegrin
DC-SIGN related ou L-SIGN
2',3'-dideoxycytidine
2',3'-dideoxyinosine
2’,3’-dideoxyinosine
Detergent-resistant membranes
Deoxyuridine triphosphate
Endocytose dépendante de la clathrine
Early endosome autoantigen 1
Epidermal growth factor
Epidermal growth factor receptor
Endosomal carrier vesicle
Enveloppe
Endosomal sorting complex required for transport
Ligand de Fas
Fragment cristallisable
Récepteurs Fc gamma
xiv
FDA
Food and Drug Administration
FITC
Fluorescein isothiocyanate
GAG
Glycosaminoglicanes
GalCer
Galactosylcéramide
GDP
Guanosine diphosphate
GEEC
GPI-AP enriched early endosome compartments
GFP
Green fluorescent protein
GH
Growth hormone
GHR
Growth hormone receptor
GM-CSF
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
GPI-AP
Glycosylphosphatidylinositol-anchored protein
GSL
Glycosphingolipides
HAART
Highly active antiretroviral therapy
hCG
Human chorionic gonadotrophin
hFcRn
Récepteur Fc humain néonatal
HLA
Human leukocyte antigen
HLA-DR
Human leukocyte antigen D locus-related protein
HMG-I(Y)
High mobility group protein- I(Y)
hPL
Hormone lactogène placentaire
HRP
Horse radish peroxydase
HSP70
Heat shock protein 70
HSPG
Héparane sulfate protéoglycane
Hssh3bp1
Human spectrin SH3-domain binding protein-1
HTLV-1
Human T-cell leukemia virus type-I
HTLV-III
Human T-cell leukemia virus type-3
HUVEC
Human umbilical vein endothelial cells
ICAM-1
Intercellular adhesion molecule-1
iDC
Cellules dendritiques immatures
IgA, G ou M Immunoglobuline A, G ou M
IL-1α ou β
Interleukine 1 alpha ou beta
IL-2
Interleukine 2
IN
Intégrase
INF-γ
Interféron gamma
kDa
KiloDalton
KIR
Killer cell-inhibitory receptor
LAMP-1 et -2 Lysosomal associated membrane protein 1 et 2
LAV
Lymphadenopathy-associated virus
LBPA
Acide bisphosphatidique
LDL
Low density lipoproteins
LFA-1
Leukocyte Function-Associated Antigen-1
LIF
Leukemia inhibitory factor
LTR
Long terminal repeats
LY
Lucifer yellow
M6PR
Récepteur du mannose-6 phosphate
MA
Matrice
MAC-1
Macrophage adhesion molecule-1
M-CSF
Macrophage-colony stimulating factor
xv
mDC
MtβCD
MVB
MVE
NANA
NC
N-CAM
Nef
NF-κB
ONU
PAK
PBMC
PCR
PECAM-1
PGs
PI3K
PIC
pIgR
PR
PtdIns(4,5)P2
PtdIns3P
P-TEFb
Ref1
Rev
RT
SAC
SDF-1
siRNA
shRNA
SLP1
SNARE
SU
TfR
TGF-β
TGN
TIR-FM
TM
TME
TNF-α
Treg
TRIM-5α
Tsg101
UNG2
VCAM-1
Vif
VIH-1 et 2
VIS
Cellules dendritiques matures
Méthyl-β-cyclodextrine
Multivesicular bodies
Multivesicular endosomes
Acide sialique
Nucléocapside
Neural cell adhesion molecule
Negative factor
Nuclear factor kappa-B
Organisation des nations unies
p21-activated kinase
Peripheral blood mononuclear cells
Polymerase chain reaction
Platelet/endothelial cell adhesion molecule-1
Protéoglycanes
Phosphatidylinositol 3-kinase
Pre-integration complex
Récepteur polymérique des immunoglobulines
Protéase
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate
Phosphatidylinositol-3 phosphate
Positive transcription elongation factor b
Restriction factor 1
Regulator of viral expression
Reverse transcriptase
Compartiment subapical
Stromal cell-derived factor-1
Small interfering RNA
Small hairpin RNA
Secretory leukocyte protease inhibitor 1
Soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor attachment protein receptors
Surface
Récepteur de la transferrine
Transforming growth factor beta
Trans Golgi network
Total internal reflection fluorescence microscopy
Transmembranaire
Transmission par la mère
Tumor necrosis factor-alpha
Lymphocytes T dits «régulateurs»
T-cell-receptor-interacting molecule-5α
Tumour susceptibility gene 101 protein
Uracil DNA glycosylase
Vascular cell adhesion molecule 1
Viral infectivity factor
Virus d’immunodéficience humaine de type 1 et 2
Virus d’immunodéficience simienne
xvi
Vpr
Vpu
v-Src
Viral protein R
Viral protein U
Oncogène codé par le virus aviaire du sarcome de Rous
Chapitre 1.
INTRODUCTION
Section 1
Le virus d’immunodéficience humaine
1.1 Préambule
Le SIDA (syndrome d’immunodéficience acquise) est actuellement une des plus
importantes et plus meurtrières épidémies associées à une maladie infectieuse au monde
(436, 449). Malgré l'augmentation du financement de la recherche, le renforcement de
l'engagement politique et les progrès accomplis pour élargir l'accès aux traitements antiVIH, l'épidémie de SIDA ne cesse d’avancer à l’échelle mondiale. Certains pays ayant
baissé la garde voient le nombre de nouvelles infections croître à nouveau. Par exemple,
dans plusieurs pays industrialisés, la découverte de thérapies anti-VIH alimente le mythe
dangereux selon lequel le SIDA serait vaincu (615).
A l’exclusion de l’Amérique du nord et de l’Europe, l'accès aux traitements antirétroviraux
et la prise en charge des autres maladies liées au VIH-1 demeurent limités. Seules 7 % des
personnes qui ont besoin de ces médicaments dans les pays en développement les reçoivent.
Entre cinq et six millions de personnes y mourront au cours des deux prochaines années si
elles ne sont pas placées sous traitement antirétroviral. Bien que ces thérapies suscitent
l'espoir de millions de personnes, l'accès élargi aux médicaments ne pourra pas être
maintenu si le nombre de nouvelles infections à VIH-1 n'est pas nettement réduit. Ainsi, la
prévention est le fondement de la riposte au SIDA. Pourtant à l'échelle mondiale, les
programmes de prévention ne touchent actuellement qu'une personne sur cinq exposées au
risque d'infection à VIH-1 (616).
Dans ce contexte il est reconnu que la recherche portant sur la compréhension du
mécanisme d’infection du VIH-1 est essentielle. En effet, celle-ci constitue la pierre
angulaire pour prévenir l'acquisition et la transmission de nouvelles infections et/ou ralentir
la progression de la maladie. L’objectif principal de cette thèse s’inscrit donc dans ces
priorités puisqu’il porte sur le mécanisme de transmission du VIH-1 de la mère à son
enfant. Nous nous intéressons plus spécifiquement aux étapes qui sous-tendent la
transmission verticale du VIH-1 pouvant se produire in utero.
2
1.2 Historique
La maladie connue aujourd’hui sous le nom de syndrome d’immunodéficience humaine
acquise (SIDA) a été rapportée par les Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
dans la littérature médicale pour la première fois aux États-Unis en 1981. Cette publication
décrivait l’état de cinq jeunes homosexuels mâles souffrant d’immunodéficience sévère
accompagnée d’une rare pneumonie causée par le Pneumocystis carinii (424). D’autres
rapports ont rapidement suivi dans la littérature et en l’espace de quelques mois l’épidémie
avait pris racine. La maladie a d’abord été observée chez les homosexuels mâles et les
utilisateurs de drogues injectables. Toutefois, entre 1981 et 1983 il est apparu évident
qu’une immunodéficience similaire touchait d’autres groupes d’individus dont les Haïtiens
récemment immigrés, les hémophiles, les transfusés, les prisonniers et les Africains de
même que les partenaires sexuels et/ou les enfants des personnes constituant ces groupes à
risque. Les premiers cas de transmission verticale ont été documentés en 1982 (186, 300,
538).
Ce nouveau syndrome d’immunodéficience était décrit comme un état de dysfonction
immunitaire profonde. Il était caractérisé par une lymphadénopathie accompagnée d’une
variété de cancers inhabituels (le lymphome malin non hodgkinien et le syndrome de
Kaposi) et d’infections opportunistes causées par divers pathogènes. Parmi ces derniers,
nous pouvons nommer le Pneumocystis carinii, le cytomégalovirus, l’Herpes simplex et
l’Herpes zoster. Des infections mycobactériennes causées par le Mycobacterium
tuberculosis, des infections fongiques envahissantes causées par le Candida albicans, et des
infections causées par des protozoaires, le Toxoplasma gondii, le Cryptosporidium, le
Microsporidium, et l’Isospora, de même que des méningites causées par le Cryptococcus
sp. sont aussi au nombre des infections opportunistes documentées. Les patients souffraient
tous d’une déplétion marquée des lymphocytes T CD4+ dans le sang périphérique. En
1982, le terme SIDA a été attribué à cette nouvelle pathologie (revue par (186, 538).
Au cours des deux années suivant la description de ces premiers cas de SIDA, les
chercheurs se sont penchés sur la cause de cette maladie. L’apparition d’un nouveau virus
comme agent causal de cette pathologie n’était qu’une des théories plausibles parmi
d’autres alors envisagées par les scientifiques. Parmi les microorganismes qui ont été
3
postulés comme agent étiologique de cette maladie citons le cytomégalovirus et le human
T-cell leukemia virus type-I (HTLV-1). C’est en 1983 à l’Institut Pasteur à Paris sous la
direction du Dr Luc Montagnier que le lymphadenopathy-associated virus (LAV) a été isolé
des ganglions d’un patient asymptomatique présentant une lymphadénopathie généralisée
d’origine inconnue (40). Il s’agissait d’un nouveau rétrovirus qui, en culture, était
hautement pathogène pour les cellules du sang périphérique et qui s’attaquait
particulièrement aux lymphocytes T CD4+. L’équipe du Dr Gallo a par la suite décrit
l’isolement d’un rétrovirus de patients atteints du SIDA, qu’elle a appelé HTLV-III, et fit la
première démonstration sérologique associant l’exposition à ce virus à des individus
immunodéprimés provenant des groupes à risque (194, 204). En parallèle, le Dr Lévy
identifia chez des sujets atteints du SIDA un rétrovirus similaire au LAV qu’il nomma ARV
(AIDS-associated retrovirus) (317). La réplication de ce virus dans les lymphocytes T
CD4+ pouvait avoir ou non des effets cytopathogènes, suggérant que, in vivo, les
conséquences biologiques du ARV sont variées (238). L’agent étiologique du SIDA fut
finalement nommé le virus d’immunodéficience humaine (VIH).
1.3 Classification du VIH
Le VIH est un rétrovirus pathogène humain qui fait partie de la sous-famille des Lentivirus.
Il présente une forte hypervariabilité génomique faisant en sorte que de nombreuses
souches différentes existent. Selon leurs ressemblances génétiques, les souches du VIH sont
classifiées en i) types, ii) groupes et iii) sous-types (en anglais clades). Il existe deux types
majeurs du VIH : le VIH de type 1 (VIH-1) et de type 2 (VIH-2) qui ont 42% d'homologie
génomique (revue par (186)).
Le VIH-2 est principalement concentré dans les pays d’Afrique de l’Ouest et suit les
mouvements des populations en provenance et en partance de cette région (22). Les souches
du VIH-2 sont classées en sept sous-types : A à G (315). Contrairement au VIH-1 qui est
maintenant retrouvé à l’échelle mondiale, la prévalence du VIH-2 s’est soit stabilisée ou a
diminué dans la population humaine depuis 10 ans. Ce phénomène est probablement relié
au fait que le VIH-2 possède une valeur d’adaptation inférieure au VIH-1, propriété qui se
traduit par une virémie plus faible, une période asymptomatique plus longue et un taux de
4
transmission inférieur au VIH-1 (22). Dans cette perspective, la pandémie du SIDA est
globalement attribuable au VIH-1.
Trois groupes de VIH de type 1 se sont développés dans le monde : M (Major), O (outlier),
et N (i.e. ni le groupe M, ni le groupe O). Le groupe M est de loin le plus répandu puisqu’il
constitue plus de 90% des cas de VIH/SIDA à l’échelle mondiale. On retrouve le groupe O
dans les régions de l’Afrique centrale et le groupe N au Cameroun (revue par (186, 564).
À l’intérieur du groupe M, neuf sous-types majeurs ont été définis : A-D, F-H, J et K.
L’infection simultanée d’un individu par deux sous-types différents du VIH-1 est possible
et peut mener à des évènements de recombinaison virale et engendrer ce qu’on nomme des
formes recombinées en circulation (en anglais, Circulating Recombinant Forms ou CRFs);
il existerait 15 CRFs (22). Les sous-types du VIH-1 sont distribués de façon inégale sur le
globe. Le clade C est le virus le plus répandu à l’échelle mondiale et il est la cause de la
moitié des infections à VIH-1. On le retrouve dans le sud et l’est de l’Afrique, en Inde, en
Chine, au Népal et au Brésil. Le sous-type B est le plus répandu en Europe, en Amérique,
au Japon et en Australie. Les autres sous-types sont restreints à une région précise (revue
par (186, 564)). La grande hypervariabilité génomique du VIH-1 fait aussi en sorte que de
nombreuses souches virales différentes coexistent au niveau inter et intra-individus. Les
différentes souches virales retrouvées chez un même individu sont nommées quasi-espèces
(186).
1.4 L’origine du VIH
L’origine du VIH comme agent pathogène chez l’humain demeure une énigme. Par ailleurs,
le virus d’immunodéficience simienne (VIS) fait partie d’un large groupe génétiquement
varié de lentivirus retrouvés chez diverses espèces simiennes en Afrique. Le VIS
n’engendre pas de pathologie chez son hôte naturel. Cependant, l’inoculation de VIS chez
le macaque, tel que le macaque rhésus, induit chez cet animal une maladie ressemblant au
SIDA. Il existe six lignées du VIS. Parmi ces différents VIS, des analyses phylogéniques
ont montré que le VIScpz isolé de chimpanzés Pan troglodytes troglodytes et Pan
troglodytes schweinfurrhii est génétiquement étroitement apparenté au VIH-1 (350). De
même, le VISsmm isolé de singes de l’espèce Cercocebus atys est apparenté au VIH-2. Cette
5
découverte indiquerait l’origine du VIH (196). Selon des données épidémiologiques
moléculaires, le VIH-1 aurait évolué pendant plusieurs siècles chez le P.t. troglodytes
porteur du VIScpz. A un certain moment dans l’évolution, le VIH aurait «sauté» d’espèce et
infecté l’humain; en d’autres termes, l'anthropozoonose serait à l'origine des infections à
VIH chez l'humain. Les conditions et les circonstances de ces transferts du singe vers
l’humain demeurent mal comprises, mais puisque la chasse et la consommation de viande
simienne infectée sont répandues en Afrique, on postule qu’il serait étroitement liée à ces
pratiques (169, 454).
On estime que des infections sporadiques à VIH ont continuellement eu lieu chez l’humain
au cours de plusieurs décennies mais passèrent inaperçues. Lorsque des conditions
démographiques et sociales permettant une propagation rapide du virus parmi la population
se sont créées, l’épidémie du SIDA s’est alors développée en Afrique. Le premier cas
documenté d’infection par le VIH-1 chez l’humain a été identifié dans un sérum datant de
1953 (666). L’introduction de l’épidémie dans les pays développés a rapidement suivi après
la « révolution gay » à New York en 1969. En effet, la concentration démographique et les
habitudes homosexuelles à risque pendant les années 70 et début des années 80 ont fait de
ces jeunes hommes homosexuels une cible parfaite pour une épidémie d’une maladie
transmissible sexuellement (revue par (169)).
1.5 Épidémiologie
1.5.1 Statistiques mondiales
Depuis le premier diagnostic de SIDA en 1981, on estime que 20 millions de personnes
sont décédées de cette maladie. Le nombre total de personnes vivant avec le virus de
l’immunodéficience humaine a grimpé en 2004 pour atteindre le plus haut niveau jamais
enregistré : 39,4 millions de personnes sont infectées par ce virus dans le monde.
L’épidémie mondiale de SIDA a tué 3,1 millions de personnes au cours de l’année écoulée
(616) (c.f. Figure 1).
Les caractéristiques démographiques des gens touchés par l’épidémie ont cependant
radicalement changé depuis 20 ans. Durant les premières années de l’épidémie du VIH-1 et
6
du SIDA en Amérique, la population touchée était presque exclusivement des hommes
homosexuels. De nos jours les nouveaux cas d’infection sont principalement associés aux
relations hétérosexuelles et à l’utilisation de drogues injectables. De plus, le SIDA, qui était
perçu comme une maladie touchant principalement les hommes, affecte en réalité un
nombre grandissant de femmes et l’écart du taux d’infection des femmes par rapport aux
hommes s’accentue dangereusement (615, 616).
L’Afrique subsaharienne reste de loin la région la plus touchée, avec près des deux tiers
(64%) de toutes les personnes atteintes par cette maladie ainsi que plus des trois quarts
(76%) de toutes les femmes infectées par ce rétrovirus. La prévalence du VIH-1, qui
avoisine 7,4%, semble se stabiliser, mais cette impression est principalement due à un
nombre à peu près égal de nouvelles infections et de décès dus au SIDA. L’Afrique australe
reste la sous-région la plus gravement atteinte au monde; d’après les relevés de
consultations médicales prénatales urbaines, la prévalence du VIH-1, qui était de l’ordre de
5% en 1990, y dépasse maintenant les 25%. L’Afrique du Sud continue à regrouper le
nombre le plus élevé au monde de personnes vivant avec le VIH-1; la prévalence générale
parmi les femmes enceintes y était de 27,9% en 2003 (616).
Avec une prévalence moyenne du VIH-1 chez l’adulte de 2,3%, les Caraïbes constituent la
deuxième région la plus touchée au monde. Le SIDA y est devenu la principale cause de
décès parmi les adultes de 15 à 44 ans. En Asie, le niveau national d’infection par le VIH-1
est relativement bas par rapport à celui d’autres continents mais étant donné l’importance
de la population dans cette région, un grand nombre de personnes sont touchées. Ainsi, à
l’échelle mondiale depuis 2002, ce sont l’Asie de l’Est, l’Europe orientale et l’Asie centrale
qui ont connu les augmentations les plus fortes du nombre des personnes infectées par le
VIH-1. Ce nombre s’est accru de près de 50% entre 2002 et 2004 en Asie de l’Est,
augmentation imputable en grande partie à l’épidémie qui s’étend rapidement en Chine. En
2004, en Europe orientale et en Asie centrale, on a compté une augmentation de 40% des
infections à VIH-1 comparé à l’année 2002. Une bonne partie de cette tendance est due à la
réapparition de l’épidémie en Ukraine et au nombre toujours croissant de personnes
séropositives en Fédération de Russie (616).
7
Le Soudan reste le pays le plus affecté de la région « Moyen-Orient/Afrique du Nord ». Les
dernières estimations indiquent que plus de 2% de la population adulte était touchée par le
VIH-1 à la fin de 2003. Deux pays d’Amérique latine, le Guatemala et le Honduras, ont une
prévalence nationale du VIH-1 chez l’adulte supérieure à 1%. Par ailleurs, le Brésil compte
plus du tiers des personnes atteintes du SIDA dans cette région (616).
En 2004, on a compté environ 64 000 nouvelles infections en Amérique du Nord, en
Europe occidentale et en Europe centrale, ce qui porte le nombre de personnes séropositives
dans ces régions à un total compris entre 1,1 million et 2,2 millions. Parmi les jeunes de 15
à 24 ans, 0,1% des femmes et 0,2% des hommes vivaient avec le VIH-1 à la fin 2004. La
large accessibilité des médicaments antirétroviraux qui permettent d’allonger la durée de
vie a maintenu le nombre des décès dus au SIDA entre 15 000 et 32 000 pour cette année
(616).
Au Canada, les estimations les plus récentes signalent environ 56 000 cas d’infection à
VIH-1 à la fin de 2002, un tiers des personnes séropositives ne sont pas conscientes de leur
statut sérologique. Les populations autochtones semblent courir un risque deux fois plus
élevé que les autres d’être infectées par le VIH-1 et constituent 25% des gens atteints par
cette infection au Canada. En 2002, la plupart des nouvelles infections à VIH-1 au Canada
étaient attribuables aux pratiques sexuelles à risque entre hommes (40%) et à l’injection de
drogues (30%) (82).
8
Figure 1
Adultes et enfants vivant avec le VIH-1. Estimations fin 2004
(tiré de : (616)).
1.5.2 Féminisation de l’épidémie du SIDA
L’épidémie de SIDA frappe un nombre croissant de femmes et de jeunes filles dans la
plupart des régions du monde. En 1997, si les femmes représentaient 41% des personnes
vivant avec le VIH-1, en 2002, cette proportion avait atteint près de 50%. Ce phénomène
9
est particulièrement frappant dans les régions du monde où les relations sexuelles sont le
principal mode de transmission du VIH-1. Par exemple, les femmes et les jeunes filles
représentent près de 57% de toutes les personnes infectées par le VIH-1 en Afrique
subsaharienne, où un pourcentage saisissant de 76% des jeunes entre 15 et 24 ans atteints
du VIH-1 sont de sexe féminin (615, 616) (c.f. Figure 2 et Figure 3).
Cette tendance est liée au fait que lors des rapports hétérosexuels, et en l'absence de toute
autre infection sexuellement transmissible, le virus a deux fois plus de chances d'être
transmis de l'homme à la femme que de la femme à l'homme. Au plan physiologique, les
femmes sont plus susceptibles à l’infection par le VIH-1 que les hommes. Les raisons de
cette disparité entre les sexes sont peu connues. Cependant, elles seraient associées à
différents facteurs qui incluent, entre autre, la présence accrue de maladies sexuellement
transmissibles chez la femme, et aussi possiblement, l’utilisation de contraceptifs
hormonaux. Deuxièmement, la susceptibilité à l’infection à VIH-1 varie tout au long de la
période reproductive de la femme. Par exemple, les adolescentes sont les plus vulnérables
au virus, soit parce qu’elles ont un comportement à haut risque de contracter l’infection
et/ou à cause des propriétés physiologiques de leur tractus génital encore immature. De
plus, de récentes études ont montré que le risque d’acquisition de la maladie est deux fois
plus élevé lors de la grossesse, de même que durant la période post-partum, et ce,
indépendamment du comportement social et des facteurs démographiques (493, 615, 616).
Outre les caractéristiques physiologiques propres à la femme, il est clair que les inégalités
entre hommes et femmes– et en particulier les règles et les normes qui gouvernent les
rapports sexuels entre femmes et hommes– sont aussi au cœur du problème. Ainsi, malgré
qu’il soit difficile de comparer tous les facteurs régionaux liés à la croissance de l’infection
à VIH-1 chez la femme, la fracture sociale qui existe entre les sexes fait en sorte que la
disparité entre les taux d’infection chez la femme et l’homme croît sans cesse (493, 615,
616).
10
Figure 2
Pourcentage d'adultes (15-49 ans) vivant avec le VIH qui sont de sexe féminin,
1985–2004
(tiré de : (616)).
Figure 3
Statistiques et caractéristiques régionales du VIH et du SIDA pour les femmes,
fin 2002 et 2004
(tiré de : (616)).
11
1.6 Structure et cycle réplicatif du VIH-1
1.6.1 Organisation génomique du VIH-1
Le génome rétroviral est constitué de deux copies d'ARN simple brin de polarité inverse de
9181 nucléotides et possède neuf cadres de lecture ouverts (Open Reading Frames, ORFs).
Trois de ces cadres de lecture codent pour les polyprotéines Gag, Gag-Pol et Env, qui sont
par la suite clivées en protéines individuelles. Premièrement, le précurseur Env (ou gp160)
génère les deux protéines qui forment l’enveloppe virale: la protéine de surface SU (ou la
gp120) et la protéine transmembranaire TM (ou la gp41). Deuxièmement, outre la protéine
p6, le précurseur de 55 kDa, le Gag (Pr55Gag), donne les protéines structurales i) de la
matrice (MA ou p17), ii) de la capside (CA ou p24) et iii) de la nucléocapside (NC ou p7).
Troisièmement, l’autocatalyse de la polyprotéine Gag-Pol (Pr160Gag-pol) génère la protéase
(PR), l’intégrase (IN) et la transcriptase inverse (Reverse transcriptase, RT), protéines qui
assurent les fonctions enzymatiques du virus. D’autre part, les six autres cadres de lecture
produisent les protéines suivantes : le Tat (Transactivator of transcription) et le Rev
(Regulator of viral expression) qui assurent entre autre des fonctions de régulation génique,
le Vpu (Viral protein U), responsable de l’assemblage viral, et le Vif (Viral infectivity
factor), le Vpr (Viral protein R) et le Nef (Negative factor) qui possèdent diverses
fonctions. Il faut savoir que les gènes tat et rev codent pour des protéines virales
régulatrices qui sont essentielles à la réplication virale. Par contre, les gènes nef, vif, vpr et
vpu codent pour des protéines accessoires puisque leur expression n’est généralement pas
essentielle à la réplication du VIH-1 in vitro. Ceci dit, ces protéines auxiliaires demeurent
requises pour la réplication virale et la pathogenèse in vivo. Notons que le VIH-2 et le
VISmac ne possèdent pas le gène vpu mais le gène vpx (revue par (184, 186, 591)) (c.f.
Figure 4).
1.6.2 Morphologie d’un virus mature
Le VIH-1 est enveloppé d’une bicouche lipidique qui provient de la membrane plasmique
de la cellule hôte. A la surface des virions, on retrouve la glycoprotéine gp120 qui est
attachée de façon non covalente à la protéine virale transmembranaire gp41. S’il est
généralement admis que la gp120 est regroupée en trimères avec trois protéines gp41,
12
formant ainsi de nombreuses pointes à la surface des particules virales (revue par (101)), de
récentes études proposent que des monomères de la gp120 s’associent plutôt en nombre
aléatoire pour former de petits groupes qui sont ensuite liés à un nombre équivalent de
gp41. Ces groupes formeraient une centaine d’épis à la surface du virus (288). La bicouche
lipidique contient aussi plusieurs protéines d’origine cellulaire telles que l’ICAM-1, le
LFA-1, le CD63, le CD55 et l’HLA-DR (604). Sous la bicouche lipidique, on retrouve
environ 2000 copies de la protéine de la matrice. La capside de forme conique est située au
centre du virus et est constituée d’environ 2000 copies de la protéine p24. Elle englobe les
deux brins d’ARN du génome viral, stabilisée par la présence de la nucléocapside. La
protéine p6, les protéines l’IN, la PR et la RT de même que les protéines accessoires, soit le
Vpr, le Vif et le Nef, sont aussi retrouvées dans le virion, alors que le Vpu, le Tat et le Rev
ne le seraient pas (184). Outre les protéines virales, on retrouve aussi dans la particule
virale des molécules d’origine cellulaire dont l’actine, l’ARNt synthetase, la cyclophiline A,
le Tsg101, l’APOBEC3G et le HSP70 (Heat shock protein) (85) (c.f. Figure 4).
13
Figure 4 Organisation génomique du VIH-1 (A) et morphologie d’un virus mature (B).
SU (protéine de surface ou gp120), TM (protéine transmembranaire ou gp41), MA (matrice
ou p17), CA (capside ou p24), NC (nucléocapside ou p7), PR (protéase), IN (intégrase), RT
(transcriptase inverse), Vif (Viral infectivity factor), Vpr (Viral protein R), Nef (Negative
factor).
14
1.6.3 Le cycle réplicatif du VIH-1
1.6.3.1 Entrée virale : attachement et fusion
L’étape initiale du cycle de réplication du VIH-1 est l’attachement d’un virion à la surface
d’une cellule cible. Notons qu’à proprement parlé, un récepteur d’attachement peut soit
simplement faciliter l’association d’un virus à la cellule ou, conjointement à cette fonction,
servir de récepteur d’entrée. Dans le cas du VIH-1, quoique l’entrée nécessite typiquement
le récepteur cellulaire CD4 (récepteur principal de l’entrée) et un corécepteur (voir plus
bas), diverses molécules de surface cellulaires peuvent participer à l’attachement. Nous
pouvons citer à titre d’exemple les HSPG (héparanes sulfates protéoglycanes) et le LFA-1
(revue par (421)). En effet, l’affinité de l’enveloppe virale pour le CD4 est relativement
faible. Dans ce contexte, la présence des facteurs d’attachement servirait à concentrer le
virus à la surface d’une cellule cible avant l’engagement du CD4 par le VIH-1 (revue par
(101, 421, 614)). L’entrée du VIH-1 dans une cellule cible se produit subséquemment grâce
à la fusion de la bicouche lipidique du virus avec la membrane plasmique de la cellule hôte,
réaction menée par les glycoprotéines virales de l’enveloppe, la gp120 et la gp41.
D’abord, la liaison de la gp120 à son récepteur cellulaire principal, le CD4, induit un
changement de conformation de ces deux molécules. Ceci permet de recruter un
corécepteur cellulaire, principalement le CXCR4 ou le CCR5, récepteurs à chimiokine de
type CC ou CXC. Une deuxième interaction a alors lieu entre la gp120 et le corécepteur,
déclenchant de nouveaux changements de conformation dans le complexe protéique de
l’enveloppe. Ces changements de conformation séquentiels mènent à terme à la dissociation
de la gp120 de la gp41 et provoquent l’exposition de l’ectodomaine de la gp41 au
corécepteur, puis la transition de la gp41 à sa forme fusogénique. C’est l’insertion du
peptide de fusion de la gp41 dans la membrane cellulaire qui entraîne la fusion des
membranes cellulaires et virales. Cet évènement permet finalement le relâchement de la
particule virale dans le cytoplasme (101, 184, 186, 591) (c.f. Figure 5). Deux observations
majeures ont permis de conclure que la fusion du VIH-1 a lieu à la surface cellulaire.
D’abord, la fusion est indépendante du pH, ensuite l’endocytose du CD4 n’est pas requise
pour l’entrée du VIH-1 (455, 570).
15
1.6.3.2 Décapsidation et transcription inverse
La fusion et l’entrée sont suivies par la décapsidation du virus. Au cours de cet évènement,
le virus est progressivement et partiellement désassemblé dans le cytoplasme pour générer
des particules sub-virales appelées complexe de transcription inverse (c.f. Figure 5). C’est à
partir de ce complexe qu’a lieu dans le cytoplasme la transcription inverse du génome viral.
Il est à noter qu’il est probable que la décapsidation et la transcription inverse aient lieu de
façon parallèle et non séquentielle. La transcription inverse du génome viral est réalisée par
la transcriptase inverse (RT) qui possède trois activités enzymatiques distinctes : i)
polymérisation d’ADN à partir de l’ARN génomique viral, ii) activité RNaseH et iii)
polymérisation d’ADN à partir de l’ADN viral nouvellement synthétisé. Ainsi, à partir
d’une amorce d’origine cellulaire liée au génome viral, l’ARNtLys3, cet enzyme convertit
l’ARN génomique rétroviral simple brin en ADN double brin et génère à chaque extrémité
du génome de longues répétitions terminales identiques (Long Terminal Repeats, LTR). Par
la suite, sous la forme d’ADN double brin, le génome viral s’associe avec des protéines
cellulaires et virales en un complexe nucléoprotéique, le complexe de pré-intégration (preintegration complex, PIC), qui est activement transporté au noyau (168, 413, 421). La
formation de ce complexe impliquerait aussi la participation du cytosquelette (76). Outre la
présence du génome viral, la structure protéique précise des complexes de transcription
inverse et de pré-intégration demeure mal connue. Ces complexes contiendraient à
différents moments la RT, l’intégrase, le Vpr, l’amorce ARNtLys3 et des protéines d’origine
cellulaire telles que le HMG-I(Y) (high mobility group protein) (168, 413, 421). Par
ailleurs, alors que les protéines structurales virales pourraient favoriser les étapes de
transcription inverse et/ou d’intégration, d’autres études ont montré que la capside, la
nucléocapside et la matrice sont rapidement relâchées durant la décapsidation, soulignant
que cette étape du cycle viral n’est pas entièrement élucidée (168, 413, 421).
Il est important de noter que la RT ne possède pas d’activité exonucléase 3’- 5’; de plus
cette enzyme fait de fréquents changements de matrice durant la transcription inverse d’un
génome viral. Ces deux propriétés font en sorte qu’un nombre élevé de mutations sont
générées lors d’un cycle de réplication virale. Ce phénomène est en partie responsable de
l’hétérogénéité des quasi-espèces du VIH-1 retrouvées chez un individu; il est un
déterminant principal de la résistance aux médicaments et de la capacité du virus à échapper
16
aux défenses immunitaires de l'organisme (revue par (186)). Par ailleurs, l’association de
l’uracil DNA glycosylase (UNG2) avec l’IN dans une cellule infectée permet
l’incorporation de cette enzyme dans la particule virale. L’UNG2 influence la précision de
la transcription inverse lors du prochain cycle viral et de ce fait, module le taux de
mutations du génome viral. En effet, l’uracile peut se retrouver dans l’ADN par
l’incorporation erronée de dUTP (deoxyuridine triphosphate) ou par déamination de
cytidine. Or, l’UNG2 est une enzyme impliquée dans la voie de réparation de l’ADN par
excision de bases : elle élimine spécifiquement l’uracile de l’ADN. L’UNG2 serait donc
recruté par l’IN dans les particules virales afin de minimiser subséquemment
l’accumulation néfaste d’uracile dans l’ADN proviral nouvellement synthétisé (489).
De plus, des protéines virales et cellulaires influencent la décapsidation et/ou la
transcription inverse. Par exemple, la protéine cellulaire APOBEC3G (aussi appelée
CEM15) est une cytidine désaminase cellulaire qui, durant la transcription inverse,
provoque le changement de dC à dU dans le brin de polarité négative de l’ADNc viral.
Même si dans ces conditions la transcription inverse peut avoir lieu (inefficacement), la
conversion massive de C à U entraîne des hypermutations G à A dans le brin de polarité
positive de l’ADNc viral qui sont souvent néfastes pour le virus. Ceci se produit car
l’APOBEC3G, en se liant à la nucléocapside, se retrouve encapsidée dans la particule
virale. Il peut alors agir sur le génome viral lors du prochain cycle viral. Afin de protéger le
VIH-1, le Vif a pour rôle de contrecarrer l’APOBEC3G en accélérant sa dégradation posttraductionnelle. En effet, dans le cytoplasme le Vif interagit avec l’APOBEC3G à
l’intérieur du complexe protéique Vif-Cul5-SCF, ce qui entraîne la poly-ubiquitination et la
dégradation par le protéasome d’APOBEC3G. A terme, en dirigeant la dégradation
d’APOBEC3G, le Vif réduit significativement les niveaux intracellulaires d’APOBEC3G et
empêche donc son incorporation dans la particule virale et son effet néfaste sur le virus
(489). On a depuis peu postulé un second rôle pour l’APOBEC3G : dans les cellules T
CD4+ activées, l’APOBEC3G se retrouve dans une forme enzymatique inactive de haut
poids moléculaire. Par contre, sous sa forme de faible poids moléculaire, l’APOBEC3G est
active et agit dans les cellules T CD4+ latentes comme puissant facteur restrictif lors des
étapes qui suivent l’entrée du virus. L’action de cytidine désaminase d’APOBEC3G ne
serait pas à l’origine de cette inhibition virale (94). Une autre protéine cellulaire qui
17
pourrait avoir un rôle clé dans le cycle viral est la cyclophiline A (CypA). Cette protéine
cellulaire, en liant le domaine de la capside de Gag, se retrouve encapsidée dans le virion et
sa présence augmente l’infectiosité du virus lors de son prochain cycle viral. En effet, en
masquant le site de liaison du facteur humain de restriction de la réplication rétrovirale
(Ref1, Restriction Factor 1) à la capside, la CypA contrecarre l’activité inhibitrice de Ref1
et permet au virus d’entreprendre la transcription inverse (603). Il a été récemment postulé
que ce facteur Ref1 serait TRIM (T-cell-receptor-interacting molecule)-5α (266).
1.6.3.3 Import nucléaire
Après la transcription inverse, le génome viral est acheminé au noyau de la cellule (c.f.
Figure 5). Les complexes de pré-intégration des lentivirus ont l’unique propriété de pouvoir
être transportés au noyau par l’intermédiaire de la machinerie d’import nucléaire de la
cellule, leur permettant ainsi d’accéder au noyau non pas uniquement lorsque la cellule se
divise, mais aussi lorsqu’elle ne prolifère pas et qu’elle est arrêtée en phase G1 du cycle
cellulaire. C’est en partie grâce à cette caractéristique que le VIH-1 peut infecter les
lymphocytes T latents, de même que les macrophages et les cellules dendritiques (revue par
(421)). Cette propriété a d’importantes conséquences sur la transmission virale, la
pathogenèse et la persistance de réservoirs viraux. Toutefois le mécanisme qui sous-tend
l’import nucléaire du VIH-1 demeure mal compris. Un des modèles qui est actuellement
favorisé postule que le PIC possède des propriétés caryophiles. En d’autres termes, un (ou
des) composant(s) du PIC contient (contiennent) un élément de ciblage, soit un signal de
localisation nucléaire, permettant son association à la machinerie cellulaire d’import
nucléaire. Ensuite cette machinerie, dont les constituants protéiques appartiennent à la
famille des caryophérines β, conduit le PIC au noyau par les pores nucléaires. Trois
protéines virales, l’IN, la MA, et le Vpr, possèderaient de telles propriétés caryophiles. Si
on n’a pas élucidé la fonction exacte de chacune de ces protéines virales dans l’import
nucléaire du VIH-1, on estime tout de même que chacune y joue un rôle significatif. Ceci
dit, certaines études remettent en question la présence d’un signal allégué de localisation
nucléaire dans la séquence de l’IN, du Vpr et de la MA, de même que leur implication dans
le transport de l’ADNc viral (revue par (77, 421)). On propose en revanche que l’ADN viral
contient lui-même une structure inhabituelle, appelée « central DNA flap », qui agirait à
18
titre d’élément en cis dans l’import nucléaire, soit en interagissant avec la machinerie
cellulaire d’import nucléaire ou encore en favorisant la translocation par les pores
nucléaires de l’ADNc viral (17, 421).
1.6.3.4 Intégration nucléaire, transcription et traduction
A la suite de l’import du complexe de pré-intégration au noyau, l’ADN viral est intégré
dans l’ADN chromosomique de la cellule infectée par l’action de l’intégrase virale. Le virus
est alors sous sa forme de provirus. A partir du promoteur viral situé en 5’ du LTR, les
copies intégrées d’ADN du VIH-1 servent de matrice pour la synthèse d’ARN messagers
viraux grâce à l’ARN polymérase II (l’ARN Pol II) et les interactions coordonnées de la
protéine Tat et des facteurs de transcription NF-κB et Sp1 (c.f. Figure 5). La protéine Tat
est essentielle au cycle viral puisqu’elle assure l’efficience (processivity) de la transcription
virale. En effet, cette protéine se lie d’abord à la sous-unité cycline T de la cycline T/CDK9
(qui fait partie du complexe d’élongation P-TEFb) ce qui entraîne sa liaison à une séquence
structurée de l’ARN située en 5’ des ARNm viraux naissants, appelée TAR. Finalement, le
complexe d’élongation se retrouve à proximité du promoteur viral où il peut à son tour
engendrer l’hyper-phosphorylation de l’ARN Pol II, étape qui déclenche l’élongation des
transcrits. La transcription produit l’ARN du génome viral de même que l’ensemble des
ARN messagers correspondants aux protéines du virus. On distingue trois classes d’ARNm
dans une cellule infectée par le VIH-1 : i) l’ARN génomique non épissé, ii) les ARNm
partiellement épissés et iii) les ARNm poly ou complètement épissés. Les transcrits
partiellement épissés et non épissés du VIH-1, en raison de la présence d’introns, sont
exportés du noyau vers le cytoplasme par un mécanisme de transport unique dirigé par la
protéine virale, Rev (revue par (186)).
Il est à noter qu’à la suite de la transcription, la traduction du précurseur Env (gp160) se fait
à partir des ribosomes associés au réticulum endoplasmique rugueux; le clivage en gp120 et
gp41 se fait par la suite au Golgi. Par ailleurs, si la traduction de Pr55Gag se produit aux
ribosomes, la synthèse de Pr160Gag-Pol nécessite quant à elle un décalage du cadre de lecture
lors de la traduction de Pr55Gag (revue par (186)).
19
1.6.3.5 Assemblage et bourgeonnement
À la suite de ces évènements, les dernières étapes du cycle viral ont lieu : l’assemblage et le
bourgeonnement de nouvelles particules virales. En résumé, les poly-protéines Pr55Gag et
Pr160Gag-Pol, en association avec les protéines accessoires (Vif, Vpr, Nef) et le génome viral
nouvellement synthétisé, se regroupent à la membrane puis s’assemblent avec les protéines
de l’enveloppe, la gp120 et la gp41. Ces étapes de transport puis d’assemblage de nouvelles
particules virales sont sous le contrôle de Pr55Gag (c.f. Figure 5).
En effet, suivant la traduction de Pr55Gag, ce précurseur protéique s’oligomérise par ses
domaines CA et NC. Ensuite, à partir de son domaine myristoylé à l’extrémité N terminale
de MA, le Pr55Gag est dirigé à la face interne de la membrane plasmique et s’y attache. Le
Pr160Gag-Pol, tout comme Pr55Gag, est myristoylé et conduit à la membrane plasmique. Par
ailleurs, le domaine de la nucléocapside de Pr55Gag, par son motif de doigt de zinc,
reconnaît une structure secondaire de l’ARN génomique viral, appelée signal
d’encapsidation. Cette interaction nucléocapside-ARN viral dirige le génome viral au site
de bourgeonnement et éventuellement à son encapsidation. Le bourgeonnement, qui
constitue l’étape où la nouvelle particule virale immature est relâchée dans l’environnement
extracellulaire, a lieu une fois que les protéines virales sont rassemblées à la membrane.
Lors du bourgeonnement, les glycoprotéines gp120 et gp41 sont incorporées dans le virion
naissant grâce à une interaction entre le domaine de la matrice et la gp41. De plus, la
particule virale s’entoure dans le processus d’une double couche lipidique provenant de la
membrane plasmique. C’est le Vpu qui stimule la relâche de nouvelles particules virales.
Suite au bourgeonnement a lieu la dernière étape du cycle viral, soit la maturation finale du
virus : la protéase virale clive les précurseurs protéiques Pr55Gag et Pr160Gag-Pol et la capside
se condense puis adopte sa forme caractéristique en cône. Le virus peut alors entamer un
nouveau cycle de réplication (revue par (186)).
En ce qui concerne le bourgeonnement proprement dit, le Gag a pour fonction de recruter
les protéines cellulaires nécessaires à ce processus. De récentes études ont montré que les
éléments essentiels de la machinerie cellulaire utilisés par le VIH-1 pour son
bourgeonnement sont d’abord recrutés par le Gag aux endosomes tardifs pour ensuite être
redirigés à la membrane plasmique. D’abord, l’extrémité N-terminale du domaine MA de
20
Gag lie spécifiquement la sous-unité gamma du complexe AP-3. Cette interaction avec AP3 constitue un moyen précis par lequel le Gag atteint les endosomes tardifs. Ensuite, les
domaines tardifs P(T/S)AP et YPLTSL contenus dans la p6 recrutent le Tsg101 (Tumor
susceptibility gene 101) du complexe ESCRT-1 (endosomal sorting complex required for
transport) (488) et l’AIPI/Alix (576), protéines impliquées respectivement dans le tri des
protéines dans les endosomes et dans la formation des corps multivésiculaires (multi
vesicular bodies, MVB) (revue par (218)). Normalement, le complexe ESCRT-1 est
acheminé de façon temporaire à la membrane des endosomes où il recrute l’ESCRT-2 et
l’ESCRT-3 afin d’initier la formation de vésicules intra-endosomales par invagination de la
membrane dans la lumière de ces compartiments (revue par (29)). Lors de l’assemblage de
nouvelles particules virales, le Tsg101 et les complexes ESCRT associés sont détournés de
leur fonction physiologique par la p6 afin de permettre le bourgeonnement du virus à la
membrane plasmique (200, 348, 633). La découverte que les domaines tardifs viraux
recrutent des protéines normalement impliquées dans la biogenèse des vésicules intraendosomales suggère que le bourgeonnement viral et la formation de vésicules intraendosomales sont des processus analogues. Ces deux évènements impliquent la courbure
des membranes, non pas à l’intérieur, mais à l’opposé du cytoplasme (140).
Fait intéressant, outre le fait que le VIH-1 bourgeonne à la membrane plasmique, on a
récemment montré que dans les macrophages, ce processus se produit de façon
intracellulaire, à partir des endosomes. Ces virions, qui se retrouvent alors dans la lumière
des endosomes, sont par la suite relâchés des endosomes lorsque ces derniers fusionnent
avec la membrane plasmique. Une voie similaire est connue pour la relâche de vésicules
intra-endosomales dans l’environnement extracellulaire. Ces vésicules sont appelées
exosomes (213, 434, 456, 457, 503). D’autre part, en ce qui à trait aux cellules épithéliales
polarisées, la présence des signaux de transport par endocytose contenus dans les protéines
de l’enveloppe du VIH-1 permet d’induire le bourgeonnement à la membrane basolatérale
plutôt qu’apicale (439).
21
Figure 5 Cycle de réplication du VIH-1
(tiré de : (574)).
1.7 Les modes de transmission du VIH
Le VIH-1 est transmissible d’une personne infectée à une autre par exposition directe à des
liquides organiques contaminés. On retrouve ce virus dans le sang, le sperme, les sécrétions
vaginales et aussi dans le lait maternel. Notons qu’il peut aussi se retrouver dans la sueur et
la salive mais, en raison de la faible quantité qui y est présente, le risque de transmission
par ces liquides est considéré comme nul (422). La transmission du VIH-1 peut avoir
lieu par divers modes qui sont listés dans la section suivante.
22
1.7.1 Relation sexuelle
De façon globale, 70 à 80% des cas de SIDA sont imputables à ce type de transmission.
Celui-ci inclut les relations sexuelles orales, vaginales et anales entre partenaires
homosexuels et bisexuels masculins ou hétérosexuels, la transmission hétérosexuelle étant
le mode le plus fréquent (492). Dans l’ensemble, le risque de transmission par relation
sexuelle, et ce, lors de chaque contact sexuel, est de l’ordre de 1/1000 (0.1%) à 1/100 (1%)
(426).
A l’exclusion des contaminations parentérales du VIH-1, virtuellement toutes les
transmissions hétérosexuelles, homosexuelles et verticales du VIH-1 requièrent le passage
du virus à travers une muqueuse. Le passage le plus commun est par les muqueuses anorectale, cervico-vaginale, du prépuce ou de l’urètre. Le risque d’acquisition de la maladie
est accru si ces épithéliums sont endommagés, particulièrement par d’autres maladies
sexuellement transmissibles causant de l’inflammation et/ou des ulcères (revue par (102,
195)). Notons que la contamination oro-pharyngienne de même qu’à partir du tractus
gastro-intestinal supérieur sont aussi probables (370, 376, 567).
1.7.2 Transmission par le sang
Cette contamination peut avoir lieu par l’échange d’aguilles contaminées chez les
toxicomanes, de façon accidentelle chez les professionnels de la santé et les chercheurs ou
encore au cours d’une transfusion sanguine ou suite à un don d’organe (422).
1.7.3 Transmission materno-fœtale
La transmission verticale du VIH-1 peut avoir lieu à trois stades : in utero, intra-partum et
lors de l’allaitement maternel. La transmission verticale est décrite de façon détaillée à la
Section 3.
1.8 Tropisme viral
Les isolats du VIH-1 sont classés en différents groupes en fonction de certaines de leurs
propriétés biologiques. Premièrement, selon leur taux de réplication dans les cellules isolées
du sang périphérique (Peripheral blood mononuclear cells, PBMC), on a nommé les isolats
23
de virus primaires à réplication lente et générant de petites quantités de nouvelles particules
«slow/low», pour les distinguer des souches virales «rapid/high» qui ont des cinétiques
d’infection rapides et qui relâchent des titres élevés de virions. Les souches virales dites
«rapid/high» sont souvent cytopathogènes. Deuxièmement, les isolats primaires du VIH-1
qui induisent la formation de syncytium sont désignés SI (syncytium-inducing) alors que
ceux qui n’en induisent pas sont dits NSI (non-syncytium-inducing)). Troisièmement, le
principal déterminant du tropisme du VIH-1 réside dans la glycoprotéine gp120 : les
souches qui n’utilisent que le CXCR4 comme corécepteur sont dites X4 alors que celles qui
n’utilisent que le CCR5 sont dites R5. Si toutes les souches virales peuvent infecter les
cellules isolées du sang périphérique, les souches X4 induisent en général la formation de
syncytium et infectent principalement les lymphocytes T CD4+. Elles sont donc aussi
appelées « à tropisme T ». Par contre, les souches R5, aussi appelées «à tropisme M», ne
génèrent pas la formation de syncytium et se répliquent de préférence dans les
macrophages. Notons que puisque les lymphocytes primaires expriment à la fois le CCR5 et
le CXCR4, les deux souches décrites peuvent les infecter. Il est aussi possible de retrouver
des souches virales qui possèdent un double tropisme; ces dernières utilisent
indifféremment le CCR5 et le CXCR4 et peuvent infecter à la fois les lymphocytes T CD4+
et les macrophages. Finalement, d’autres corécepteurs que le CCR5 et le CXCR4 sont
utilisés par le VIH-1 dont le CCR1, le CCR2b, le CCR3, le CCR8, le CCR9, le CXCR2,
l’APJ, le Bonzo (STRL33), le BOB (GPR15) et l’US28 (revue par (101)).
1.9 Autres récepteurs cellulaires du VIH-1
Comme nous l’avons décrit précédemment, le CD4 est le récepteur primaire du VIH-1 et
son engagement par la gp120 induit des changements de conformation dans l’enveloppe
virale, initiant le processus d’entrée du virus dans une cellule cible. La présence du CD4 est
donc nécessaire pour qu’ait lieu la fusion du VIH-1. Cet évènement requiert aussi la
participation d’un corécepteur cellulaire, les principaux étant le CXCR4 et le CCR5 (revue
par
(101)).
Ceci
dit,
outre
les
lymphocytes
T
CD4+,
qui
expriment
ces
récepteurs/corécepteurs, la pathogenèse du VIH-1 implique divers types cellulaires (tels que
les macrophages et les cellules dendritiques) qui expriment le CD4 à des niveaux quasi
indétectables et/ou qui n’expriment peu ou pas les corécepteurs décrits. L’infection et la
24
réplication du VIH-1 sont donc plus faibles dans ces types cellulaires parce que la fusion et
l’intégration s’y produisent rarement (6, 101). Pourtant ces types cellulaires jouent un rôle
certain dans la pathogenèse du VIH-1.
Or, il est maintenant reconnu que dans ces cellules déficientes en CD4 et/ou corécepteurs,
l’enveloppe virale se lie à d’autres récepteurs exprimés à la surface cellulaire. On pense que
ceux-ci pourraient pallier, à divers degrés, l’absence des molécules requises pour l’entrée
du virus et, ainsi, permettre une certaine infection. Plusieurs cas de figures sont possibles
quant à la participation de ces autres récepteurs dans l’infection du VIH-1. Premièrement,
dans le cas des macrophages (527) et des cellules HeLa CD4+ (387), l’attachement initial
du VIH-1 a lieu indépendamment du CD4. Par contre, le CD4 et les corécepteurs (CXCR4
ou CCR5) demeurent essentiels pour que se produisent la fusion et l’entrée du VIH-1. Dans
cette situation, on pense que les autres molécules d’attachement servent à accroître la
liaison du virus afin de favoriser les évènements de fusion. Deuxièmement, dans le cas des
cellules épithéliales intestinales, non seulement l’entrée mais aussi l’infection sont
indépendantes du CD4. Cependant, l’infection requiert la participation du CXCR4 (109,
128). Troisièmement, l’infection des astrocytes ne requiert pas la participation du CD4, ni
celle des corécepteurs CXCR4 et CCR5. Dans ce cas, il semblerait donc que les autres
récepteurs impliqués, non seulement permettent l’attachement du virus aux cellules, mais
aussi, remplacent le CD4, le CXCR4 et le CCR5 pour que se produise l’entrée du VIH-1
(326).
Remarquons également qu’en plus d’agir comme récepteur d’entrée en cis, certains de ces
autres récepteurs participent à l’infection en trans des lymphocytes T CD4+ par le VIH-1 à
partir des cellules qui sont peu ou pas susceptibles à l’infection par ce rétrovirus (59, 203).
Nous pouvons citer le galactocérébroside, les lectines de type C telles que le DC-SIGN, le
DC-SIGNR et le récepteur du mannose et les protéoglycanes, qui contiennent des chaînes
chondroïtine ou héparane sulfate (CSPG et HSPG) comme autres récepteurs du VIH-1
(revue par (101)). De plus, outre les interactions directes entre l’enveloppe virale et les
récepteurs cellulaires, des molécules de l’hôte acquises par le VIH-1 interagissent avec
leurs ligands présents à la surface d’une cellule cible, favorisant ainsi les étapes précoces de
son cycle réplicatif (604). Nous présentons dans cette section une description détaillée des
25
principales molécules alternatives d’attachement au CD4/corécepteurs; un résumé est
présenté au Tableau 1. Le rôle de chacune de ces macromolécules dans la pathogenèse du
VIH-1 est par la suite décrit en fonction de chaque type cellulaire touché par le VIH-1 (c.f.
Section 1.10).
1.9.1 Les lectines de type C :
Les lectines sont des protéines qui lient des sucres spécifiques présents sur des
glycoprotéines, des glycolipides, des pathogènes ou encore présents à la surface cellulaire.
De ce fait, elles sont impliquées dans divers processus incluant l’adhésion cellulaire, la
reconnaissance des pathogènes et la présentation antigénique. Les lectines de type C ont été
nommées de la sorte afin de refléter la nécessité du Ca2+ dans leur liaison aux
carbohydrates. La famille des lectines de type C inclut, entre autres, le DC-SIGN (Dendritic
cell (DC)-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3) grabbing nonintegrin), le LSIGN (ou DC-SIGNR), la langerine, le récepteur du mannose et les sélectines (19).
La liaison des sucres avec les lectines de type C se fait par leur domaine de reconnaissance
des carbohydrates (Carbohydrate Recognition Domain, CRD). Par exemple, la portion
extracellulaire du récepteur du mannose contient huit CRD qui reconnaissent le mannose, le
N-acétylglucosamine et le fucose lorsqu’ils se trouvent à l’extrémité d’une chaîne de
carbohydrates. Le récepteur du mannose possède aussi un domaine extracellulaire riche en
cystéine qui lie les glycoprotéines contenant des sucres sulfatés tels que les chondroïtine
sulfates et les oligosaccharides de types Lewis-a ou x (19). D’autre part, le DC-SIGN a été
identifié d’abord comme molécule dirigeant l’interaction entre les cellules dendritiques et
les lymphocytes T permettant la présentation antigénique et la costimulation. Le DC-SIGN
et le DC-SIGNR n’ont qu’un seul CRD qui reconnaît des groupements mannose d’ICAM-2
et d’ICAM-3, de même que la gp120 du VIH-1 (revue par (149, 367, 624)).
On croit que la portion intracellulaire de la plupart des lectines de type C contiendrait des
motifs d’internalisation par endocytose (motif di-leucine, ou regroupement de trois
glutamine) et à ce titre on imagine qu’elles peuvent agir comme récepteur d’endocytose. En
accord avec ce principe, les lectines de type C, qui possèdent un regroupement de trois
glutamines, dirigent les antigènes internalisés aux lysosomes et aux endosomes tardifs alors
26
que les autres lectines de type C, tels que le récepteur du mannose, recyclent rapidement
(revue par (624)).
1.9.2 Les glycosphingolipides (GSL)
Les glycosphingolipides (GSL) sont formés d’un céramide auquel est lié une grande variété
de glucides (mono ou polysaccharides). Le céramide est constitué d’un alcool aminé à
longue chaîne (sphingosine ou dihydrosphingosine) et d'un acide gras (souvent de plus de
20 carbones) lié par une liaison amide à l'azote de l’alcool. On retrouve divers types de
GSL : les cérébrosides, les sulfatides, les globosides et les gangliosides. Premièrement, les
cérébrosides contiennent une seule unité glucidique en association avec le cérébroside, le
plus commun étant le galactocérébroside (GalCer). Deuxièmement, les sulfatides sont des
cérébrosides sulfatés. Troisièmement, les globosides contiennent plus d’un résidu
glucidique et finalement, les gangliosides sont similaires aux globosides mais contiennent
aussi l’acide sialique (NANA). Le GM1, le GM2 et le GB3 sont des globosides. La
reconnaissance spécifique d’un ligand par les GSL se fait par leur(s) chaîne(s)
d’oligosaccharide(s). Cette séquence est le site d’attachement à des anticorps, à des lectines,
à des toxines microbiennes et à des GSL complémentaires. Au plan fonctionnel, les GSL
sont insérés, grâce à leur domaine céramide, dans le feuillet externe de la membrane
plasmique. De plus, ce domaine engage des interactions entre les GSL adjacents entraînant
leur regroupement en microdomaines dans la membrane plasmique. A l’intérieur des
microdomaines, les GSL s’associent avec des tétraspanines, des intégrines, des facteurs de
croissance et des kinases de la famille Src (sarcoma), formant ainsi des glycosynapses qui
modulent la signalisation et l’adhésion cellulaires. Il est à noter que les microdomaines
riches en GSL diffèrent des microdomaines spécialisés de la membrane plasmique appelés
cavéoles. En effet, alors que la sphingomyéline et le cholestérol sont présents dans ces deux
types de structure, ils sont plus abondants dans les cavéoles. Aussi seuls les cavéoles sont
sensibles à la filipine (revue par (224)).
1.9.3 Les protéoglycanes (PG) : les HSPG
Les protéoglycanes (PG) sont des macromolécules présentes dans tous les tissus conjonctifs
et matrices extracellulaires, ainsi qu’à la surface de beaucoup de cellules. Ils sont constitués
27
d’une charpente protéique à laquelle sont greffés par covalence un ou plusieurs
polysaccharides appelés glycosaminoglicanes (GAG). Les GAG sont de longs polymères de
modules disaccharidiques (40 à 150), dont souvent l’un des glucides est un uronate (Dglucuronate
ou
L-iduronate)
et
l’autre
la
N-acétyl-glucosamine
ou
la
N-
acétylgalactosamine. L’un des sucres ou les deux sont substitués par un ou deux groupes
sulfates; chaque chaîne de GAG porte donc un grand nombre de charges négatives. Il existe
diverses catégories de GAG différenciés par la composition de leur module disaccharidique
répétitif. Il s’agit de l’acide hyaluronique, le chondroïtine 4- et 6-sulfate, le dermatane
sulfate, l’héparane sulfate, l’héparine et le kératane sulfate. Tous les GAG sont des
composants des PG, à l’exception de l’hyaluronane qui n’est pas lié de façon covalente à
une structure peptidique. Outre le N-acétyl ou le N-sulfo-D-glucosamine qui entre dans la
composition de l’héparane sulfate et de l’héparine, on retrouve l’acide D-glucuronique dans
l’héparane sulfate et l’acide D-iduronique dans l’héparine. Aussi, l’héparine est davantage
sulfatée que l’héparane sulfate. Trois éléments importants soit : i) une épimérisation
variable, ii) une grande hétérogénéité dans les motifs de sulfatation, et iii) une variabilité
dans la longueur des chaînes de disaccharides, permettent une diversité structurale
importante des héparanes sulfates. La portion protéique des PG est classée en différentes
familles
et
parmi
celles-ci
on
distingue
trois
types
d’héparane
sulfate
protéoglycane (HSPG): les syndécanes (de 1 à 4 qui sont trans-membranaires), les
perlécanes (qui sont secrétés et qui sont retrouvés dans les membranes basales ou associés à
des intégrines) et les glypicanes (de 1 à 6 qui possèdent un motif d’ancrage
glycosylphosphatidylinositol ou GPI). Les HSPG comportent des chaînes d’héparane
sulfate, ceci dit, certaines HSPG (tel que le syndécane-1) comportent aussi des chaînes de
chondroïtine sulfate. Afin d’alléger le texte, les GAG contenus dans les HSPG seront
référés à titre d’héparane sulfate dans cette thèse (revue par (44, 47, 161, 190, 247, 639)).
Les HSPG lient de nombreux ligands extracellulaires et nous pouvons citer à titre
d’exemples les facteurs de croissance tels que le TGF-β (Transforming Growth Factor
Beta), les molécules d’adhésion (la L-sélectine, le MAC-1, le N-CAM, le PECAM-1), les
chimiokines, les cytokines (l’IL-2, le TNF-α) et des composantes de la matrice
extracellulaire (la fibrine, la fibronectine et la laminine). Si l’on estime que l’affinité des
protéoglycanes pour divers ligands est déterminée par la structure détaillée de leurs chaînes
28
GAG, les sites précis de liaison d’un ligand à une chaîne d’héparane sulfate demeurent pour
la plupart mal définis et font l’objet d’intenses recherches. Il est proposé que la liaison se
produise à des séries spécifiques de disaccharides modifiés de façon variable dans les
domaines N-acétylés et N-sulfatés des HSPG. En ce qui concerne la portion protéique des
PG, elle influence la localisation cellulaire des HSPG. Par exemple, le domaine
transmembranaire permet la localisation des syndécanes dans des micro-domaines
particuliers de la membrane plasmique. Ainsi, le syndécane-1 est retrouvé au domaine
basolatéral des cellules épithéliales simples. De plus, la nature protéique des PG dicte les
issues biologiques qui résultent de la liaison des HSPG avec leur ligand (revue par (44, 47,
111, 161, 190, 247, 639)).
En interagissant directement avec des ligands extracellulaires, les héparane sulfates
retrouvés à la surface cellulaire peuvent immobiliser un ligand, augmenter sa concentration
locale, changer sa conformation et le présenter à un récepteur impliqué dans la signalisation
cellulaire. Les fonctions qui sont attribuées aux HSPG en relation avec ces propriétés sont :
1) servir de corécepteurs pour des ligands solubles (facteurs de croissance, cytokines)
formant ainsi un des constituants des complexes de signalisation transmembranaire, 2)
servir de corécepteurs pour des ligands insolubles (telles que les molécules de la matrice
extracellulaire) causant leur association avec les microfilaments d’actine. Ils relient donc
des protéines à la matrice extracellulaire (les glypicanes n’ont pas cette fonction), 3) servir
de récepteurs d’internalisation cellulaire qui, à partir des puits de clathrine ou des cavéoles,
conduisent à la dégradation, au recyclage ou à la transcytose de ligands présents à la surface
cellulaire, 4) séquestrer certaines protéines à l’intérieur des vésicules de sécrétion et 5)
servir de molécules effectrices paracrines (revue par (44, 47, 111, 161, 190, 247, 639)).
1.9.4 Autres molécules d’attachement
Le VIH-1 est un virus enveloppé qui a la propriété d’acquérir, lors de son bourgeonnement,
une grande variété de molécules issues de la membrane plasmique de la cellule hôte et qui
de ce fait se retrouvent à la surface des virions (revue par (604)). Or, il est maintenant
reconnu qu’outre les associations directes des glycoprotéines de l’enveloppe avec des
récepteurs cellulaires, de nombreuses interactions entre les molécules acquises par le VIH-1
29
et leurs ligands/récepeturs à la surface d’une cellule ont lieu lors des étapes précoces du
cycle viral. De telles interactions ont des conséquences importantes sur le cycle viral du
VIH-1. A titre d’exemples, la présence de molécules de l’hôte à la surface du VIH-1 peut :
i) réduire la neutralisation du VIH-1 par des anticorps et sa destruction par le complément,
ii) induire une signalisation à la surface d’une cellule cible, et iii) augmenter la cinétique et
l’efficacité d’entrée du VIH-1 à partir du CD4 et du corécepteur CXCR4 ou CCR5 sur cette
dite cellule (revue par (85, 604)). L’ICAM-1 à la surface des particules virales est l’une des
protéines procurant un tel avantage au VIH-1 (68, 179, 445, 592). Un rôle similaire a été
attribué à B7.1 et B7.2 (207) et au HLA-DR (83, 84). Outre ces fonctions, on a également
récemment montré que le LFA-1 pourrait favoriser l’attachement du VIH-1 aux cellules
dendritiques, puis son transfert aux cellules T CD4+, de même que l’infection en cis des
cellules dendritiques (208). Finalement, la galectine-1, qui est une lectine du type S,
pourrait agir comme molécule d’adhésion soluble permettant un meilleur attachement du
VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ (438).
1.10 Cellules cibles de l’infection à VIH-1
Il est reconnu que les lymphocytes T CD4+ sont la cible privilégiée de l’infection à VIH-1.
Ceci dit, de nombreux autres types cellulaires, aussi bien hématopoïétiques que non
hématopoïétiques, jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de ce rétrovirus. Or l’infection
de ces cellules ne suit pas toujours le mécanisme établi pour les cellules T CD4+. La
transmission verticale du VIH-1 émerge comme un cas probant de cette infection atypique
et dans ce contexte nous avons jugé important de brosser une vue d’ensemble des cellules
ciblées par l’infection à VIH-1.
Nous présentons d’abord le processus infectieux dans les lymphocytes T CD4+. Ensuite, la
relation entre le VIH-1 et les cellules dendritiques, les cellules macrophages, les cellules
endothéliales, le système nerveux central et les cellules épithéliales est séquentiellement
décrite afin d’illustrer deux éléments importants : premièrement, que les autres types de
récepteurs d’attachement du VIH-1 sont essentiels aux étapes précoces de son cycle
réplicatif dans de nombreuses cellules. Deuxièmement, que l’endocytose des particules
virales joue un rôle clé dans la pathogénèse du VIH-1, plus particulièrement lors de la
30
primo-infection et de la dissémination du virus. En effet, l’endocytose permet dans certains
types cellulaires : i) l’entrée du virus menant à l’infection d’une cellule cible, ii) le transport
trans-cellulaire (i.e. la transcytose) et/ou iii) l’infection en trans d’une cellule.
La lecture de cette section permettra de comprendre la diversité des types cellulaires
touchés par le VIH-1, de même que la variété des modes d’infection et de propagation
utilisés par le VIH-1 à l’intérieur de l’organisme. Un résumé de ces processus est présenté
au Tableau 1.
CXCR4, CCR5
Négative
Lymphocytes B
Positive
Positive
Positive
Cellules dendritiques folliculaires
Cellules de Langerhans
CCR5
Négative
CCR5
CXCR4, CCR5
n.d.
n.d.
Négative
n.d.
n.d.
Cellules dendritiques
Cellules dendritiques
HUVEC
Cellules endothéliales des sinus des ganglions
lymphatiques
Veinules endothéliales supérieures des adénoïdes
Cellules endothéliales sinusoïdales du foie
CCR5
CXCR4, CCR5
Positive
Lymphocytes T CD4+
Positive
CCR5, CXCR4
Positive
(faiblement)
Macrophages
Cellules endothéliales
Expression de
corécepteurs
Expression
de CD4
ICAM-1
Récepteur du complément
ICAM-1
Récepteur du complément (iC3b)
CCR5
CCR5
Récepteur Fc gamma
Récepteur du mannose
Récepteur du mannose
Cellules non permissives à l'infection
DC-SIGN
HSPG
Syndécan-3: rôle postulé
DC-SIGNR: rôle postulé
DC-SIGNR: rôle postulé
CD21
DC-SIGN
Cellules non permissives ou faiblement:
controverse
n.d.
n.d.
Cellules permissives à l'infection
Cellules non permissives à l'infection
(265, 608)
(554, 663)
(33)
(208)
(222)
(203, 608)
(59, 109, 241, 290, 522)
(59)
(482)
(41, 482, 558, 569)
(384, 641)
(85, 604)
LFA-1, CD28, CTLA-4
(56, 245, 450, 527)
(414, 588)
(67)
(527)
Références
(310)
CD4 (fonction postulée)
Récepteur du mannose
Molécules d'attachement:
infection en trans
DC-SIGN (in vitro)
HSPG (rôle controversé)
Récepteur Fc
Récepteur du complément
Syndécans
Molécules d'attachement:
infection en cis
Susceptibilité des différents types cellulaires à l’infection et au transfert du VIH-1 et molécules d’attachement
impliquées
Types cellulaires
Tableau 1
31
Négative
Négative
Négative
Positive
Positive
Positive
Négative
Négative
Lignées immortalisées de l'exocol (Ect1)
Endocol: épithélium cylindrique simple (polarisé)
Lignées immortalisées de l'endocol (ME180)
HeLa CD4+ (lignées immortalisées du col de
l'utérus)
Utérus (cellule de l’endomètre): épithélium
cylindrique simple (polarisé)
Lignées endométriales immortalisées (RL 95-2,
ECC1 et HEC-1)
Trompe de Fallope: épithélium cylindrique simple
(polarisé)
Cellules épithéliales de la cavité orale: épithélium
pavimenteux stratifié
n.d.
Négative (ou
très faible)
Exocol: épithélium stratifié pavimenteux
Intestin grêle (duodénum, jéjunum, iléon):
épithélium cylindrique simple (polarisé)
Négative
Expression
de CD4
Vagin: épithélium stratifié pavimenteux
Cellules épithéliales
Types cellulaires
CCR5
(biopsie du jéjunum)
CCR5 faiblement,
CXCR4
n.d.
CCR5 faiblement,
CXCR4 faiblement
CXCR4
CXCR4
Négative
Négative
Négative
CCR5,
CXCR4 faiblement
CCR5,
CXCR4 faiblement
Expression de
corécepteurs
Infection in vivo des muqueuses intestinales
documentée. Cellules primaires du jéjunum
réfractaire in vitro.
Susceptibles à l'infection. Implication de GalCer
mais aucune infection démontrée lors de la primoinfection in vivo.
Cellules permissives à l'infection.
Infection productive non prouvée. Serait
indépendante du CD4.
Cellules permissives à l'infection. Seulement par
souche X4? Controverse
HSPG
Infection productive non prouvée. Entrée par
endocytose postulée.
Infection productive non prouvée
Cellules non permissives à l'infection
Infection productive non prouvée
Cellules non permissives à l'infection
Molécules d'attachement:
infection en cis
Transfert par les cellules épithéliales
primaires du jéjunum (par CCR5).
Transfert par une liaison au GalCer et
relâche de virions par une liaison au
mannose
Le contact 2 jours post-infection avec
des cellules H9 permet la relâche de
virions. Transcytose postulée par
l’agrine et le GalCer.
n.d.
n.d.
Le contact des cellules infectées avec
des PBMC permet la relâche de virions
= transfert?
n.d.
Le contact des cellules infectées avec
des PBMC permet la relâche de virions
= transfert? HSPG impliqués
Transfert controversé. Aucune
transcytose.
Non permissives au transfert. Aucune
transcytose
Non permissives au transfert. Aucune
transcytose
Molécules d'attachement:
infection en trans
(230, 411)
(2, 225, 262, 325, 390, 567)
(237)
(8, 26, 43, 212, 233)
(25, 237, 648)
(387)
(134, 474, 589)
(134, 215, 237, 431, 443,
590)
(643)
(215, 237, 452, 648)
(215, 237, 243)
Références
Tableau 1 – suite Susceptibilité des différents types cellulaires à l’infection et au transfert du VIH-1 et molécules d’attachement
impliquées
32
n.d.
Négative
Rectum: épithélium cylindrique simple (polarisé)
Caco-2 (lignées cellulaires épithéliales du rectum)
Négative
Négative
Négative
Négative
Astrocytes
Oligodendrocytes
Neurones
Cellules endothéliales microvasculaires du cerveau
n.d. = non déterminé.
Positive
(faiblement)
Microglie
Légende :
Positive
(faiblement)
Macrophages péri-vasculaires et du parenchyme
Système nerveux central
Négative
HT-29 (lignées cellulaires épithéliales du côlon)
Négative
n.d.
Cellules M
Expression
de CD4
Côlon: épithélium cylindrique simple (polarisé)
Types cellulaires
CCR5, CXCR4
CCR5, CXCR4
CXCR4
CCR5,
CXR4 faiblement
CCR5, CXCR4
CCR5
Négative
CXCR4
CCR5, CXCR4
CXCR4
(biopsie du colon)
CXCR4
Expression de
corécepteurs
Cellules non permissives à l'infection in vivo.
Lignées cellulaires: infection CD4-indépendante,
GalCer dépendante
Permissivité limitée et controversée:
1) Non permissives: entrée par
macropinocytose et dégradation. Entrée
indépendante du CD4 et du CCR5 mais
dépendante des HSPG.
2) Permissive: indépendante des rafts et des
HSPG mais requiert les CSPG.
Cellules non permissives à l'infection
Permissivité limitée et controversée in vivo et in
vitro. Pourrait être indépendante du CCR5, du
CXCR4 mais dépendante du MR
Infection productive in vitro
Permissives
Non permissives à l'infection
Infection in vivo des muqueuses intestinales
documentée
Indépendante de CD4. Requiert le GalCer et
favorisée par le récepteur du complément C3b.
Infection in vivo des muqueuses intestinales
documentée.
Non permissives à l'infection.
Molécules d'attachement:
infection en cis
HSPG et CSPG permettent la
transcytose du VIH à partir de la gp120
mais de façon indépendante du CCR5
et du CXCR4
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
L’agrine et le galactosylcéramide sont
requis pour la transcytose
Galactosylcéramide permet la
transcytose
Galactosylcéramide permet la
transcytose de souches X4
Molécules d'attachement:
infection en trans
(20, 58, 323, 399)
(52, 211, 226)
(52, 211)
(52, 326)
(52, 211)
(52, 211)
(128)
(318, 411)
(66, 128, 164, 166, 167)
(61, 63, 259, 370, 411)
(180)
Références
Tableau 1 - suite Susceptibilité des différents types cellulaires à l’infection et au transfert du VIH-1 et molécules d’attachement
impliquées
33
34
1.10.1 Les lymphocytes T CD4+
Les lymphocytes T CD4+ sont la cible privilégiée de l’infection à VIH-1. Nous décrivons
d’abord quelques caractéristiques importantes de ces cellules afin d’aborder dans un
deuxième temps une description de la pathogenèse virale et du mécanisme d’infection.
1.10.1.1 Mise en contexte
In vivo, la plupart des cellules T CD4+ sont dans un état quiescent (G0) et, chez l’adulte,
environ la moitié des cellules quiescentes sont naïves (CD45RA+) alors que les autres sont
des cellules T CD4+ mémoires (CD45RO+) qui ont déjà répondu à un antigène. Les cellules
T CD4+ mémoires quiescentes ont une demi-vie de six mois et les cellules T CD4+ naïves
quiescentes ont une demi-vie encore plus longue. Si la population de cellules naïves est
maintenue par de nouvelles cellules dérivées du thymus, la stimulation antigénique entraîne
plutôt une vague de prolifération et de différenciation cellulaire des lymphocytes T naïfs en
cellules effectrices. La plupart des cellules effectrices meurent rapidement mais une portion
survit et retourne dans un état quiescent (G0) et ces cellules persistent alors comme cellules
mémoires (revue par (467)). Spécifions qu’une présentation antigénique de courte durée
favorise le développement de cellules effectrices précoces qui donnent lieu aux cellules
mémoires centrales, alors qu’une stimulation antigénique soutenue engendre les cellules
effectrices tardives produisant ensuite les cellules mémoires effectrices. Les cellules
mémoires centrales (CD62Lhigh/CCR7+) sont localisées dans les tissus lymphoïdes et les
cellules mémoires effectrices (CD62Llow/CCR7-), exprimant le CCR5 et le CCR2, sont
dirigées vers les tissus périphériques. Les cellules mémoires effectrices ont la capacité de
répondre rapidement dans un contexte antigénique. De façon globale, le CXCR4 est
exprimé par les cellules T CD4+ CD45RA+, alors que le CCR5 est exprimé par les cellules
T CD4+ mémoires effectrices (revue par (260, 523)).
1.10.1.2 Particularité du cycle réplicatif
Nous avons précédemment décrit que l’entrée du VIH-1 dans une cellule T CD4+ se
produit à la surface de la cellule par la fusion des membranes virales et cellulaires.
Toutefois, le contact des virions avec une telle cellule provoque, de façon simultanée et
35
dans une très grande proportion, l’endocytose des particules virales. Ainsi le VIH-1 peut
pénétrer à l’intérieur de la cellule par deux voies distinctes : la fusion et l’endocytose.
Cependant, seule la fusion des virions mène à l’infection productive des lymphocytes T
CD4+ car l’internalisation des virions est une voie sans issue dans ces cellules. En effet,
elle conduit à leur dégradation (340, 532). De plus, il s’agit d’un processus non spécifique
puisque les virions déficients en glycoprotéines de l’enveloppe sont aussi retrouvés dans les
vésicules intracellulaires (340, 532).
Ceci dit, le fait que l’endocytose du VIH-1 par les cellules T soit complètement inutile
voire néfaste au virus fait présentement l’objet d’un débat dans la littérature scientifique.
Deux études sont à souligner à cet égard. Premièrement, le contact entre des cellules
infectées qui relâchent des particules virales et des cellules T CD4+ primaires n’exprimant
pas les corécepteurs du VIH-1 induit la capture de ces virions par ces lymphocytes. Cette
internalisation n’entraîne pas l’infection des cellules T CD4+ mais lorsque le contact
cellulaire cesse, les virions internalisés (qui sont toujours infectieux) sont relâchés. Ceci
indique que : i) les virions endocytosés ne sont pas nécessairement dégradés et ii)
l’endocytose pourrait contribuer à la dissémination du virus in vivo (56). Deuxièmement,
on a remarqué que l’inhibition de l’acidification des endosomes dans les lymphocytes
augmente la fusion virale. Une des conclusions possibles suggérées par les auteurs est que,
lorsque la machinerie endolysosomale est inhibée, les virions internalisés échappent à la
lyse et la fusion du VIH-1 peut alors avoir lieu dans les endosomes. Ceci laisse croire que
dans certaines conditions, l’endocytose permet l’entrée du VIH-1 (532).
En ce qui concerne l’infection proprement dite des cellules T CD4+, leur progression à la
phase G1 du cycle cellulaire est requise pour que la formation d’un provirus puisse y avoir
lieu. Ainsi, les cellules T CD4+ qui sont en phase G0 du cycle cellulaire, donc quiescentes,
sont réfractaires à l’infection par le VIH-1. En effet, dans ces conditions cellulaires le cycle
viral est bloqué et ce durant et immédiatement après la transcription inverse (278).
Pourtant, on a détecté la réplication virale chez des cellules T CD4+ qui n’exprimaient pas
les marqueurs reconnus d’activation cellulaire. Des chercheurs ont postulé que de subtils
signaux d’activation (ex : cytokines ou molécules de co-stimulation) reçus par les cellules T
36
CD4+, sans pour autant déclencher le cycle cellulaire, seraient suffisants pour lever les
restrictions associées au cycle viral et rendre les cellules permissives à l’infection (revue
par (574, 584, 621)). Par exemple, chez les patients infectés par le VIH-1, les cellules T
CD4+ naïves non activées et/ou n’étant pas en phase de prolifération (G0/G1a) permettent
l’expression génique du VIH-1 (665), alors qu’en culture ces cellules sont réfractaires à
l’infection (661). Pour expliquer cette disparité, les chercheurs ont montré par des études ex
vivo que l’environnement retrouvé dans les organes lymphoïdes pourrait créer un état de
permissivité cellulaire à l’infection par le VIH-1, condition qui ne serait pas nécessairement
retrouvée dans le sang périphérique (151).
1.10.1.3 Dynamique d’infection des lymphocytes T CD4+
S’il est généralement admis que les cellules T CD4+ mémoires activées sont la principale
cible du VIH-1, des chercheurs se sont récemment penchés sur la contribution d’autres
sous-populations de lymphocytes T CD4+ à la pathogenèse virale. D’une part, parmi les
cellules isolées du sang périphérique de sujets séropositifs, ce sont les cellules T CD4+
mémoires centrales latentes qui contiennent le plus grand nombre de copies d’ADN viral.
Ceci suggère que, dans ce compartiment, ce type cellulaire est le plus fréquemment infecté
par le VIH-1. Quant aux cellules mémoires effectrices du sang périphérique, elles possèdent
dix fois moins d’ADN viral que les cellules mémoires centrales (70). Après ces types
cellulaires, et ce, malgré qu’elles soient peu susceptibles à l’infection par le VIH-1 (57), les
cellules T CD4+ naïves constituent la deuxième cible du VIH-1 dans la circulation
sanguine. Notons que les cellules T CD4+ effectrices du sang périphérique qui prolifèrent
ou qui ont proliféré contiennent plus d’ADN viral que les autres cellules T CD4+ naïves.
Finalement, in vivo il n’existe pas de corrélation entre le nombre de cellules T CD4+ naïves
et mémoires infectées, i.e. que le nombre de cellules T CD4+ mémoires infectées est
beaucoup plus important. Ceci implique que les cellules T CD4+ naïves ne contribuent pas
de façon significative au pool de cellules T CD4+ mémoires infectées, mais qu’elles
meurent suite à leur stimulation antigénique. La voie prédominante d’infection productive
des cellules T CD4+ mémoires est donc l’infection directe (70).
37
L’étude comparative des cellules T CD4+ du sang périphérique, des ganglions
lymphatiques et des muqueuses gastriques chez des sujets infectés par le VIH-1, de même
que dans le modèle simien du VIH-1, a apporté des éléments nouveaux quant à la
dynamique d’infection des lymphocytes par le VIH-1. Sachons d’abord qu’à l’état normal,
on retrouve des lymphocytes T CD4+/CCR5+ dans les ganglions lymphatiques et dans le
sang périphérique. Toutefois, l’abondance de ces cellules est nettement supérieure dans les
muqueuses gastriques. De plus, le tractus gastro-intestinal contient une proportion plus
importante de lymphocytes activés que le sang périphérique et les ganglions. Or, quoi que
le pourcentage de cellules T CD4+/CCR5+ ne varie pas dans les ganglions lymphatiques ni
dans le sang périphérique chez les sujets séropositifs en comparaison aux individus sains, il
est profondément diminué dans les muqueuses gastriques. Cette infection induit donc une
déplétion des cellules T CD4+/CCR5+ spécifiquement dans le tractus gastro-intestinal. En
revanche, le pourcentage de cellules T CD4+ mémoires effectrices activées dans les
ganglions lymphatiques et dans le sang périphérique chez les sujets infectés est supérieur à
celui des sujets sains. On estime que, sous l’effet de l’activation chronique du système
immunitaire qui prévaut chez les sujets infectés, les T CD4+ mémoires effectrices activées
sont recrutées aux sites d’intense réplication virale tels les ganglions. Étant donné que chez
les individus sains il y a peu de T CD4+ mémoires effectrices activées à cet endroit, leur
recrutement combiné à leur prolifération chez les sujets séropositifs se traduit par une
augmentation du nombre de ces cellules dans les ganglions. Par contre, dans les muqueuses
gastriques, l’infection soutenue des T CD4+ mémoires effectrices n’est que partiellement
contrebalancée par la prolifération cellulaire, y entraînant une déplétion profonde de ces
cellules (71, 320, 354) (c.f. Figure 6).
38
Figure 6
Processus infectieux dans les lymphocytes T CD4+
A) et B) Les cellules naïves émergent du thymus et atteignent les tissus lymphoïdes
secondaires où elles résident comme cellules naïves latentes jusqu’à ce qu’elles rencontrent
leur antigène propre. C) Une fois activées par un antigène, ces cellules migrent rapidement
vers les organes lymphoïdes effecteurs, et deviennent des cellules mémoires effectrices coexprimant le CD4 et le CCR5. Chez les sujets séropositifs, les ganglions lymphatiques
activés pourraient contenir plus de cellules CD4/CCR5+ activés. De plus, la réplication
virale a principalement lieu dans les muqueuses (tiré de : (627)).
1.10.2 Les cellules dendritiques
Voici d’abord quelques généralités sur les types de cellules dendritiques retrouvés dans
l’organisme, de même que sur leurs propriétés et leurs fonctions; on retrouvera la relation
entre le VIH-1 et ces cellules par la suite.
1.10.2.1 Types, propriétés et fonctions
Parmi les cellules dendritiques, on retrouve celles d’origine myéloïde et celles d’origine
plasmacytoïde. De plus, les centres germinaux contiennent des cellules dendritiques qui ne
dérivent pas de la moelle osseuse, à savoir les cellules dendritiques folliculaires (revue par
39
(139, 571)). Les cellules de Langerhans et les cellules dendritiques interstitielles (aussi
appelées dermiques) sont des cellules dendritiques d’origine myéloïde. Il existe aussi
d’autres types de cellules dendritiques d’origine myéloïdes dans la circulation sanguine et
lymphatique mais nous n’en ferons pas mention. Si les cellules de Langerhans résident dans
les épithéliums stratifiés pavimenteux (incluant la peau), les cellules dendritiques
interstitielles, quant à elles, sont largement répandues dans les tissus périphériques. On les
retrouve en effet dans i) le derme, ii) la lamina propria des muqueuses et iii) le tissu
interstitiel de la plupart des organes, incluant les reins, les poumons et le cœur. Spécifions
qu’une fois parvenues aux organes lymphatiques secondaires, les cellules dendritiques sont
nommées cellules dendritiques interdigitées. D’autre part, les cellules dendritiques
d’origine plasmacytoïde (ou lymphoïde, pDC) sont moins nombreuses et mal caractérisées
(revue par (35, 638)). Chez les sujets infectés par le VIH-1, il y a une déplétion progressive
des cellules dendritiques d’origine myéloïde et plasmacytoïde qui corrèle avec la charge
virale (139, 440, 441).
De façon générale, les cellules dendritiques (DC) se présentent sous deux formes
différentes dans l’organisme, à savoir les cellules dendritiques immatures et les cellules
matures, chacune possédant des propriétés et des fonctions qui leur sont propres. Les
cellules dendritiques immatures (iDC), grâce à leurs récepteurs phagocytaires et
endocytaires, capturent les antigènes dans les tissus périphériques. Ceci entraîne leur
transformation en cellules dendritiques matures (mDC) qui transportent les antigènes aux
organes lymphoïdes, les digèrent, puis présentent les peptides qui en résultent aux cellules
T. Les DC jouent donc un rôle essentiel dans l’activation de la réponse immunitaire. De
façon générale, les iDC possèdent une forte activité endocytaire mais une activité de
présentation antigénique réduite; il s’agit du cas contraire pour les mDC (3).
1.10.2.2 Le VIH-1 et les cellules dendritiques
L’infection des DC, quoique possible, est considérée comme un élément mineur dans la
pathogenèse virale, en comparaison du rôle qu’elles pourraient avoir dans la dissémination
du VIH-1. En effet, n’exprimant que faiblement le récepteur et les corécepteurs requis pour
l’entrée de ce virus dans une cellule cible, les mDC ne sont pas permissives à l’infection
40
par le VIH-1 in vitro et in vivo, et les cellules immatures le sont peu (revue par (638)). Par
ailleurs, elles joueraient un rôle crucial dans la primo-infection du VIH-1 puisqu’on estime
qu’elles propagent le virus du site initial de contact, soit les muqueuses, aux organes
lymphoïdes.
En résumé, les interactions entre les DC et le VIH-1 peuvent être divisées en différentes
étapes : i) attachement aux cellules à partir de divers récepteurs de surface, ii)
internalisation et/ou infection productive, iii) migration vers les organes lymphoïdes, puis
iv) transmission du VIH-1 aux lymphocytes T qui se traduit par leur infection productive.
Les sections qui suivent traiteront de ces différents types de contacts virus-cellules.
L’étude in vitro des cellules dendritiques dérivées des monocytes sanguins (monocytederived dendritic cells, MDDC) a permis de montrer que les interactions entre le VIH-1 et
les DC sont multifactorielles puisqu’elles impliquent divers récepteurs exprimés à la
surface de ces cellules. Par exemple, la gp120 est une protéine fortement glycosylée et de
nombreux glycans retrouvés sur cette protéine sont mannosylés. En conséquence, le VIH-1,
de types R5 et X4, lie le DC-SIGN et le récepteur du mannose sur les DC (222). Des
chercheurs ont récemment montré que cette liaison aux iDC entraîne l’endocytose des
particules virales (203, 289, 609). Les mDC internalisent aussi le VIH-1 mais l’identité du
récepteur cellulaire responsable de cet évènement demeure matière à débat car l’expression
du récepteur du mannose et de DC-SIGN est réprimée dans ces cellules (608, 609). Ceci
dit, alors que l’endocytose des ligands naturels du DC-SIGN mène à leur destruction par la
machinerie endolysosomale cellulaire, certains virus internalisés évitent cette lyse et
persistent dans des organelles acides situés en périphérie de la membrane plasmique dans
les iDC, et dans la région périnucléaire dans les mDC (182, 609). Or, ces virions qui ont
échappé à la dégradation demeurent infectieux, caractéristique fort avantageuse pour le
VIH-1 (289).
En effet, le contact subséquent entre des lymphocytes T CD4+ et les DC crée une synapse
virologique, où les virions qui ont été internalisés par les cellules dendritiques sont
retournés au milieu extra-cellulaire et transmis aux lymphocytes. Ce transfert des particules
virales conduit à l’infection de ces dernières; il s’agit d’un processus d’infection en trans.
41
Ainsi, la liaison du VIH-1 au DC-SIGN sur les DC permet l’accès à un compartiment
intracellulaire, ce qui, à terme, contribue à augmenter l’infection des lymphocytes T CD4+
(203, 289). À la lumière de ces études, des chercheurs ont proposé que, puisqu’in vivo les
DC sont l’une des premières cibles du VIH-1 dans les muqueuses, un tel processus servirait
à propager rapidement le virus lors de la primo-infection. Dans ce modèle, les DC servent
donc de cheval de Troie dans la dissémination du VIH-1 (23, 24, 363).
On estime que le transfert du VIH-1 par les iDC peut se faire par deux processus qui
diffèrent aux plans cinétique et mécanistique. D’abord, on retrouve le transfert précoce où
les particules virales sont rapidement transférées aux lymphocytes T après leur
internalisation. Ceci ne nécessite pas la synthèse de novo de virus par les iDC et diminue
rapidement dans le temps en raison de la dégradation des virions capturés. Ce transfert est
donc indépendant de l’infection productive des iDC. Quant à la deuxième phase, elle se
produit 24 à 48 h plus tard et se produit à la suite de l’infection productive des iDC. Il s’agit
du transfert tardif (609). Il est important de préciser que les cellules dendritiques immatures
et matures peuvent toutes deux transférer le VIH-1 (les souches virales X4 et R5).
Toutefois, seules les immatures sont susceptibles à l’infection par le VIH-1 et de façon
préférentielle par les souches R5 (428). Dans ce contexte, le transfert tardif du VIH-1 des
cellules dendritiques aux lymphocytes T CD4+ ne s’applique donc qu’aux cellules
dendritiques immatures et favorise les souches R5 (428, 609).
Outre les résultats que nous venons de présenter, la compréhension des mécanismes qui
sous-tendent le transfert de particules virales par les DC est embryonnaire et de nombreuses
questions importantes demeurent sans réponse. Par exemple, on n’a pas élucidé la voie par
laquelle le virus évite sa dégradation à la suite de son internalisation (23). De plus, afin
d’être transmis aux cellules T par les DC, les virions endocytés doivent être recyclés à la
surface des cellules. Le mécanisme responsable de ce processus est mal caractérisé (203).
Une première piste à cet égard est la suivante : les virions, qui résistent à la dégradation
dans les DC, résideraient dans des compartiments intracellulaires non conventionnels et
mal caractérisés ne contenant pas les marqueurs des endolysosomes tels que l’EEA1, le
CD63 et le LAMP-2 (198, 289, 609).
42
Malgré les études fort pertinentes illustrant le transfert du VIH-1 à la suite de son
interaction avec le DC-SIGN, on se demande si in vivo le virus s’attache bel et bien à ce
récepteur. En effet, alors qu’in vitro les cellules MDDCs immatures expriment
abondamment le DC-SIGN et le récepteur du mannose (608), ce profil d’expression semble
sensiblement différent in vivo : il est modulé en fonction du phénotype des cellules
dendritiques et de leur migration dans l’organisme (159, 239, 250, 608). Un deuxième
élément important qui remet également en cause la pertinence biologique de DC-SIGN est
le suivant : l’endocytose des virions par les DC n’est que partiellement inhibée par l’ajout
exogène de mannose ou d’anticorps dirigés contre cette lectine. Elle n’est pas non plus
bloquée lorsque l’expression de DC-SIGN y est réprimée. En s’appuyant sur ces résultats, il
est raisonnable de croire que d’autres récepteurs permettent la capture des virions par les
DC et/ou que d’autres mécanismes d’endocytose et de transfert sont mis en jeu (23, 39,
222, 239, 609). Outre le CD4 et les lectines de type C (222), des molécules d’adhésion
(ICAM-1) (208), les récepteurs du complément, et les récepteurs Fc (33) sont au nombre
des récepteurs putatifs du VIH-1 aux cellules dendritiques qui pourraient jouer un rôle dans
la pathogénèse virale.
Par ailleurs, on postule que le DC-SIGN servirait non seulement au transfert des virions
mais aussi à augmenter l’infection en cis des DC. En effet, l’étude des cellules HeLa et
293T exprimant de façon stable le DC-SIGN a permis de conclure que cette lectine facilite
l’attachement et l’internalisation des particules virales, évènement qui se traduit par une
augmentation de leur infectiosité (310, 427). En s’appuyant sur ces résultats, on estime
qu’en raison de cette endocytose du VIH-1, la fusion des virions menant à leur entrée
pourrait se produire non pas à la membrane plasmique mais plutôt dans les endosomes.
Ceci dit, les CD4/corécepteurs demeurent essentiels à ce processus puisque, par exemple,
l’infection est sensible à l’inhibiteur de fusion T-20. De plus, l’entrée est indépendante du
pH endosomal (310, 427, 638). Finalement, l’opsonisation des souches R5 du VIH-1 par
des molécules du complément et des IgG anti-VIH cause une augmentation de l’infection
des DC dérivées des monocytes à partir du récepteur du complément iC3b. Ceci démontre
une autre voie d’infection (33).
43
1.10.2.3 Les cellules de Langerhans
Les cellules de Langerhans, localisées dans les épithéliums stratifiés pavimenteux, ont des
dendrites qui s’étendent jusqu’à la lumière de l’épithélium. La position anatomique des
cellules de Langerhans dans les épithéliums génitaux, combinée à leur capacité à migrer de
la surface des épithéliums aux ganglions lymphatiques en réponse à des cytokines proinflammatoires, suggèrent que ces cellules pourraient être un vecteur important de la
transmission sexuelle du VIH-1 (265). Cependant, le mécanisme qui sous-tend cette
transmission serait différent de celui décrit pour les cellules dendritiques interstitielles.
D’une part, l’infection des cellules Langerhans est nécessaire au transfert du VIH-1 vers les
lymphocytes T CD4+ (il n’y aurait pas de transfert précoce). En effet, les cellules de
Langerhans expriment le récepteur CD4 et les corécepteurs à chimiokine et elles sont
susceptibles à l’infection par le VIH-1 (265, 505, 578). D’autre part, l’infection de ces
cellules, de même que leur transmission du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+, n’impliquent
pas les lectines de type C (la langerine) mais principalement le corécepteur CCR5 (265).
1.10.2.4 Les cellules dendritiques folliculaires
Finalement, les cellules dendritiques folliculaires sont situées dans les centres germinaux
des organes lymphoïdes secondaires où elles capturent et retiennent les antigènes sous la
forme de complexes immuns. Dans la pathogenèse du VIH-1, les tissus lymphoïdes
deviennent rapidement un réservoir majeur du virus contribuant ainsi à la persistance du
VIH-1 chez un sujet infecté. En fait, on estime que la majorité des particules virales dans
l’organisme est associée aux cellules dendritiques folliculaires. En effet, au cours des
phases aiguës et chroniques de la maladie, les cellules dendritiques folliculaires, par leurs
extensions cellulaires, capturent le VIH-1 sous forme de complexes immuns à l’intérieur
desquels le virus est opsonisé par des anticorps et/ou des protéines du complément. Or, les
particules virales capturées par ces cellules sont conservées à leur surface dans une forme
infectieuse pendant plusieurs mois, et constituent une source de virus infectieux à long
terme (78, 162, 553, 554).
44
1.10.3 Les macrophages
Les macrophages sont à la fois une cible du VIH-1 et un joueur essentiel de la défense
antivirale et, de ce fait, ils sont à la frontière entre la pathogenèse virale et la protection de
l’hôte. Voici cinq exemples à cet effet. Premièrement, l’infection des macrophages par le
VIH-1 affecte les fonctions de ces cellules (ex : la présentation antigénique et la destruction
intracellulaire des pathogènes par la phagocytose) et altère leur production de cytokines.
Ces dysfonctions alimentent l’inflammation chronique qui prévaut chez les sujets atteints
par le VIH-1 et endommagent les tissus (285, 312, 373, 486). Deuxièmement,
contrairement aux lymphocytes, l’infection des macrophages par le VIH-1 ne conduit pas à
leur mort puisque ceux-ci sont moins sensibles à ses effets cytopathogènes. De plus, les
macrophages sont peu susceptibles aux antiviraux (197, 574). Ces propriétés leur
permettent d’être à la fois un réservoir important du VIH-1 et un joueur pivot dans la
persistance de la maladie. Troisièmement, puisque les macrophages sont des cellules
présentatrices d’antigènes et qu’ils produisent des cytokines chimiotactiques, les
interactions entre macrophages et lymphocytes T CD4+ créent des conditions favorisant la
transmission intercellulaire du virus (revue par (628)). Quatrièmement, dans les ganglions
lymphatiques, l’apoptose se produit non seulement dans les lymphocytes infectés mais
aussi, et même davantage, dans les cellules non infectées (revue par (334)). Or, ce
processus a lieu particulièrement en présence de cellules présentatrices d’antigènes tels que
les macrophages (revue par (628)). Finalement, la capacité des monocytes et des
macrophages à migrer dans les organes et à survivre dans les tissus en fait des vecteurs de
l’infection. En effet, tout comme les cellules dendritiques, les macrophages pourraient
transporter, puis transmettre le VIH-1. Par exemple, la liaison du VIH-1 au récepteur du
mannose concentre le virus à la surface de ces cellules et conduit au transfert des virions
aux lymphocytes T CD4+ (414).
Nous abordons maintenant le mécanisme d’infection des macrophages. Différents types de
molécules de surface permettent l’attachement du VIH-1 sur les monocytes-macrophages et
pourraient jouer un rôle essentiel dans les étapes initiales d’infection de ces cellules. Les
HSPG sont de ce nombre. En effet, un traitement enzymatique par l’héparinase, éliminant
les chaînes d’héparane sulfate des protéoglycanes à la surface des cellules, diminue
45
l’attachement et l’infection à VIH-1 dans les HeLa CD4+ et les macrophages (387, 527).
Parmi les HSPG, ce sont les syndécanes qui sont requis pour l’infection en cis des
macrophages par le VIH-1 (527). Deuxièmement, l’opsonisation des particules virales par
les molécules du complément leur permet d’interagir avec les récepteurs du complément
CR1 (CD35) et CR3 (CD11b/CD18) présents à la surface des monocytes et des lignées
cellulaires monocytoïdes. Cette interaction favorise l’infection de ces cellules par un
processus qui est indépendant du récepteur CD4 mais qui requiert la participation du CCR5
(66, 595). Finalement, le récepteur FcRI à la surface des macrophages est responsable de
l’infection des macrophages par des virions opsonisés par des anticorps dirigés contre le
VIH-1 (235, 588).
Outre les mécanismes d’attachement du VIH-1 aux macrophages, il importe de souligner
qu’il existe des différences fondamentales entre les lymphocytes T et les macrophages dans
le processus infectieux de ce rétrovirus. D’abord, comme nous l’avons mentionné
précédemment, le VIH-1 présente un tropisme distinct pour les lymphocytes T et les
macrophages; les souches de laboratoire X4 infectant préférentiellement les lymphocytes,
alors que les macrophages y sont réfractaires. Pourtant, les monocytes et les macrophages
expriment le corécepteur CXCR4 (629). Plusieurs études ont tenté d’expliquer cette
inhibition. On postule que chez les cellules exprimant faiblement le CD4, telles que les
macrophages, la co-expression de CCR5 et de CXCR4 par ces cellules provoque une
réduction significative de la fusion du VIH-1 à partir du CXCR4; évènement se traduisant
par une perte de la susceptibilité à l’infection par les souches X4. En effet, dans ces
conditions, il y aurait une compétition des souches X4 et R5 pour leur association au CD4,
ce qui aurait pour effet de moduler la susceptibilité à l’infection des cellules par ces
différentes souches (314). Ceci dit la susceptibilité même des macrophages aux souches X4
demeure controversée. En effet, si ces cellules sont insensibles aux souches X4 de
laboratoire du VIH-1, elles sont néanmoins permissives aux souches X4 primaires (34, 649651).
Le deuxième élément distinctif concernant l’infection des macrophages est le processus
d’entrée. Celui-ci, de même que les étapes précoces du cycle viral du VIH-1, n’aurait pas
46
lieu par fusion à la membrane mais serait plutôt lié à l’endocytose des virions. En effet, une
étude a montré que rapidement après leur contact avec des macrophages, les virions se
retrouvent dans des vésicules intracellulaires, les macropinosomes. Alors que la majorité
des virions internalisés est dégradée, une fraction de ceux-ci échappe à la lyse et complète
leur cycle viral. Cette conclusion s’appuie sur le fait que des agents pharmacologiques,
inhibant la macropinocytose, bloquent l’infection des macrophages. Spécifions qu’alors
même que la macropinocytose du VIH-1 est indépendante de la gp120, l’accès des virions
au cytoplasme requiert, quant à lui, la participation de l’enveloppe virale (341). Le dernier
aspect à remarquer est le bourgeonnement du VIH-1 : tel que décrit ultérieurement (c.f. la
section 1.6.3.5), il se produit à partir des endosomes des macrophages plutôt qu’à la
membrane plasmique (456, 503).
1.10.4 Les cellules endothéliales
Les cellules endothéliales participent à plusieurs égards à la pathogénèse du VIH-1.
Tapissant le système cardiovasculaire dans son ensemble, les cellules endothéliales sont par
conséquent en contact fréquent avec les cellules T CD4+ mémoires. Or, les cellules
endothéliales fournissent des signaux, qui sont en partie relayés par le récepteur T (T cell
Receptor, TCR), aux cellules T CD4+ mémoires infectées par le VIH-1, et qui
conjointement avec le Nef et le Vpr, activent fortement la production virale dans ces
dernières (95, 96). De plus, les lymphocytes des sujets séropositifs, comparés à ceux de
sujets sains, sont plus aptes à migrer à travers une monocouche de cellules endothéliales
confluentes in vitro (50). Or, une étape déterminante dans l’évolution de l’infection à VIH1 semble être le moment où les lymphocytes infectés acquièrent la capacité de transmigrer
et d’exporter des particules infectieuses à travers des barrières vasculaires et d’atteindre
divers tissus et organes (revue par (49)).
En ce qui concerne la susceptibilité à l’infection des cellules endothéliales, les études
publiées font état de résultats divergents. D’abord, les cellules endothéliales sinusoïdales
hépatiques (290, 569), de même que les cellules endothéliales microvasculaires de la
moelle épinière seraient permissives à l’infection productive par le VIH-1 (394). De plus,
les HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) permettent in vitro la réplication
47
virale. Notons que le processus d’entrée menant à l’infection de ces cellules serait
indépendant du CD4 car les HUVEC n’expriment pas ce récepteur (109). Toutefois,
d’autres auteurs ont plutôt observé que les HUVEC demeurent réfractaires au VIH-1 (290,
291).
Dans ce contexte, le rôle des cellules endothéliales serait peut-être davantage lié à la
propagation du VIH-1. Les principales molécules d’attachement du VIH-1 aux HUVEC
sont les héparanes sulfates (59). Or suite à cette liaison, le VIH-1 peut être soit conservé
dans un état infectieux pendant plusieurs jours par la cellule ou être transféré aux cellules T
CD4+ par un processus en trans qui amplifie la réplication du VIH-1 dans ces dernières
(59). Précisons qu’on n’a pas encore déterminé si la liaison du VIH-1 aux HSPG sur les
cellules endothéliales entraîne l’endocytose du VIH-1 ou si les virions restent plutôt
attachés à leur surface. Ceci dit, considérant que les veinules endothéliales supérieures des
adénoïdes expriment fortement le syndécane-3, cette propriété des cellules endothéliales de
capturer/transférer le VIH-1 pourrait avoir des conséquences biologiques importantes dans
la dissémination du VIH-1 in vivo (59). Des résultats préliminaires indiquent également que
la présence du CD62L à la surface des particules virales permettrait un meilleur
attachement du VIH-1 aux HUVEC, se traduisant par un transfert et une infection en trans
accrus des lymphocytes T CD4+ (594). De même, on pense que le DC-SIGNR/L-SIGN,
exprimé par les cellules endothéliales sinusoïdales du foie et des ganglions lymphatiques,
provoquerait l’attachement à ces cellules endothéliales, le transfert du VIH-1 aux
lymphocytes T CD4+ et l’infection en trans de ces cellules (41, 482).
1.10.5 Le système nerveux central
Chez plus de 25% des sujets infectés, le VIH-1 cause des troubles neurologiques dont la
sévérité varie de désordres cognitifs et moteurs légers à la démence. La neuropathologie
associée à l’infection par le VIH-1 est caractérisée par : i) des dommages extensifs aux
axones, ii) l’envahissement par les astrocytes des tissus endommagés, iii) la perte de
myéline et iv) l’infiltration de divers types cellulaires dont les cellules géantes
multinucléées, les cellules microgliales et les monocytes/macrophages en provenance du
sang (revue par (211)).
48
Au plan anatomique, le parenchyme du cerveau est séparé du reste du corps par la barrière
hémato-encéphalique qui est une couche cellulaire sélectivement perméable composée de
cellules endothéliales microvasculaires. Ces cellules sont associées les unes aux autres par
des jonctions étanches et contrôlent de façon étroite le transport de molécules et de cellules
en provenance de la circulation sanguine vers le cerveau. Par ailleurs, les astrocytes et les
macrophages péri-vasculaires se retrouvent au voisinage de l’endothélium des capillaires
cérébraux. Les astrocytes, entre autres fonctions, régulent la perméabilité de la barrière
hémato-encéphalique. Finalement, les neurones, les cellules oligodendritiques et
microgliales se retrouvent dans le parenchyme cérébral (revue par (211)).
Pour qu’il y ait infection des cellules cérébrales, il faut d’abord que les virions franchissent
les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, soit la barrière hématoencéphalique. Deux voies, qui ne s’excluent pas mutuellement, sont postulées: 1) des
particules virales libres traversent la barrière hémato-encéphalique ou 2) des monocytes
et/ou des lymphocytes infectés par le VIH-1 traversent cette barrière (hypothèse du cheval
de Troie) et s’établissent dans le parenchyme cérébral. En ce qui concerne le passage du
VIH-1 par des cellules infectées, le contact des monocytes activés et/ou infectés par le
VIH-1 avec les cellules endothéliales microvasculaires induit l’expression des molécules
d’adhésion E-sélectine et VCAM-1 chez ces dernières, ce qui pourrait favoriser la
transmigration de cellules infectées par le VIH-1 au travers des cellules de la barrière
hémato-encéphalique (430).
Pour ce qui est du passage de virions libres, deux possibilités sont envisagées. D’abord, il
pourrait y avoir infection des cellules endothéliales microvasculaires, suivie d’un
bourgeonnement de nouvelles particules virales du côté du parenchyme cérébral (20, 393,
483). Ces cellules n’expriment pas le récepteur CD4. Cependant, elles expriment le CCR5,
le CXCR4, le DC-SIGN et le DC-SIGNR (399). Or, l’infection des cellules endothéliales
microvasculaires du cerveau impliquerait l’attachement des virions aux CSPG (20). Par
contre, contrairement à cette étude, d’autres auteurs ont observé que les virions seraient
internalisés par macropinocytose par ces cellules endothéliales, événement qui conduirait à
leur dégradation et non à l’infection des cellules (323). De plus, peu d’études corroborent le
49
fait que les cellules endothéliales microvasculaires soient infectées in vivo. La susceptibilité
à l’infection de ces cellules est donc incertaine (revue par (52)). L’autre possibilité est que
les cellules endothéliales microvasculaires capturent les virions, pour ensuite les relâcher du
côté du cerveau par un mécanisme de transcytose (36, 37, 58, 323). Ce passage transcellulaire se ferait grâce à la liaison de la gp120 aux HSPG et aux CSPG exprimés à la
surface de ces cellules, et serait indépendant à la fois du CD4 et des corécepteurs CXCR4 et
CCR5 (58).
En plus de ces voies de passage trans-cellulaires, on postule que le VIH-1 pourrait utiliser
une voie para-cellulaire impliquant les jonctions étanches. En effet, la protéine virale Tat
perturbe l’expression et la distribution des protéines des jonctions étanches des cellules
endothéliales microvasculaires du cerveau et induit leur apoptose (revue par (211) et (1,
269)). Ces évènements perturbent l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, ce qui
pourrait alors favoriser le passage du VIH-1 au cerveau (1, 15, 269).
Une fois la barrière hémato-encéphalique franchie, le VIH-1 peut alors infecter le
parenchyme cérébral. Quoique des lignées dérivées de neuroblastomes soient susceptibles
in vitro à l’infection par le VIH-1 par un mécanisme impliquant l’attachement du virus au
GalCer (226), in vivo les neurones demeurent réfractaires à cette infection (revue par (52)).
En fait, les principales cibles d’infection par le VIH-1 dans le cerveau sont les macrophages
et les cellules microgliales péri-vasculaires et/ou du parenchyme. De plus, les macrophages
et les microglies surproduisent des protéines virales (telles que la gp120, le Tat, et le Vpr),
des chimiokines et des cytokines qui induisent la dysfonction ou l’apoptose des neurones et
des astrocytes, causant les troubles neurologiques décrits plus haut (revue par (211)). Si
l’étude de l’infection des astrocytes in vivo et in vitro a donné des résultats fort variables
(revue par (211)), certains chercheurs estiment tout de même qu’elle peut se produire.
Citons l’étude de Liu et al qui décrit un exemple intéressant du mécanisme d’infection des
astrocytes. Les auteurs de cette étude ont montré que l’entrée du VIH-1 dans ces cellules se
fait par endocytose suivant la liaison du virus au récepteur du mannose. Notons qu’elles
n’expriment pas le CD4. De plus, l’accès des virions au cytoplasme, donc les étapes
initiales du cycle viral, est étroitement lié au transit des virions par les endosomes. En effet,
50
la présence d’agents lysosomotropiques inhibe l’infection du VIH-1 dans les astrocytes. En
s’appuyant sur ces résultats, on conclut que le mécanisme d’entrée du VIH-1 dans les
astrocytes est radicalement différent de celui utilisé dans les lymphocytes T CD4+ (326).
1.10.6 Les cellules épithéliales
1.10.6.1 Structure et fonctions
Les muqueuses forment le revêtement tissulaire qui tapisse l’intérieur du conduit digestif
(cavité orale, intestin, rectum, anus) et reproducteur (vagin, col de l’utérus (endocol et
exocol), utérus, trompe de Fallope, prépuce, verge du pénis, urètre) de l’organisme. Les
muqueuses jouent un rôle crucial dans la primo-infection par le VIH-1 parce qu’elles
constituent une barrière physique à l’entrée de ce rétrovirus dans l’organisme, barrière qui
doit absolument être franchie par les particules virales afin d’atteindre les organes
lymphoïdes de l’organisme.
Les muqueuses sont formées de cellules épithéliales qui reposent sur une couche dense de
tissu conjonctif, la lamina propria. De plus, parce que les muqueuses font face au monde
extérieur, elles sont extrêmement actives au plan immunologique. La plupart des cellules
immunitaires des muqueuses sont distribuées de façon diffuse dans le tissu conjonctif subépithélial. Ces cellules incluent des lymphocytes B, des lymphocytes T CD8+ et CD4+, des
cellules NK, des monocytes/macrophages et des cellules dendritiques. De plus, les cellules
épithéliales expriment une variété de molécules d’adhésion et de cytokines proinflammatoires qui permettent à ces cellules d’interagir avec les cellules mononucléaires et
les cellules dendritiques sous-jacentes (intra-épithéliales ou de la lamina propria). Les
interactions étroites entre les cellules épithéliales et les cellules du système immunitaire ont
d’importantes répercussions sur la transmission du VIH-1 (560).
Il existe divers types de muqueuses qui sont définis par l’organisation et la structure des
cellules épithéliales qui les constituent. En fonction de leur forme, on distingue les cellules
épithéliales pavimenteuses, cubiques ou cylindriques. De plus, en fonction du nombre de
couches de cellules épithéliales superposées, on retrouve les épithéliums simples, stratifiés,
pseudostratifiés et de transition. Les épithéliums simples sont formés d’une monocouche de
51
cellules épithéliales associées les une aux autres par des jonctions serrées et reposent sur
une lamina propria vascularisée. Ces cellules possèdent deux domaines dans leur
membrane plasmique : apical et basolatéral. La surface apicale des épithéliums simples, qui
peut présenter de nombreuses microvillosités, est typiquement retrouvée du côté de la
lumière du tractus. La portion latérale attache les cellules adjacentes entre elles alors que la
portion basale repose sur la lamina propria et fait face au milieu interne (i.e. la circulation
sanguine) (revue par (549, 647)).
Les cellules épithéliales simples sont polarisées, caractéristique distinctive et fondamentale
de ce type d’épithélium. D’abord, les domaines apical et basolatéral possèdent une
composition protéique et lipidique qualitativement et quantitativement différente, leur
conférant des propriétés morphologiques et biochimiques distinctes. Ensuite, la distribution
des organelles dans le cytoplasme de même que celle du cytosquelette cytoplasmique et
cortical dans les cellules épithéliales simples est asymétrique. La création et le maintien de
la polarité cellulaire sont assurés par divers mécanismes qui incluent : i) l’attachement de la
cellule à un substrat, ii) des contacts cellule-cellule extensifs où les jonctions serrées situées
au pôle apical empêchent la diffusion latérale des protéines et des lipides d’un domaine à
l’autre et iii) le ciblage des protéines nouvellement synthétisées au domaine approprié
(revue par (90, 273, 513)).
Le fait que les cellules épithéliales simples soient polarisées leur confèrent plusieurs
fonctions biologiques telles que : i) la formation d’une barrière étanche pour l’organisme et
ii) le contrôle des échanges entre la lumière et la circulation sanguine. Premièrement, en ce
qui concerne l’étanchéité de la barrière, les jonctions serrées (zona occludens) forment une
ceinture continue à la frontière des domaines apical et latéral entre des cellules épithéliales
adjacentes. Ceci permet : i) de marquer la frontière entre les domaines apical et basolatéral,
ii) de limiter les mouvements des constituants membranaires d’un domaine vers l’autre, et
iii) d’empêcher la diffusion intercellulaire d’ions et de macromolécules. Deuxièmement en
ce qui à trait au contrôle des échanges avec le milieu extracellulaire, les cellules épithéliales
polarisées possèdent un transport par endocytose qui est vectoriel et bidirectionnel entre la
lumière et la circulation sanguine. Ceci découle de la distribution polarisée des
52
macromolécules cellulaires et de la présence d’un système de transport endosomal à des
domaines spécifiques de la membrane. Grâce à cette fonction, les épithéliums simples
peuvent assurer, non seulement le recyclage et la dégradation, mais aussi la transcytose de
macromolécules d’un pôle vers l’autre (revue par (62, 412, 513, 549, 647)). Les surfaces de
l’estomac, de l’intestin grêle, du côlon (incluant le rectum) et de l’endocol sont recouvertes
par un épithélium cylindrique simple (revue par (62)) (c.f. Figure 7).
D’autre part, les épithéliums stratifiés, qui reposent sur une lamina propria et une sousmuqueuse vasculaire sous-jacente, sont formés de multiples couches de cellules épithéliales
allant de 20 à 45 cellules d’épaisseur. Les épithéliums stratifiés sont divisés en sections: la
couche basale (cellules cubiques de petite taille), les cellules intermédiaires (cellules plus
volumineuses, losangiques), et la couche la plus superficielle (cellules superficielles). La
couche superficielle peut être kératinisée, c’est le cas de l’épiderme. Alors qu’il existe
toujours une controverse à ce sujet, plusieurs auteurs sont tout de même venus à la
conclusion que les jonctions étanches sont généralement absentes des épithéliums stratifiés
(revue par (62, 297)). Dans ce contexte, ces épithéliums ne sont donc pas polarisés et ne
peuvent assurer un transport vectoriel de macromolécules par la transcytose. En l’absence
de jonction serrée des macromolécules extracellulaires et d’autres types cellulaires, telles
que les cellules de Langerhans, sont libres de diffuser entre les cellules épithéliales par un
transport paracellulaire et peuvent atteindre la lumière du tissu. Toutefois, des éléments
structuraux des épithéliums stratifiés limitent tout de même la diffusion passive de
molécules vers les couches profondes de l’épithélium tels que: i) la superposition de
plusieurs couches de cellules épithéliales, ii) la présence de desmosomes et de jonctions
adhérentes
intercellulaires et iii) la présence de matériel lipoïde. La cavité orale, le
pharynx, du vagin, l’exocol, le prépuce et de l’anus sont recouverts d’un épithélium
pavimenteux stratifié (revue par (62, 412)) (c.f. Figure 7).
53
Figure 7
Comparaison entre un épithélium simple et un épithélium stratifié
(tiré de : (62)).
L’infection des cellules épithéliales par le VIH-1 est controversée et plusieurs études
présentent des résultats divergents à ce sujet. De façon générale, les cellules épithéliales
expriment peu ou pas les récepteurs et corécepteurs requis pour l’entrée du VIH-1 dans une
cellule cible. Ainsi, le taux d’infection dans ces cellules est généralement faible. Les
épithéliums constituent tout de même un élément clé de la primo-infection et dans cette
54
perspective, nous présentons dans les prochaines sections un état de la littérature à ce sujet
qui est divisé en fonction du site anatomique des épithéliums.
1.10.6.2 Épithéliums génitaux féminins : endocol, exocol et vagin
On peut inférer, d’après des études faites chez le modèle expérimental simien et des
données épidémiologiques, qu’au cours de la transmission sexuelle du VIH-1 chez la
femme, le virus réussit à pénétrer les muqueuses des organes génitaux inférieurs (vagin et
exocol) et probablement aussi des organes génitaux supérieurs (l’endocol, l’utérus, les
trompes de Fallope) (revue par (374)). Rappelons que le vagin et l’exocol sont formés de
cellules épithéliales stratifiées pavimenteuses alors que l’endocol est formé d’un épithélium
cylindrique simple. Le système immunitaire muqueux du tractus génital inférieur consiste
en des cellules dendritiques, monocytes/macrophages, et lymphocytes T et B dans la lamina
propria. Les cellules de Langerhans sont nombreuses dans les couches épithéliales du col
de l’utérus et leurs dendrites s’étendent jusqu’à la lumière de l’épithélium ((215) et revue
par (374)).
Il est établi que le mucus cervical et la sécrétion de SDF-1 (ligand naturel de CXCR4) par
les cellules de l’endocol confèrent une certaine protection antivirale en régulant à la baisse
la présence de CXCR4 à la surface des cellules ciblées par le VIH-1 (4). Toutefois, certains
auteurs ont montré que des lignées immortalisées de cellules endométriales (les HEC-1, les
ECC1 et les RL 95-2), de même que les cellules épithéliales primaires isolées des trompes
de Fallope, de l’utérus, de l’endocol et de l’exocol, sont permissives à l’infection par des
virions libres (25, 26, 212, 237). D’autres auteurs ont également pu détecter une infection
productive du VIH-1 dans les épithéliums génitaux mais leurs résultats présentent une
différence majeure. En effet, les lignées immortalisées de l’endocol (ME-180), de même
que les cellules primaires du col de l’utérus, sont susceptibles à l’infection par le VIH-1
seulement lorsqu’elles sont mises en contact avec des cellules du sang périphérique
infectées; ces cellules épithéliales sont réfractaires à l’infection par des virions libres (589,
590). Dans cette perspective, les auteurs de ces études ont alors postulé que la transmission
sexuelle du VIH-1 se ferait par l’infection des cellules épithéliales suite à leur contact avec
des cellules infectées provenant d’un partenaire sexuel séropositif (589, 590).
55
Ce modèle est controversé puisque des résultats opposés quant à la susceptibilité à
l’infection des cellules génitales ont été publiés. En effet, selon d’autres auteurs l’infection
des cellules HEC-1, qui expriment le CXCR4 et le GalCer mais non le CD4 ou le CCR5,
n’a pu être démontrée (43, 233). En revanche, les HEC-1 permettraient la transcytose du
VIH-1 à la suite de son interaction avec le GalCer et/ou des lectines de type C liant le
mannose exprimés par ces cellules épithéliales (8, 43, 233). Dans le même ordre d’idée, les
ME-180 et les cellules primaires isolées de l’endocol, exprimant le GalCer mais non le
CD4, le CXCR4 ou le CCR5, de même que la lignée cellulaire immortalisée de l’exocol
(les Ect1), sont réfractaires à l’infection productive par le VIH-1. En effet, ni la présence de
provirus ni une production virale n’ont pu être détectées dans ces cellules (134, 643).
Précisons tout de même que lorsque ces cellules ont été infectées pendant une période de 16
à 24 h, puis ensuite mises en contact avec des PBMC, on a pu alors noter une certaine
production virale. Les auteurs ont conclu que ces cellules ont la capacité de séquestrer le
VIH-1, par un attachement impliquant les HSPG, et de le transférer aux lymphocytes (134,
643). De plus, ces cellules épithéliales prétraitées à la trypsine ne transfèrent plus le VIH-1,
indiquant que les particules virales sont simplement attachées à la surface de ces cellules
épithéliales et non internalisés (134).
Les études suivantes, qui sont fort probantes, démontrent également que les cellules
épithéliales sont réfractaires à l’infection par le VIH-1. Premièrement, l’analyse de biopsies
faites à partir des organes génitaux de femmes infectées par le VIH-1 et des études faites à
partir de la culture d’organes du col de l’utérus ex vivo ont montré que les cellules infectées
par
le
VIH-1
sont
essentiellement
situées
dans
la
muqueuse
sub-épithéliale
(particulièrement des macrophages) alors que les cellules épithéliales de l’endocol, de
l’exocol et du vagin demeurent réfractaires à l’infection par ce rétrovirus (215, 431, 443).
Deuxièmement, les premières cibles d’infection par le VIS, à la suite de l’infection
expérimentale intra-vaginale de macaques, sont les cellules sub-épithéliales du col et du
vagin (375, 563).
Ces dernières études illustrent qu’une pénétration trans-épithéliale du VIH-1 a bel et bien
lieu lors de la primo-infection. Cependant, puisque les cellules épithéliales sont réfractaires
56
à l’infection, on conclut qu’un épithélium génital intact constitue une barrière efficace à la
transmission du VIH-1. La participation directe de la muqueuse au passage du VIH-1 est
donc remise en cause. Dans ce contexte, une question cruciale demeure épineuse :
l’épithélium joue-t-il un rôle actif dans le passage du VIH-1 ou au contraire, est-il
réfractaire au passage du VIH-1? Les mécanismes qui sous-tendent la transmission du VIH1 à partir des muqueuses seront décrits plus longuement à la Section 1.11.2.1.
1.10.6.3 Épithéliums uro-génitaux masculins : prépuce, gland, verge et épithélium de
l’urètre
La verge du pénis, tout comme le prépuce, sont couverts d’un épithélium stratifié. En ce qui
concerne la transmission impliquant la muqueuse de prépuce, de façon similaire à la
transmission du VIH-1 chez la femme, les cellules infectées par le VIH-1 dans cette
muqueuse ne sont pas les cellules épithéliales mais bien les cellules immunitaires. Ces
dernières incluent les cellules de Langerhans et les cellules T CD4+ que l’on y retrouve en
grand nombre (362, 453). Notons que le DC-SIGN est co-exprimé avec le CD4 et le CCR5
par les cellules dendritiques et macrophages du prépuce, suggérant un contexte favorable au
transfert et à la dissémination du VIH-1 (556). Par ailleurs, chez les hommes circoncis, on
postule que la transmission du VIH-1 se ferait à partir de l’épithélium du gland. Le virus
pourrait être aussi transmis à partir de la muqueuse de l’urètre à la suite de traumatismes
causés à l’épithélium de la verge (ex : ulcère génital) (254, 453).
1.10.6.4 Tractus gastro-intestinal supérieur et inférieur, rectum et anus
Le VIH-1 peut infecter certaines cellules épithéliales immortalisées du côlon (telles que les
cellules HT-29) à la suite d’un contact à leur pôle apical ou basolatéral (166, 167).
L’infection des HT-29 est accrue lorsque les particules virales sont préalablement mises en
contact avec du sperme puisque les molécules du complément qui s’y retrouvent entraîne
une opsonisation du VIH-1 (66). D’autre part, les HT-29 n’expriment pas le CD4, ni le
CCR5 et leur infection par des souches de laboratoire du VIH-1 requiert la participation
conjointe du GalCer et du CXCR4 (128, 164). On a montré que dans ce processus,
l’interaction du VIH-1 avec le GalCer exprimé par les HT-29 nécessite la participation
conjointe de trois partenaires : les domaines glycosylés de la gp120 (région V3), le domaine
57
lectine de la gp41 et le domaine de la membrane épithéliale qui contient le GalCer. Le
contact initial entre la gp120 et le GalCer à la surface d’une cellule épithéliale stabiliserait
les radeaux lipidiques à la surface cellulaire ce qui permettrait alors la liaison entre le
domaine lectine de la gp41 et le GalCer (6). Le GalCer participerait ensuite activement à la
formation du complexe de fusion (165, 242). Fait intéressant, la lignée immortalisée de
cellules épithéliales du côlon Caco-2, qui n’exprime pas le GalCer, est réfractaire à
l’infection par le VIH-1, démontrant l’importance de ce sphingolipide dans l’infection
(164). Les entérocytes fœtaux primaires sont également sensibles à l’infection par des
souches de laboratoire mais demeurent insensibles à des isolats cliniques du VIH-1 (93).
Finalement, alors que l’infection des muqueuses intestinales, duodénales et rectales in vivo
est documentée, l’infection des cellules épithéliales proprement dite n’a pas été investiguée,
ce qui constitue une question importante dans la compréhension de la primo-infection (230,
279, 318, 411).
Outre l’infection des cellules épithéliales, d’autres modèles sont postulés. Des études
portant sur des cellules épithéliales immortalisées de l’intestin ont montré que le contact
entre le pôle apical de ces cellules et des PBMC infectés par le VIH-1 induit le
bourgeonnement polarisé du VIH-1 par les PBMC. Les virions nouvellement relâchés sont
alors rapidement internalisés par les cellules épithéliales par endocytose pour être
acheminés par un transport vésiculaire intracellulaire au travers des cellules épithéliales et
relâchés intact au pôle basolatéral. Il s’agit d’un processus de transcytose qui n’implique
pas la réplication de novo de particules virales (61, 63). On a confirmé la pertinence
biologique de ce processus par des études similaires, cette fois faites ex vivo en utilisant des
spécimens provenant de muqueuses duodénales humaines (63). Le contact direct entre la
surface apicale des cellules épithéliales et les cellules sanguines infectées par le VIH-1 est
requis puisque l’internalisation et la transcytose de virions libres sont négligeables. Dans ce
contexte, les chercheurs ont émis deux hypothèses : premièrement, les cellules du sang
périphérique sont capables de traverser la couche de glycolax qui couvre les cellules
épithéliales et de les atteindre, alors que les virions libres ne le peuvent pas (61, 63).
Deuxièmement, les cellules du sang périphérique adhèrent à la membrane plasmique
épithéliale apicale, établissant un microenvironnement similaire à une synapse
58
immunologique. Cette synapse « mucosale » provoque des modifications dans les
membranes des deux types cellulaires, qui, à terme, induisent l’endocytose et à la
transcytose des particules virales par les cellules épithéliales (8). On pense que
l’engagement de l’intégrine beta-1, de même que l’agrine, servant de molécule
d’attachement au VIH-1 à la surface des cellules épithéliales par le domaine P1 de la gp41,
et le GalCer, le récepteur cellulaire du VIH-1 sur ces cellules, sont tous trois requis pour la
formation de cette synapse (7, 8).
Notons également qu’une équipe a isolé des cellules épithéliales primaires du jéjunum et
montré que le transfert du VIH-1 à partir de ces cellules aux lymphocytes T CD4+
impliquait la liaison du VIH-1 au GalCer et au CCR5 plutôt qu’au CXCR4 (370). Un autre
modèle envisagé, et qui est sensiblement similaire à la transcytose du VIH-1 par les cellules
épithéliales, est le transport trans-épithélial des virions par les cellules M retrouvées dans
les Peyers’s patch. Ce processus implique l’attachement des virions au corécepteurs
CXCR4 et au GalCer (180).
En ce qui concerne le tractus gastro-intestinal supérieur, il pourrait être également le portail
d’entrée du VIH-1, et ce, à la suite de contacts oraux-génitaux avec un partenaire infecté
par le VIH-1 (370). Toutefois, s’il n’est pas exclu que le virus puisse traverser cet
épithélium, de nombreux facteurs hostiles au VIH-1 sont présents in vivo dans la salive et
dans l’estomac et qui fort probablement nuisent considérablement au virus (revue par
(546)). Cette réalité est bien différente si on considère la transmission verticale du VIH-1.
On présume que la muqueuse du tractus supérieur gastro-intestinal est le site d’entrée du
VIH-1 chez les fœtus et les nouveau-nés, et ce, à la suite de l’ingestion de liquide
amniotique in utero (sous toute réserve puisque la charge virale amniotique est quasiment
nulle (383)), de cellules infectées au moment de la naissance ou encore de lait maternel
contaminé durant l’allaitement (193, 257, 530). En effet, les amygdales ne sont pas encore
développées chez les fœtus et les nouveau-nés alors que leur estomac ne contient pas
d’acide gastrique. Ceci pourrait permettre au VIH-1 d’atteindre, sans être dégradé dans
l’estomac, les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal supérieur (370).
59
1.10.6.5 Épithélium de la cavité orale et du pharynx
Lors de relations sexuelles homosexuelles, les contacts oraux-génitaux seraient plus
communs que les contacts anaux génitaux. Or, les contacts sexuels par voie orale (receptive
oral sex) est connue comme étant un facteur de risque dans l’infection à VIH-1 qui pourrait
contribuer au taux élevé de transmission du VIH-1 enregistré chez les homosexuels de sexe
masculin (revue par (516)). L’étude de biopsies prélevées chez des sujets séropositifs a
montré que les cellules épithéliales de la cavité orale comportaient dans leur génome le
provirus du VIH-1, suggérant que ces cellules seraient infectées par le VIH-1 in vivo. Ceci
corrobore l’hypothèse selon laquelle la transmission du VIH-1 par contacts oraux est
possible (494, 495, 514).
D’autre part, on postule que la cavité orale pourrait non seulement entraîner la
contamination d’un partenaire sexuel mais également être le site de la primo-infection. En
effet, on a montré que le VIH-1 atteint les organes lymphoïdes à la suite d’une inoculation
de la cavité orale. Le mécanisme par lequel le VIH-1 atteint les organes lymphoïdes dans ce
contexte est incertain mais l’étude du modèle simien a permis de conclure que, suivant
l’inoculation du VIS sur les amygdales in vivo, les amygdales, de même que les muqueuses
orales et œsophagiques, sont des sites potentiels d’infection par le VIS (376, 567). On a
investigué le rôle des cellules épithéliales dans cette dissémination et découvert que
l’infection se produit initialement dans les lymphocytes T CD4+ retrouvés dans les
amygdales à proximité des cellules M, alors que l’épithélium directement mis en contact
avec le virus demeure réfractaire à cette infection (376, 567). Il est intéressant de noter que
les kératinocytes de la cavité orale expriment la protéine antivirale SLP1 (Secretory
Leukocyte Protease Inhibitor). Or, l’expression de cette protéine par ces cellules est activée
à la suite de leur contact avec le VIH-1, et ce, indépendamment de leur infection. Ceci
pourrait leur conférer une certaine protection à l’infection par le VIH-1 (251).
A l’inverse de ces études, on a montré que les kératinocytes primaires de la cavité orale
permettent la réplication du VIH-1 in vitro (2, 501). D’après Liu et al, cet évènement
nécessite entre autres la participation du CXCR4 et du GalCer, alors que, d’après Moore et
al, ces cellules sont susceptibles qu’à des souches R5 de façon indépendante du CD4 (325,
60
390). Les lignées cellulaires immortalisées de cellules épithéliales dérivées des glandes
salivaires, les HSY et les HSG, sont également susceptibles à l’infection par le VIH-1 de
façon indépendante du CD4 mais nécessitant le GalCer (225, 389).
Un dernier modèle envisagé est le transfert de virions. En effet, les kératinocytes isolés de
gencives peuvent in vitro capturer des particules virales puis, à partir de leur surface
membranaire adjacente à la circulation sanguine, les relâcher (325). Ce transport
intracellulaire impliquerait l’interaction entre la gp120 du VIH-1 et des glycoprotéines
mannosylées cellulaires (262).
1.11 La pathogénèse du VIH-1
1.11.1 Histoire naturelle de l’infection à VIH-1
Il y a trois phases distinctes dans l’évolution de l’infection causée par le VIH-1 :
i)
ii)
iii)
La phase aiguë;
La phase chronique (ou latente) et;
Le stade SIDA.
C’est au cours de la première phase que le virus entre dans le corps, se réplique rapidement,
générant une charge virale plasmatique importante, et se propage de façon systémique dans
l’organisme. Deux à quatre semaines suivant cette infection, le sujet atteint développe des
symptômes s’apparentant à la mononucléose (fièvre, rougeur cutanée, fatigue, pharyngite,
myalgie) accompagnés d’une virémie importante. Cette période est aussi caractérisée par
une chute marquée du compte de cellules T CD4+ dans le sang périphérique et de la
formation d’un réservoir de cellules T CD4+ infectées de façon latente par le VIH-1.
D’autre part, la réplication intense du VIH-1 déclenche une réponse immunitaire innée et
adaptée vigoureuse. On détecte d’abord l’activation et l’expansion des cellules T CD8+,
une augmentation du nombre de cellules NK et la sécrétion de cytokines proinflammatoires dans le sang (telles que le TNF-α, l’INF-γ et l’IL-1β), puis une réponse
humorale. Chez un individu infecté, des lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques au
VIH-1 sont détectés entre 4 à 6 semaines suivant la primo-infection par le VIH-1, alors que
61
les anticorps dirigés contre le VIH-1, indiquant la séroconversion, apparaissent 1 à 3 mois
suivant l’infection.
À la suite de l’émergence de la réponse immunitaire dirigée contre le VIH-1, la virémie
décline progressivement et finit par se stabiliser à un point donné défini comme « le niveau
viral de base ». Le moment entre l’infection virale initiale et l’atteinte du niveau viral de
base (de 4 à 6 mois) constitue la phase aiguë de la maladie (revue par (263, 484, 568)).
Notons que l’interaction entre la réponse des lymphocytes T CD8+ et le VIH-1 durant la
phase aiguë est cruciale puisqu’elle établit probablement le niveau de base viral et par
conséquent le taux de progression de la maladie. En effet, plus le niveau de base est élevé,
moins le pronostic est bon (45). (c.f. Figure 8).
À la suite de la réponse immunitaire humorale et cellulaire vigoureuse induite par
l’infection à VIH-1, le sujet infecté entre dans une période asymptomatique définie comme
la période de latence clinique (aussi appelée chronique) qui persiste pendant plusieurs
années (approximativement 7-10 ans) avant que ne surgissent les signes cliniques de la
maladie. Alors que la phase aiguë de l’infection à VIH-1 est marquée par une virémie
croissante puis décroissante et par une chute du nombre de cellules T CD4+, cette
dynamique des cellules T CD4+ et virale est fort différente durant la phase chronique.
D’une part, si les marqueurs immunitaires, qui étaient élevés durant la phase aiguë,
déclinent au début de la phase chronique, cette deuxième phase est rapidement marquée par
un état d’activation immune systémique élevée. De plus, au début de cette période, il y a
une récupération partielle du nombre de cellules T CD4+ du sang périphérique. Par contre,
la dégradation du système immunitaire perdure et le compte de cellules T CD4+ chute
graduellement, jusqu’à ce qu’il atteigne un niveau critique sous lequel les risques de
maladies opportunes sont substantiels. Finalement, la virémie, qui est très basse au début de
la phase chronique, demeure en lente progression tout au long de cette phase en raison
d’une réplication virale se poursuivant inexorablement (revue par (263, 484, 568)) (c.f.
Figure 8).
62
Le terme SIDA est appliqué au stade avancé de l’infection à VIH. De façon standard,
lorsque le compte de cellules T CD4+ dans le sang tombe sous les 200/mm3, un sujet
devient très vulnérable aux infections opportunes et aux cancers qui sont typiques du SIDA.
Ces évènements se produisent souvent de façon concomitante à une augmentation accélérée
de la virémie et à une chute dramatique du nombre de cellules T CD4+ en circulation. Chez
ces individus, les infections opportunes sont souvent sévères, voire fatales en raison de la
destruction de leur système immunitaire par l’infection à VIH-1(423).
Le VIH-1 est donc une maladie chronique et mortelle et qui demeure à ce jour incurable.
Quelques éléments importants des phases aiguë et chronique de l’infection par le VIH-1
sont décrits de façon plus exhaustive dans les sections qui suivent.
Figure 8
Histoire naturelle de l’infection à VIH-1
(A) Niveaux de lymphocytes T CD4+ plasmatiques et (B) charge virale plasmatique en
fonction du stade de la maladie (tiré de : (406)).
63
1.11.2 Primo-infection et phase aiguë
1.11.2.1 La transmission
Les contacts sexuels constituent le principal mode de transmission de l’infection à VIH-1.
Pour que la contamination ait lieu, le virus doit d’abord traverser les cellules épithéliales du
tractus intestinal ou génital afin d’atteindre la couche sous-jacente, la lamina propria, et
éventuellement les cellules T CD4+. La transmission peut impliquer des virions libres ou
des cellules infectées/associées à des particules virales car les sécrétions corporelles telles
que le sang et le sperme contiennent des virions libres de même que des lymphocytes
infectés par le VIH-1 (revue par (180)). Par ailleurs, la transmission horizontale de souches
X4 du VIH-1 est un évènement rare. En effet, l’examen du phénotype des souches du VIH1 prélevées à différents moments durant l’infection révèle que les individus récemment
infectés présentent principalement des isolats R5 (revue par (476)). De plus, les individus
homozygotes pour une délétion de 32 paires de bases dans le gène CCR5, mutation
supprimant l’expression de ce gène, sont résistants à l’infection par le VIH-1 (525). Ces
observations démontrent le rôle critique du CCR5 dans la transmission du VIH-1 in vivo.
Le mécanisme qui sous-tend ces phénomènes n’a pas été établi mais il pourrait inclure la
présence de cellules exprimant le CCR5 et le SDF-1 aux sites où a lieu la transmission, de
même qu’une pression négative bloquant la persistance de souches X4 (revue par (476)).
S’appuyant sur des études portant sur des cellules épithéliales in vitro, de même que sur des
modèles primates, on a émis plusieurs hypothèses pour expliquer le passage du VIH-1 par
les barrières épithéliales. Ces modèles incluent i) l’infection directe des cellules
épithéliales, ii) la transcytose de particules virales du pôle apical vers le pôle basolatéral de
ces cellules, iii) la transmigration de cellules infectées par le VIH-1 au travers des
muqueuses, iv) la capture de particules virales par les cellules de Langerhans, et v) le
passage direct du VIH-1 par des brèches dans la barrière épithéliale (87, 239). Remarquons
que les modèles proposés ne sont pas mutuellement exclusifs et qu’il est probable que
plusieurs de ceux-ci soient utilisés simultanément par le VIH-1 (239). Toutefois, ces
hypothèses demeurent controversées, particulièrement en ce qui concerne leur pertinence in
vivo (541).
64
Il est important de rappeler que les épithéliums cylindriques simples sont polarisés alors
que les épithéliums stratifiés ne le sont pas. Cette distinction dans la structure des
épithéliums implique que les mécanismes de transmission vont différer en fonction du type
d’épithélium franchi par le VIH-1 lors de la primo-infection. Par exemple, contrairement
aux épithéliums stratifiés, où ce rétrovirus peut entrer directement en contact avec des
cellules du système immunitaire atteignant la lumière de la muqueuse, les épithéliums
simples forment une barrière étanche qui doit être franchie par les particules virales afin
d’accéder à la lamina propria sous-jacente (62). Nous avons déjà discuté de la susceptibilité
à l’infection des épithéliums simples (c.f. Section 1.10.6), phénomène qui pourrait être en
partie associé à la transmission du VIH-1. Outre cette voie, des études in vitro, portant sur
des lignées cellulaires endométriales et intestinales, ont permis de proposer que les cellules
épithéliales polarisées pourraient permettre le transport du VIH-1 par un mécanisme de
transcytose du virus. Il s’agit d’un processus par lequel le virus est internalisé par
endocytose au pôle apical, transporté par la machinerie endosomale, puis relâché au pôle
opposé sans que la cellule ne soit infectée (7, 61, 63, 87). D’autre part, les muqueuses de
l’intestin et des voies respiratoires ont la particularité de posséder des cellules M. Ce sont
des cellules épithéliales polarisées distinctes, qui de façon normale livrent par transcytose
des antigènes et des microorganismes aux tissus lymphoïdes associés à ces muqueuses
(280). Le VIH-1 pourrait profiter de cette propriété particulière des cellules M et être
transporté par ces dernières (12, 180). Ces deux voies de transcytose permettent au VIH-1
d’atteindre les lymphocytes T+ CD4 et/ou les cellules dendritiques situées dans la lamina
propria (223, 239, 563).
En ce qui concerne les cellules épithéliales stratifiées, des études effectuées in vitro
permettent de suggérer des mécanismes de passage du VIH-1 tels que le transfert de virions
et l’infection directe (c.f. section 1.10.6). Ceci dit, l’analyse des cellules épithéliales
primaires du col de l’utérus et du vagin, de même que d’explants de la peau, a montré que
ces cellules épithéliales stratifiées ne sont pas susceptibles à l’infection par le VIH-1, ni ne
permettent la transcytose ou le transfert de particules virales. Ces cellules forment donc une
barrière significative au passage du VIH-1 (215, 375, 431, 443, 505, 563). Dans ce
contexte, d’autres voies de propagation sont envisagées. Par exemple, les cellules de
65
Langerhans pourraient jouer un rôle important dans le mécanisme de transmission du VIH1 à travers ce type d’épithélium. En effet, les cellules de Langerhans intra-épithéliales, à la
suite de leur infection et de leur transfert de nouvelles particules aux lymphocytes T CD4+,
serviraient de portail d’entrée au VIH-1 (265). De plus, les cellules dendritiques DCSIGN+, situées dans la lamina propria, pourraient participer à la dissémination de ce
rétrovirus dans les muqueuses stratifiées. En effet, en se référant à un modèle ex vivo du col
de l’utérus, une étude a montré que lorsque l’on bloque l’interaction du CD4 ou aux
récepteurs CXCR4 et CCR5, seule la production virale se produisant localement dans la
muqueuse est inhibée. Par contre, en bloquant simultanément le CD4 et les lectines de type
C liant le mannose, on empêche la capture et la dissémination du virus par les cellules en
migration retrouvées dans cet épithélium. Cette étude montre que la primo-infection
implique la participation d’un grand nombre de types cellulaires et/ou de récepteurs (239).
1.11.2.2 La dissémination
Une fois la barrière épithéliale franchie, le VIH-1 se retrouve dans la lamina propria de la
muqueuse. D’après des études faites chez des sujets séropositifs et sur le modèle simien du
SIDA, il y a alors deux évènements possibles (c.f. Figure 9). Premièrement, puisque les
muqueuses offrent un continuum de cellules cibles à partir duquel le VIH-1 peut
rapidement se propager et se multiplier, il y aurait d’abord infection locale des cellules
immunitaires présentes. En effet, la plupart des cellules CD4+ permissives à l’infection par
le VIH-1, les cellules T mémoires effectrices CD4+ CCR5+, constituent le principal type de
cellules T CD4+ retrouvé dans les muqueuses intestinales et génitales. Ces cellules sont
donc rapidement et massivement infectées et détruites préférentiellement lors de cette
réplication explosive du VIH-1 (71, 320, 354). De plus, puisque les cellules mémoires T
CD4+ CCR5+ sont rares dans le sang périphérique, dans les ganglions lymphatiques et
dans la rate, leur infection préférentielle dans les muqueuses intestinales entraîne donc une
perte radicale des cellules T CD4+ mémoires effectrices de l’organisme et ce rapidement
suivant la primo-infection. Ceci aura de lourdes conséquences dans la pathogenèse du VIH1 (71, 141, 320, 354).
66
Deuxièmement, suivant l’implantation de l’infection dans les muqueuses, les virions
seraient rapidement transportés par les cellules dendritiques et/ou lymphocytes T CD4+
infectés aux ganglions lymphatiques régionaux (revue par (141, 568)). En réponse à
l’activation du système immunitaire, il y a, à cet endroit, une accumulation de lymphocytes
T CD4+ mémoires activés (71) et les organes lymphoïdes forment rapidement des
réservoirs du VIH-1 in vivo (444). On a aussi récemment suggéré que, dans la pathogenèse
du VIH-1, les organes lymphoïdes sont intiment associés à la production de cellules T
CD4+ CCR5+, servant ainsi à alimenter l’infection (revue par (627)). En définitive, les
cellules T CD4+ infectées quittent les ganglions lymphatiques pour gagner la circulation
sanguine; il s’ensuit une dissémination du VIH-1 à tout l’organisme (ex : cerveau, rate,
thymus, et organes lymphoïdes secondaires) accompagnée d’une réplication intense (revue
par (263)) (c.f. Figure 9). Ainsi, à la fin de la phase aiguë, le système immunitaire aura subi
des dommages considérables, ayant comme résultat, une lymphopénie substantielle précoce
des cellules T CD4+ mémoires.
67
Figure 9
La primo-infection
(tiré de : (263)).
68
1.11.3 La phase chronique
La phase chronique de l’infection à VIH-1 est associée à un état d’activation immunitaire
chronique découlant d’une constante réplication virale. Alors que l’activation immune en
réponse à des pathogènes est essentielle, elle pourrait aussi paradoxalement créer
l’environnement immunologique qui favorise la réplication et la dissémination du virus
(revue par (306)). Le mécanisme qui sous-tend cette dérégulation est mal connu mais il
existe une corrélation positive entre l’activation immune et la charge virale et une
association négative entre l’activation immune et le compte de cellules T CD4+ dans la
circulation. Ainsi, l’état d’activation immunitaire est un marqueur clinique reconnu de la
progression de l’infection par le VIH-1.
Lors de la phase chronique, le pool de lymphocytes T CD4+ mémoires latents est déjà
sévèrement réduit et le système immunitaire tente de le reconstituer. Outre le fait que la
production thymique est limitée par l’âge de l’individu, trois éléments, qui sont grandement
liés à l’activation chronique du système immunitaire, contraignent cette tentative.
Premièrement, l’activation du système immunitaire provoque l’inhibition de la production
thymique, la perte de la moelle osseuse et la destruction de l’architecture des ganglions
lymphatiques, ce qui réduit la capacité de ces tissus à assurer normalement l’homéostasie
des lymphocytes et la présentation antigénique (revue par (65, 306)).
Deuxièmement, la réplication virale soutenue induit l’activation chronique des lymphocytes
T CD4+, entraînant leur expansion puis leur mort cellulaire. Plusieurs mécanismes soustendent cet évènement. Par exemple, la rencontre des lymphocytes T CD4+ avec des
antigènes dérivés du VIH-1 déclenche l’activation de ces cellules, processus menant à leur
expansion initiale et à leur différenciation en cellules effectrices/mémoires. Or, cet
évènement entraîne une susceptibilité croissante des cellules T CD4+ à l’infection par le
VIH-1 (142). En d’autres termes, en induisant une réponse chez les lymphocytes T CD4+
spécifiques au VIH-1, le virus génère son propre substrat. De ce fait, parmi les cellules T
CD4+ mémoires, ce sont celles spécifiques au VIH-1 qui sont infectées de façon
préférentielle par le VIH-1 (70, 142). De plus, la présence de cytokines et de certaines
protéines virales dans les muqueuses est suffisante pour induire l’activation des
69
lymphocytes T CD4+ mémoires, évènement qui alimente l’infection (revue par (143)).
Parallèlement, l’accumulation de cellules T CD4+ est rapidement contrebalancée par la
destruction préférentielle de ces cellules qui est causée par : i) la mort cellulaire découlant
de l’activation cellulaire, ii) l’infection directe/la cytopathogénéicité du VIH-1, iii) l’action
des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1, et iv) l’apoptose d’une plus grande proportion
de cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 que de celles ayant une autre spécificité
antigénique (71, 142, 654).
Troisièmement, cette activation cellulaire, tout en favorisant la réplication virale, contribue
à augmenter la pression sur le pool résiduel de lymphocytes T CD4+ naïfs et mémoires
latentes. A terme, la phase chronique est caractérisée par un équilibre instable entre i)
l’activation des cellules T, ii) la mort et le remplacement cellulaire, et iii) la production et
l’élimination des particules virales. Inexorablement, cet équilibre se brisera et le système
immunitaire s’effondera (revue par (65, 306)).
1.12 Autres types cellulaires contribuant à la pathogénèse virale
Cette section présente une description sommaire d’autres cellules immunitaires qui
contribuent à la pathogénèse virale.
1.12.1 Les lymphocytes T CD8+
In vivo, l’infection des cellules T CD8+ naïves est quasi absente, et si les thymocytes
(majoritairement CD4+ et CD8+) sont infectés par le VIH-1, il est peu probable qu’ils
survivent et entrent dans la circulation périphérique. Si c’était le cas, la fréquence
d’infection des cellules T CD8+ naïves par le VIH-1 serait supérieure (revue par (568)). De
plus, l’infection des cellules T CD8+ mémoires est rare à moins que l’expression de leur
récepteur CD4 ne soit induite, et contrairement aux lymphocytes T CD4+, il n’y a pas
d’infection préférentielle des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 (70).
Le dysfonctionnement immunitaire associé à l’infection à VIH-1 est aussi éloquent en ce
qui concerne les cellules T CD8+. Alors que les lymphocytes T CD8+ jouent un rôle-clé
dans le contrôle de la virémie durant la phase aiguë, ils présentent de nombreuses
70
anomalies durant la phase chronique telles que la perte des fonctions cytolytiques, une
maturation inadéquate et une prolifération limitée. Ceci engendre une incapacité des
cellules T CD8+ à contrôler la réplication virale. De plus, la dérégulation du système
immunitaire est associée à une réponse insuffisante et une anergie des cellules T CD4+ et
CD8+ (revue par (45, 469, 470)).
1.12.2 Les lymphocytes T dits «régulateurs» (Treg)
Les lymphocytes T dits «régulateurs» (ou Treg) sont une population unique de cellules T
CD4+ (ces cellules sont CD25+, FOXP3+) qui contrôlent les activations immunes
cellulaires inappropriées et/ou excessives. Ces cellules répriment également la réponse des
cellules T CD4+ et CD8+ effectrices dirigée contre les tumeurs et les allogreffes, de même
que la réponse aux infections parasitaires, bactériennes et virales (revue par (517, 582)). Le
mécanisme qui sous-tend ce processus est inconnu mais le CTLA-4 exprimé par les cellules
Treg et la sécrétion de cytokines anti-inflammatoires pourraient jouer un rôle important
dans ce processus. On estime également que les cellules Treg pourraient altérer les
propriétés des cellules présentatrices d’antigènes, de même que les interactions entre ces
cellules et les lymphocytes T (revue par (517, 582)). Étant donné ces multiples fonctions, il
est raisonnable de penser que les cellules Treg pourraient avoir un rôle dans la pathogenèse
du VIH-1 (revue par (582)).
En accord avec cette hypothèse, chez les patients VIH-1+ asymptomatiques, la réponse des
lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH-1 est en partie régulée grâce aux
cellules Treg (271). Certains auteurs ont postulé que cette activité permettrait de contrôler,
simultanément, l’apoptose et/ou l’anergie cellulaire, la destruction par le système
immunitaire et la susceptibilité des lymphocytes T CD4+ à l’infection par le VIH-1
(évènements néfastes aux lymphocytes T CD4+ et CD8+) dans les premiers moments de la
maladie. Ultérieurement durant la pathogenèse, on observe une déplétion du nombre de
cellules Treg, et de façon parallèle, une augmentation de l’état d’activation des cellules T
CD4+ et CD8+. Or, comme nous l’avons décrit, l’activation chronique du système
immunitaire est fortement associée à un mauvais pronostic de l’infection à VIH-1 (152,
271).
71
1.12.3 Les cellules NK (Natural Killer Cells)
Les cellules tueuses naturelles (en anglais Natural Killer cells, NK) sont des lymphocytes
ayant une importante fonction effectrice dans la défense innée. Premièrement, ces
lymphocytes participent à la régulation de la réponse immune innée et adaptée en
produisant diverses cytokines et chimiokines. Deuxièmement, les cellules NK, par un
processus ne requérant pas leur immunisation préalable, lysent les cellules tumorales ou
infectées par des virus. Leur cytotoxicité est contrôlée par deux types de récepteurs
membranaires à l’activité antagoniste. En effet, l’engagement de ces récepteurs engendre
des signaux d’activation ou d’inhibition selon l’identité du récepteur impliqué. Par
exemple, les cellules NK sont tenues en échec par la reconnaissance des molécules CMH-I
(complexe majeur d’histocompatibilité de type 1) présentes à la surface de la majorité de
nos cellules. La réduction de l’expression des molécules CMH-I, ou leur modification, est
un phénomène courant lors d’infections virales ou de la croissance d’une tumeur. Or ce
phénomène diminue ou parfois même annule l’interaction des récepteurs d’inhibition des
cellules NK avec leurs ligands naturels. La cellule infectée devient alors vulnérable à
l’activité lytique des cellules NK (299).
Les cellules NK, exprimant le CD4 et les corécepteurs CXCR4 et CCR5, peuvent être
infectées de façon productive par les souches R5 et X4 du VIH-1 in vitro (622). De plus,
chez les patients virémiques, on assiste à une expansion de cellules NK altérées (fonctions
cytotoxiques faibles et sécrétion de cytokines impliquées dans la défense antivirale réduite)
qui se traduit par le dysfonctionnement de l’ensemble des cellules NK. Ceci a
d’importantes répercussions dans le contrôle de la virémie (357).
1.12.4 Les lymphocytes B
Les lymphocytes B sont peu permissifs à l’infection par le VIH-1. Par ailleurs, le VIH-1
opsonisé par des molécules du complément peut s’attacher au récepteur CD21 en surface de
ces cellules. De plus, les cellules B possèdent la capacité de circuler dans le sang
périphérique et de migrer dans les tissus où elles peuvent alors interagir avec les
lymphocytes T. Dans ce contexte, on croit que les lymphocytes B, de façon similaire aux
cellules dendritiques, peuvent servir de réservoir extracellulaire au VIH-1 (384). D’autre
72
part, l’infection à VIH-1 entraîne une profonde dérégulation phénotypique et fonctionnelle
des lymphocytes B. Les problèmes les plus marquants sont l’hypergammaglobulinémie,
l’augmentation des marqueurs d’activation et de différenciation cellulaires, la perte de la
réponse aux activateurs cellulaires et l’activation aberrante des cellules du système
immunitaire (revue par (385)). Des résultats préliminaires indiquent que la présence de
CD40L à la surface des virions enclenche la production d’immunoglobulines par les
lymphocytes B. Il pourrait s’agir d’un des mécanismes qui sous-tendent la dérégulation de
ces cellules (346).
1.12.5 Les mastocytes, basophiles, neutrophiles et érythrocytes
Les basophiles, de même que les mastocytes immatures, sont susceptibles à l’infection par
le VIH-1, infection qui perdure lors de leur maturation in vitro. Le constant déplacement
des mastocytes immatures vers de nombreux tissus in vivo, combiné à la grande longévité
des mastocytes matures, suggèrent que ces cellules pourraient constituer un réservoir
persistant du VIH-1 (38, 343, 581, 593). D’autre part, deux protéines virales, le Tat et la
gp120, peuvent induire la production d’IL-4 et d’IL-13, cytokines de type Th2, chez les
mastocytes et les basophiles, contribuant ainsi à l’activation du système immunitaire
associée à l’infection à VIH-1. De plus, en produisant ces cytokines, les mastocytes et les
basophiles entraînent l’expression d’IgE par les lymphocytes B. Or, l’élévation d’IgE
sérique est associée à un mauvais pronostic de la maladie (249, 328, 343).
Chez certains individus séropositifs asymptomatiques, des neutrophiles expriment le
récepteur CD4 et s’associent à la gp120. Dans ce contexte, on a suggéré que ces cellules
pourraient servir au transport du VIH-1 aux sites d’inflammation (53). De même, les
érythrocytes pourraient livrer le VIH-1 aux tissus permissifs à l’infection à VIH-1, grâce à
l’interaction directe des particules virales aux récepteurs du complément présents sur ces
cellules ou, indirectement, à la suite de l’opsonisation du VIH-1 par des complexes immuns
(236).
73
1.13 Les réservoirs du VIH-1
Un réservoir viral est défini comme un type cellulaire ou un site anatomique où des
particules virales s’accumulent et persistent en ayant des propriétés cinétiques plus stables
que le pool principal de virus en réplication active. La latence du VIH-1 est un élément
incontournable dans la pathogenèse du VIH-1 puisqu’elle rend l’infection par le VIH-1
intrinsèquement incurable par les anti-rétroviraux existants. (467). En effet, la latence
empêche l’éradication virale puisqu’elle protège le virus de la dégradation, de la réponse
immunitaire et des interventions thérapeutiques et ce, même chez les patients qui reçoivent
une médication anti-rétrovirale très efficace (Highly Active Antiretroviral Treatment,
HAART) (revue par (302)).
La latence du VIH-1 est en partie reliée au fait que le rétrovirus se réplique dans les
lymphocytes T CD4+. Il existe deux formes de latence du VIH-1 dans les lymphocytes T
CD4+: i) la forme dite de pré-intégration et ii) la latence post-intégration. En effet, le VIH1 se retrouve de façon prédominante sous la forme d’ADN linéaire non intégré dans les
cellules T CD4+ latentes. La transcription inverse est lente dans ces cellules et l’import
nucléaire est inefficace. L’ADN viral non intégré devient rapidement non fonctionnel dans
ces cellules. Par ailleurs, si elles subissent une activation antigénique avant que l’ADN viral
ne soit dégradé, le cycle viral peut alors procéder. Ainsi, les cellules CD4+ T latentes
récemment infectées possédant de l’ADN viral non intégré représentent une forme de
réservoir du VIH-1 qui est labile et inductible. Il s’agit de la forme de latence dite de préintégration (revue par (302)).
D’autre part, certaines cellules CD4+ effectrices activées et infectées survivent et
retournent à un état quiescent dans lequel l’expression virale est minimale; le virus se
retrouve dans un état dormant. L’intégration du génome viral dans l’ADN chromosomique
de la cellule hôte garantit la persistance virale pour la durée de vie de la cellule T CD4+
mémoire, longue par définition puisque ces cellules assurent la mémoire immunologique. Il
s’agit de la latence post-intégration. Ces réservoirs de cellules T CD4+, même s’il en existe
d’autres types, sont suffisants pour assurer la persistance du VIH-1 durant toute la durée de
vie de l’hôte infecté (176). Il importe de noter que la latence est un état réversible :
74
l’activation subséquente de la cellule T déclenche la production virale. Ainsi, des rebonds
de réplication du VIH-1 se produisent même après de longues périodes durant lesquelles le
VIH-1 demeure indétectable dans le plasma. Les facteurs et les voies de signalisation qui
réactivent l’expression virale font l’objet d’intenses études afin de pouvoir identifier des
moyens pour éliminer la latence du VIH-1 (revue par (302)).
Il existe d’autres types cellulaires/tissus qui servent de réservoir au VIH-1. Nous pouvons
nommer les macrophages, les cellules dendritiques folliculaires, le système nerveux central,
la moelle osseuse, les reins et les testicules. De plus, on estime que l’accès des anti-viraux à
la rétine de l’œil, au cerveau, aux reins et aux sécrétions génitales (tel que le sperme) est
limité (revue par (568)).
1.14 Les traitements et les vaccins anti-VIH
1.14.1 Les traitements
Les autorités sanitaires ont approuvé plusieurs médicaments pour contrôler l’évolution des
infections à VIH-1. Le premier type de médicaments regroupe les inhibiteurs de la
transcriptase inverse. Dans cette catégorie, on retrouve les analogues nucléosidiques, qui
agissent comme terminateurs de chaîne (chain terminator), et les analogues non
nucléosidiques, qui inhibent la polymérisation de l’ADN en liant la RT. L’AZT
(zidovudine), le 3TC (lamivudine), le ddC (zalcitabine), le ddI (dideoxyinosine), le d4T
(stavudine), le ddl (didanosine), l’abacavir (ziagen), le tenofovir (viread) et l’emtriva
(emtricitabine)
sont
des
analogues
nucléosidiques.
Les
analogues
non
nucléosidiques incluent la nevirapine (Viramune), la delavirdine (Rescriptor) et l’efavirenz
(Sustiva) (423).
Les inhibiteurs de protéase virale constituent la deuxième classe de médicaments pour le
traitement des infections à VIH-1. Le ritonavir (Norvir), le saquinivir (Invirase), l’indinavir
(Crixivan), l’amprenivir (Agenerase), le nelfinavir (Viracept), le lopinavir (Kaletra),
l’atazanavir (Reyataz) et le fosamprenavir (Lexiva) sont de ce type. Les inhibiteurs de
75
fusion forment la troisième classe de médicaments anti-VIH. Le Fuzeon (l’enfuvirtide ou
T-20) est le premier médicament de cette classe approuvé par les autorités sanitaires (423).
Il est important de remarquer que la résistance du VIH-1 aux anti-rétroviraux est bien
documentée. Dans ce contexte, ces médicaments sont administrés en combinaison afin de
maximiser la suppression de la réplication virale. La combinaison de deux ou trois antiviraux, appelée HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy), réduit la réplication virale
à des niveaux indétectables dans le sang et dans les réservoirs lymphatiques. De plus,
malgré que les cellules infectées de façon latente ne soient pas éradiquées par la prise
d’antirétroviraux, le contrôle de la réplication active du VIH-1 qui en découle se traduit par
une augmentation du nombre de cellules T CD4+, une reconstitution partielle des fonctions
immunes et une diminution de l’incidence des maladies opportunes et de la mort. Ainsi,
alors que la thérapie combinée n’est pas une cure contre le SIDA, il n’en demeure pas
moins qu’elle améliore de façon indéniable la santé des gens infectés par le VIH-1 (423).
1.14.2 Les vaccins anti-VIH
Au même titre que pour les autres maladies infectieuses, la meilleure approche pour
contrôler la propagation du SIDA consiste à développer un vaccin empêchant
l’implantation de l’infection à VIH-1 chez l’hôte. Malgré d’intenses recherches
biomédicales et des études cliniques encourageantes, aucun vaccin anti-VIH n’a encore été
mis au point (revue par (157, 232, 368)). En effet, le développement d’un vaccin fait face à
de nombreux obstacles. Par exemple, la diversité génétique du VIH-1 et sa capacité à muter
sont des éléments qui rendent la conception d’un vaccin problématique.
Les approches privilégiées à l'heure actuelle dépendent de la production d'anticorps, de la
stimulation des cellules CD8+, ou des deux, dans l'espoir que ces réponses immunitaires
puissent prévenir la transmission de l'infection à VIH-1. Dans le cas de la production
d’anticorps, la conception de puissants immunogènes, induisant chez l’hôte la production
d’anticorps dirigés contre les protéines virales, dont la gp120, la gp41, la p24 et la p17, est
difficile. En effet, ces anticorps ne procurent qu’une protection partielle puisque des
76
domaines structuraux essentiels aux protéines virales mentionnées plus haut échappent à
ces anticorps, et demeurent donc fonctionnels (revue par (157, 232, 368)).
La seconde possibilité envisagée est l’induction d’une forte réponse immune cellulaire antiVIH-1. En effet, la réponse des lymphocytes cytotoxiques in vivo est primordiale dans le
combat contre l’infection. Pour ce faire, on a utilisé des vaccins de VIS très affaiblis, qui se
sont avérés puissants chez le singe. Cependant, une telle stratégie vaccinale chez l’humain
n’est pas envisageable. Dans ce contexte, les chercheurs ont présentement recours à des
vaccins d’ADN ou à des virus autres que le VIH, notamment le virus de la vaccine, le virus
canarypox, l’adénovirus, les alphavirus ou le virus de la stomatite vésiculaire affaiblis où
sont insérées des protéines du VIH-1. Malheureusement, la stimulation des cellules CD8+
n'offre vraisemblablement pas une protection complète contre le VIH-1 parce que les CD8+
ne s'en prennent qu'aux cellules déjà infectées par le VIH-1. Ainsi, chez le macaque, de tels
vaccins permettent de contrôler la virémie, de même que la progression de la maladie, mais
ne bloquent pas l’infection proprement dite (revue par (157, 232, 368)).
De plus, l’immunité adaptive a besoin de temps pour consolider ses défenses contre les
microbes envahissants. Or, on aura besoin d'une réponse très rapide, se déclenchant après à
peine quelques minutes ou heures, si on espère maîtriser le VIH-1 dans les parties du corps
les plus susceptibles de le rencontrer lors de la primo-infection, soit les muqueuses. Ainsi,
une des options envisagées pour contrer le VIH-1 est celle de favoriser la réponse immune
innée de l’organisme puisque c’est là la première défense de l’hôte face à un envahisseur
(revue par (157, 232, 368)).
77
Section 2
Le placenta
Nous abordons maintenant les étapes menant à la formation du placenta en cours de la
grossesse. Ceci est suivi d’une description de la structure d’un placenta à terme et des
fonctions placentaires. L’objectif poursuivi est de se familiariser avec les éléments
caractérisant le placenta et son environnement afin de mieux comprendre, par la suite, la
transmission verticale du VIH-1 qui sera abordée à la Section 3.
2.1 Le développement placentaire
2.1.1 Généralités
Considérons d’abord quelques éléments structuraux. Au début du développement
embryonnaire, quatre membranes fœtales (ou annexes extra-embryonnaires) dérivées du
zygote sont constituées : l’amnios, le sac vitellin, l’allantoïde et le chorion.
•
•
•
•
Le chorion est l'enveloppe la plus externe: il contient l'embryon et les autres
enveloppes. De plus, il participe conjointement avec l'utérus à la composition du
placenta;
L'amnios constitue l'enveloppe la plus interne. Il renferme le liquide amniotique
dans lequel baigne le fœtus;
Le sac vitellin formera une partie du tube digestif et constitue la source de cellules
germinales;
Finalement, l’allantoïde sert d’élément de base pour le développement du cordon
ombilical.
Ensuite, trois couches forment la paroi de l’utérus :
•
•
•
La séreuse;
Le myomètre (couche musculaire);
L’endomètre. Il est constitué d’un épithélium glandulaire simple mucosécrétant qui
borde la cavité utérine, et de cellules stromales sous-jacentes (incluant les vaisseaux
sanguins et le tissu conjonctif).
Le placenta, qui a une forme caractéristique en disque, a deux composantes :
•
une portion d’origine fœtale dérivant du chorion, et;
•
une portion d’origine maternelle issue de l’endomètre
(revue par (11, 51, 214, 298, 301, 342, 347, 391, 561, 600)) (c.f. Figure 10).
78
Figure 10
Diagramme d’un fœtus à terme in utero incluant une vue du placenta
(tiré de : (214)).
2.1.2 Formation du placenta
2.1.2.1 L’implantation
Les étapes de développement placentaire sont multiples. À la suite de la fertilisation,
l’embryon migre des trompes de Fallope jusqu’à la cavité utérine. À ce stade, l’embryon,
qui est sous la forme dite « blastocyste » (composé d’un bouton embryonnaire entouré
d’une couche cellulaire, le trophoectoderme), va s’attacher puis s’implanter dans
79
l’endomètre (7 jours post-fertilisation). Or, l’implantation marque le début du
développement placentaire.
D’abord, au contact de l’endomètre, le trophoectoderme se différencie en trophoblaste.
Deux éléments structuraux importants dériveront du trophoblaste : i) le chorion et ii) la
portion fœtale du placenta. Pour ce faire, deux évènements ont lieu. Premièrement, une
couche de cellules mésodermiques se développe à la face interne du trophoblaste, et en s’y
associant, forme la membrane chorionique (i.e. le chorion). Simultanément, les cellules
trophoblastiques prolifèrent rapidement et se différencient en deux couches distinctes : le
cytotrophoblaste et le syncytiotrophoblaste. Ces cellules sont les éléments structuraux
majeurs du placenta. Précisons que les cytotrophoblastes sont les cellules pluripotentes du
placenta, alors que les syncytiotrophoblastes résultent de la fusion et de la différenciation
des cytotrophoblastes.
Grâce au développement des cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes, l’embryon peut
s’enfouir dans l’endomètre. Le syncytiotrophoblaste, qui est produit à ce stade du
développement, a l’avantage distinctif d’être très envahissant. En effet, il sécrète des
enzymes digestives (ex : la collagénase et la gélatinase) dont l’activité lytique permet
l’ancrage, puis la pénétration du blastocyste dans l’endomètre au site d’attachement du
blastocyste. Parallèlement, l’endomètre se propage au-dessus du blastocyste qui se retrouve
alors complètement enfoui, recouvert par les cellules de l’endomètre. Ceci termine
l’implantation (revue par (11, 51, 214, 298, 301, 342, 347, 391, 561, 600)) (c.f. Figure 11).
80
Figure 11
L’implantation de l’embryon dans l’endomètre.
(A) Trajet de l’embryon des trompes de Fallope au site d’implantation. L’embryon vient au
contact de l’endomètre: (B) vue externe et (C) vue interne. (D) Les cellules
trophoblastiques se différencient en deux types de cellules au contact de l’endomètre: les
cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes (adapté de: (600)).
2.1.2.2 La réaction déciduale
Remarquons que l’implantation entraîne des changements profonds dans l’endomètre. En
effet, lorsque le blastocyste entre en contact avec celui-ci, il stimule, du côté maternel, la
réaction déciduale. Lors de cette réaction, l’endomètre se transforme et devient la caduque :
i) le stroma s’épaissit et se vascularise davantage, et ii) les cellules stromales accumulent
lipides et glycogène et se différencient en cellules déciduales. Or, ces cellules fournissent
les éléments nutritifs à l’embryon lors de l’implantation et contrôlent l’invasion des cellules
trophoblastiques. En effet, les cellules déciduales sécrètent des facteurs solubles qui
stimulent ou inhibent l’invasion trophoblastique en modulant la synthèse des protéines
matricielles, des protéases et de leurs inhibiteurs. On distingue trois régions dans la
caduque en fonction de leur position par rapport au site d’implantation : i) la portion en
profondeur sous l’embryon est la caduque basale (ou plaque déciduale). Elle va constituer
81
la portion maternelle du placenta, ii) la portion située au-dessus du fœtus est la caduque
capsulaire, et iii) la caduque pariétale définit la zone de tissu utérin entre ces deux
extrémités (301).
2.1.2.3 La voie du cytotrophoblaste villeux
À la suite de l’implantation, le placenta prend rapidement forme. Pour ce faire, les
cytotrophoblastes empruntent deux voies de différenciation distinctes, donnant lieu à
l’ensemble des cellules trophoblastiques du placenta, soit : la voie du cytotrophoblaste
villeux et la voie du cytotrophoblaste extravilleux (c.f. Figure 13). Les cytotrophoblastes
villeux sont des cellules épithéliales pluripotentes polarisées responsables de la formation
des villosités chorioniques flottantes, éléments fonctionnels de la barrière placentaire. La
formation de ces villosités se déroule comme suit : entre les 11e et 13e jours postfertilisation, des lacunes se créent au travers du syncytium de syncytiotrophoblastes
développé lors de l’implantation. Parallèlement, à la base du chorion (i.e. la plaque
choriale), les cytotrophoblastes se multiplient en direction du syncytium et le colonisent
pour former une structure en villosités, soit les villosités trophoblastiques primaires. En
périphérie de ces villosités, les cytotrophoblastes fusionnent et se différencient en
syncytiotrophoblastes. Les syncytiotrophoblastes constituent donc le pourtour des
villosités. Dès le 16e jour, un mésoblaste extra-embryonnaire associé au cytotrophoblaste
pénètre dans le tronc des villosités primaires, transformant celles-ci en villosités
secondaires. A la fin de la 3e semaine, l’angiogenèse des vaisseaux sanguins fœtaux se
produit à l’intérieur de l’axe mésenchymateux des villosités, créant la circulation fœtale du
placenta. De plus, les vaisseaux des villosités choriales s’étendent à l’embryon formant les
veines et les artères du cordon ombilical. A ce stade, les villosités sont appelées villosités
tertiaires car elles contiennent des vaisseaux sanguins fonctionnels (c.f. Figure 12).
D’autre part, les lacunes présentes entre les villosités s’anastomosent avec les capillaires
maternels de la caduque basale, ce qui entraîne l’irrigation de ces espaces par le sang
maternel. Ces lacunes sont appelées chambres intervilleuses. Les villosités situées dans ces
chambres intervilleuses sont libres et baignent donc dans le sang maternel : d’où leur nom
de
villosités
chorioniques
flottantes.
Ainsi,
les
cellules
cytotrophoblastes
et
82
syncytiotrophoblastes des villosités flottantes forment une bicouche épithéliale polarisée
qui baigne dans la circulation maternelle. Les circulations fœtale et maternelle sont
séparées l’une de l’autre en tout temps par l’endothélium des capillaires placentaires, le
mésenchyme qui les entoure et la double couche épithéliale de cytotrophoblastes et
syncytiotrophoblastes. Ces trophoblastes constituent ce qu’on appelle la barrière placentaire
et contrôlent tous les échanges materno-fœtaux (11, 51, 214, 298, 301, 342, 347, 391, 561,
600).
Après le 4e mois, la croissance placentaire diminue et le cytotrophoblaste disparaît peu à
peu de la paroi des villosités tertiaires, réduisant la distance entre les vaisseaux maternels et
fœtaux. Ainsi, en fin de grossesse, la circulation maternelle n’est plus séparée que par le
syncytiotrophoblaste et les cellules endothéliales. De plus, si au départ les villosités sont
présentes sur toute la surface du chorion, seules les villosités placentaires en regard de la
caduque basale persistent et se développent au cours du 3e mois. Le chorion à cet endroit
prend le nom de chorion villeux. C’est cette portion qui participe au placenta et qui lui
donne une structure typique en disque. Ailleurs, les villosités dégénèrent et le chorion
devient chorion lisse, sans villosité ni échange, formé par la lame choriale (mésenchyme
extra-embryonnaire et cytotrophoblaste) (11, 51, 214, 298, 301, 342, 347, 391, 561, 600).
Notons que les cellules trophoblastiques ou les trophoblastes sont des termes génériques
qui sont employés dans cette thèse et font référence de façon générale aux cellules
cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes. D’aitre part, le syncytiotrophoblaste (comme
unité tissulaire) ou les cellules syncytiotrophoblastes, de même que le cytotrophoblaste et
les cellules cytotrophoblastes, sont des termes synonymes.
83
Figure 12
Principaux stades du développement placentaire humain
L’embryon entre en contact avec l’endomètre. Sous l’action d’un syncytiotrophoblaste très
invasif, il s’y implante. Des lacunes se créent dans le syncytiotrophoblaste. Les
cytotrophoblastes se multiplient, colonisent le syncytiotrophoblaste et forment les villosités
primaires. Il y a fusion des cytotrophoblastes pour former les syncytiotrophoblastes en
périphérie des villosités. Le mésoblaste apparaît, créant les villosités secondaires, puis la
circulation sanguine fœtale, générant les villosités tertiaires libres dans la circulation
sanguine maternelle (tiré de : (11)).
84
2.1.2.4 La voie du cytotrophoblaste extravilleux
Parallèlement à la formation des villosités flottantes, des cytotrophoblastes s’engagent
plutôt dans la voie du trophoblaste extravilleux (c.f. Figure 13). En effet, une souspopulation de cytotrophoblastes villeux situés à la pointe ou à l’extérieur des villosités
adoptent un phénotype invasif et/ou prolifératif, avec perte de polarité comparable à celui
des cellules tumorales. Ces cellules épithéliales non polarisées représentent des
cytotrophoblastes extravilleux (ou intermédiaires). Elles prolifèrent et migrent au-delà des
villosités pour envahir l’endomètre et une partie du myomètre en interagissant avec les
cellules
déciduales.
Les
cytotrophoblastes
qui
débordent
extérieurement
le
syncytiotrophoblaste attachent les villosités à la caduque et forment ainsi les «villosités
crampon ». Ce processus permet l’ancrage du placenta dans l’utérus. Lorsque l’invasion est
stoppée dans l’endomètre, les cytotrophoblastes extravilleux continuent de proliférer et
migrent de façon latérale pour former la coque cytotrophoblastique. Celle-ci s'intercale
entre le syncytiotrophoblaste et la muqueuse utérine. Finalement, des cytotrophoblastes
extravilleux vont soit se différencier en cellules géantes bi ou tri-nucléées, ou encore se
diriger vers les artères utérines et coloniser les cellules endothéliales maternelles pour
devenir des cellules endovasculaires. Ceci va permettre un accroissement de l’apport
sanguin maternel au fœtus. Notons qu’il y a une gradation dans le phénotype prolifératif
versus le phénotype invasif des cellules extravilleuses, en fonction de leur localisation
proximale ou distale par rapport à la pointe des villosités (11, 51, 214, 298, 301, 342, 347,
391, 561, 600).
85
Figure 13
Principales voies de différenciation du cytotrophoblaste
(tiré de : (11)).
2.2 La structure du placenta
Le placenta à terme est un disque d’environ 20 cm de diamètre et de 3 cm d’épaisseur, qui
pèse approximativement 500 g et qui couvre 25-30% de la surface interne de l’utérus. En
résumé il est constitué de deux portions :
•
•
Fœtale, soit la villosité choriale (villosités flottantes et crampons) incluant les
espaces intervilleux, et
Maternelle, soit la caduque basale dérivée de l’endomètre.
D’abord, la face fœtale du placenta est limitée par la plaque choriale constituée de
l’épithélium de l’amnios, suivi d’un mésenchyme contenant les principaux vaisseaux du
86
cordon ombilical puis d’une monocouche de cytotrophoblastes et syncytiotrophoblaste en
contact avec les espaces intervilleux.
Ensuite, sa face maternelle est limitée par la plaque basale formée de la caduque basale et
de la coque cytotrophoblastique.
Finalement, les villosités flottantes et crampons, soit la portion centrale du placenta,
constituent la villosité choriale (ou chorion villeux) (c.f. Figure 14).
Dans sa structure définitive à douze semaines de grossesse, la villosité choriale possède 60
à 70 villosités centrales ou cotylédons. Ces villosités contiennent des artères et veines
fœtales entourées d’un riche stroma. Les villosités intermédiaires se ramifient à partir des
villosités centrales et contiennent des artérioles et veinules. Ces dernières s’arborisent en
villosités terminales qui contiennent des capillaires sanguins (c.f. Figure 14). Dans le
stroma de la villosité choriale, on retrouve des macrophages fœtaux, soit les cellules
Hofbauer. Notons qu’avec la croissance du fœtus, le chorion lisse se trouvera en contact
avec la caduque pariétale et se fusionnera avec elle. De la même façon, l’amnios et le
chorion se fusionnent pour former la membrane amnio-chorionique. Cette membrane se
rompt au cours du travail (revue par (11, 51, 214, 298, 301, 342, 347, 391, 561, 600)).
87
Figure 14
Diagramme de l’organisation des tissus placentaires
(tiré de : (214)).
2.3 Les fonctions placentaires
La barrière placentaire exerce de nombreuses fonctions essentielles au bon déroulement de
la grossesse et de la croissance fœtale. Le contrôle des échanges entre la mère et le fœtus,
assurant la nutrition, la respiration et l’excrétion du fœtus, est sa fonction première.
2.3.1 Les échanges materno-fœtaux
Le placenta est une membrane semi-perméable et les échanges placentaires se font selon
plusieurs modalités : i) la diffusion simple de l'eau, de l'urée, de l'oxygène et du gaz
88
carbonique, ii) le transfert facilité accéléré par une molécule porteuse qui, après couplage
aux flux d'un ion, se charge spécifiquement de la substance à transporter (ex : le glucose),
iii) le transfert actif qui nécessite un apport d'énergie avec couplage aux flux ioniques (ex :
les acides aminés, le sodium, le calcium et le potassium), enfin iv) l’endocytose. Cette
dernière permet la dégradation des substances absorbées, ainsi que le transfert accéléré vers
le placenta de substances telles que le fer, le cholestérol et les IgG maternels. Ces IgG
protègent l'enfant par une immunité passive qui dure quelques mois après la naissance. Le
placenta est imperméable aux macroglobulines (IgM ou IgA) et leur présence dans le sérum
de nouveau-né traduit leur synthèse directe (10).
2.3.2 Fonction endocrine
La deuxième fonction importante du placenta est la fonction endocrine. Le cytotrophoblaste
et syncytiotrophoblaste synthétisent chacun de nombreuses hormones stéroïdes et
polypeptidiques. Ces hormones jouent un rôle essentiel dans le maintien de la grossesse,
dans la croissance et le développement du fœtus et dans l’induction de l'accouchement à
terme. Les hormones stéroïdes incluent principalement la progestérone et les œstrogènes,
alors que parmi les hormones polypeptidiques, on retrouve essentiellement l'hCG (human
chorionic gonadotrophin), l'hPL (hormone lactogène placentaire) et l'hormone de
croissance (GH, growth hormone) placentaire. Enfin, le placenta est le siège de l'expression
de neuropeptides et de nombreux facteurs de croissance et de cytokines (ex : l’EGF, le
CSF, le GM-CSF, le TNF-α, l’IL-1, l’IL-6, l’IL-4, l’IL-10, le LIF, le TGF-β) qui jouent, par
un mécanisme autocrine ou paracrine, un rôle dans son développement et dans le maintien
de ses fonctions différenciées (392, 429, 521).
2.3.3 L’immunotolérance
Un exemple marquant des fonctions placentaires est l’immunotolérance qui prévaut en
cours de grossesse. Les cellules fœtales placentaires sont dérivées de la mère et du père.
Dans ce contexte, elles devraient être perçues comme « étrangères » par le système
immunitaire maternel et le fœtus devrait être rejeté. Or ce n’est pas le cas. Pour que la
grossesse puisse avoir lieu, la réponse immunitaire est réprimée de façon locale de telle
89
sorte qu’une tolérance immunologique existe dans l’environnement placentaire (201, 599,
652). Premièrement, les cellules trophoblastiques n’expriment pas le complexe majeur
d’histocompatibilité de type I ou II (CMH-I, CMH-II), les protégeant de la destruction
immunologique dirigée par les lymphocytes. Par contre, certaines populations du
cytotrophoblaste extravilleux expriment le HLA-C et le HLA-E de même que le HLA-G, ce
qui inhibe l’action des cellules NK à partir de leurs récepteurs KIR (NKG2A/C et NKAT3)
(51, 446). Les cellules trophoblastiques expriment également le FasL, entraînant l’apoptose
des cellules immunes exprimant le Fas. Deuxièmement, la composition en cellules
immunes de la caduque est particulière. En effet, les lymphocytes T et B y sont rares. Par
contre, les macrophages y sont nombreux (35-40%) et les cellules NK y constituent de 50 à
90% des leucocytes présents (377, 504). De plus, contrairement au sang périphérique, la
grande majorité des cellules NK de la caduque sont CD56bright/CD16-, ce qui leur confère
une activité cytotoxique réduite (108).
Section 3
La transmission verticale des virus
3.1 Les virus transmissibles de la mère à l’enfant
Outre le VIH-1, notion que nous développerons à la Section 3.2, de nombreux virus sont
transmis de façon verticale au fœtus par la mère. Ils incluent le parvovirus B19 (360), le
virus de la rubéole (464), les virus de l’hépatite B (664) et C (386, 585), le virus humain du
polyome (BKV) (478), le virus du papillome humain (VPH) (635), le virus coxsackie
(163), et les virus herpétiques tels que le virus varicella-zoster, le virus herpes simplex et le
cytomégalovirus (534). On postule que le HTLV-1 (324, 601), le virus Epstein–Barr
(EBV), l’herpès humain de type 6 (HHV-6) et de type 7 (HHV-7), de même que le virus
herpétique du sarcome de Kaposi (KSHV) (534) pourraient aussi être transmis de la mère à
l’enfant mais peu de données scientifiques appuient cette hypothèse.
Le placenta est somme toute une barrière efficace à plusieurs de ces virus puisque, dans la
plupart des cas, le risque de contamination demeure faible. Ceci dit, les conséquences de la
contamination fœtale sont souvent désastreuses. D’une part, elle peut entraîner des
anomalies fœtales, la mort fœtale intra-utérine et l’infection postnatale chronique du
90
nouveau-né (277, 464). D’autre part, un virus peut se répliquer dans les cellules
placentaires sans nécessairement infecter le fœtus. Ceci peut causer de sérieux
dysfonctionnements placentaires qui ont souvent de lourds effets sur le fœtus (revue par
(277)). Par exemple, l’infection des trophoblastes par le virus de la rage est associée à des
apports réduits en sang et en oxygène au fœtus, de même qu’à des retards dans la
croissance fœtale (274). De même, on pense que la présence de l’adénovirus dans
l’environnement placentaire, pathogène viral le plus communément retrouvé dans des
échantillons fœtaux issus de grossesses anormales, soit un facteur néfaste à la croissance
placentaire (277). Finalement, la présence du virus de l’influenza dans le placenta in vivo
est associée à une naissance prématurée et à des avortements spontanés. On estime que si ce
virus se réplique faiblement dans les cellules trophoblastiques, il pourrait tout de même
atteindre les membranes par une voie ascendante (611).
Le mécanisme qui sous-tend la transmission verticale de la plupart des virus énumérés
demeure inconnu. Tout comme le VIH-1, ces virus pourraient être transmis au fœtus durant
la grossesse, au moment de l’accouchement ou après la naissance. Le moment où se produit
la contamination peut varier selon le type de virus impliqué. Dans le cas de la
contamination in utero, peu de chercheurs ont caractérisé les infections virales placentaires
et le rôle des cellules trophoblastiques dans le passage d’un virus de la mère à la circulation
fœtale. Un sommaire des hypothèses postulées à cet égard est présenté au Tableau 2.
Références
(464)
(635, 653)
(360)
(664)
(398, 464)
(276, 464)
(158, 361)
(386, 585)
(163)
(324, 601)
Infection
Primo-infection rubéolique chez la mère pouvant, par sa virémie, contaminer le fœtus et provoquer un avortement spontané ou un syndrome polymalformatif et une
infection chronique du fœtus. Risque de transmission de 80% durant le premier trimestre de grossesse, et de 25% pendant le second trimestre. Le mécanisme de
réplication du virus et de la transmission verticale sont peu connus. (Note : ce virus n’est plus endémique en raison de la vaccination).
Le taux de transmission verticale est de 33 à 50%. Il serait transmis intra-partum et in utero. Ce virus se réplique in vitro dans les cellules trophoblastiques.
Seule la primo-infection de la mère pendant la grossesse est dangereuse : elle est associée à la contamination fœtale par le placenta. Le risque de transmission au fœtus
peut atteindre 33%. Le mécanisme est inconnu.
Le taux de transmission in utero atteint 40%. La contamination aurait lieu à la suite de l’infection des trophoblastes car le virus y est détecté in vivo. Risque de 90% de
transmission à l’accouchement si réplication active chez la mère à ce moment : exposition du nouveau-né à des liquides organiques infectieux.
Première cause des infections virales congénitales et périnatales. Primo-infection maternelle en cours de grossesse : la contamination fœtale se produit dans 20 à 40% des
cas. L’infection secondaire maternelle en cours de grossesse : le virus est transmis dans moins de 5% des cas. Deux modes de transmission in utero sont postulés : la voie
trans-placentaire et trans-annexielle. Il infecte les cellules du col de l’utérus et de la cavité utérine, de même que les cellules placentaires adjacentes, puis le fœtus. Les
explants villeux de placentas à terme seraient réfractaires à l’infection par ce virus, in vitro. Outre la contamination in utero, les transmissions intra-partum et post-partum
se produisent.
Virus détecté dans les tissus placentaires avortés. Pourtant, la transmission trans-placentaire de ce virus et l’infection prénatale sont extrêmement rares puisque les
cellules trophoblastiques, particulièrement les syncytiotrophoblastes, seraient réfractaires à ce virus. La transmission a principalement lieu lors de l’accouchement (80%) :
par voie ascendante après la rupture des membranes. Virus dans les sécrétions cervico-vaginales pourrait la favoriser.
Trois voies de transmission sont postulées : in utero (rarement, risque de 8%), par voie ascendante au moment de la naissance et post-partum par propagation des
gouttelettes ou contact direct avec la mère. Dans les trois semaines précédant l’accouchement jusqu’à deux jours après l’accouchement, le risque de transmission verticale
est de 17-30% s’il y a primo-infection aiguë maternelle de façon périnatale. L’infection intra-utérine peut causer le syndrome de varicelle congénitale (2%).
La transmission mère-enfant est peu commune : le taux étant de 4-5%. Par contre, chez les femmes co-infectées par le VIH-1 et le VHC, il atteint jusqu’à 20%. La
transmission se produisant uniquement chez des mères virémiques (il est nul chez les mères non virémiques). Au moins le tiers, sinon la moitié des enfants infectés,
contractent l’infection in utero. Le mécanisme demeure inconnu. Dans les autres cas, il s’agit d’une contamination intra-partum. Quoique la transmission post-partum ne
soit pas exclue, elle est rare.
Il est transmis in utero. La transmission se ferait par un passage trans-placentaire suite à l’infection des trophoblastes : la présence de ce virus a été détectée dans les
cellules trophoblastiques in vivo.
Virus présent dans les tissus placentaires avortés. Pourtant, la susceptibilité des trophoblastes à l’infection par ce virus in vitro est très faible sinon nulle. La barrière
placentaire protégerait le fœtus de ce rétrovirus. Toutefois, la co-infection par le virus d’Epstein-Barr (EBV) induit in vitro la réplication de HTLV-1 latent dans les
cellules trophoblastiques, suggérant un mécanisme de transmission. Transmission par allaitement maternel possible.
Virus de la rubéole
Virus du papillome humain
Parvovirus B19
Virus de l’hépatite B
Cytomégalovirus
Le virus herpes simplex-2
Virus Varicella-zoster
Virus de l’hépatite C
Le virus coxsackie
HTLV-1
Les infections virales transmissibles par la mère à son fœtus/nouveau-né
Virus
Tableau 2
91
92
3.2 La transmission verticale du VIH-1
3.2.1 Épidémiologie
Selon l’ONUSIDA, 2,1 millions d’enfants de moins de 15 ans vivent aujourd’hui avec le
VIH-1-SIDA dans le monde, cette réalité touchant 8% de ceux vivant en Afrique
subsaharienne. De plus, on estime qu’en 2003 seulement, 700 000 enfants ont été infectés
par ce rétrovirus. Si ceux-ci ne représentent que 5.5% des cas de VIH-1-SIDA, ils sont
victimes de 16% des décès. Or, la première cause d’infection par ce rétrovirus chez
l’enfant est associée à la transmission par la mère (TME): plus de 90% des infections parmi
les enfants de moins de 15 ans sont imputables à cette transmission verticale (617, 619).
La TME du VIH-1 peut se produire au cours de trois (3) stades. D’abord pre-partum (ou in
utero) i.e. la contamination du fœtus en cours de grossesse. Ensuite, intra-partum i.e. durant
l’accouchement. Finalement, post-partum i.e. par l’allaitement maternel (619). Les
standards internationaux catégorisent le moment de l’infection comme suit : i) un PCR
(polymerase chain reaction) détectant l’ADN proviral du VIH-1 dans les 48 h de vie
indique une contamination in utero, ii) un PCR positif à trois semaines de vie combiné à un
PCR négatif dans les 48h après l’accouchement indique une infection intra-partum, iii) un
PCR positif 45 jours suivant la naissance avec un résultat antérieur négatif est associé à une
transmission par l’allaitement maternel (74).
Le taux de contamination materno-fœtale du VIH-1 varie d’une étude à l’autre. Cependant,
selon les statistiques d’ONUSIDA, en absence de tout traitement chez la mère, le risque de
transmission aux nourrissons non allaités se situe entre 15-25% dans les pays industrialisés
et entre 25-35% dans les pays en voie de développement (619). D’autre part, le risque de
transmission est accru de 5 à 20% s’il y a allaitement (tiré de : (618). La fréquence
d’infection associée à chacun des modes de contamination est également une question
importante. En fait, on croit que la majorité des cas de contamination fœtale ont lieu au
moment de l’accouchement. En effet, si l’on n’envisage que les cas de transmission qui se
produisent au moment de l’accouchement et in utero, une étude mathématique a permis
d’estimer que les deux tiers des enfants (65%) seraient infectés par le VIH-1 le jour même
93
de la naissance (i.e. au moment même de l’accouchement) (518). Toujours selon cette étude
mathématique, la contamination materno-fœtale in utero aurait lieu chez environ un tiers
des enfants, et elle se produirait dans la plupart des cas moins de deux mois avant la
naissance (518). Ceci dit, sachant que 2,1 millions d’enfants sont séropositifs dans le
monde, on peut estimer que plusieurs centaines de milliers de ces cas d’infection sont
attribuables à une transmission in utero. En d’autres termes, même si la contamination
ayant lieu durant la grossesse n’est pas le principal mode de transmission verticale du VIH1, étant donné l’ampleur de la pandémie, ce type de transmission est probablement associé à
un nombre impressionnant d’infections.
3.2.2 Traitements et prévention de la transmission verticale
Il est maintenant établi que le traitement des femmes enceintes aux antirétroviraux réduit
significativement la TME du VIH-1 (revue par (27, 281, 366, 381)). Par exemple, en 1999,
l’étude clinique HIVNET 012 conduite en Ouganda a montré qu’une seule dose de
névirapine donnée à la mère durant le travail, suivie d’une seule dose au nouveau-né dans
les 72 heures après l’accouchement, sont suffisantes pour réduire de 50% la TME (219). La
simplicité, l’efficacité et le faible coût associés à ce protocole ont suscité beaucoup d’espoir
pour les régions en voie de développement. Cependant, une seule dose de Névirapine peut
causer l’émergence de souches virales résistantes à ce traitement chez la mère et le
nouveau-né. L’impact clinique de ces résistances dans un contexte de prévention de la
contamination materno-fœtale est inconnu mais ne peut être ignoré. En effet, il pourrait
engendrer d’importantes répercussions sur la santé de la mère et de l’enfant, de même que
sur la prévention de la transmission verticale lors de grossesses subséquentes (258, 435,
579).
La combinaison d’antirétroviraux de même que les traitements administrés pendant des
périodes prolongées sont reconnus comme étant plus efficaces pour éviter la TME (294).
Par exemple, la zidovudine, donnée en trois phases (i.e. à partir de la 14e semaine de
grossesse, au moment de l’accouchement et pendant 6 semaines chez le nourrisson), réduit
le taux de transmission entre 50 et 68% (106, 107, 381). La bithérapie pourrait réduire
davantage le risque de transmission (pour atteindre entre 1.6 et 4%) (337), alors que la
94
combinaison de médicaments visant à réduire de façon agressive la charge virale connue
sous le nom de « HAART » serait associée au plus faible taux de transmission verticale
(107).
Dans les faits, les traitements antirétroviraux ont permis de minimiser la TME du VIH-1
dans les pays dits riches. Par contre, l’accès aux traitements que l’on vient de décrire est
excessivement limité dans les pays en voie de développement où la majorité des femmes
infectées par le VIH-1 vivent actuellement. En 2003 par exemple, dans les pays à faibles et
moyens revenus, une femme enceinte sur dix seulement a bénéficié de services de
prévention de la TME du VIH-1 (615, 616). Cette réalité, combinée au fait que les cas
d’infection à VIH-1 chez la femme augmentent sans cesse, et ce particulièrement chez les
femmes en âge de procréer, permettent de conclure que l’infection des enfants par la
transmission verticale est un problème de santé public majeur (615, 616).
3.2.3 Facteurs de risque
Différents facteurs, soit maternels ou fœtaux, peuvent favoriser la TME du VIH-1.
D’abord, quoique ne permettant pas de prédire à quel moment la contamination aura lieu, la
charge virale maternelle est reconnue comme étant un déterminant de la transmission in
utero et intra-partum (199, 256, 380, 562). Par contre, ce marqueur n’est pas absolu. En
effet, la transmission, tout comme l’absence de transmission, peuvent se produire à tous les
niveaux de charge virale (86, 388). De plus, la réduction de la transmission, par la prise de
zidovudine, n’est qu’en partie attribuable à la baisse de la virémie (562). D’autres facteurs
de risque associés à la mère incluent le compte de lymphocytes T CD4+ (170, 380, 425), un
stade avancé du SIDA (170, 284), la présence de maladies/infections concomitantes (313,
481), la malnutrition et le tabagisme (revue par (366)). La prématurité et un faible poids à
la naissance sont aussi au nombre des paramètres reliés à une incidence accrue de la TME
(revue par (366)). Finalement, nous pouvons citer l’environnement immunologique (42) et
des facteurs d’ordre génétique, tels que le taux d’expression de LIF (451) et le faible
polymorphisme HLA mère-enfant (332, 487) comme éléments contribuant à la transmission
verticale.
95
Si l’on a cru que le taux d’anticorps anti-VIH-1 de la mère et/ou l’affinité de ces anticorps
pouvaient empêcher la transmission périnatale, dans les faits les résultats publiés à cet égard
sont fort variables. En effet, selon l’étude considérée, ces anticorps pourraient protéger de la
transmission, ne pas avoir d’impact, ou même favoriser la transmission verticale du VIH-1
(81, 133, 220, 481, 509, 551, 613). Ceci dit, la concentration d’IgG anti-VIH-1 dans le
liquide amniotique est supérieure à celle du plasma maternel, ce qui appuie ainsi la thèse
selon laquelle l’environnement placentaire contribue à la protection du fœtus (252). En
accord avec cet énoncé, un modèle simien de la transmission intra-partum par voie orale du
VIS a permis de développer une combinaison d’anticorps monoclonaux protégeant le
macaque nouveau-né de la transmission du virus. Cette découverte suscite beaucoup
d’espoir pour le développement d’un traitement préventif de la TME (28).
Deux questions importantes doivent également être considérées dans la TME : le phénotype
et le génotype viraux. L’importance du phénotype viral dans ce processus fait l’objet d’un
large débat. Certaines études démontrent que la majorité des mères transmettant le VIH-1
sont porteuses des souches R5 (352, 432, 433, 660). De plus, quoique la transmission de
virus X4 soit documentée, les nourrissons possèdent toujours des isolats qui sont soit
uniquement R5 ou qui présentent un tropisme multiple incluant le R5 (revue par (530)). Ces
données permettent de penser que la présence des virus R5 influence la transmission
verticale (127). Par contre, pour d’autres auteurs, l’utilisation du CCR5 par les isolats du
VIH-1 ne serait pas un facteur décisif dans la transmission verticale. En effet, la plupart des
isolats maternels sont soit uniquement R5 ou présentent un tropisme multiple (incluant R5),
et ce, indépendamment du fait qu’il y ait ou non transmission verticale (524). De plus, les
mères qui transmettent le VIH-1 sont étonnamment plus souvent porteuses de souches X4
que celles qui ne le transmettent pas (revue par (530)).
En ce qui concerne le génotype viral, des analyses phylogéniques ont permis d’établir que
les variants du VIH-1 transmis de façon verticale dérivent d’un seul variant mineur retrouvé
chez la mère. Ceux-ci prédominent initialement chez le bébé, formant une population virale
homogène dont la diversité s’accroît avec l’âge (5, 351, 400, 640). En désaccord avec ces
études, d’autres auteurs ont observé que les virus transmis pouvaient être des variants
96
majeurs aussi bien que mineurs ou encore constituer une population hétérogène de variants
(531, 626, 630). Cette disparité dans les résultats publiés peut être imputable à l’âge des
enfants au moment de l’étude, au nombre d’enfants évalués, à la région du génome viral
analysée et au moment où la contamination a eu lieu. De façon intéressante, on a proposé
que la présence d’une population virale hétérogène chez le nourrisson pouvait être en partie
causée par la charge virale maternelle et/ou à la durée d’exposition du fœtus au VIH-1
(630). De plus, une diversité génétique limitée des quasi-espèces du VIH-1 chez la mère
serait associé à un taux réduit de contamination materno-fœtale (351).
3.2.4 La transmission mère-enfant intra-partum
L’hypothèse la plus souvent citée pour expliquer la transmission intra-partum du VIH-1 est
la suivante : le nouveau-né, lors de son passage dans le canal de naissance au moment de
l’accouchement, serait exposé aux sécrétions cervicovaginales et/ou au sang maternel
contaminé par le VIH-1. On parle ici d’une contamination par voie orale des muqueuses du
fœtus et/ou du nouveau-né, à la suite de l’ingestion de fluides contaminés. Le contact de
liquides biologiques contaminés maternels avec des microlésions dans la peau du nouveauné (survenu au moment de la naissance) est aussi possible (193, 530).
Ce modèle de contamination a été proposé en s’appuyant sur plusieurs études; nous en
énumérons ici quelques-unes. D’abord, il y aurait un taux différentiel d’infection verticale
par le VIH-1 chez des jumeaux nés par voie vaginale (209). Deuxièmement, la probabilité
de transmission mère-enfant est réduite de moitié si l’accouchement se fait par césarienne
(pratiquée avant le début du travail) (103, 217). Troisièmement, une rupture prolongée des
membranes amniotiques durant l’accouchement favoriserait la transmission du VIH-1 lors
du travail et de l’accouchement (296, 366). Finalement, la présence du VIH-1 a été détectée
dans les sécrétions génitales et serait un facteur de risque de la transmission périnatale (256,
388). Précisons que, dans cette dernière étude, on pense que des virions retrouvés dans le
vagin accèdent à la cavité utérine durant la grossesse, plus particulièrement au moment de
la rupture des membranes durant le travail, et, ainsi, la transmission verticale périnatale
aurait lieu par voie ascendante (100).
97
3.2.5 La transmission mère-enfant in utero
Alors que peu de doutes existent quant à l’existence de la transmission intra-partum du
VIH-1, la contamination du fœtus durant la grossesse fait l’objet d’un intense débat dans la
communauté scientifique. Les indications scientifiques que le VIH-1 infecte le fœtus in
utero viennent d’abord du fait que l’on a détecté la présence du VIH-1 in vivo dans le
liquide amniotique, chez les cellules Hofbauer, le cordon ombilical et les leucocytes chez
des nouveau-nés immédiatement après l’accouchement (73, 303, 371, 659). De plus, le
VIH-1 a été isolé des tissus fœtaux avortés au cours du premier et du deuxième trimestre de
grossesse (73, 112, 319, 338, 555). Ces études illustrent le fait important que la
transmission in utero peut effectivement se produire, et ce, non seulement en fin de
grossesse mais aussi à son début.
Deux modes de transmission in utero sont envisagés : i) par voie trans-annexielle i.e. par les
membranes fœtales, et ii) par voie trans-placentaire.
3.2.5.1 La voie trans-annexielle
Il s’agit d’une contamination du fœtus impliquant le trajet ascendant du virus dans les tissus
génitaux, suivi de son passage par les membranes fœtales pour finalement atteindre le
liquide amniotique. Baignant dans cet environnement contaminé, le fœtus serait alors
infecté, probablement, par voie orale.
Cette hypothèse repose sur l’observation suivante : l’infection des tissus génitaux (par des
pathogènes autres que le VIH-1) crée des conditions propices à la contamination fœtale. En
effet, de telles infections sont associées à : i) la présence de chorioamniotite, ii) une
augmentation de la charge virale dans les sécrétions cervico-vaginales, iii) la production de
cytokines pro-inflammatoires, iv) un travail prématuré, et v) une rupture prolongée des
membranes (revue par (587)). Or, une récente étude a montré qu’il existe, pour le CRF01AE, une relation positive entre la présence d’une chorioamniotite aiguë et la transmission in
utéro du VIH-1 (48). Ces résultats, combinés au fait que le VIH-1 soit bel et bien retrouvé
dans le liquide amniotique (401, 566), supportent la thèse selon laquelle la transmission
98
verticale in utero du VIH-1 se produit par voie trans-annexielle plutôt que trans-placentaire
(48).
Toutefois, plusieurs études infirment ces données. D’abord, le fait qu’une chorioamniotite
aiguë favorise la transmission in utero n’a été observé que pour le CRF01-AE. Pour les
autres sous-types, ni l’inflammation placentaire due à une chorioamniotite aiguë, ni la
présence d’ulcères génitaux, ne seraient associées à la transmission in utero. Ces
évènements seraient plutôt reconnus comme étant des éléments favorisant la transmission
peri-partum du VIH-1 (405). De plus, la prise d’antibiotique par la mère pendant la
grossesse, ou au moment de l’accouchement, ne réduit pas l’incidence de la transmission
verticale (261).
3.2.5.2 La voie trans-placentaire
La transmission par la barrière placentaire est la deuxième voie envisagée pouvant mener à
l’infection fœtale. Le rôle du placenta dans la contamination verticale a fait l’objet
d’importantes études afin de définir les mécanismes d’infection du fœtus, et plusieurs
hypothèses ont été formulées telles que le passage du VIH-1 par des microlésions, la
transcytose des virions et l’infection directe des trophoblastes (c.f. Figure 15).
3.2.5.3 Le rôle des microlésions
D’abord, il est généralement admis qu’en cours de grossesse, les cellules trophoblastiques
se retrouvent en contact avec des virus libres et/ou avec des cellules infectées par le VIH-1
provenant de la circulation maternelle et/ou de la caduque. Or, tout au long de la grossesse,
il se crée des microlésions dans la barrière placentaire (qui est plus mince et vulnérable en
fin de grossesse). On a proposé qu’il puisse y avoir un passage direct de cellules
maternelles infectées et/ou de virus libres au travers de ces brèches pour atteindre la
circulation sanguine fœtale (revue par (530). En accord avec cette hypothèse, des conditions
propices à la dissémination du virus prévalent dans l’environnement placentaire. En effet,
les capillaires placentaires expriment le DC-SIGNR. De plus, cette lectine est exprimée par
les cellules Hofbauer et les macrophages de la décidue. Or ces cellules DC-SIGN+
d’origine maternelle et fœtale ne sont séparées que par les trophoblastes (557). Ainsi, des
99
brèches dans la barrière placentaire pourraient permettre le contact entre les cellules
Hofbauer et la circulation maternelle contaminée par le VIH-1 et permettre la transmission
(557).
Ceci dit, une étude a montré que la présence de lésions mineures dans la couche de cellules
trophoblastiques ne serait pas associée à la transmission verticale du VIH-1. Deux éléments
pourraient pallier ces lésions: l’intégrité de la membrane basale de l’épithélium et
l’apparition des cellules fibroïdes dans les lésions (79). Remarquons qu’il s’agit d’une étude
qui portait sur des femmes qui présentaient une faible virémie. Or, on sait que la virémie est
un facteur important dans la transmission verticale. Le rôle des microlésions placentaires
n’est donc pas clarifié.
3.2.5.4 La transcytose
Dans ce contexte, on a alors postulé d’autres modèles pour expliquer la transmission
verticale du VIH-1 in utero, la transcytose est l’un de ceux-là. Les cellules trophoblastiques
transportent des macromolécules d’un pôle à un autre tout au long de la grossesse (i.e. de la
circulation maternelle vers la circulation fœtale). Il s’agit du processus de transcytose qui
est utilisé, entre autres, pour le transfert d’immunoglobulines au fœtus en cours de
grossesse (154, 155, 206, 500, 623). Le VIH-1 pourrait profiter de ce transport et être
transcytosé du pôle apical vers le pôle basolatéral sans qu’il n’y ait réplication virale au sein
des cellules trophoblastiques. Dans ce modèle, les cellules trophoblastiques permettraient le
passage du VIH-1, non pas à travers des microlésions, mais directement par l’internalisation
du VIH-1 (292).
3.2.5.5 L’infection directe des trophoblastes
De façon alternative mais non exclusive, on peut aussi considérer l’infection directe des
cellules trophoblastiques dans la transmission verticale du VIH-1. Il est connu que les
cellules trophoblastiques baignent dans la circulation maternelle et de ce fait pourraient
représenter une cible potentielle d’infection par le VIH-1. Les questions qui se posent alors
sont les suivantes: est-ce que le VIH-1 peut entrer dans ces cellules? Peut-il s’y répliquer
pour atteindre de façon subséquente les cellules fœtales sous-jacentes?
100
D’abord, d’après des études faites in vitro, certains auteurs estiment que le VIH-1 peut
entrer dans les cellules trophoblastiques. Par contre l’infection n’y serait pas productive, i.e.
qu’il n’y aurait pas de réplication virale (138, 268, 339, 364, 382). Toutefois, des résultats
sensiblement différents ont également été obtenus. Premièrement, les cellules
trophoblastiques primaires isolées de placentas à terme seraient sensibles à l’infection par le
VIH-1 in vitro, mais seulement par la souche virale IIIB. Puisque cette souche utilise le
CXCR4 indépendamment du CD4, ceci indique qu’il pourrait exister une limitation lors de
l’entrée virale (9). Deuxièmement, les cellules trophoblastiques isolées de placentas
précoces (13) et à terme (123, 144, 146, 172, 657), de même que des lignées immortalisées
de cellules trophoblastiques sont permissives à une infection productive par le VIH-1 in
vitro (21, 124, 292, 473, 655, 658). Cependant, le niveau de production virale y est si faible
qu’il peut être nécessaire de les cocultiver avec des cellules fortement susceptibles à
l’infection pour détecter la production de virions (21, 124, 655, 657, 658). Des divergences
d’ordre expérimental permettent d’expliquer la différence entre les résultats obtenus. Par
exemple, celles-ci pourraient inclure le tropisme des virus utilisés, le type de virus (souche
clinique vs souche de laboratoire), la maturité du placenta ou encore la sensibilité des
méthodes de détection (c.f. Tableau 3).
D’autres études ont porté sur la susceptibilité des cellules placentaires à l’infection par le
VIH-1 non pas in vitro mais in vivo. Par des techniques d’immunohistologie et de PCR, des
chercheurs ont démontré la présence du VIH-1 chez des placentas du premier et troisième
trimestres dans le syncytiotrophoblaste et cytotrophoblaste, de même que chez les cellules
Hofbauer et les cellules endothéliales. Ces observations appuient la thèse selon laquelle la
contamination fœtale peut résulter de l’infection placentaire (31, 91, 126, 319, 345, 371,
659). En revanche, certains auteurs estiment qu’à l’intérieur du placenta, seuls les
lymphocytes T et les macrophages sont infectés (605). Le degré de pureté des préparations
de placenta serait la cause de cette disparité entre les résultats publiés. Par contre, il est
important de noter que cette dernière étude a été faite chez des patientes sous antirétroviraux, ce qui peut affecter les résultats obtenus (31, 605).
101
Au-delà de cette disparité dans les données, une preuve importante que le VIH-1 accomplit
un cycle complet de réplication dans les trophoblastes in vivo, et donc de la pertinence
biologique de ce mode de transmission, vient d’une étude phylogénique. Celle-ci a montré
que les séquences du VIH-1 retrouvées du côté maternel et du côté des trophoblastes étaient
reliées, mais qu’il y avait évolution des séquences virales au niveau du trophoblaste. Pour
que cela soit possible, le VIH-1 a dû compléter un cycle complet de réplication au sein des
cellules trophoblastiques (660).
S’appuyant sur les données présentés plus haut, on estime qu’en cours de grossesse, il
pourrait y avoir infection des trophoblastes suite à l’interaction entre des virus libres et/ou
des cellules maternelles infectées. Les nouveaux virions bourgeonneraient du côté
basolatéral (donc du côté de la circulation fœtale) pour atteindre ensuite les cellules
endothéliales et/ou macrophages sous-jacentes, pour finalement atteindre la circulation
fœtale (123, 172, 292, 660).
3.2.5.6 Contexte de l’entrée virale dans les trophoblastes
Si le VIH-1 se réplique dans les cellules trophoblastiques, on convient de dire que c’est à
faible taux, et seulement chez une faible proportion des femmes enceintes. Pourquoi? Nous
avons déjà décrit plusieurs facteurs de risque associés à la transmission verticale; certains
pourraient moduler la susceptibilité à l’infection des cellules trophoblastiques. Outre ces
facteurs, d’autres éléments sont également importants à considérer et l’un d’eux est la
présence du CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 à la surface des trophoblastes. En
effet, ces molécules ont un lien direct avec un aspect essentiel du cycle du VIH-1 : l’entrée
virale.
L’expression du CD4 est considérée comme nulle, voire extrêmement faible dans les
lignées cellulaires trophoblastiques immortalisées (JEG-3, JAR, BeWo). En effet, une seule
étude a pu l’observer, et ce, uniquement par la technique du RT-PCR (Reverse transcription
PCR) (658). D’autre part, il est difficile de tirer des conclusions fermes au sujet de
l’expression du CD4 par les cellules primaires. Si l’expression du CD4 ne semble pas
modulée en fonction du développement placentaire (1er, 2e ou 3e trimestre de grossesse), la
102
présence du CD4 à leur surface varie grandement d’une étude à l’autre, et même, d’un
échantillon de cellules trophoblastiques à l’autre (13, 123, 382) (c.f. Tableau 4). Dans cette
perspective, il n’est pas étonnant que, pour certains auteurs, l’infection productive des
trophoblastes soit indépendante du CD4 (9, 473, 655), alors que, pour d’autres l’entrée du
VIH-1 dans ces cellules se fait par l’interaction gp120/CD4 (123, 124, 342, 356).
En ce qui concerne les corécepteurs, alors que les lignées cellulaires trophoblastiques
immortalisées les expriment à faible niveau (21, 138, 248, 292), les études publiées font état
de résultats variables lorsqu’on considère les cellules primaires (9, 21, 382). Ceci dit, si
nous regardons l’ensemble des données, on peut tout de même dire qu’en début de
grossesse, les cellules primaires sont généralement faiblement positives pour le CCR5 et le
CXCR4 (248, 382). Par contre, l’expression du CCR5 chute en fin de grossesse (147, 248,
382). De plus, une étude a noté que le CXCR4 et le CCR5 étaient davantage localisés de
façon intracellulaire qu’extracellulaire dans ces cellules (335) (c.f. Tableau 4).
En résumé, les trophoblastes expriment peu ou pas les récepteurs/corécepteurs nécessaires à
l’entrée du VIH-1. Or, comme nous l’avons précédemment décrit, la susceptibilité à
l’infection des trophoblastes est controversée. Dans ce contexte, nous pouvons donc penser
que la faible permissivité des cellules trophoblastiques à l’infection soit en partie associée à
une limitation au niveau de l’entrée/fusion virale.
Par ailleurs, si nous convenons du fait que l’infection des cellules trophoblastiques est
possible, alors dans un contexte où les CD4, CCR5 et CXCR4 sont absents, voire ne
participent pas du tout au processus infectieux, la question qui se pose alors est la suivante :
comment se déroule le processus d’entrée du VIH-1 dans ces cellules? Très peu d’éléments
sont connus à ce sujet. On a remarqué que l’entrée du VIH-1 est plus importante lorsque les
trophoblastes sont mis en contact avec des lymphocytes T infectés qu’avec des virions
libres. L’adhésion entre les deux types cellulaires formerait une « synapse virale » qui
pourrait favoriser l’endocytose des virions et/ou l’expression de molécules de surface
requises pour l’entrée du VIH-1 (21, 144, 172, 473). De plus, une étude a montré que
l’infection serait augmentée in vitro en présence d’antisérum contre le VIH-1, mais réduite
en présence d’anticorps contre les galactosyl céramides, suggérant l’implication des
103
récepteurs Fc et/ou des glycolipides dans l’entrée virale (124, 292, 602). Le mécanisme
d’entrée et les récepteurs cellulaires requis pour ce processus sont donc très peu connus et
requièrent une investigation plus approfondie.
Figure 15
Mécanismes de transmission transplacentaire du VIH-1
Des virions libres ou des cellules lymphocytaires (ou encore des macrophages) présents
dans la circulation maternelle viennent au contact des cellules trophoblastiques. Le VIH-1
entre alors dans les cellules trophoblastiques. Plusieurs modèles sont postulés. Soit que les
virions fusionnent à la membrane ou qu’encore les virions sont internalisés par endocytose.
Il pourrait s’agir d’une entrée indépendante de CD4, de CXCR4 et de CCR5. Il s’ensuit
alors une réplication virale à l’intérieur des cellules trophoblastiques et un bourgeonnement
de nouveaux virions au pôle basolatéral (i.e. circulation fœtale). D’autre part, le VIH-1
pourrait entrer par endocytose pour cette fois être directement transporté du pôle apical
vers le pôle basolatéral sans qu’il n’y ait infection des cellules trophoblastiques. C’est le
processus de transcytose. Dans les deux cas (infection des cellules trophoblastiques et
transcytose), le VIH-1 atteint les cellules fœtales sous-jacentes, dont les lymphocytes et
macrophages, pour les infecter. Le passage par des microlésions n’est pas illustré sur ce
modèle.
Cellules mises en contact avec des
MOLT-4 infectées par le VIH-1BRU
Cellules mises en contact avec des
M4C18 infectées par le VIH-1LAI
Syncytiotrophoblastes dérivés en
culture de cytotrophoblastes purifiés
Syncytiotrophoblastes dérivés en
culture de cytotrophoblastes à terme
purifiés
L'infection requiert un contact avec des cellules infectées.
Le contact avec des cellules infectées pourrait activer
l'endocytose ou déclencher l'expression de récepteurs requis
pour l'entrée/infection.
Réfractaire à l'entrée et à l'infection par des
virions libres. Entrée par endocytose.
La cinétique d'infection est augmentée par un
contact avec des cellules infectées. Entrée par
endocytose.
Provirus détecté par PCR. Production virale faible
qui nécessite une amplification par des CEM-SS.
Infection détectée par PCR et inhibée par AZT
mais aucune production virale. Aucun effet, de
RANTES/MIP1-α/β/SDF-1 ou d'un anti-CD4.
Infection détectée par immunobuvardage de Gag.
Infection avec VIH-1NL4-3 ou Bal et
souches cliniques
Infection avec VIH-1RF, NDK ou IIIB
Utilise souches cliniques du VIH-1
Infection avec VIH-1BRU
Cytotrophoblastes isolés de
placentas à terme
Syncytiotrophoblastes dérivés en
culture de cytotrophoblastes purifiés
(1er trimestre)
Explants placentaires (trophoblastes
du 1er trimestre)
Provirus détecté par PCR. Production virale faible
qui nécessite une amplification par des PBLs.
Infection bloquées par CD4s.
Provirus détecté. Aucun effet, de
RANTES/MIP1-α/β/SDF-1 ou d'un anti-CD4. La
cinétique d'infection est augmentée par un contact
avec des cellules infectées. Ce contact cellulaire
inhibé par anti-LFA-1.
Infection possible.
Entrée indépendante de CD4, CXCR4 et CCR5. Placentas
précoces réfractaires à la production virale. Cytokines
pourraient créer conditions favorables.
Infection très limitée qui est indépendante du CD4.
L'infection des trophoblastes est favorisée par un contact avec
des lymphocytes T infectées (interaction impliquant le LFA-1).
Le contact avec des cellules infectées pourrait activer
l'endocytose ou déclencher l'expression de récepteurs requis
pour l’entrée/infection.
Infection faible dépendante du CD4.
Les cellules sont réfractaires à l'infection par des souches
dépendantes du CD4.
Autres récepteurs impliqués. Le SDF-1 pourrait bloquer
l'adhésion des PBMC aux trophoblastes.
30% d'inhibition d'infection par le SDF-1
Résistantes à VIH-1IIIB ou souches cliniques mais
non à VIH-1 IIIBx
Conclusions
Résultats observés
Cytotrophoblastes isolés de
placentas à terme et JAR, JEG-3
Cytotrophoblastes isolée de
placentas à terme
i) production de p24 dans le
surnageant, ii) contact avec des
PBMC lors de la récolte
Infection avec VIH-1BRU
Cellules mises en contact avec
PBMC infectées par VIH-1Lai
Syncytiotrophoblastes dérivés en
culture de cytotrophoblastes purifiés
Cytotrophoblastes isolée de
placentas à terme
Techniques/virus utilisés
Sommaire des résultats publiés sur la susceptibilité des trophoblastes à l’infection par le VIH-1 in vitro
CAS: INFECTION DÉTECTÉE
Cellules primaires
Tableau 3
104
(13)
(382)
(657)
(21)
(123)
(9)
(172)
(144)
(145)
Références
Entrée par endocytose. Fusion dans les
endosomes et/ou lyse des endosomes. Production
virale faible qui nécessite une amplification par
des CEM-SS. Insensible au CD4 soluble.
Résultats observés
Aucune infection. Pas d'amplification du signal
par contact avec des CEM. Seuls les macrophages
sont infectés.
Aucune infection. Pas d'amplification du signal
par contact avec des lymphocytes.
Aucune infection. Mesure de la p24 dans le
surnageant : aucun signal.
Cellules mises en contact avec des
MOLT-4 infectées par le VIH-1
Techniques
Infection avec VIH-1BRU. Mesure
de la transcription inverse.
Infection avec VIH-1NL4-3 et AD8.
Infection par virions libres
Infection avec VIH-1IIIB, DV et 89.6.
Infection par virions libres
BeWo
CAS: ABSENCE D'INFECTION
Trophoblastes isolées par gradients
de densité (1er, 2e et 3e trimestres)
Cytotrophoblastes isolés de
placentas à terme et
syncytiotrophoblastes dérivés en
culture de cytotrophoblastes
JAR, BeWo, JEG-3, HP-W1 et
cellules placentaires primaires
Infection réfractaire à des virions libres.
Production virale faible qui nécessite une
amplification par des PBMC.
Infection avec des souches
cliniques. Cellules polarisées
Infection avec VIH-1RF, NDK ou IIIB
Provirus détecté par PCR. Production virale faible
qui nécessite une amplification par des CEM-SS.
Provirus détecté par PCR. Les JEG-3 sont les plus
susceptibles. Production virale faible qui
nécessite une amplification par des CEM-SS.
Infection plus forte dans les JAR. Contact avec
des PBL augmente le signal. Anti-CD4 ou CD4
soluble bloque l'infection.
Infection avec VIH-1LAI, NDK ou ROD
Infection avec VIH-1RF
Résultats observés
Techniques/virus utilisés
Les trophoblastes sont réfractaires à l'infection.
Les trophoblastes sont réfractaires à l'infection.
Conclusions
Les trophoblastes sont réfractaires à l'infection et ce à tous les
stades de développement.
Infection faible associée à une entrée par endocytose de façon
indépendante du CD4.
Infection possible.
Infection très limitée.
Infection très limitée.
Infection faible dépendante du CD4.
Conclusions
Sommaire des résultats publiés sur la susceptibilité des trophoblastes à l’infection par le VIH-1 in vitro
BeWo
JAR, BeWo, JEG-3
JAR
CAS: INFECTION DÉTECTÉE
Lignées cellulaires
JAR, BeWo
Tableau 3 – suite
105
(364)
(268)
Références
(339)
(473)
(292)
(658)
(655)
(124)
Références
(-)
n.d.
Explants placentaires (trophoblastes)
2 trimestre
Villosités chorioniques
(types cellulaires non déterminés)
Cellules trophoblastiques isolées
3 trimestre
Cellules trophoblastiques isolées
Cellules trophoblastiques isolées
Cellules trophoblastiques isolées
Cellules trophoblastiques isolées
Explants de placentas à terme
(-)
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
Syncytiotrophoblastes dérivés en culture
de cytotrophoblastes purifiés
Villosités chorioniques
(types cellulaires non déterminés)
Cellules trophoblastiques isolées
Explants de villosités chorioniques
n.d.
(+)
(-)
n.d.
(-)
(-)
(+)
n.d.
(-)
n.d.
(-)
(-)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
n.d.
(-)
n.d.
Explants placentaires (trophoblastes)
Syncytiotrophoblastes dérivés en culture
de cytotrophoblastes purifiés
e
n.d.
(-)
n.d.
Cellules trophoblastiques isolées
Explants placentaires (trophoblastes)
e
(+)
n.d.
(+)
? (5/10)
(+)
n.d.
n.d.
CCR5
CD4
(+)
(+)
(+)
(+)
n.d.
(+)
(-)
(+)
n.d.
(+)
n.d.
(-)
(+)
(+)
n.d.
(+)
(+)
n.d.
(+)
CXCR4
n.d.
n.d.
CCR-1, 2, 4
CCR1, CCR3, CCR6, CCR10
n.d.
CCR3, CCR6
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
CCR-1, 2, 4 et CXCR-1, 2
n.d.
n.d.
n.d.
CCR3, Bonzo
n.d.
CCR-1, 2, 3, 4 et CXCR-1, 2
Autres
Immunohistochimie et RT-PCR. Expression chute au 3e trimestre
FACS intracellulaire : <13% des cellules (+) pour CCR5 et < 40% pour le CXCR4
FACS extracellulaire : < 30% des cellules (+) pour CCR5
RT-PCR, FACS
Immunohistochimie, RT-PCR
Immunohistochimie et Northern blot
Immunofluorescence et RT-PCR
FACS, RT-PCR
FACS ou RT-PCR
(+) seulement par PCR
FACS: >96% des cellules (+)
Immunohistochimie. FACS: 10% sont (+)
RT-PCR
RT-PCR, FACS
Immunohistochimie et RT-PCR
Immunohistochimie et Northern blot
FACS: < 15% des cellules (+) à la surface et < 45% (+) intracellulaire
FACS, RT-PCR
Immunohistochimie
RT-PCR, FACS
Techniques de détection
Sommaire des résultats publiés sur l’expression du CD4, du CCR5 et du CXCR4 par les trophoblastes
Types cellulaires
1er trimestre
Cellules trophoblastiques isolées
Explants placentaires (trophoblastes)
Villosités chorioniques
(types cellulaires indéterminés)
Tableau 4
106
(286)
(335)
(248)
(147)
(293)
(145)
(382)
(21)
(660)
(9)
(123)
(9)
(248)
(286)
(293)
(335)
(382)
(13)
(248)
Références
(+)
(-)
(-)
(-)
n.d.
n.d.
n.d.
(-)
BeWo, JAR, JEG-3
BeWo
BeWo
JAR, JEG-3
BeWo
JEG-3
JAR
JAR, JEG-3
CD4
(+)
(+)
(+)
n.d.
(+)
(+)
(+)
(-)
CCR5
(+)
(+)
(+)
n.d.
(+)
(+)
(+)
(+)
CXCR4
CCR3
CCR-1, 3, 4 et CXCR-1, 2
CCR-1, 3, 4 et CXCR-1, 2
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
CCR-1, 3, 4 et CXCR-1, 2
Autres
FACS ou RT-PCR
RT-PCR, < 5% des cellules sont (+) par FACS
RT-PCR, < 5% des cellules sont (+) par FACS
Très faible: (+) seulement par PCR
Immunofluorescence
Immunohistochimie
Très faible: (+) seulement par PCR
RT-PCR, < 5% des cellules sont (+) par FACS
Techniques de détection
Sommaire des résultats publiés sur l’expression du CD4, du CCR5 et du CXCR4 par les trophoblastes
Légende: (+) = expression détectée, (-) = expression non détectée, n.d. = non déterminée, ? = résultats variables.
Lignées cellulaires
Types cellulaires
Tableau 4 – suite
107
(21)
(248)
(248)
(658)
(138)
(292)
(21)
(248)
Références
108
Section 4
L’endocytose
4.1 Mise en contexte
Les cellules mammifères ont développé une variété de mécanismes pour internaliser à partir
de vésicules de transport dérivées de la membrane plasmique de petites molécules, des
macromolécules ou des particules volumineuses, pour ensuite les diriger vers des
organelles spécifiques dans le cytoplasme. À ce niveau, le contenu des vésicules est trié
vers la voie de dégradation ou recyclé à la membrane plasmique. Ces mécanismes
correspondent collectivement à l’endocytose, processus essentiel à toute cellule.
Trois modes d’endocytose sont possibles. Le premier est l’endocytose par phase fluide (en
anglais fluid-phase endocytosis ou bulk-phase endocytosis) qui est l’internalisation de
solutés en l’absence d’une liaison à la membrane plasmique (572). Il s’agit d’un processus
non spécifique par lequel toute substance qui se retrouve à l’endroit où une vésicule est
formée est internalisée. L’efficacité de ce processus est strictement proportionnelle à la
concentration des solutés dans le milieu extracellulaire. Le HRP (Horse Radish
Peroxydase) est un marqueur reconnu de ce mode d’endocytose. Il est à noter que la
pinocytose est souvent utilisée pour décrire l’endocytose par phase fluide dans la littérature
scientifique (409). Nous donnerons une définition plus large à la pinocytose dans cette
thèse.
Le second mode est l’endocytose par adsorption non spécifique. Des solutés ou des
particules sont internalisés suivant leur adsorption à la surface cellulaire grâce à des forces
intermoléculaires, telles que les interactions de nature hydrophobique et les liaisons
hydrogène, se créant à des sites non spécifiques présents à la membrane plasmique. Ceci
inclut par exemple les interactions protéine-carbohydrate (ex : les lectines) et celles
impliquant les HSPG. L’efficacité de la capture d’un soluté/macromolécule par ce type
d’endocytose dépend de l’abondance des sites de fixation présents à la surface d’une cellule
et de l’avidité du soluté/macromolécule pour ces sites : elle varie donc en fonction du type
cellulaire et de la nature du soluté/macromolécule (14, 610).
109
Le troisième mode est l’endocytose relayée par des récepteurs. Dans ce mode, un ligand
reconnaît un récepteur exposé à la surface cellulaire et s’y lie spécifiquement, puis ce
complexe ligand-récepteur se retrouve dans des vésicules primaires précises, typiquement
des vésicules de clathrine. Il est important de noter que l’endocytose dépendante de la
clathrine et l’endocytose relayée par des récepteurs sont souvent synonymes dans la
littérature. Cependant, cette définition est inadéquate parce qu’elle ne tient pas compte du
fait que dans plusieurs cas de figures, l’interaction ligand-récepteur se traduit par une
internalisation qui est indépendante de la clathrine (105). Notons que l’endocytose par
récepteur, en internalisant des macromolécules spécifiques, capture simultanément de façon
non sélective des fluides extracellulaires et leur contenu.
Les trois modes d’endocytose décrits s’appliquent en tout ou en partie à deux grands
mécanismes d’endocytose : la phagocytose qui est l’internalisation et la dégradation de
particules de grandes tailles, de débris ou de cellules entières, et la pinocytose qui est
l’internalisation de molécules en solution et de fluide extracellulaire. La pinocytose inclut à
la fois la macro et la micropinocytose qui possèdent des caractéristiques différentes. Par
exemple, la création des macropinosomes, lors de la macropinocytose, nécessite la
formation de voiles ondulants, ce qui n’est pas le cas des micropinosomes. De plus, le
diamètre des micropinosomes est inférieur à celui des macropinosomes (396, 583).
En utilisant comme critères les molécules ou structures requises suivantes, la clathrine, la
dynamine,
la
cavéoline
et
les
radeaux
lipidiques,
cinq
types
différents
de
micropinocytose sont décrits dans la littérature: i) l’endocytose classique par les puits de
clathrine, ii) l’endocytose par les cavéoles, iii) l’endocytose par les radeaux lipidiques de
type cavéolaire, iv) l’endocytose par les radeaux lipidiques indépendante de la dynamine, et
v) l’endocytose indépendante des puits de clathrine, des cavéoles, des radeaux lipidiques et
de la dynamine. L’ensemble de ces voies endocytaires peut coexister dans une même
cellule (revue par (460)) (c.f. Tableau 6).
Nous résumons dans cette section les mécanismes qui sous-tendent les principales voies
d’internalisation cellulaire. En effet, la plupart sont exploitées comme portail d’entrée dans
une cellule-cible par plusieurs pathogènes incluant de nombreux virus, bactéries et toxines.
110
De plus, l’endocytose émerge comme un mécanisme d’entrée et/ou de dissémination du
VIH-1 initialement sous-estimé dans la pathogénèse de ce rétrovirus (289, 292, 326, 341,
609).
Figure 16
Les mécanismes d’endocytose
(1) La phagocytose, (2) la macropinocytose, (3) l’endocytose classique par les puits de
clathrine, (4) l’endocytose par les cavéoles, (5) l’endocytose par les radeaux lipidiques de
type cavéolaire, (6) l’endocytose par les radeaux lipidiques indépendante de la dynamine, et
(7) l’endocytose indépendante des puits de clathrine, des cavéoles, des radeaux lipidiques et
de la dynamine (tiré de (105, 460)).
111
Tableau 5
Inhibiteurs de l’endocytose et leurs modes d’action
Catégories
Nom de l'inhibiteur
Fonctions/mode d'action
Endocytose
Dimethyl amiloride
Inhibiteur des canaux Na /H qui bloque spécifiquement l'ondulation
membranaire et la macropinocytose qui en découle.
Chlorpromazine
Inhibiteur de l'endocytose par les puits de clathrine.
Élimination du potassium
Amantadine
Méthyl-βcyclodextrine (MtβCD)
Inhibiteur de l'endocytose par les puits de clathrine.
Bloque le bourgeonnement des vésicules de clathrine.
Élimine le cholestérol membranaire.
Implication des radeaux
lipidiques
+
+
Nystatine
Séquestre le cholestérol membranaire.
Filipine
Séquestre le cholestérol membranaire.
Lovastatine
Inhibe la synthèse du cholestérol.
Cytochalasine B
Réduit la taille des filaments d'actine est bloquant l'ajout d'actine monomérique
à l'extrémité (+) des polymères.
10 fois plus puissante que la cytochalasine B à bloquer la polymérisation
d'actine.
Cytosquelette d'actine
1) Dépolymérisation des
filaments d’actine
2) Stabilisation des
filaments d’actine
Cytochalasine D
Latrunculine
Se lie à l'actine monomérique et empêche leur polymérisation en filament
d'actine.
Phalloïdine
Se lie aux filaments d'actine ce qui les stabilise et empêche leur
dépolymérisation. Elle n'empêche pas la polymérisation d'actine.
Jasplakinolide
Stabilise les filaments d'actine: induit la polymérisation de l'actine en stimulant
la nucléation des filaments d'actine.
Nocodazole
Se lie à la β-tubuline et bloque la formation de liaisons disulfides ce qui
perturbe l'équilibre des microtubules et entraîne leur dépolymérisation.
Colchicine
Se lie aux hétérodimères d'α/β-tubuline et empêche leur polymérisation en
microtubules. L'organisation des microtubules est perturbée puisque seule la
dépolymérisation est maintenue.
Microtubules
1) Dépolymérisation des
microtubules
Vinblastine
Se lie à la β-tubuline afin d'empêcher la polymérisation des microtubules.
Vincristine
Se lie à la tubuline monomérique afin d'empêcher la polymérisation des
microtubules.
2) Stabilisation des
microtubules
Paclitaxel (taxol)
Se lie à la région N-terminale de la β-tubuline ce qui provoque la formation de
microtubules très stables résistants à la dépolymérisation.
Activités des petites
GTPases
Toxine dermonécrotique de
Bordetella pertussis
Hyperactivation de Rho, Cdc42 et Rac. Transglutaminase qui catalyse le
déamidation ou la polyamination du résidu glutamine 63 de Rho, Rac, Cdc42.
Ceci réduit l'hydrolyse du GTP de ces protéines et induit l'interaction de Rho
avec la Rho kinase, indépendamment de son statut GDP/GTP.
Toxine A ou B de Clostridium difficile
Possède une activité glucosyl-transferase dirigée sur les résidus Thr37 de Rho
et Thr35 de Cdc42 et Rac. Cette glucosylation bloque la liaison à leurs
effecteurs
Bafilomycine A1
Inhibiteur des ATPases vacuolaires.
Concanamycine
Inhibiteur des ATPases vacuolaires.
Acidification endosomale
Activité des
kinases/phosphatases
Autres
Chlorure d'ammonium
Base lysosomotropique faible
Génistéine
Inhibiteur des protéines kinases de type tyrosine.
PP2 (4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine)
Inhibiteur des protéines kinases de type tyrosine de la famille des Src.
Staurosporine
Inhibiteur de la protéine kinase C (PKC).
bpV(pic)
Acide okadaïque
Inhibiteur des tyrosines phosphatases.
Inhibiteur spécifique des protéines phosphatases 1 et 2A.
Wortmmannin
Inhibe l'activité de la phosphatidylinositol 3-kinase de classe I.
LY294002
Inhibe l'activité de la phosphatidylinositol 3-kinase de classe I.
Toxine pertussique
de Bordetella pertussis
ADP-ribosyle l'unité α des protétines G hétérotrimériques Gi, Go, and Gt. Ceci
empêche leur intéraction avec leurs récepteurs.
Clathrine
Dynamine
Cavéoles
Radeaux lipidiques
Cytosquelette d’actine
Endocytose régulée par
l'activité de protéines
kinases
Sensibilité aux
inhibiteurs :
Diméthyl amiloride
Chlorpromazine
MtβCD
Filipine ou nystatine
Cytochalasine ou
jasplakinolide
Wortmannin
Toxine B (Clostridium
difficile)
Propriétés :
Induit
Processus induit ou
constitutif
Marqueurs d’endocytose
(-)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
?
n.d.
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
?
?
?
(+)
(+)
(+)
Les deux sont
possibles
Dextran de 70 kDa,
Hss3bp1?
0,2 – 5 μm
Phase fluide
Macropinocytose
?
?
(-)
?
(+)
Bioparticules
billes de
latex
> 1 μm
Relayée par
récepteur
Phagocytose
?
(-)
?
(-)
(+)
(+)
(-)
?
(+)
(+)
(-)
(-)
?
Transferrine, récepteur
EGF ou LDL
100 – 150 nm
Relayée par récepteur.
Participe à la phase
fluide
Les deux sont possibles
Endocytose classique
par les puits de clathrine
(-)
n.d.
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
SV40, Ctx,
albumine,
LacCer
Induit
50 – 80 nm
Relayée par
récepteur
n.d.
n.d.
n.d.
(-)
(-)
(+)
(+)
n.d.
(-)
(+)
(-)
(+)
n.d.
Récepteur
de l’IL-2
Constitutif
n.d.
Relayée par
récepteur
Pinocytose
Endocytose
Endocytose par
par les
les radeaux
cavéoles
lipidiques de type
cavéolaire
Sommaire des mécanismes d’endocytose et de leurs propriétés
Diamètre des vésicules
Modes d’endocytose
Caractéristiques :
Mécanismes
d’endocytose
Tableau 6
n.d.
n.d.
n.d.
(-)
(-)
(+)
(+)
?
(-)
(-)
(+)
(+)
n.d.
SV40, Ctx, DAF,
GPI-GFP, CD59
Constitutif
n.d
Relayée par récepteur et
phase fluide
Endocytose par les
radeaux lipidiques et
indépendante de la
dynamine
?
?
n.d.
n.d.
(-)
(-)
?
n.d.
(-)
(-)
(-)
(-)
n.d.
Dextran de 10 kDa,
HRP, Ctx, CMH-I
Endocytose
indépendante de la
clathrine, des
cavéoles, des
radeaux lipidiques et
de la dynamine
n.d
Phase fluide. Peut
être relayée par
récepteur (Ctx)
Constitutif
112
Légende :
Références
Sensibilité à l’expression
d’un dominant négatif
de :
Eps15
Dynamine
RhoA
Rac1
Cdc42
Caractéristiques :
Mécanismes
d’endocytose
(+)
(+)
?
?
?
(121, 189, 192, 336,
511, 577)
(-)
(-)
?
?
?
(14, 135, 177, 216,
282, 460, 491, 548,
583, 645)
Endocytose classique
par les puits de clathrine
(46, 105, 255,
407, 415, 419,
447, 463, 552)
(-)
(+)
n.d.
n.d.
n.d.
(295)
(-)
(+)
(+)
(+)
n.d.
Pinocytose
Endocytose
Endocytose par
par les
les radeaux
cavéoles
lipidiques de type
cavéolaire
(122, 272, 409, 519)
(-)
(-)
(-)
(-)
?
Endocytose par les
radeaux lipidiques et
indépendante de la
dynamine
(114, 121, 409, 410,
519, 598)
(-)
(-)
?
?
?
Endocytose
indépendante de la
clathrine, des
cavéoles, des
radeaux lipidiques et
de la dynamine
(+) = présence essentielle et reconnue ou effet probant d’un inhibiteur; (-) = présence non essentielle ou inhibiteur n’a
pas d’effet; (?) = résultats variables selon les types cellulaires et/ou les études; n.d. = rôle/effet non déterminé.
n.d.
?
(+)
(+)
(+)
(60, 119,
131, 205,
210, 365,
466, 471,
502, 606)
Macropinocytose
Sommaire des mécanismes d’endocytose et de leurs propriétés
Phagocytose
Tableau 6 - suite
113
114
4.2 Les mécanismes d’endocytose
4.2.1 La phagocytose
La phagocytose est un processus par lequel certaines cellules internalisent de volumineux
corps étrangers (>1 μm). La phagocytose permet l’élimination de cellules apoptotiques
durant le développement, le remodelage tissulaire et l’inflammation. De plus, il s’agit d’un
mécanisme fondamental de l'immunité innée et adaptée, participant à la défense de
l'organisme contre les invasions par les microorganismes et contribuant aux réponses
immunitaires. Les cellules épithéliales, les fibroblastes, les macrophages, les neutrophiles et
les cellules dendritiques sont aptes à la phagocytose (131). En ce qui concerne le placenta,
l’implantation et l’invasion des trophoblastes nécessitent un réarrangement tissulaire
considérable de la caduque maternelle. Si l’on a cru que les macrophages assuraient seuls
l’activité phagocytaire dans ce processus, en réalité les trophoblastes sont aptes à la
phagocytose, mais ce, dans des proportions moindres que les phagocytes professionnels
(98).
La liaison de particules à des récepteurs phagocytaires exprimés à la surface cellulaire est la
première étape de la phagocytose. Il existe de nombreux récepteurs impliqués dans la
phagocytose qui sont en partie redondants puisque plus d’un type de récepteurs peuvent être
utilisés pour l’internalisation d’une particule donnée. Certains récepteurs de la phagocytose
interagissent directement avec les pathogènes, en reconnaissant des motifs qui sont
conservés à la surface de certains microorganismes. Ces récepteurs incluent des lectines de
type C telles que le récepteur du mannose. D’autres récepteurs interagissent plutôt avec des
opsonines. Par exemple, les récepteurs Fcgamma (FcγR), en liant la région constante des
immunoglobulines G (IgG), permettent l'élimination de microorganismes pathogènes
opsonisés par des anticorps spécifiques. De plus, les particules opsonisées par des
molécules du complément (iC3b) sont internalisées par le récepteur du complément C3b. Il
est important de noter que la taille des complexes opsonisés détermine le mode
d’internalisation associé aux récepteurs Fc : les petits complexes immuns et les agrégats
d’IgG solubles sont internalisés par les puits de clathrine. Seuls les gros complexes
déclenchent la phagocytose (606).
115
En résumé, voici les étapes de la phagocytose. Premièrement, l’activation d’un récepteur de
la phagocytose initie une onde de signalisation intracellulaire qui déclenche une
réorganisation
du cytosquelette d’actine et l’extension concomitante de pseudopodes.
Notons que la signalisation intracellulaire, à partir des récepteurs Fcγ, est induite par les
GTPases, le Cdc42 et le Rac1; il s’agit de RhoA dans le cas du récepteur du complément
C3b (60). Deuxièmement, les pseudopodes encerclent progressivement la particule, puis se
fusionnent pour former un phagosome dont la taille correspond exactement à leur contenu,
entraînant l’internalisation de la particule. Quoique la clathrine soit retrouvée sur les
phagosomes naissants et pourrait participer à la phagocytose (466), il est généralement
admis que son rôle dans la phagocytose demeure non essentiel ((606) et revue par (131)).
Troisièmement, l’amphiphysine recrute la dynamine-2 par un processus nécessitant la
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), ce qui pourrait fournir une partie de la machinerie
requise pour le bourgeonnement du phagosome (210). Ceci dit, on n’a toujours pas établi un
rôle précis de la dynamine-2 dans la phagocytose puisque son inhibition n’affecte pas cet
évènement (606). Les microtubules sont aussi impliqués dans la biogenèse et dans le transit
intracellulaire des phagosomes (119, 365). Quatrièmement, une fois relâché dans le
cytoplasme, le phagosome fusionne séquentiellement avec les endosomes précoces, les
endosomes tardifs et les lysosomes, générant les phagolysosomes, dont l’activité permet la
digestion enzymatique des particules internalisées. Lors de cette dernière étape, on postule
que la biogenèse des phagolysosomes se produit à la suite d’évènements transitoires de
fusion/fission. Ce processus est en partie régulé par l’activité enzymatique de la petite
GTPase de la famille des RAS, le Rab5. Le RAP1 et le Rab7 sont aussi retrouvés à la
surface des phagosomes (revue par (131, 132, 205, 471, 502)).
À la suite de la phagocytose, les macrophages et les neutrophiles produisent, par un
processus appelé explosion oxydative, du peroxyde d’hydrogène, de l’oxyde nitrique et de
l’O2-. Ces métabolites, présents dans les phagolysosomes et dans le milieu extracellulaire,
sont microbicides (117).
116
4.2.2 La macropinocytose
La macropinocytose est une fonction naturelle des macrophages activés et des cellules
dendritiques immatures où elle se produit de façon constitutive (i.e. indépendamment d’un
signal extracellulaire). Elle est aussi présente dans plusieurs lignées cellulaires tumorales,
mais plutôt rare dans les autres types cellulaires. Ceci dit, dans les neutrophiles, certaines
cellules épithéliales et les fibroblastes, la présence de certains signaux permet de déclencher
la macropinocytose, et ce, de façon transitoire. Les stimulations cellulaires possibles
incluent le PAK (p21-activated kinase), l’EGF (epidermal growth factor) et l’insuline, des
cytokines telles que le M-CSF (macrophage-colony stimulating factor), des agents
mitogènes tels que les esters de phorbol, l’expression de v-Src (oncogène codé par le virus
aviaire du sarcome de Rous), ou l’activation des protéines G de la famille des Rho (14, 419,
583).
De façon générale, la macropinocytose sert à : i) éliminer par endocytose de larges
domaines de la membrane, ii) modifier les propriétés d’adhésion/de communication des
cellules, iii) favoriser la migration cellulaire, iv) induire la présentation antigénique, et v)
détruire des virus (revue par (14, 419, 583).
Puisqu’il s’agit d’une endocytose ne nécessitant pas de liaison à un récepteur cellulaire, la
macropinocytose est considérée comme un mécanisme d’internalisation par phase fluide
(revue par (14, 583)). Les étapes de ce mode d’internalisation sont les suivantes : il se
produit d’abord une évagination de la membrane plasmique aux sites de voiles ondulants
membranaires (membrane ruffling), conduisant à la formation de lamellipodes. Ces derniers
encerclent de larges volumes de fluide extracellulaire, et en se refermant, créent de grandes
vésicules de tailles et de formes irrégulières, les macropinosomes. Ceux-ci sont ensuite
acheminés au cytoplasme. Une fois dans le cytoplasme, les macropinosomes, tout comme
les phagosomes, subissent une série de modifications biochimiques. Celles-ci impliquent la
fusion/fission avec d'autres organelles endocytiques et l’acidification des macropinosomes.
Ces modifications permettent, à terme, la dégradation des cargos internalisés; ceci dit, le
recyclage membranaire à partir des macropinosomes est aussi possible (14, 419, 583).
117
La formation de voiles ondulants et de lamellipodes dans la macropinocytose nécessite une
réorganisation des filaments d’actine à la périphérie cellulaire, et ainsi, la macropinocytose
est complètement inhibée par la cytochalasine (susbtance qui induit la dépolymérisation des
filaments d’actine) ((135) et revue par (548)). Cette réorganisation des filaments d’actine
implique la participation de la PI3K (p85/110). En effet, la production de PIP3 par cette
enzyme déclenche la voie de la phospholipase C, et active le Rac1 de même que le Cdc42.
À son tour, le Rac1 déclenche la synthèse de PtdIns(4,5)P2 et l’activation du complexe
WAVE/Arp2/3, chacun entraînant la nucléation et la polymérisation d’actine. De plus, le
Rac1 et le Cdc42 activent la PAK, induisant de ce fait la phosphorylation de la kinase LIM
puis l’inactivation de la cofiline (revue par (177, 491)). Remarquons que le recrutement à la
membrane plasmique de Rac1 est en partie dirigé par l’ARNO/Arf6 (183).
On estime que la macropinocytose requiert l’intégrité du cholestérol membranaire. En effet,
une étude a montré que le MtβCD perturbe la localisation membranaire de Rac1, et par
conséquent empêche la réorganisation du cytosquelette d’actine (216). En revanche, la
macropinocytose est insensible aux agents qui fixent le cholestérol membranaire, tels que
la filipine ou la nystatine, suggérant qu’elle est indépendante des radeaux lipidiques (282).
Ceci dit, la concentration de marqueurs des radeaux lipidiques, tels que le GM-1 et des
protéines
possédant
un
motif
d’ancrage
glycosylphosphatidylinositol
(glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, GPI-AP) dans les macropinosomes des
cellules dendritiques murines permet tout de même de postuler qu’il s’y produit un certain
triage qui est tributaire des lipides présents (636).
Il n’existe pas de marqueur spécifique de la macropinocytose, ce qui rend ardue l’étude du
transit intracellulaire des macropinosomes. Toutefois, il est généralement admis que le
dextran de haut poids moléculaire (70 kDa), étant donné sa taille, est internalisé par la
macropinocytose. C’est pourquoi ce dextran couplé au FITC (fluorescein isothiocyanate)
est souvent utilisé pour étudier cette voie d’endocytose (135). Deuxièmement, une étude a
montré que la protéine Hssh3bp1 (human spectrin SH3-domain binding protein-1) régule la
formation des macropinosomes dans les fibroblastes NIH 3T3, et de ce fait pourrait en être
un marqueur spécifique (645). Par contre, aucune autre étude n’est venue confirmer ces
118
données. Troisièmement, contrairement à l’endocytose par les puits de clathrine, la
formation des macropinosomes est indépendante de la clathrine et de la dynamine (460).
Finalement, le dimethyl amiloride, un inhibiteur des canaux Na+/H+ bloquant
spécifiquement l'ondulation membranaire et la macropinocytose qui en découle, est
largement utilisé pour inhiber cette voie (255).
En résumé, la macropinocytose i) est stimulée par différents signaux incluant des facteurs
de croissance, ii) est dépendante de la PI3K, iii) nécessite la réorganisation du cytosquelette
d’actine, iv) capte un large volume de fluide extracellulaire, et v) n’induit pas
l’internalisation du récepteur de la transferrine puisque celui-ci est dépendant de la clathrine
(revue par (14, 255, 419, 548, 583)).
4.2.3 L’endocytose dépendante de la clathrine
Les récepteurs internalisés par l’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) sont classés
en deux groupes. Certains, comme celui de la transferrine ou des LDL (low density
lipoproteins), le sont de façon «constitutive», c’est-à-dire indépendamment de la liaison de
leur ligand alors que d’autres, principalement les récepteurs de facteurs de croissance
(l’EGF ou l’insuline), ne sont internalisés qu’après la liaison de leur ligand. Cette
endocytose est donc associée à l’internalisation relayée par récepteurs. Le LDL, la
transferrine, l’EGF, de même que leur récepteur respectif, en sont des marqueurs reconnus.
Il est important de noter que ce mode d’internalisation permet, dans une certaine mesure et
de façon simultanée, l’internalisation par phase fluide. Ainsi, le HRP, marqueur de
l’endocytose par phase fluide, pourra se retrouver dans des vésicules de clathrine au
moment de leur formation (revue par (46, 136, 396)).
L’endocytose dépendante de la clathrine sous-entend la formation de vésicules de clathrine,
évènement qui se déroule en trois étapes distinctes qui sont : i) la nucléation de la clathrine
pour générer des puits recouverts d’un manteau de clathrine qui concentrent les récepteurs
transmembranaires en cours d’internalisation, ii) l’invagination des puits de clathrine, et iii)
la scission pour créer les vésicules de clathrine libres dans le cytoplasme, soit
119
l’internalisation proprement dite (revue par (46, 396)) (c.f. Figure 17). En voici une
description.
L’endocytose débute par la formation des puits recouverts de clathrine. La clathrine est
constituée de trois chaînes lourdes et de trois chaînes légères associées en triskèles. Les
triskèles sont les éléments structuraux du manteau de clathrine. Le complexe protéique AP2 (Adaptor ou Assembly protein-2) possède à la fois des sites de liaison aux phosphoinositides PtdIns(4,5)P2 membranaires et à la clathrine. Ainsi l’AP-2 peut d’abord
s’associer au feuillet interne de la membrane plasmique, puis ensuite recruter la clathrine.
Ce complexe protéique, conjointement avec d’autres protéines adaptatrices, telles que
l’AP180/CALM, dirigent alors la nucléation de la clathrine. A terme, ce processus crée les
manteaux de clathrine qui, en tapissant l’extérieur des puits de clathrine, aident à concentrer
les cargos et à stabiliser les vésicules en formation (revue par (396)). Notons que la liaison
de l’AP-2 au PtdIns(4,5)P2 n’est qu’un des éléments contrôlant son recrutement à la
membrane plasmique. En fait, le mécanisme qui sous-tend cet évènement n’est pas
totalement élucidé et, de ce fait, les étapes qui initient la nucléation de la clathrine ne sont
pas complètement établies. Toutefois, on postule que la synaptotagmine participe à ce
processus (228).
Parallèlement à la formation de ces puits de clathrine, c’est à cet endroit que le recrutement
sélectif des récepteurs transmembranaires destinés à être internalisés s’opère. Cette
sélection des récepteurs se fait grâce à des motifs de type tyrosine (NPxY ou YxxΦ), dileucine ou di-lysine ou encore ubiquitinés, localisés dans leur région intracytoplasmique, et
qui sont reconnus par l’AP-2 (revue par (46, 136, 396)). En effet, en plus de reconnaitre la
clathrine et le PtdIns(4,5)P2, le complexe AP-2 lie les motifs d’endocytose par la clathrine
contenus dans les récepteurs. Il est à noter que l’internalisation de certains récepteurs ne
dépend pas directement du complexe AP-2 mais se fait plutôt par les β-arrestines (revue par
(396)).
Deuxièmement, l’epsine dirige l’invagination des puits de clathrine. Pour ce faire, l’epsine,
à la suite de sa liaison aux PtdIns(4,5)P2 membranaires, induit le bourgeonnement de la
membrane plasmique. De façon simultanée, l’epsine, de même que l’AP180, ainsi
120
retrouvées aux puits en formation, facilitent le recrutement des triskèles. Ceci permet
d’induire en un lieu précis la formation du maillage de clathrine. L’epsine lie alors l’AP-2,
directement ou par l’intermédiaire de l’Eps15. Finalement, l’epsine se dissocie des puits
lorsque l’AP-2 déclenche la nucléation de la clathrine. Ainsi, l’epsine arrime l’étape de
courbure de la membrane à la formation des puits de clathrine. Troisièmement, une fois les
puits formés, ceux-ci se creusent sous l’action de l’endophiline, puis il y a fission
membranaire à la zone d’étranglement des puits pour générer les vésicules de clathrine qui
se retrouvent alors libres dans le cytoplasme. Ce processus est dirigé par la GTPase
dynamine-2, l’endophiline de même que par l’amphysine qui recrute la dynamine-2 aux
vésicules de clathrine naissantes ((46, 121, 136, 344, 396)).
Les puits de clathrine constituent des régions spécialisées de la membrane, caractérisées par
une composition en phospho-inositides distincte du reste de la membrane plasmique.
Pourtant, ils ne font pas partie des radeaux lipidiques (418, 577). Or, l’extraction du
cholestérol membranaire (par traitement des cellules au MtβCD) entraîne une réduction de
l’ordre de 50% du taux d’internalisation du récepteur de la transferrine. L’internalisation du
récepteur EGF diminue de 35% dans ces conditions. Par contre, la filipine n’a eu aucun
effet sur ce processus (511). Deux hypothèses sont envisagées. D’une part, le MtβCD
pourrait induire une perte de l’invagination membranaire associée aux puits de clathrine et,
ainsi, inhiber l’endocytose par les clathrines. D’autre part, la composition lipidique
membranaire pourrait offrir l’environnement spatial pour recruter, moduler et activer les
protéines requises pour la formation des vésicules de clathrine et donc réguler la formation
et les fonctions des puits de clathrine. En accord avec cette seconde idée, on sait que l’AP-2
et la dynamine-2 sont recrutées à la membrane par une liaison au PtdIns(4,5)P2 (396).
Il est reconnu que plusieurs protéines associées à l’endocytose dépendante de la clathrine
sont directement associées au cytosquelette d’actine ou à des protéines qui induisent la
polymérisation de l’actine (244, 336). De plus, certaines protéines associées à l’endocytose
stimulent elles-mêmes la polymérisation de l’actine. Pourtant, les agents qui modulent
l’actine n’inhibent pas ou peu l’endocytose médiée par la clathrine (189). Dans ce contexte,
on croit que l’actine pourrait servir de plate-forme pour regrouper des protéines impliquées
121
dans l’internalisation par la clathrine ou contribuer à l’invagination de la membrane lors de
la formation des puits. Une autre hypothèse serait que l’actine pourrait propulser les
vésicules naissantes au travers du dense maillage d’actine du cortex cellulaire (revue par
(105, 490, 533)). Les protéines le Cdc42, le RhoA et le Rac1 pourraient être impliquées lors
de cette étape (revue par (156, 244, 295, 336)).
Notons finalement que la production de phosphoinositides, lors de la formation des puits de
clathrine, est insensible à l’action de la wortmannine ou du LY294002, inhibiteurs des PI3K
de la classe I (349, 565). On postule que cette endocytose requiert non pas la participation
de ces kinases mais celle de la PI3K-C2, enzyme PI3K de classe II, insensible à la
wortmannine (192).
122
Figure 17
L’endocytose classique par les puits de clathrine
(1) Recrutement de la clathrine et de l’AP-2 à la membrane plasmique. (2) Les motifs
d’endocytose par la clathrine contenus dans la queue intra-cytoplasmique des récepteurs
destinés à l’endocytose sont reconnus par l’AP-2. (3 & 4) Il y a invagination et fission des
vésicules de clathrine sous l’action des protéines accessoires (l’epsine, l’Eps15, la
dynamine-2, l’endophiline, l’amphysine). (5) Le manteau de clathrine est retiré, permettant
aux protéines d’être recyclées, alors que (6) la vésicule primaire fusionne avec les
endosomes de triage sous l’action de Rab5 et de l’EEA1 et du complexe protéique SNARE
(tiré de : (358)).
123
4.2.4 L’endocytose par les cavéoles
Le terme «radeaux lipidiques» réfère à des microdomaines putatifs de la membrane qui ont
une composition différente des régions membranaires contiguës et qui sont enrichis en
cholestérol, glycosphingolipides (dont le GM-1), sphingomyéline, phospholipides à longues
chaînes insaturées et en GPI-AP. De façon globale, on postule que les radeaux lipidiques
fournissent des sites où sont étroitement regroupées des molécules devant: i) interagir
ensemble ou ii) être transportées au même endroit dans la cellule. Les cavéoles sont une
variété des radeaux lipidiques définis comme de petites invaginations de la membrane
plasmique en forme de flasque. Elles sont caractérisées, au plan biochimique, par la
présence en surface de la cavéoline-1/cavéoline-2, protéines membranaires impliquées dans
leur formation et/ou leur maintien et qui lient le cholestérol (revue par (46, 105, 255, 407,
415, 419, 447, 552)).
La composition lipidique particulière des radeaux lipidiques les rend résistants à la
solubilisation par des détergents anioniques à 40C, une propriété utilisée pour les isoler sur
gradient de sucrose sous forme de DRM (detergent-resistant membranes). En fonction de
cette caractéristique, on retrouve plusieurs termes synonymes dans la littérature scientifique
pour désigner les radeaux lipidiques, soit : i) «membranes riches en glycolipides insolubles
aux détergents», ii) «radeaux lipidiques de type cholestérol-sphingolipide», iii)
«membranes enrichies en glycolipides», iv) «membranes enrichies en cavéoline», v)
«domaines semblables aux cavéoles», et vi) «membranes apparentées aux cavéoles» (revue
par (46, 105, 255, 407, 415, 419, 447, 552)). Il est important de préciser que seuls les
radeaux lipidiques associés à la cavéoline sont définis comme des cavéoles dans cette thèse;
ceux qui ne possèdent pas la cavéoline sont nommés radeaux lipidiques.
La modulation du cholestérol membranaire par l’action d’agents pharmacologiques, tels
que le MtβCD, la filipine ou la nystatine, réduit la propension des protéines et des lipides
associés aux radeaux lipidiques à se retrouver dans les fractions DRM. Ces agents sont
donc utilisés à profusion pour démontrer qu’une voie d’internalisation est associée à
l’endocytose par les cavéoles et/ou les radeaux lipidiques. Outre cette méthode, deux
techniques expérimentales et/ou critères sont régulièrement utilisées pour conclure qu’une
124
endocytose est dépendante des radeaux lipidiques proprement dits (ce qui inclut les
cavéoles le cas échéant) : i) l’insolubilité du récepteur internalisé dans le Triton X-100, et
dans le cas de l’endocytose par les cavéoles, ii) la localisation du cargo internalisé aux
cavéoles par microscopie électronique ou la co-localisation du cargo et de la cavéoline par
microscopie confocale (revue par (447)). Il est important de remarquer que le MtβCD,
comme nous l’avons déjà mentionné, affecte partiellement l’endocytose par les clathrines
(ce qui n’est pas le cas de la filipine et ou de la nystatine) (511), alors que les puits de
clathrine ne sont pas localisés dans les radeaux lipidiques. Cet inhibiteur n’est donc pas
considéré comme marqueur spécifique de l’endocytose impliquant les radeaux lipidiques.
Les cavéoles sont présentes dans plusieurs types cellulaires, et ce, particulièrement dans les
cellules endothéliales. Par ailleurs, les cavéoline-1 et -2 ne sont pas exprimées par les
cellules trophoblastiques (331) ni par les lymphocytes (227) : l’endocytose par les cavéoles
n’y a donc pas lieu. Le rôle de la cavéoline-1 dans la formation/fonction des cavéoles est
controversé. D’une part, l’expression de cette protéine est suffisante pour générer des
cavéoles (322). Ensuite, chez les souris knock-out pour le gène de la cavéoline-1, on
n’observe plus de cavéoles (148). S’étant appuyé sur ces données, on a cru que la fonction
des cavéoles était intimement liée à la présence d’un manteau de cavéoline-1 à leur surface.
Ce principe est remis en question (407, 415). D’abord, les résultats d’expérience utilisant un
ARNsi (small interference) suggèrent que l’endocytose se produit normalement en
l’absence de cavéoline-1 (417). Ensuite, la surexpression de la cavéoline-1 inhibe
l’endocytose par les cavéoles (308, 378). Il est donc possible que cette protéine régule non
pas positivemnt mais plutôt négativement le bourgeonnement des cavéoles (407). Toutefois,
la fonction exacte de la cavéoline demeure incertaine.
Les fonctions cellulaires des cavéoles sont également mal définies. D’une part, de
nombreux intermédiaires des voies de signalisation cellulaire sont retrouvés dans les
cavéoles suggérant que ces structures pourraient agir comme plate-forme de signalisation.
D’autre part, alors qu’il est admis que l’endocytose par les cavéoles est impliquée dans la
transcytose de macromolécules par les cellules endothéliales (378), l’ampleur de
l’endocytose par les cavéoles reste controversée dans la plupart des autres types cellulaires.
125
En effet, les cavéoles sont des structures statiques à la membrane, laissant supposer que
l’internalisation par la formation de vésicules associées aux cavéoles se produit peu
fréquemment (596). Dans ce contexte, on postule que la fonction première des cavéoles est
la potocytose, mécanisme par lequel la liaison d’un ligand à son récepteur retrouvé dans les
cavéoles induit l’invagination et la fermeture des cavéoles sans qu’il n’y ait fission et
détachement de vésicules (revue par (552)).
En s’appuyant sur deux études, la validité de cette hypothèse est questionnée. D’abord, il
est maintenant établi que la dynamine se retrouve au site d’internalisation et contrôle la
fission des cavéoles (646). Ensuite, on a récemment montré que si des cavéoles sont
stationnaires, d’autres sont en mouvement. En effet, lorsque les cavéoles ne sont pas
engagées dans le transport endocytaire, elles sont arrimées les unes aux autres, formant une
structure contenant de multiples cavéoles reliée à la membrane plasmique. Par contre, les
cavéoles aptes au transport endocytaire subissent, individuellement et de façon continue,
des cycles de fusion/fission avec le feuillet interne de la membrane plasmique. Au cours de
ces cycles, les cavéoles séquestrent leurs cargos, et leur manteau de cavéoline, présent à
leur surface, reste intact. Pour que les cavéoles quittent la région de la membrane plasmique
avec leur cargo, un signal moléculaire est requis. Celui-ci provoque en effet un changement
dans ce transport minimal et localisé des cavéoles, qui alors transitent loin de la membrane
plasmique et atteignent des organelles intracellulaires, possiblement les cavéosomes (463,
586). Les cavéosomes sont des structures non acides enrichies en cavéoline-1 et en
cholestérol qui sont distinctes des endosomes précoces et tardifs associés à la voie de
l’endocytose par les clathrines. Ainsi, les cavéosomes ne contiennent pas de marqueur de
l’endocytose par les clathrines tel que la transferrine (461). Parallèlement à ce transport aux
cavéosomes, des cavéoles intracellulaires retournent à la membrane plasmique (417, 463).
L’endocytose par les cavéoles ne serait donc pas un processus constitutif (596) mais
nécessiterait au contraire une induction pour être déclenchée. L’étude du virus SV40 (461,
462), de l’albumine (539) et de certains glycosphingolipides (540), marqueurs de
l’internalisation par les cavéoles, a permis d’établir que ce processus peut être stimulé par
les inhibiteurs des phosphatases, tels que l’acide okadaïque et le vanadate, et inhibé par les
126
inhibiteurs des tyrosine kinases tels que la staurosporine et la génistéine. Ceci suggère
qu’une cascade de signalisation menant à la phosphorylation de résidus tyrosine contenus
dans les constituants cavéolaires est nécessaire à ce type d’endocytose. En fait, de
nombreuses protéines kinases, dont les protéines Src, régulent l’endocytose par les cavéoles
(459, 463). De plus, la perturbation du cytosquelette d’actine par des agents
pharmacologiques tels que la cytochalasine, la latrunculine et la jasplakinolide inhibe
l’endocytose par les cavéoles, alors que le cholestérol et les glycosphingolipides exogènes
l’activent (revue par (46, 105, 255, 407, 415, 419, 447, 552)). Une étude a montré que
l’inhibiteur des protéines Rho, la toxine B de Clostrodium difficile, n’affecte pas cette
endocytose (540).
En résumé, l’endocytose par les cavéoles implique les étapes suivantes : i) le regroupement
des composantes des radeaux lipidiques dans les cavéoles à la membrane plasmique, ii) le
déclenchement d’une cascade de signalisation cellulaire impliquant la phosphorylation de
résidus tyrosine, ce qui augmente la dynamique d’invagination et d’internalisation des
vésicules, de même qu’un réarrangement du cytosquelette d’actine, puis finalement iii) le
transport des vésicules vers des organelles intracellulaires stables préexistantes exprimant la
cavéoline, les cavéosomes. Il est important de noter que l’endocytose par les cavéoles est
une endocytose relayée par récepteur et que, puisque le diamètre des cavéoles est petit
(~50-80 nm), l’internalisation concomitante de volume associé à la phase fluide est limitée
(revue par (46, 105, 255, 407, 415, 419, 447, 552)).
4.2.5 L’endocytose par les radeaux lipidiques de type cavéolaire
Il est important de rappeler que les cavéoles ne représentent qu’une variété de radeaux
lipidiques présents à la surface cellulaire. Or, il existe dans certaines cellules qui
n’expriment pas la cavéoline, un type d’endocytose possédant des caractéristiques
semblables à celles de l’endocytose par les cavéoles. Cependant, faute de cavéoline, cette
endocytose ne satisfait pas la définition d’endocytose par les cavéoles. Ce type
d’endocytose, qui est souvent nommé «endocytose par les radeaux lipidiques» dans la
littérature, sera définie comme « l’endocytose par les radeaux lipidiques de type
cavéolaire » dans cette thèse. L’exemple le plus éloquent est l’internalisation constitutive
127
du récepteur de l’IL-2 par les lymphocytes. Cet évènement est indépendant des puits de
clathrine et de la cavéoline. Par contre, l’endocytose du récepteur de l’IL-2 est associée à sa
localisation dans les radeaux lipidiques et nécessite la dynamine. Aussi, l’activité des
GTPases RhoA et Rac1 est requise, illustrant la participation du cytosquelette d’actine. La
signalisation cellulaire impliquant la phosphorylation n’a pas été investiguée (295).
Nous aborderons dans les prochaines sections la pinocytose qui est indépendante des
cavéoles et des puits de clathrine. Nous tenons à préciser que les rapports publiés faisant
état d’une telle endocytose se multiplient (revue par (105, 255, 419)). Cependant, la
méconnaissance des transporteurs impliqués dans les étapes initiales d’entrée par cette
endocytose rend difficile la caractérisation de la machinerie moléculaire responsable. Dans
cette perspective, on dit qu’une molécule est internalisée par une endocytose indépendante
de la clathrine et des cavéoles par exclusion de la participation des marqueurs reconnus de
l’endocytose associée à ces types d’internalisation.
4.2.6 L’endocytose par les radeaux lipidiques indépendante de la
dynamine
Il s’agit d’une voie d’internalisation récemment décrite qui est indépendante de la clathrine,
des cavéoles et de la dynamine mais qui requiert tout de même la participation des radeaux
lipidiques distincts des cavéoles. Voici quelques exemples à cet égard. Premièrement, les
protéines membranaires ayant un motif d’ancrage de type GPI sont enrichies dans les DRM,
suggérant leur présence à la membrane plasmique dans des microdomaines spécifiques. Or,
l’internalisation des protéines ancrées à la membrane par un motif natif GPI (GPI-AP) telles
que le récepteur du folate et le DAF (Decay Accelerating Factor) qui ne sont pas en essaim
(cluster), de même que la GFP (Green Fluorescent Protein) en fusion avec un motif GPI
(GFP-GPI), se produit de façon indépendante de la dynamine et de la clathrine. De plus, il
s’agit d’un processus indépendant des cavéoles puisque, d’une part, ces GPI-AP internalisés
ne colocalisent pas avec la cavéoline et que, d’autre part, leur endocytose se produit
normalement dans des cellules qui n’expriment pas la cavéoline (519).
128
Deuxièmement, une autre étude a montré que le CD59 (protéine possédant un motif
d’ancrage de type GPI) et le Tac-GPI (sous-unité alpha du récepteur de l’IL-2 jumelée à un
motif GPI) co-localisent avec des protéines (telles que le CMH-I) internalisées de façon
indépendante de la clathrine et de la dynamine. De plus, dans cette étude la filipine réduit
de 50-60% l’internalisation du CD59, confirmant l’implication d’une endocytose atypique
dépendante des radeaux lipidiques (409). En ce qui à trait à la participation de l’actine à ce
processus, l’équipe du Dr Mayor a montré que l’internalisation de GPI-AP n’est pas
affectée par l’expression d’un dominant négatif de RhoA ni de Rac1, mais l’est par
l’expression d’un dominant négatif de Cdc42 (519), alors que l’équipe du Dr Donaldson n’a
observé aucun effet en présence de ces mutants (409); on se retrouve ainsi devant une
controverse à ce sujet. Toutefois, ils ont fait l’intéressante observation que ce type
d’endocytose participe aussi grandement à l’internalisation par phase fluide du dextran et
du HRP (519).
Le troisième exemple d’une endocytose par les radeaux lipidiques indépendante de la
dynamine concerne la sous-unité B de la toxine du choléra (Ctx) et le SV40. Spécifions
d’abord que l’internalisation de la Ctx peut se produire par divers types d’endocytose
simultanément. D’une part, elle peut être internalisée par les puits de clathrine (417) et par
les cavéoles (272). Par ailleurs, dans les fibroblastes murins primaires (déficients en
cavéoline-1), la toxine cholérique peut aussi être internalisée par un processus indépendant
de la clathrine, de la dynamine et des cavéoles, mais partiellement sensible au MtβCD
(272). Dans un modèle expérimental similaire, le virus SV40, qui est normalement
internalisé par les cavéoles, peut emprunter cette voie alternative d’internalisation.
L’endocytose indépendante de la clathrine et des cavéoles du SV40 requiert la signalisation
par les tyrosine kinases (122). Le rôle du cytosquelette d’actine n’a pas été évalué dans ces
deux études; par contre l’endocytose du SV40 est sensible au nocadazole qui perturbe la
fonctionnalité des microtubules (122, 272).
Immédiatement après leur endocytose, les protéines possédant un motif d’ancrage GPI se
retrouvent dans des compartiments intracellulaires contenant également le dextran, l’HRP
et le LY. Ces organelles, qui sont distincts de ceux contenant le transferrine et le LDL, sont
129
nommées les GEEC (GPI-AP enriched early endosome compartments) (519). L’endocytose
de la cytotoxine VacA de l’Helicobacter pylori par les cellules HeLa (202), de même que
celle de la Ctx par les cellules fibroblastes embryonnaires déficientes en cavéoline (272)
conduit également à ces organelles.
4.2.7 L’endocytose indépendante de la clathrine, des cavéoles, des
radeaux lipidiques et de la dynamine
Puisque l’accumulation intracellulaire du HRP, du Lucifer Yellow (LY) et du dextran de
faible poids moléculaire (10 kDa) est peu affectée par les inhibiteurs de l’endocytose
dépendante des puits de clathrine (114) ou par l’expression d’un dominant négatif de la
dynamine (120), ces molécules sont traditionnellement décrites comme des marqueurs de
l’endocytose par phase fluide (120). Cette définition est donnée un peu par défaut dans la
mesure où l’endocytose de ces molécules ne rencontrait aucun des paramètres connus. Il en
va de même pour l’accumulation des marqueurs de l’endocytose par adsorption non
spécifique. Or, d’après les résultats de récentes études, on envisage que l’endocytose de
certaines molécules indépendante des puits de clathrine, des cavéoles, des radeaux
lipidiques et de la dynamine soit possible et suive des paramètres encore mal définis.
Premièrement, l’internalisation du dextran est partiellement inhibée par la toxine B de
Clostridium difficile et par l’expression d’un dominant négatif de Cdc42 (519).
Deuxièmement, une étude a démontré qu’en plus des voies d’internalisation précédemment
décrites, une grande proportion de la Ctx (toxine cholérique) peut être simultanément
endocytosée de façon indépendante de la clathrine et de la dynamine (en raison de
l’inhibition incomplète de son internalisation par l’expression d’un dominant négatif de la
dynamine), de même que des cavéoles et des radeaux lipidiques (598). Troisièmement,
l’endocytose de Tac (sous unité alpha du récepteur de l’IL-2) se fait par une voie
indépendante de la clathrine et de la dynamine. L’équipe du Dr Donaldson a conclu que
l’endocytose de Tac est également indépendante des cavéoles et des radeaux lipidiques
puisque cette protéine est soluble dans le triton X-100 et qu’elle ne co-localise pas avec la
cavéoline à la membrane plasmique (410). Quatrièmement, l’internalisation du CMH-I se
ferait par un mode similaire. Le fait que le CMH-I et Tac soient acheminés vers des
130
endosomes associés à l’Arf6 qui sont distincts de ceux contenant la transferrine est une
bonne indication d’un nouveau mode d’endocytose (410).
Il est important de remarquer que la macropinocytose répond aussi à la définition
d’endocytose indépendante de la clathrine, des cavéoles, des radeaux lipidiques et de la
dynamine, mais que les mécanismes qui la sous-tendent en sont différents. Ceci illustre
toute la complexité des voies d’internalisation indépendantes de la clathrine.
4.2.8 Les voies d’endocytose dans les cellules épithéliales polarisées
Si l’on a caractérisé la majorité des voies d’endocytose, que nous venons de décrire dans les
cellules non polarisées, il n’est pas encore établi que les mêmes phénomènes prévalent
également dans les cellules épithéliales polarisées. En effet, il faut considérer que dans ces
cellules, l’endocytose se produit à deux pôles membranaires distincts, ce qui pourrait se
traduire par des mécanismes/modes d’internalisation différents. Voici, en résumé, l’état de
la situation à ce sujet : premièrement, la macropinocytose et la phagocytose se produisent
principalement au pôle apical de ces cellules (465). Deuxièmement, on a documenté que
l’endocytose par les puits de clathrine a lieu au pôle apical et, également mais
majoritairement, au pôle basolatéral des cellules épithéliales polarisées (revue par (115,
465)). Troisièmement, alors que la cavéoline-1 est retrouvée à la membrane apicale et
basolatérale des cellules épithéliales polarisées, l’endocytose par les cavéoles n’a lieu qu’au
pôle basolatéral (631). Toutefois, le pontage des GPI-AP par des anticorps induit la
formation de cavéoles à la membrane apicale de ces cellules (631). Quatrièmement, puisque
ni les cavéosomes ni les GEEC n’ont encore fait l’objet d’une étude dans les cellules
polarisées, on ne sait toujours pas si ces structures y existent (465). Finalement, pour les
voies d’endocytose indépendante de la dynamine, le mécanisme qui sous-tend la fission des
vésicules membranaires demeure une énigme pour les scientifiques. Or, on a récemment
montré que la protéine CtBP3/BARS contrôle la fission vésiculaire lors du transport
s’opérant, d’une part entre le Golgi et la membrane plasmique basolatérale dans les cellules
épithéliales polarisées, et d’autre part dans l’endocytose des marqueurs de la phase fluide
dans les cellules non polarisées (64).
131
4.3 Le transport intracellulaire : la voie endolysosomale
4.3.1 Mise en contexte
Cette section est consacrée à la définition des caractéristiques principales de chaque
compartiment endosomal traversé par un complexe ligand-récepteur internalisé, l'ensemble
de ces données permettant de mieux comprendre la fonction réservée à chaque type
d'endosomes. Cette description s’applique à l’endocytose par les puits de clathrine dans les
cellules non polarisées; le cas des épithéliums polarisés sera décrit dans un deuxième temps.
Globalement, suivant leur internalisation par les puits de clathrine, les complexes
ligand/récepteur sont d’abord acheminés par transport vésiculaire aux endosomes de triage
où se produit l’amarrage puis la fusion des vésicules avec la membrane de ces endosomes.
Ces premiers compartiments endosomaux constituent un centre décisionnel intracellulaire à
partir duquel les molécules internalisées sont dirigées vers l’une des trois voies suivantes :
i) retour direct à la membrane plasmique, ii) recyclage à la membrane suite à un passage par
les endosomes de recyclage ou iii) transport aux endosomes tardifs puis aux lysosomes. Il
s’agit dans ce dernier cas de la voie traditionnellement dite de « dégradation » (c.f. Figure
18). Certaines molécules retrouvées dans les endosomes de triage ou dans les endosomes
tardifs peuvent aussi être acheminées au réticulum endoplasmique ou au Golgi par un
transport dit « rétrograde ». Ce transit permet de relier les voies endosomale et de
biosynthèse. Il est à noter que dans cette thèse le terme « endosome de triage » est attribué
aux endosomes qui sont atteints en premier lieu par les vésicules suite à l’endocytose, alors
que la définition d’endosome précoce englobe les endosomes de triage et de recyclage.
Cette définition diffère de celle donnée dans les articles présentés aux chapitres 2 à 6 où les
notions d’endosomes de triage et d’endosomes précoces sont confondues.
Deux modèles sont postulés pour expliquer la formation des endosomes. Premièrement, les
endosomes de triage sont issus de novo, possiblement par la coalescence des vésicules
internalisées. D’après ce modèle, chaque organelle serait dans un état transitoire tel que les
endosomes tardifs résulteraient de la maturation des endosomes de triage et, par la suite, les
lysosomes dériveraient des endosomes tardifs. Chaque état de maturation des endosomes
est caractérisé par des marqueurs biochimiques précis. Notons que l’on a aussi proposé que
132
les lysosomes fusionnent périodiquement avec les endosomes tardifs pour former un
organelle hybride et, subséquemment, les lysosomes bourgeonnent de cet organelle pour
être réutilisés (329). Le deuxième modèle proposé pour expliquer la formation des
endosomes est le suivant : les endosomes de triage et les endosomes tardifs formeraient des
compartiments préexistants stables et le transport inter-compartiment serait relayé par des
vésicules (revue par (479)).
Remarquons que dans les deux modèles envisagés, il existe un intermédiaire entre les
endosomes de triage et les endosomes tardifs. Dans le premier cas, cet intermédiaire est
l’organelle que l’on obtient à la suite de l’élimination des molécules destinées au recyclage
des endosomes de triage. Dans le second cas, l’intermédiaire est une vésicule de transport
qui a bourgeonné des endosomes de triage (revue par (330)). Cet intermédiaire, donc issu
des endosomes de triage (soit par maturation ou par bourgeonnement), est nommé corps
multivésiculaire (MVB; multivesicular body) ou encore vésicule de transport endosomal
(ECV; endosomal carrier vesicle). Les MVB/ECV possèdent des vésicules luminales (i.e.
intra-endosomales) qui sont générées par l’invagination puis le bourgeonnement de petites
régions de la membrane externe des endosomes vers l’intérieur (donc la lumière) des
endosomes. En d’autres termes, ces vésicules, dont la lumière est au plan topologique
équivalente au cytoplasme, dérivent d’un processus de vésiculation intra-endosomale (218).
Or, les MVB/ECV incorporent de façon sélective dans leurs vésicules internes les
récepteurs/protéines destinés aux endosomes tardifs/lysosomes. Une fois détachés des
endosomes de triage, les MVB/ECV fusionnent avec les endosomes tardifs, permettant
l’accès de ces vésicules intra-endosomales aux endosomes tardifs (c.f. Figure 18). Il est à
noter que tous les endosomes impliqués dans la voie de dégradation, incluant certaines
régions des endosomes de triage de même que les endosomes tardifs, possèdent également
des vésicules en nombre variable dans leur lumière. Ces endosomes, tout comme les
MVB/ECV, sont donc multivésiculaires. De ce fait, « endosome multivésiculaire » (MVE;
multivesicular endosomes) est un terme générique attribuable à tout endosome (incluant les
MVB/ECV) ayant des vésicules luminales. Ceci dit, les MVB/ECV réfèrent dans cette thèse
strictement aux organelles/vésicules intermédiaires impliqués dans le transport entre les
endosomes de triage et les endosomes tardifs.
133
Figure 18
La voie endolysosomale
Les différentes étapes de la voie endolysosomale sont illustrées (flèches pleines). Les
invaginations membranaires et les vésicules intra-endosomales sont en rouge, montrant les
régions tubulaires (en citerne) et/ou multivésiculaires des endosomes. Le recyclage (flèches
en pointillé) se produit depuis les endosomes de triage et de recyclage, ou encore à partir
des endosomes tardifs et du Golgi. Dans ce second cas, il s’applique à la voie de
biosynthèse (tiré de : (218)).
4.3.2 Les endosomes de triage
Nous abordons ici la description du transport des vésicules aux endosomes de triage et le
processus de triage se produisant dans ces organelles.
Une fois les vésicules de clathrine relâchées dans le cytoplasme, leur manteau de clathrine
est rapidement désassemblé par l’action concertée de l’auxiline et de la Hsp70c (heat shock
134
protein 70c) (620). Ces vésicules endosomales primaires peuvent alors fusionner avec les
endosomes de triage. L’une des fonctions de la petite guanosine triphosphatase (GTPase)
Rab5 est de recruter les facteurs protéiques nécessaires à l’amarrage des membranes des
vésicules primaires et des endosomes de triage, étape précédant leur fusion. Le Rab5
contrôle aussi et de la même façon la fusion homotypique des endosomes de triage.
Les étapes de cette amarrage/fusion sont les suivantes : le Rab5 sous sa forme GDP
(guanosine diphosphate) se retrouve inactif dans le cytoplasme. Le complexe protéique
rabex-5 et rabaptine-5 catalyse la relâche du GDP associé au Rab5. Le Rab5 peut alors lier
le GTP et se retrouve dans un état activé. Ce faisant, le complexe protéique est recruté à la
membrane des vésicules primaires et des endosomes de triage. Le Rab5-GTP lie alors la
PI3K hVPS34, ce qui induit la synthèse de PtdIns3P localement. Ensuite, la présence
conjointe de Rab5 et de PtdIns3P permet l’attachement des protéines effectrices, l’EEA1
(Early Endosome Autoantigen) et la rabenosyne-5, par l’intermédiaire de leur domaine en
doigt de zinc FYVE. De plus, puisque EEA1 possède à ses extrémités N et C terminales un
site de liaison à Rab5, cette protéine peut donc lier deux Rab5 qui sont situés sur des
membranes distinctes (vésicules primaires et endosomes de triage, par exemple). Ceci
permet l’arrimage de ces deux membranes. La fusion proprement dite est ensuite réalisée
par des protéines SNARE (soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor attachment protein
receptors). Les protéines EEA1 et Rab5 sont donc des marqueurs des endosomes de triage
(revue par (642, 662)).
Malgré les progrès accomplis dans la caractérisation moléculaire et structurelle des
endosomes de triage, le mécanisme qui sous-tend le triage des cargos et des récepteurs
internalisés ayant lieu dans ces organelles est mal défini. Différents cas de figure sont
possibles : i) le recyclage à la membrane du complexe ligand-récepteur dans son entièreté
(ex: la transferrine), ii) la dissociation du complexe ligand-récepteur suivie du recyclage du
récepteur et du transport aux endosomes tardifs du ligand (ex: le LDL), ou iii) le transport
du complexe ligand/récepteur aux endosomes tardifs (ex : l’EGF). Le pH des endosomes de
triage, de 6,3-6,5, est généré par une H+-ATPase et régulé par une Na+, K+-ATPase. A ce
135
pH légèrement acide, plusieurs ligands se dissocient de leur récepteur, ce qui constitue la
première étape de triage (revue par (358)).
Un des postulats émis pour expliquer le tri vers la dégradation ou vers le recyclage est le
suivant : les endosomes de triage sont des compartiments pléomorphes et dynamiques,
formés d’une large citerne centrale vacuolaire (i.e. multivésiculaire) d’où émanent des
extensions tubulaires. Or, les récepteurs qui recyclent sont rapidement et continuellement
ségrégués dans les extensions tubulaires des endosomes de triage. En se scindant par la
suite en vésicules de transport, ces extensions permettent le transit, soit à la surface
cellulaire, soit aux endosomes de recyclage, des molécules à recycler qu’elles contiennent
(ex : le récepteur de la transferrine (TfnR)). La région tubulaire des endosomes de triage
constitue donc un domaine de recyclage. A l’opposé, les ligands et récepteurs (ex : l’EGFR)
destinés à la voie endolysosomale sont retenus dans la portion vacuolaire des endosomes de
triage par un processus qui sera décrit dans la prochaine section. On estime que le recyclage
constitue une voie par défaut, alors que le transport vers les endosomes tardifs/lysosomes
requiert la présence d’un signal précis (revue par (358, 520)).
En ce qui concerne le tri vers la voie de dégradation, les étapes suivantes se produisent dans
les endosomes de triage. La monoubiquitination des récepteurs de facteurs de
croissance/protéines présents à la membrane des endosomes de triage sert d’étiquette à leur
transport vers la voie de dégradation endolysosomale. En effet, la protéine Hrs (hepatocyte
growth factor-regulated tyrosine kinase substrate) est localisée aux endosomes de triage
grâce à l’interaction entre son domaine FYVE et le PtdIns3P présent sur ces organelles. Or,
le Hrs fonctionne d’une part comme protéine adaptatrice de la clathrine, créant un maillage
de clathrine sur la membrane des endosomes de triage (différent de celui de l’endocytose
par la clathrine). D’autre part, cette protéine, qui possède un motif de liaison à l’ubiquitine
(ubiquitin-interacting-motif, UIM), capture dans les microdomaines de clathrine, les
protéines membranaires ubiquitinées des endosomes de triage. Ceci entraîne la rétention de
ces récepteurs/protéines aux microdomaines de clathrine et empêche leur recyclage.
Remarquons que le GHR (growth hormone receptor) et l’EGFR, qui sont destinés à la
dégradation dans les lysosomes, sont retrouvés dans ces régions contenant la clathrine et le
136
Hrs. Par contre, le TfR présente une distribution uniforme à la membrane des endosomes.
Si le TfR est fusionné à l’ubiquitine, il n’est alors plus recyclé mais dégradé. Ceci indique
que le TfR n’est pas, à proprement dit, exclu des régions riches en clathrine, mais qu’en
absence d’un signal précis, il est recyclé (496-498, 520). Par la suite, la phosphorylation de
l’Hrs induit sa dissociation des endosomes de triage et le démantèlement du maillage de
clathrine.
Remarquons que la monoubuquitination n’est pas le seul signal dirigeant les protéines vers
la voie de dégradation. Certaines protéines sont acheminées aux vésicules luminales en
raison d’une association préférentielle avec les radeaux lipidiques ou par association avec
des protéines de la famille des tétraspanines (644).
4.3.3 Les MVB/ECV
Une fois les récepteurs/protéines concentrés à la membrane des endosomes de triage, leur
transport aux endosomes tardifs nécessite leur transfert de la membrane externe des
endosomes de triage à la membrane des vésicules intra-endosomales. L’atteinte de ces
vésicules luminales par les récepteurs/protéines leur permet par la suite d’être acheminés
aux endosomes tardifs par les MVB/ECV. Rappelons que les MVB/ECV sont formés par
dissociation des endosomes de triage (revue par (218, 264, 499)).
Pour ce faire, le Hrs lie la sous-unité Tsg101 (tumor susceptibility gene 101) du complexe
protéique ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport)-I, ce qui permet le
recrutement d’ESCRT-I à la membrane externe des endosomes. D’après le modèle de la
levure, l’ESCRT-I active alors ESCRT-II qui recrute et dirige ensuite l’assemblage des
composantes d’ESCRT-III à la membrane externe des endosomes. L’action concertée des
trois complexes protéiques ESCRT-I, II et III contrôle deux éléments : i) l’inclusion dans
les invaginations membranaires des endosomes des récepteurs associés à l’Hrs (ce
processus va créer les vésicules dans la lumière des endosomes), et ii) l’invagination
membranaire proprement dite. Une fois le bourgeonnement intraluminal complété, les
complexes ESCRT sont relâchés de la membrane et les vésicules se retrouvent libres dans
la lumière des MVB/ECV. Les complexes ESCRT sont relâchés sous l’action de la Vps4p.
137
Il est à noter que puisque le ESCRT-I est responsable de recruter ESCRT-II et ESCRT-III,
le Hrs induit indirectement la vésiculation intraluminale en initiant le recrutement de
ESCRT à la membrane des endosomes (30, 104, 327) (c.f. Figure 19).
Ensuite, la biogenèse des MVB/ECV nécessite la participation de l’annexine-II : à la suite
de sa liaison au cholestérol à la surface des endosomes de triage, l’annexine-II pourrait
réguler la dissociation des MVB/ECV en devenir à partir des endosomes de triage (359).
Une fois qu’ils se sont détachés des endosomes de triage, les MVB/ECV, qui ont un
diamètre de 400-500 nm, sont tranportés par les microtubules vers les endosomes tardifs,
avec lesquels ils fusionnent éventuellement. Le contenu des MVB/ECV, incluant les
vésicules luminales, se retrouve ainsi dans la lumière des endosomes tardifs (revue
par (218)).
138
Figure 19
La biogenèse des vésicules intraluminales par les complexes ESCRT
Trois complexes protéiques identifiés chez la levure, les Endosomal Sorting Complexes
Required for Transport-I, -II et -III (ESCRT-I, -II et -III), dirigent le triage des protéines
internalisées dans les vésicules intra-endosomales des MVB/ECV. Les ESCRT sont
recrutés l’un aprèe l’autre et fonctionnent séquentiellement dans l’ordre qui correspond à
leur numéro. L’ESCRT-I et II contiennent des sous-unités qui dirigent le triage des
récepteurs ubiquitinylés dans les invaginations membranaires, alors que l’ESCRT-III
contrôle la courbure de la membrane endosomale, non pas à l’intérieur, mais à l’opposé du
cytoplasme. La Vps4 permet la dissociation des complexes et leur réutilisation. Les
récepteurs sont dé-ubiquitinylés avant d’être insérés dans les vésicules intra-endosomales
(Ub, ubiquitine) (tiré de : (218)).
4.3.4 Les endosomes tardifs
Les endosomes tardifs possèdent des caractéristiques physiques qui leur sont propres.
Premièrement, ces organelles sont hautement pléomorphes, possédant des régions
cisternales, tubulaires et multivésiculaires. Deuxièmement, le pH des endosomes tardifs à
139
5,6 est plus acide que celui des endosomes de triage. Troisièmement, ils sont enrichis en
CD63. Cette tétraspanine est localisée aussi bien à la membrane externe que dans les
vésicules luminales de ces endosomes. De plus, la membrane externe des endosomes tardifs
est riche en glycoprotéines lysosomales, telles que le LAMP-1 et le LAMP-2 (lysosomal
associated membrane protein), alors que l’acide bisphosphatidique (LBPA), phospholipide
unique à ces endosomes, est particulièrement abondant dans les vésicules luminales. On
distingue deux catégories de vésicules intraluminales dans les endosomes tardifs : celles
riches en CD63 et LBPA et celles riches en CD63 et phosphatidylcholine (275) (c.f. Figure
20). Finalement, les petites protéines G, Rab7 et Rab9, sont localisées aux endosomes
tardifs ; le Rab7 est responsable du transport des cargos des endosomes de triage aux
endosomes tardifs (634) ainsi que du contrôle de l’aggrégation et de la fusion des
endosomes tardifs/lysosomes (75, 118). Le Rab9 facilite plutôt l’acheminement des
vésicules contenant le M6PR en provenance des endosomes tardifs vers le Golgi (revue
par (559, 662)).
Par ailleurs, les endosomes tardifs accomplissent diverses fonctions. D’une part, la fusion
de la membrane externe des endosomes tardifs avec les lysosomes expose les vésicules
luminales des endosomes aux lipases et aux protéases lysosomales. Ceci entraîne la
dégradation des vésicules et de leur contenu, processus important pour l’homéostasie
cellulaire. D’autre part, il est maintenant reconnu que les endosomes tardifs exercent aussi
de nombreuses fonctions de triage (revue par (479)). Par exemple, certaines molécules
présentes à la membrane externe de ces endosomes sont recyclées vers le TGN (réseau
trans-golgien; ou trans Golgi network) ou le réticulum endoplasmique, à la suite d’un
bourgeonnement puis d’un transport vésiculaire entre ces deux organelles. Ce transport est
associé à la voie de biosynthèse (revue par (526)).
Il est important de noter qu’outre la dégradation des protéines et des lipides associés aux
vésicules luminales suite à la fusion des lysosomes avec les endosomes tardifs (ex: les
récepteurs de facteurs de croissance), on distingue deux issues possibles à partir des
vésicules intra-endosomales. Premièrement, certains lipides et protéines, tels que le M6PR
(récepteur du mannose-6 phosphate), le CMH-II et les tétraspanines (le CD63, le CD37, le
140
CD81, le CD82), sont stables dans les vésicules luminales des endosomes tardifs. Ceci
indique que les molécules dirigées aux vésicules internes ne sont pas nécessairement
destinées à la dégradation, et que leur devenir est donc plus complexe. En fait, la cellule
peut récupérer des protéines et des lipides spécifiques des vésicules intra-endosomales pour
les transporter vers d’autres destinations (revue par (330, 479, 480)). Par exemple, le M6PR
transporte en boucle les protéines possédant un mannose-6 phosphate du TGN aux
endosomes, puis recycle des endosomes tardifs pour être réutilisé. Or, lorsque le M6PR
atteint les endosomes tardifs, il est localisé dans les vésicules internes et non à la membrane
externe, il n’y est donc pas dégradé (379). De même, le CMH-II est retourné des vésicules
internes à la membrane externe des endosomes tardifs, permettant ainsi son transport
subséquent à la surface cellulaire (97, 404). C’est donc qu’il existe un équilibre dynamique
entre les vésicules luminales et la membrane externe des endosomes tardifs menant au
recycalge.
Dans ce contexte, on a proposé que les vésicules luminales puissent re-fusionner avec la
membrane externe endosomale, ce qui occasionnerait le recyclage des protéines/lipides qui
s’y trouvaient associés. La machinerie cellulaire/protéique responsable de la re-fusion est
inconnue (403). Toutefois, puisque dans des conditions où le cholestérol cellulaire est en
faible quantité, le M6PR n’est plus recyclé des endosomes tardifs mais dégradé, on émet
l’hypothèse que le cholestérol présent dans les endosomes tardifs permet la réorganisation
des endosomes tardifs. Celle-ci serait essentielle à la ségrégation des molécules vers le
recyclage ou la dégradation (379).
Une autre issue possible est la suivante. La membrane externe des endosomes tardifs et/ou
des MVE pourraient fusionner avec la membrane plasmique, permettant ainsi la relâche des
vésicules internes qui s’y trouvent, appelées alors exosomes, dans l’environnement extracellulaire (revue par (129, 160, 229, 575, 625)).
141
Figure 20
Schéma d’un endosome tardif
Les molécules présentées sont des typiques des vésicules intra-endosomales des endosomes
tardifs (tiré de : (499)).
4.3.5 Les lysosomes
Les lysosomes sont traditionnellement perçus comme le point final de la voie
endolysosomale, à savoir comme le centre de dégradation. La membrane endolysosomale
crée un environnement circonscrit et scellé, permettant le fonctionnement optimal des
hydrolases tout en évitant l’auto-dégradation de la cellule. En effet, les protéines
membranaires des lysosomes sont fortement glycosylées. On a suggéré que ces
oligosaccharides (particulièrement le mannose) liés aux asparagines du LAMP-1 et du
LAMP-2 préservent ces protéines de la protéolyse. De plus, les LAMP, ayant un large
domaine protéique luminal, protégeraient par le fait même les membranes des endosomes
de la protéolyse, et ainsi éviteraient la fuite d’hydrolases dans le cytoplasme (287).
142
Puisque plusieurs protéines, telles que les hydrolases lysosomales et le LAMP-1 et -2, sont
localisées aussi bien dans les endosomes tardifs que dans les lysosomes, certains auteurs ne
font pas de distinction entre ces deux organelles. En fait, malgré leur association étroite, les
endosomes tardifs et les lysosomes possèdent des distinctions morphologiques et
fonctionnelles. D’abord, même s’ils ne possèdent que 20% du pool total d’hydrolases, les
endosomes tardifs sont le principal site de protéolyse de la voie endolysosomale.
Inversement, les lysosomes contiennent la plus grande proportion d’hydrolases, mais
seulement 20% de l’activité totale de protéolyse y a lieu. Dans ce contexte, les lysosomes
agissent comme organelles de mise en réserve des hydrolases; leur fusion avec les
endosomes tardifs crée une organelle hybride où la dégradation se produit. Par la suite, les
lysosomes pourraient se reformer à partir des organelles hybrides et être réutilisés ((597); et
revue par (479)).
Notons que les lysosomes ne contiennent pas de M6PR puisqu’il est recyclé avant que les
lysosomes n’aient fusionné avec les endosomes tardifs. Ainsi, le M6PR est un marqueur
pouvant servir à distinguer les endosomes tardifs des lysosomes (revue par (479)).
4.3.6 Les endosomes de recyclage
Le recyclage des cargos peut se faire, soit par les endosomes de triage, soit par les
endosomes de recyclage. Le ratio surface/volume de la région tubulaire des endosomes de
triage est supérieur à celui de sa région vésiculaire. Cette particularité structurelle est à la
base de la sélection des cargos vers la voie de recyclage (revue par (358)). En effet, au
moment où les vésicules primaires fusionnent avec les endosomes de triage, des tubules de
faible diamètre bourgeonnent rapidement et continuellement de ces endosomes, entraînant
dans ce processus une grande fraction membranaire et peu de volume luminal. Ces
vésicules nouvellement formées se dirigent ensuite vers la membrane plasmique ou aux
endosomes de recyclage. Or, comme nous l’avons précédemment décrit, en l’absence d’un
signal précis de ciblage, les récepteurs retrouvés à la membrane des endosomes de triage ne
sont pas acheminés vers les endosomes tardifs mais restent plutôt à cette membrane. Ainsi,
ces récepteurs sont transportés hors des endosomes de triage avec la majeure partie de la
membrane endosomale (ex : le récepteur de la transferrine) au moment où la membrane
143
bourgeonne. Une fois dans ces vésicules de transport, les cargos sont dirigés à la membrane
plasmique directement ou via un passage préalable par les endosomes de recyclage (358)
(c.f. Figure 21).
Par ailleurs, les ligands dissociés de leur récepteur en raison du pH acide endosomal, se
retrouvent dans la lumière des endosomes de triage. De ce fait, ils ne participeront pas aux
évènements de bourgeonnement mais resteront plutôt dans le domaine vésiculaire des
endosomes de triage. Ils seront alors acheminés par défaut vers les endosomes tardifs. Dans
cette perspective, il est logique que les marqueurs de la phase fluide (ex : le dextran, le HRP
et le BSA), qui sont internalisés en l’absence d’une liaison à un récepteur, se retrouvent
dans la lumières des endosomes de triage et, ainsi, sont acheminés vers la voie de
dégradation (revue par (358)).
Outre ce processus, peu de choses sont connues sur le recyclage des cargos à la membrane
plasmique. Par exemple, la petite protéine G Rab4, localisée aux endosomes de triage et de
recyclage, est impliquée dans le transit des cargos des endosomes de triage aux endosomes
de recyclage. On pense qu’elle participerait à la fission des vésicules des endosomes de
triage (442). De plus, les endosomes de recyclage sont composés d’éléments tubulaires de
50 à 60 nm associés aux microtubules. Le transport des vésicules des endosomes de
recyclage à la membrane plasmique nécessite la participation de la petite protéine G Rab11
mais le mécanisme par lequel elle agit est inconnu. Notons que le recyclage des endosomes
de recyclage vers le TGN est aussi possible (321).
144
Figure 21
Les endosomes de recyclage
(1 et 2) L’endocytose par les puits de clathrine du récepteur du LDL et de la transferrine (à
titre d’exemple) conduit les vésicules primaires aux endosomes de triage. Le pH acide
dissocie le LDL de son récepteur qui se retrouve alors dans la lumière des endosomes. Les
récepteurs, ne possédant pas de signal menant vers les endosomes tardifs, se retrouvent
dans les extensions tubulaires des endosomes de triage. Celles-ci bourgeonnent rapidement
et continuellement, entraînant dans ce processus les récepteurs qui s’y trouvent. (3) Ces
vésicules nouvellement formées se dirigent ensuite vers les endosomes de recyclage. (4)
Des endosomes de recyclage, les récepteurs sont retournés à la membrane plasmique (tiré
de : (358)).
145
4.4 La voie endolysosomale des cellules épithéliales simples
Les cellules épithéliales polarisées internalisent des molécules tant à partir de leur pôle
apical que basolatéral; de plus, le transport de protéines/lipides d’un pôle vers l’autre (i.e. la
transcytose) est possible. Dans ce contexte, un degré de complexité supérieur caractérise la
voie endolysosomale des cellules polarisées (revue par (18, 62)). Premièrement, elles
possèdent des endosomes de triage distincts à chaque extrémité de la cellule, soit les
endosomes de triage apicaux et basolatéraux. Ces endosomes de triage, qui sont tous deux
associés au Rab5 et à l’EEA1, ne communiquent pas directement entre eux ((545, 607), et
revue par (234)). Deuxièmement, ces cellules possèdent des endosomes de recyclage qui
sont uniquement présents au pôle apical et qui sont nommés « endosomes de recyclage
apicaux » (316). Troisièmement, ces cellules possèdent des endosomes communs aux voies
endosomales en provenance des surfaces apicale et basolatérale. Ces organelles, qui sont
aussi appelés « compartiment subapical » ou SAC, reçoivent : i) les récepteurs qui recyclent
et qui sont en transit soit des endosomes de triage apicaux ou basolatéraux, de même que ii)
les récepteurs qui transcytosent d’un pôle vers l’autre. De ce fait, la fonction des endosomes
communs est reliée au recyclage et à la transcytose. Finalement, les endosomes tardifs, de
même que les lysosomes, constituent une population d’organelles utilisée aussi bien par les
cargos internalisés au pôle apical que basolatéral (revue par (234, 395)) (c.f. Figure 22).
Le transit intracellulaire à partir des différents endosomes se produit selon les modalités
suivantes : les macromolécules internalisées du pôle apical ou basolatéral sont livrées
respectivement aux endosomes de triage apicaux et basolatéraux. De là, les cargos peuvent
recycler au domaine membranaire d’origine ou être dirigés vers la voie de dégradation en
passant par les endosomes tardifs et les lysosomes. Ceci dit, les étapes de transport
intracellulaire se produisant post-internalisation varient en fonction des cargos. Les
marqueurs de la phase fluide internalisés par les pôles apical et basolatéral sont
respectivement acheminés aux endosomes de triage apicaux et basolatéraux. A cet endroit,
alors que la majorité des marqueurs internalisés au pôle apical est recyclée ou transcytosée
au pôle opposé, une fraction est plutôt acheminée aux endosomes tardifs puis aux
lysosomes, trajet emprunté par les marqueurs internalisés au pôle basolatéral (revue par
(18)). Par ailleurs, la transferrine et son récepteur utilisent un trajet différent car
146
l’internalisation de ce complexe au pôle basolatéral conduit à son recyclage selon trois
modalités différentes. Des endosomes de triage basolatéraux, le complexe peut, soit : i) être
directement retourné à la membrane basolatérale, ii) être acheminé aux endosomes
communs puis par un transport vésiculaire, retourné à la membrane basolatérale ou iii) être
acheminé aux endosomes communs, puis aux endosomes de triage apicaux, pour finalement
être retourné à la membrane basolatérale (revue par (18)). D’autre part, les protéines
internalisées au pôle apical qui recyclent (ex : le récepteur polymérique des
immunoglobulines ou pIgR) sont d’abord livrées aux endosomes de triage apicaux. A ce
stade, elles sont envoyées : i) aux endosomes de recyclage apicaux ou ii) aux endosomes
communs puis aux endosomes de recyclage apicaux pour être finalement retournées à la
membrane plasmique apicale (revue par (18, 395)) (c.f. Figure 22).
La transcytose est un transport vésiculaire intracellulaire rapide et sélectif d’un pôle de
l’épithélium vers l’autre. La transcytose se produit dans les deux sens : apical vers
basolatéral et vice versa (revue par (62)). La transcytose du pôle basolatéral vers le pôle
apical, telle qu’illustrée par le transport du complexe pIgR-IgA, implique les étapes
séquentielles suivantes : i) endosomes de triage basolatéraux, ii) endosomes communs, iii)
endosomes de recyclage apicaux et finalement iv) membrane plasmique apicale (revue par
(395)). Le cas de la transcytose du pôle apical au pôle basolatéral, quoique moins bien
défini, est particulièrement éloquent dans le cas de l’immunité passive fournie au fœtus par
le transfert d’IgG maternels dans la circulation fœtale. Ceci est grande partie effectué par le
transport d’IgG du pôle apical au pôle basolatéral des trophoblastes. On postule que les IgG
sont internalisés par endocytose par phase fluide. Le pH acide des endosomes de triage
apicaux entraîne la liaison des IgG aux récepteurs Fc humains néonataux (hFcRn) (et non
leur dissociation), suivi d’un triage vers la voie de transcytose. D’après des études faites sur
les cellules MDCK (Mardin Darby canine kidney) et à partir d’entérocytes fœtaux, le
complexe est livré des endosomes de triage apicaux aux endosomes communs, soit
directement ou en passant d’abord par les endosomes de recyclage. Des endosomes
communs, il atteint la membrane basolatérale, soit directement ou par un passage préalable
par les endosomes de triage basolatéraux. La machinerie cellulaire qui est responsable de ce
transport n’est pas connu (154, 155, 206, 500, 623) (c.f. Figure 22).
147
Figure 22
Voies de transport endosomal dans les cellules épithéliales polarisées.
Les fluides et les récepteurs membranaires sont livrés aux endosomes de triage apical (1A)
ou basolatéral (1B). Les fluides endocytés au pôle apical peuvent recycler (3A),
transcytosés (4) ou être acheminés au endosomes tardifs (2) puis aux lysosomes (5). Les
fluides internalisés au pôle basolatéral sont principalement acheminés aux endosomes
tardifs (2B) puis aux lysosomes (5). Les protéines, recyclant du pôle apical, transitent
directement des endosomes de triage apicaux aux endosomes de recyclage (3B) ou via les
endosomes communs (3C), pour être ensuite acheminées à la membrane plasmique apical
(8). Les protéines recyclant au pôle basolatéral, de même que celles transcytosant du pôle
basolatéral au pôle apical, transitent par les endosomes de triage basolatéraux (1B). Ensuite,
alors qu’une proportion des récepteurs recyclent directement de ces organelles (6B), la
majorité se rend aux endosomes communs avec les récepteurs qui transcytosent (6A). La
majorité des récepteurs qui recyclent vont alors retourner à la membrane plasmique (7B).
Cependant, une fraction va tout de même être acheminée aux endosomes de triage apicaux
(7) et recycler à partir de ces organelles (4). Les récepteurs en transcytose sont transportés
des endosomes communs aux endosomes de recyclage (7A), puis à la membrane plasmique
(8) (tiré de : (18).
148
Section 5
Les objectifs de recherche
5.1 Objectifs généraux
La transmission verticale du VIH-1 est un problème de santé public majeur, et celle se
produisant in utero contribue de façon significative au nombre total d’infections par ce
rétrovirus chez l’enfant. Pourtant, les mécanismes qui sous-tendent ce type de
contamination sont très peu connus. Quoique plusieurs hypothèses aient été postulées pour
expliquer le passage du VIH-1 durant la grossesse, l’infection directe des trophoblastes
demeure énigmatique, tout particulièrement le processus d’entrée virale dans ces cellules.
L’objectif principal de cette thèse est donc d’élucider les étapes précoces du cycle réplicatif
du VIH-1 dans les trophoblastes humains. Les données recueillies sont essentielles afin de
mieux contrôler un jour la transmission mère-enfant du VIH-1 durant la grossesse, et/ou de
trouver des solutions alternatives aux antirétroviraux existants.
Nous pensons que la transmission verticale du VIH-1, tout particulièrement celle
se produisant in utero, est un processus complexe et multifactoriel. D’abord, des
caractéristiques structurelles et fonctionnelles propres aux variants du virus sont à
considérer. Ensuite, nul doute que l’organisation et le développement des trophoblastes
influencent cet évènement. Nous sommes donc en présence de deux paramètres interreliés : les virions et le placenta. Nous pensons qu’une combinaison précise d’éléments
associés à chacun d’eux déterminerait d’une part si la transmission verticale se produit, et
d’autre part, le mode de transmission. Nous estimons que la caractérisation de l’ensemble
des éléments reliés à la contamination fœtale nous permettrait de mieux saisir la biologie du
VIH-1 dans ce contexte précis. La première étape vers cette compréhension globale est de
définir clairement le mode d’entrée du virus dans les cellules placentaires, sujet que nous
traitons dans cette thèse.
149
5.2 Objectifs particuliers
Afin de définir les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes
humains, nous tenterons dans cette thèse de répondre aux cinq questions suivantes :
i)
ii)
iii)
iv)
v)
Est-ce que toutes les étapes du cycle de réplication du VIH-1 peuvent se réaliser
dans les cellules trophoblastiques?
Quel est le rôle du CD4 et de l’enveloppe virale dans le cycle réplicatif du VIH-1
dans ces cellules?
Quel est le parcours intracellulaire du VIH-1 à la suite de son internalisation dans les
trophoblastes polarisés?
Quelle est la voie d’endocytose menant à l’internalisation du VIH-1 par les
trophoblastes, évènement se traduisant par l’infection de ces cellules?
Quel est le rôle des endosomes de triage, tardifs et de recyclage dans les étapes
précoces du cycle réplicatif du VIH-1?
Ces objectifs de recherche sont présentés de façon plus détaillée dans la section qui suit, et
ce, en fonction de l’ordre dans lequel les articles scientifiques sont par la suite introduits
dans cette thèse (chaque objectif particulier correspondant à un des articles scientifiques).
De plus, à la suite de chaque objectif, nous décrivons brièvement les découvertes
principales qui en découlent, ce afin d’illustrer le lien existant entre chacun des articles
scientifiques présentés.
5.2.1 Objectif 1
La susceptibilité des trophoblastes à l’infection par le VIH-1 est controversée. Toutefois,
considérant que cette infection est possible mais limitée et que, d’autre part,
l’environnement placentaire contient de nombreuses cytokines, nous formulons les
questions suivantes : est-ce que certaines étapes du cycle de réplication du VIH-1 se
déroulent inefficacement dans les trophoblastes et, ainsi, limitent la production virale dans
ces cellules? Ensuite, est-ce que l’environnement placentaire pourrait contribuer à lever
certaines des restrictions observées? Pour répondre à ces interrogations, nous avons mesuré
l’efficience des principales étapes du cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes.
Ensuite, nous avons vérifié si des cytokines pro-inflammatoires, retrouvées dans
150
l’environnement placentaire, peuvent moduler le taux de réplication du virus dans les
trophoblastes.
L’étude de cet objectif a permis de tirer deux conclusions importantes. Premièrement,
quoiqu’il n’existe aucune restriction en ce qui concerne la production virale dans les
trophoblastes, le virus génère tout de même une infection limitée. La faible susceptibilité
naturelle des trophoblastes à l’infection productive du VIH-1 est due au mode d’entrée du
virus. En effet, à la suite de leur contact avec les trophoblastes, les virions sont
principalement retrouvés dans les endosomes cellulaires, phénomène entraînant
probablement la dégradation de la majorité des virions internalisés. Deuxièmement, les
cytokines pro-inflammatoires, comme le TNF-α ou l’IL-1, augmentent dans les
trophoblastes la transcription du VIH-1, de même que la production virale. Ces cytokines
pourraient, de façon transitoire pendant la grossesse, activer la réplication virale et, ainsi,
favoriser la contamination fœtale. De plus, on a pu ainsi dériver les conditions de culture
cellulaire, permettant de détecter de façon constante et reproductible la réplication du VIH1 dans les trophoblastes.
5.2.2 Objectif 2
Nous savons que les trophoblastes sont susceptibles à l’infection par le VIH-1 lorsqu’ils
sont mis en présence des cytokines pro-inflammatoires. Par ailleurs, puisqu’elles expriment
peu ou pas les récepteurs/corécepteurs requis pour l’entrée du VIH-1 dans une cellule cible,
les étapes précoces du cycle réplicatif de ce virus dans ces cellules demeurent inconnues.
L’objectif proposé est de définir le rôle du CD4 et des protéines de l’enveloppe virale, la
gp120 et la gp41, dans le cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes polarisés.
Nous montrons dans cette étude que l’entrée et l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes
sont indépendantes non seulement du CD4, mais aussi des glycoprotéines de l’enveloppe, la
gp120 et la gp41. Par contre, les héparans sulfates contribuent à l’attachement du virus sur
ces cellules. Ceci illustre que le mode de réplication du VIH-1 dans les trophoblastes,
particulièrement l’entrée virale, est différent de ce qui est connu pour les lymphocytes T
CD4+.
151
5.2.3 Objectif 3
Le virus se retrouve dans les endosomes à la suite de son contact avec les trophoblastes.
Nous voulons maintenant savoir s’il existe, dans les trophoblastes polarisés, un lien
nécessaire entre l’internalisation par endocytose du VIH-1 et l’expression génique du virus.
En d’autres termes, l’endocytose est-elle requise pour l’infection des trophoblastes? Le cas
échéant, le parcours intracellulaire du VIH-1, à la suite de son internalisation dans les
trophoblastes polarisés, doit être élucidé. En effet, cette notion est essentielle à la
compréhension du processus infectieux dans ces cellules.
Nous avons observé que les inhibiteurs de la fonction des endosomes bloquent
complètement l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes, montrant que l’endocytose y est
le mode d’entrée préférentiel de ce virus. Il existe donc bel et bien un lien étroit entre
l’endocytose du VIH-1 et l’infection des trophoblastes. Pour éclaircir le parcours
intracellulaire des particules virales dans les trophoblastes polarisés, nous avons suivi pas à
pas, par microscopie confocale, leurs mouvements dans les compartiments endocytaires à la
suite de leur endocytose. Nous avons observé que les virions sont distribués dans divers
endosomes, suggérant que le transport du VIH-1 est un processus complexe requérant
l’active participation de la machinerie endocytaire de la cellule-hôte.
5.2.4 Objectif 4
Sachant que l’infection du VIH-1 est liée à son internalisation par les trophoblastes, définir
la voie d’endocytose qui sous-tend cet évènement est essentiel pour comprendre le
processus infectieux de ce virus dans ces cellules.
Nous avons étudié la participation des différents modes d’endocytose et observé que
l’internalisation du VIH-1 dans les trophoblastes se fait par un mécanisme inhabituel qui est
indépendant de la clathrine, des cavéoles et de la dynamine mais qui requiert toutefois que
le cholestérol membranaire demeure libre. De plus, nous pensons que si les virions sont
internalisés par une voie dite « non classique », les virions bifurquent éventuellement vers
la voie classique, suggérant qu’il existe un transport entre les endosomes non classiques et
les endosomes classiques.
152
5.2.5 Objectif 5
Nous avons établi que l’endocytose des virions est essentielle pour qu’ait lieu l’infection
des trophoblastes. De plus, nous avons déterminé le parcours intracellulaire du VIH-1 à la
suite de son internalisation dans ces cellules. L’objectif que nous proposons est de définir le
rôle des endosomes de triage, tardifs et de recyclage dans les étapes précoces du cycle
réplicatif du VIH-1. Notre intention est d’établir quel(s) endosome(s) joue(nt) un rôle
nécessaire dans les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes.
Les protéines Rab, faisant partie de la famille des petites GTPases, coordonnent le transport
vésiculaire entre les différentes organelles endocytaires. L’expression transitoire dans les
trophoblastes de vecteurs d’expression codant pour des mutants des protéines Rab nous a
permis de montrer que l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes polarisés dépend du
Rab5 et du Rab7 mais ne requiert pas l’Arf6 ni le Rab11. Ainsi, nous concluons que le
transit des virions aux endosomes de triage, pour atteindre les endosomes tardifs par la
suite, constituent des étapes essentielles à son processus infectieux dans les cellules
placentaires.
Section 6
Le modèle expérimental utilisé
On a établi plusieurs modèles expérimentaux pour étudier les fonctions et/ou le
développement placentaire, dont les lignées. Il existe trois sources de lignées cellulaires
trophoblastiques : les lignées générées de tissus sains, de tissus cancéreux et celles issues de
la fusion entre des cellules primaires et des lignées cellulaires de choriocarcinome.
Afin de définir si une lignée est de nature villeuse ou extravilleuse, des critères précis ont
été établis (270). Ceci dit, parmi les 41 lignées trophoblastiques existantes, seules 16
lignées ont pu être validées et aucune ne rencontrait l’ensemble des critères définis. Parmi
ces lignées, on retrouve les lignées dérivées de choriocarcinomes qui sont des tumeurs
malignes relativement rares. Il s’agit de tumeurs formées de cytotrophoblastes mitotiques et
peu différenciés. Les lignées cellulaires de choriocarcinome les plus utilisées sont les JAR,
les JEG-3 et les BeWo (507).
153
La valeur des lignées immortalisées, comme modèle placentaire, dépend de leurs similarités
aux cellules trophoblastiques normales, et il est reconnu que des différences majeures
existent entre les lignées cellulaires et les cytotrophoblastes primaires dont on doit tenir
compte. Par exemple l’expression génique et les fonctions cellulaires associées à la
différenciation cellulaire sont altérées. La formation de syncytium est rare également. Il
pourrait donc sembler plus adéquat d’utiliser des cellules trophoblastiques primaires (547).
Les cytotrophoblastes et les syncytiotrophblastes sont des cellules de type épithélial,
formant in vivo deux couches cellulaires superposées qui, soulignons-le, sont polarisées
(51). Or, alors que la culture des cellules primaires est possible, ces cellules ne peuvent plus
reformer de jonctions étanches entre elles une fois mises en culture. L’isolation des
cytotrophoblastes et syncytiotrophoblastes résulte donc en une perte de polarité cellulaire
(507). Il s’agit d’une limite importante pour l’étude d’évènements associés à la barrière
placentaire et au transport polarisé par endocytose. Dans ce contexte, les lignées cellulaires
offrent des avantages notables. D’abord, leur propagation en culture est rapide et
reproductible. De plus, il est reconnu que la culture de BeWo sur des membranes semiperméables, permettant au milieu de culture l’accès aux pôles apical et basolatéral, génère
une monocouche cellulaire polarisée exprimant des jonctions étanches (90, 155).
Dans cette thèse, nous avons utilisé les lignées cellulaires de choriocacinome, soit les
BeWo et les JEG-3, mais principalement les JAR. Les cellules sont ensemencées dans des
cupules (i.e. des inserts de culture) qui, individuellement sont déposées dans un des puits
d’une plaque de culture cellulaire. Or, l’extrémité inférieure de ces cupules est une
membrane possédant des pores de 0,4 μm de diamètre. Cette particularité permet aux
cellules d’avoir accès au milieu de culture, non pas uniquement à leur pôle apical, mais
également à leur pôle basolatéral (c.f. Figure 23). Cet environnement de culture cellulaire
favorise le développement de jonctions étanches par les cellules épithéliales, lesquelles
après quelques jours forment une monocouche de cellules épithéliales confluentes et
polarisées (549). Cette technique a aussi l’avantage de reproduire l’environnement
placentaire tel qu’on le retrouve in vivo, à savoir les circulations fœtale et maternelle
154
baignant chaque extrémité des cellules. En résumé, ce modèle cellulaire s’apparente bien
aux cytotrophoblastes villeux tels que retrouvés in vivo.
Figure 23
La culture cellulaire sur cupule avec membrane poreuse de 0,4 μm
(Tiré de : (110))
Une fois la monocouche de cellules polarisées constituée, les cellules sont exposées au
VIH-1 ; différentes souches virales à tropisme M ou T ont été employées. Les virus sont
produits par transfection des cellules 293T avec un vecteur d’expression codant pour un
clone moléculaire du VIH-1. 48 heures après la transfection, les particules virales relâchées
dans le milieu extracellulaire sont conservées et congelées jusqu’au moment de leur
utilisation. Deux clones moléculaires ont servi aux travaux présentés dans cette thèse : le
pNL4-3 de type sauvage et le pNL4-3 possédant une mutation dans le cadre de lecture du
gène env (il est donc déficient en enveloppe). Le vecteur d’expression codant pour
différentes enveloppes virales peut être cotransfecté, ce qui permet de pseudotyper les
virions produits par l’enveloppe de son choix. Dans cette thèse, nous avons majoritairement
utilisé les enveloppes du VIH-1 Ada-M, HXB-2 et SM, de même que l’enveloppe du virus
de la stomatite vésiculaire.
155
Afin d’étudier le processus infectieux dans les trophoblastes polarisés, nous avons
essentiellement eu recours à trois techniques. Premièrement, un ÉLISA de la capside virale
(la p24), qui effectué à partir de cellules exposées pendant de courtes périodes au VIH-1,
permet d’estimer l’entrée virale dans les cellules. Deuxièmement, la quantification des
particules virales nouvellement produites et relâchées dans le milieu extracellulaire, par ce
même ÉLISA, correspond à l’infectiosité du VIH-1. Une autre approche pour mesurer
l’infectiosité est d’utiliser des virus qui codent, sous le contrôle du LTR du VIH-1, pour le
gène rapporteur de la luciférase (inséré à l’intérieur du gène nef). Ces virus permettent
d’évaluer rapidement l’infectiosité virale dans un lysat cellulaire par une réaction de
bioluminescence : la luciférase est responsable d’une émission lumineuse. Notons que
l’entrée virale et/ou l’infectiosité sont souvent investiguées en présence ou en absence
d’inhibiteurs pré-determinés. Troisièmement, une fois infectées, les cellules peuvent être
fixées, puis marquées par différents anticorps couplés à des marqueurs fluorescents. Ces
échantillons sont alors analysés par microscopie confocale afin de suivre le parcours
intracellulaire des virions (c.f. Figure 24).
Figure 24
Modèle de recherche et principales techniques expérimentales
156
Chapitre 2. PARAMÈTRES DÉFINISSANT LA
SUSCEPTIBILITÉ À L’INFECTION DES
TROPHOBLASTES PAR LE VIH-1
Section 1
Premier article scientifique
1.1 Title page
1.1.1 Title
The low viral production in trophoblastic cells is due to a high endocytic internalization of
the human immunodeficiency virus type 1 and can be overcome by the pro-inflammatory
cytokines tumor necrosis factor-α and interleukin-1.
1.1.2 Authors
Gaël Vidricaire, Mélanie R. Tardif and Michel J. Tremblay
1.1.3 Affiliation
Research Center in Infectious Diseases, CHUL Research Center, and Faculty of Medicine,
Laval University, Quebec, Canada.
1.1.4 Corresponding author
Mailing address:
Laboratory of Human Immuno-Retrovirology
Research Center in Infectious Diseases, RC709
CHUL Research Center
2705 Laurier Blvd.
Quebec (QC), Canada, G1V 4G2
Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2212
1.2 Résumé
La transmission mère-enfant du virus d’immunodéficience humaine de type-1 (VIH-1) est
la première cause d’infection par ce rétrovirus chez le nouveau-né. On a proposé que les
157
trophoblastes puissent jouer un rôle-clé dans la transmission du virus au fœtus. Cet article
porte sur le mécanisme responsable de la susceptibilité à l’infection des cellules
trophoblastiques par le VIH-1. Des lignées cellulaires immortalisées de trophoblastes, les
BeWo, les JAR et les JEG-3, ont été infectées avec des particules virales du VIH-1
pseudotypées avec l’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire ou avec l’enveloppe de
différentes souches du VIH-1. Nous avons montré que, malgré une internalisation massive
du VIH-1 dans ces cellules, et l’absence de restrictions au niveau de la production virale, le
virus génère une infection limitée dans ces cellules, produisant peu de virions. L’élément
responsable de cette limitation du cycle réplicatif du VIH-1 dans ces cellules est le suivant :
on retrouve la p24 intracellulaire de façon prédominante dans les vésicules endosomales à
la suite de l’entrée virale. Par ailleurs, l’ajout de TNF-α ou d’IL-1 augmente la transcription
du VIH-1, de même que la production virale dans les trophoblastes. Cependant, la quantité
de virions nouvellement produite est faible, et ce même en présence des cytokines proinflammatoires. En fait, une étape de co-culture avec des cellules indicatrices a été
nécessaire pour détecter une production virale. En résumé, les résultats obtenus montrent
pour la première fois que la faible susceptibilité naturelle des trophoblastes à une infection
productive du VIH-1 est due à une restriction dans le mode d’entrée du virus. Cette
inhibition peut être renversée par la présence de TNF-α ou d’IL-1 en concentration
physiologique (cytokines exprimées par le placenta), en combinaison avec un contact
cellule-cellule. Considérant qu’il y a une corrélation linéaire entre la charge virale et la
transmission verticale, l’environnement placentaire pourrait contribuer à la propagation
trans-placentaire du VIH-1.
1.3 Abstract
Maternal-infant transmission of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) is the
primary cause of this retrovirus infection in neonates. Trophoblasts have been proposed to
play a critical role in modulating virus spread to the fetus. This paper addresses the
mechanism of HIV-1 biology in trophoblastic cells. The trophoblastic cell lines BeWo,
JAR, and JEG-3 were infected with reporter HIV-1 particles pseudotyped with envelope
glycoproteins from the vesicular stomatitis virus or various strains of HIV-1. We
158
demonstrate that despite a high internalization process of HIV-1 and no block in viral
production, HIV-1 established a limited infection of trophoblasts with the production of
very few progeny viruses. The factor responsible for this restriction to virus replication in
such a cellular microenvironment is that the intracellular p24 is concentrated predominantly
in endosomal vesicles following HIV-1 entry. HIV-1 transcription and virus production of
infectious particles were both augmented upon treatment of trophoblasts with tumor
necrosis factor-α and interleukin-1. However, the amount of progeny virions released by
trophoblasts infected with native HIV-1 virions was so low even in the presence of proinflammatory cytokines that a co-culture step with indicator cells was necessary to detect
virus production. Collectively these data illustrate for the first time that the natural low
permissiveness of trophoblasts to productive HIV-1 infection is because of a restriction in
the mode of entry, and such a limitation can be overcome with physiologic doses of tumor
necrosis factor-α and interleukin-1, which are both expressed by the placenta, in
conjunction with cell-cell contact. Considering that there is a linear correlation between
viral load and HIV-1 vertical transmission, the environment may thus contribute to the
propagation of HIV-1 across the placenta
Section 2
2.1 Introduction
Mother-to-child transmission of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a
serious public health issue. An estimated 2.4 million infected women give birth annually,
and 1,600 infants acquire HIV-1 infection every day worldwide (reviewed in Ref. (15)). In
the absence of antiretroviral treatment, the reported risk of vertical transmission lies within
the range of 10–39% (7, 15, 67). Vertical transmission of HIV-1 from mother-to-child can
occur prepartum (in utero involving transplacental passage) and intrapartum (at birth upon
exposure of the skin and mucous membranes of the infants to maternal blood and vaginal
secretions) (31, 55, 59). Mathematical modeling has allowed the estimation that 30% of
infections occur in utero less than 2 months before birth and 65% at birth (49).
159
Transmission of HIV-1 during early gestation also occurs since HIV-1 has been detected in
8-week aborted fetuses and in second trimester fetal tissues (14, 32, 33, 52).
In order for the virus to reach the fetal circulation and infect the fetus in utero, HIV-1 must
cross the placental barrier which is made of a double layer of polarized epithelial type cells,
the cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts. These cells separate the maternal and fetal
blood circulations and control fluxes between the two circulations. Several published
reports have addressed the question as to how HIV-1 reaches the fetus. It has been shown
that the placenta may allow transcytosis of the virus from the maternal to the fetal
circulation (28). Alternatively and/or concomitantly, the virus may infect the placenta to
reach the fetal circulation and ultimately the fetus. Indeed, HIV-1 has been detected on both
the maternal and fetal portions of the placenta, i.e. in decidual macrophages, leukocytes,
trophoblasts, Hofbauer cells, in villous endothelial cells, and CD3-expressing placental
cells (3, 10, 18, 32, 35, 36, 66). Moreover, some authors have shown that HIV-1 undergoes
productive replication in the placenta. The analysis of the evolutionary relationships of the
sequences of HIV-1 clearly linked maternal sequences with associated sequences in the
trophoblasts and put them on distinctive branches (67). In addition, human choriocarcinoma
cell lines (i.e. BeWo, JAR, and JEG-3) as well as isolated primary trophoblastic cells
(including cytotrophoblasts from term placenta and cytotrophoblasts from term placenta
induced to differentiate in syncytiotrophoblasts in vitro) and Hofbauer cells were shown to
be weakly permissive to HIV-1 infection in vitro and to sustain a low level of virus
replication.
However, other scientists have failed to detect the presence of HIV-1 in the placenta of
infected mothers and/or replication of the virus in these cells (56). Thus, it remains
controversial whether HIV-1 can sustain a productive cycle in trophoblastic cells, but if
indeed possible, it is clear that it is magnitudes lower than in CD4-positive T lymphocytes.
The reasons behind this limited infection are ill defined but are thought to be due to factors
related to the phenotype of HIV-1 in conjunction with particular cellular environments.
This may include limitations in virus entry, intracellular restriction, inappropriate cellular
environment, or a combination of the three (reviewed in Ref. (57)). The question of viral
160
entry is crucial because the expression of the cellular receptor CD4 of HIV-1 is very low,
whereas the expression of co-receptors, CXCR4 and CCR5, of HIV-1 may decline from the
first to third trimester of gestation. This may account for a limited viral entry (1, 16, 17, 33,
38). However, the process of viral entry per se in trophoblastic cells has not been
investigated thus far.
A key feature of pregnancy is the production of a vast array of cytokines (e.g. IL-1, IL-3,
IL-4, IL-6, IL-10, granulocyte macrophage-colony stimulating factor, macrophage-colony
stimulating factor, leukemia inhibitory factor, transforming growth factor-β, interferon-γ
and TNF-α), hormones, growth factors (e.g. epidermal growth factor, vascular endothelial
growth factor, progesterone, and estrogen), and prostaglandins (e.g. prostaglandin E2) in a
developmentally regulated fashion by the conceptus and/or the uterus. These agents play
pivotal roles during gestation and are mandatory for a successful pregnancy (reviewed in
Refs. (39, 48, 50)). On the other hand, some of these agents are also known to be upregulated in vivo in HIV-1-infected patients and to modulate viral expression in vitro
(reviewed in Refs. (57) and (46)). We previously tested the ability of factors known to be
present in the vicinity of the trophoblast during gestation and for which trophoblastic cells
express the appropriate receptors to drive HIV-1 transcriptional activity in trophoblasts.
Among all the soluble agents tested (i.e. epidermal growth factor, granulocyte macrophagecolony stimulating factor, interferon-γ, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10 IL12, leukemia inhibitory factor, macrophage-colony stimulating factor, nerve growth factor,
prostaglandin E2, transforming growth factor-β, and TNF-α), only two cytokines, TNF-α
and IL-1, were found to strongly activate virus transcription (58).
Thus,
specific
cytokines
and/or
modulatory
factors
present
in
the
placental
microenvironment while controlling cellular activities may also play a regulatory role in
protecting the host or, inversely, in driving HIV-1 expression. More specifically, because
HIV-1 may be present in too low a concentration and/or may be latent, some of these
factors could be, in part, the triggering element necessary for the expression of HIV-1 in
infected trophoblastic cells. This would translate into productive viral expression and
spreading of the virus to the fetus.
161
The central objective of the present work was to provide further insight on the
susceptibility of human trophoblasts to a productive infection with HIV-1. To this end, we
conducted experiments with both fully infectious HIV-1 particles and recombinant HIV-1based reporter viruses pseudotyped with the envelope proteins of the broad-host-range
vesicular stomatitis virus (VSV-G) and certain strains of HIV-1. The pseudotyping strategy
with VSV-G allows bypassing the natural mode of HIV-1 entry and not only broadens the
natural virus tropism but also significantly enhances virus infectivity (9).
Contrary to previous assumptions, we demonstrate for the first time that the reason for the
limited HIV-1 infection of trophoblastic cells is not linked with ineffective virus
internalization because we found massive HIV-1 entry in trophoblastic cells. Rather, the
subcellular distribution of viral p24 was predominantly located in the vesicular fraction, an
event accounting for the weak virus production in such cells. On the other hand, we showed
that trophoblastic cells possess no block in viral transcription or viral production. We
showed that TNF-α and IL-1 triggered an important increase in viral gene expression.
However, production of progeny virions upon treatment with these pro-inflammatory
cytokines was only seen following co-cultivation with susceptible indicator cells. These
data represent further evidence that the natural low permissiveness of trophoblasts to
productive HIV-1 infection is associated with limitations in the early events of the virus life
cycle.
Our results suggest that the presence of cytokines such as TNF-α and IL-1 in the vicinity of
trophoblastic cells in association with lymphocytic cells would create favorable conditions
leading to vertical transmission of this retrovirus. Considering that expression of these
cytokines is highly regulated according to the stage of placental development, it can be
proposed that windows of opportunity are transiently created for the induction of viral
expression by extracellular factors in trophoblasts. Collectively, the data presented may
explain in part the mechanism of transmission of HIV-1 to the fetus during gestation.
162
2.2 Material and Methods
2.2.1 Cells
The malignantly transformed human cell lines of trophoblast lineage BeWo, JAR, and JEG3 were obtained from the American Tissue Culture Collection (Manassas, VA). The human
embryonic kidney cell line 293T (expressing the simian virus 40 large T antigen) was
kindly provided by W. C. Greene (J. Gladstone Institutes, San Francisco). The JAR, JEG-3,
and 293T cells lines were cultured in DMEM (Invitrogen), and the BeWo cell line was
maintained in F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen). Both media were supplemented with
10% fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen), glutamine (2 mM), penicillin G (100 units/ml),
and streptomycin (100 mg/ml). BeWo, JAR, and JEG-3 cells were routinely subcultured at
a seeding density of 3 X 106 cells and 293T cells at 1 X 106 cells in 75-cm2 tissue culture
flasks. PM1 cells were obtained through the AIDS Research and Reference Reagent
Program (Division of AIDS, NIAID, National Institutes of Health, Bethesda). These cells
were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% FBS. The reporter LuSIV
cell line, kindly provided by J. E. Clements (The Johns Hopkins University School of
Medicine, Baltimore, MD), was derived from the CEMx174 parental cell line (B-cell/T-cell
hybrid) and carries the luciferase reporter gene under the control of the SIVmac239 LTR.
These cells were maintained at 0.5 X 106 cells/ml in selection medium made of RPMI 1640
(Invitrogen) with 10% FBS, 15 mM NaOH, 25 mM HEPES, and supplemented with
glutamine (2 mM), penicillin G (100 units/ml), streptomycin (100 mg/ml), and 300 μg/ml
hygromycin B (Roche Applied Science). Human peripheral blood mononuclear cells
(PBMCs) from healthy donors were isolated by centrifugation through a Ficoll-Paque
density gradient. PBMCs were resuspended at a density of 106 cells/ml in RPMI 1640 with
20% FBS, 15 mM NaOH, 25 mM HEPES and supplemented with glutamine (2 mM),
penicillin G (100 units/ml), streptomycin (100 mg/ml), 3 μg/ml of PHA-P (Sigma), and 50
units/ml of human recombinant IL-2 (kind gift of M. Gately, Hoffmann-La Roche
Molecular Biochemicals) (29).
163
2.2.2 Molecular constructs
pNL4-3 is a full-length infectious molecular clone of HIV-1 and the NL4-3-LucE-R+ vector
_
was constructed by inserting a frameshift mutation near the env gene and the firefly
luciferase reporter gene into the nef gene (2, 13). Both molecular constructs were obtained
through the AIDS Repository Reagent Program. The pHCMV-G molecular construct codes
for the broad-hostrange vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G (VSV-G) under
the control of the human cytomegalovirus promoter (61). The pcDNA-1/Amp-based
expression vector coding for the HIV-1 Ada-M (M-tropic) full-length envelope protein was
generously provided by N. R. Landau (The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla,
CA). pHXB2-env is a mammalian expression vector coding for the HIV-1 HXB2 (T-tropic)
envelope glycoprotein and was obtained from the AIDS Repository Reagent Program.
pLTR-Luc and pmκBLTR-Luc have been kindly provided by Dr. K. Calame (Columbia
University, New York). These molecular constructs contain the luciferase reporter gene
under the control of wild-type (GGGACTTTCC) or NF-κB-mutated (CTCACTTTCC)
HIV-1HXB2 LTR (453 to +80) (22). The molecular construct pNF-κB-Luc contains five (5)
consensus sequences of NF-κB bindingsites placed in front of the luciferase reporter gene
(Stratagene,La Jolla, CA). The reporter gene vectors pBlue3’LTR-Luc-A to G carry the
HIV-1 LTR regions from subtypes A to G driving the firefly luciferase reporter gene
(obtained through the AIDS Repository Reagent Program) (26).
2.2.3 Preparation of virus stocks
Viruses were produced by calcium phosphate transfection of 293T cells, as described
previously (11, 21). Briefly, 293T cells were plated 16 h before transfection to reach a 50–
80% confluence the day of transfection. By using the Clontech Transfection Kit (BD
Biosciences), cells were co-transfected with NL4-3-Luc E-R+ along with a vector coding
_
for VSV-G, Ada-M-env, or HXB2-env to produce the luciferase expressing single cycle
pseudotyped HIV-1 virions. Fully infectious viral entities were produced by transiently
transfecting 293T cells with the infectious molecular clone pNL4-3 or by co-transfection
with pNL4-3 and pHCMV-G. Sixteen hours after transfection, the cells were washed twice
with phosphatebuffered saline (PBS) and incubated for 24 h in complete DMEM culture
164
medium. Pseudotypes and fully infectious viruses were collected at this point by filtering
the culture media through a 0.22-μm pore size cellulose acetate membrane (Millipore,
Bedford, MA). Virus stocks were aliquoted and frozen at -85 °C for future use. All virus
preparations underwent only one freeze-thaw cycle before initiation of infection studies.
Virus stocks were normalized for virion content by using a p24 antibody capture assay
developed in our laboratory (8).
2.2.4 Virus entry and cell fractionation assays
Approximately 1 X 106 of JAR and PM1 cells were incubated with Ada-M or VSV-G
pseudotyped HIV-1 particles (200 ng of p24) in 6-well tissue culture plates at 37 °C for a
period of 5 min to 4 h. Cells were next extensively washed with ice-cold PBS and
trypsinized for 5 min at 37 °C. The cells were then washed with RPMI supplemented with
10% FBS followed by three washes with ice-cold PBS. For cell entry assays, cells were
resuspended in lysis buffer (20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100).
The level of p24 was determined by an in-house enzymatic assay as described previously
(8). For cell fractionation assays, to disrupt cellular membranes, cells were resuspended in
1 ml of ice cold hypotonic buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM KCl, 1 mM EDTA)
for 1 min and broken by Dounce homogenization (three strokes, 7-ml B pestles). Nuclei,
cell debris, and undamaged cells were pelleted by centrifugation (1,800 rpm for 5 min at 4
°C). Supernatants containing cytosol and vesicles (including endosomes) were centrifuged
at 12,000 rpm for 90 min at 4 °C in a Heraeus centrifuge. Supernatant that represents the
cytosolic fraction was adjusted to 0.5% Triton X-100 while the pellet which is the vesicular
fraction was resuspended in 1 ml of lysis buffer (20 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl,
0.5% Triton X-100). The level of p24 present in each fraction was assessed using the p24
assay (8).
2.2.5 Virus infection, luciferase assays, and co-culture experiments
In 25- or 75-cm2 tissue culture flasks, 2–6 X 106 BeWo, JAR, or JEG-3 cells were
incubated at 37 °C under a 5% CO2 atmosphere for 7 h with luciferase-encoding HIV-1
particles pseudotyped with VSV-G (6–145 ng of p24), Ada-M, or HXB2 envelope
165
glycoproteins (250–400 ng of p24). Cells were then washed three times with PBS,
trypsinized, and subcultured at 25 X 103 cells per well in 96-well flat-bottom tissue culture
plates or at 50 X 103 cells per well in 48-well flat-bottom tissue culture plates in 200 μl of
complete DMEM culture medium. After an overnight incubation, 100 μl of medium was
removed from each well and replaced with 100 μl of culture medium supplemented with
the following agents: tumor necrosis factor (TNF)-α (R&D Systems, Minneapolis, MN) or
interleukin (IL)-1α or IL-1β (NCI, National Institutes of Health, Bethesda). After an 8- to
72-h incubation period, luciferase activity was monitored in cell lysates as described
previously (5). For co-culture experiments, 1 X 106 JAR cells were incubated in 25-cm2
tissue culture dishes at 37 °C for 7 h with fully competent NL4-3 particles (400 ng of p24).
Cells were then washed three times with PBS, trypsinized, and subcultured at 1 X 105 cells
per well in 12-well flat-bottom tissue culture plates in 1.3 ml of complete DMEM culture
medium. After an overnight incubation, 650 μl of culture medium was removed from each
well and replaced with 650 μl of fresh complete DMEM culture medium supplemented
with TNF-α at a final concentration of 10 ng/ml. After a 24-h stimulation period, the
infected JAR cells were co-cultured for 24 h with 4 X 105 indicator cells (i.e. LuSIV or
PBMCs). Indicator cells that remained in suspension were removed from the attached JAR
cells, centrifuged for 5 min at 1,200 rpm, and re-suspended in the appropriate culture
medium. The rescued LuSIV and PBMCs were seeded in 48-well plates at 3 X 105 cells per
well. On each subsequent day, 100 μl of LuSIV or 150 μl of cell-free culture media from
the PBMCs were transferred to 96-well plates and lysed. The lysed cells and culture media
were frozen. Finally, luciferase activity and p24 level were assessed in lysed LuSIV and in
PBMCs culture media, respectively.
2.2.6 Transient transfection of JAR cells
JAR cells were transiently transfected by calcium phosphate precipitation using the
Clontech Transfection Kit. Briefly, 0.5–1.5 X 106 JAR cells were plated 16 h before
transfection in 25-cm2 tissue culture dishes. For each transfection, 5 μg of plasmid DNA
was used. For the HIV-1 clades A to G transfection experiment, JAR cells were cotransfected with 1 μg of an actin promoter-driven β-galactosidase vector (pActin-β-
166
galactosidase) to normalize for transfection efficiency. Sixteen hours after transfection, the
cells were washed twice with PBS and incubated for 8 h in complete DMEM culture
medium. The transfected cells were then washed three times with PBS, trypsinized, and
subcultured at 25 X 103 cells per well in 96-well flat-bottom tissue culture plates or at 50 X
103 cells per well in 48-well flat-bottom tissue culture plates in 200 μl of complete DMEM
culture medium. After an overnight incubation, 100 μl of medium was removed from each
well and replaced with 100 μl of fresh complete DMEM culture medium supplemented
with TNF-α at a final concentration of 10 ng/ml. After an 8-h stimulation period, 100 μl of
cell-free culture media was removed, and 25 μl of a 5 X luciferase assay lysis buffer was
added. Luciferase activity was measured as described above. β-Galactosidase assays were
performed using the Galacto LightTM chemiluminescent reporter assay for β-galactosidase
(Tropix, Bedford, MA).
2.3 Results
2.3.1 Early events in the HIV-1 replicative cycle represent rate-limiting
steps for virus infection of trophoblast-derived malignant cell lines
Given the reported low susceptibility of trophoblastic cells to productive HIV-1 infection
(16, 17, 65), we initially defined the permissiveness of malignantly transformed cell lines
of trophoblast lineage to the early events in HIV-1 biology. This goal was reached by
inoculating BeWo, JAR, and JEG-3 with luciferase expressing single-cycle HIV-1 particles
pseudotyped either with the envelope protein of HXB2 (T-tropic HIV-1 strain), Ada-M
(macrophage-tropic HIV-1 strain), or the envelope G protein of VSV (i.e. VSV-G). A
previous study (9) has shown that pseudotyping of HIV-1 particles with VSV-G results in
both a marked enhancement of virus infectivity and in an extended cellular tropism.
Exposure of BeWo, JAR, and JEG-3 cell lines to HXB2 and Ada-M pseudotypes yielded a
very low spontaneous HIV-1 LTR-directed reporter gene activity (Table I). However, when
these cells were exposed to single-cycle VSV-G pseudotyped reporter viruses, a significant
enhancement in luciferase activity was observed. The highest augmentation in HIV-1
transcriptional activity was obtained for JAR and the lowest for BeWo. Based on these
167
observations, it can be concluded that the failure of HIV-1 to productively infect human
trophoblast cells is related to a blockade in the early steps in the virus life cycle.
2.3.2 Virus internalization shows no restriction in trophoblastic cells
We next verified whether the limitation in HIV-1 production was at the level of
internalization because trophoblastic cells are reported to express either no or very little
CD4 and CXCR4 or CCR5. JAR cells were exposed to VSV-G pseudotypes, Ada-M
pseudotypes, or fully infectious NL4-3 for 5 min to 4 h at 37 °C. Subsequently, the cells
were trypsinized, washed, and lysed before monitoring the amount of internalized virus.
We found that the three virus preparations tested were able to enter with high efficiency
and in a timely fashion in the trophoblastic cell line JAR (Fig. 1). Surprisingly enough,
VSV-G and Ada-M pseudotypes were found to enter JAR cells at a comparable level;
therefore suggesting that the blockade in HIV-1 transcriptional activity in trophoblast cells
is not associated with a barrier that limits the process of HIV-1 attachment and
internalization.
2.3.3 HIV-1 is found predominantly in the vesicular fraction upon viral
entry into trophoblastic cells
In order to define the exact location of HIV-1 upon virus entry into trophoblasts, JAR cells
were exposed to Ada-M pseudotyped HIV-1 particles for a short time, and we measured the
amount of viruses present in the cytosolic and vesicular fractions. A similar technical
approach was used with PM1 cells, a CD4-expressing T lymphoid cell line known to be
highly susceptible to HIV-1 infection. Although we observed comparable absolute amounts
of intracellular p24 levels in JAR and PM1 cells, differences were detected with respect to
intracellular p24 in cytosolic and vesicular fractions. In JAR cells, at 30 min following
virus exposure, Ada-M pseudotyped viruses were present in the vesicular fraction only
(Fig. 2A). Vesicular and cytosolic p24 represented 82 and 18%, respectively, of total
intracellular p24 after 2 h of virus exposure. The distribution of intracellular p24 between
the cytosolic and vesicular fractions was different in PM1 cells. For example, after 2 h of
exposure to Ada-M pseudotypes, vesicular and cytosolic p24 in PM1 cells represented 65
168
and 35%, respectively, of the total intracellular p24 (Fig. 2B). Our findings indicate that
HIV-1 internalization in trophoblastic cells is a highly efficient process, but the route of
entry is mediated in large part through endosomal vesicles. Given that productive HIV-1
infection has been proposed to result from the cytosolic release of p24 (34), the reduced
susceptibility of trophoblast to HIV-1 infection is due to an extensive vesicular uptake.
2.3.4 HIV-1 LTR-driven reporter gene activity is increased in
trophoblastic cells by TNF-α, IL-1α, and IL-1β
Based on our present data, we now know that HIV-1 is indeed present in the cytoplasm of
trophoblastic cells, albeit at a low concentration. We therefore argue that these viruses can
lead to a productive infection. This notion is controversial because other scientists have
failed to detect the replication of HIV-1 in trophoblastic cells. Two hypotheses can be made
as follows: 1) either the virus is integrated and becomes latent, and/or 2) the virus is present
in such a low concentration in the cytoplasm that viral expression resulting from these
viruses may be too low to be detected. In both instances, external stimulus may be required
to detect viral gene expression. Numerous extracellular soluble factors are present in the
vicinity of the placenta during gestation, and some of them are known to modulate the
expression of HIV-1 in other cellular environments. We tested the effect of TNF-α, IL-1α,
and IL-1β to trigger the viral regulatory elements in trophoblastic cells by using
recombinant luciferase-expressing HIV-1 pseudotyped with envelope glycoproteins from
the Ada-M or HXB2 strain of HIV-1. In agreement with our previous findings, no increase
in luciferase activity could be detected in untreated JAR cells following infection with AdaM or HXB2 pseudotypes. However, a significant enhancement of HIV-1 LTR activity was
observed upon exposure of such virally infected JAR cells to TNF-α and IL-1β (Fig. 3). For
example, incubation of Ada-M-infected JAR cells with increasing doses of TNF-α and IL1β led to a maximal 87.3- and 26.3-fold increase in LTR activity, respectively. A similar
treatment of JAR cells once infected with HXB2 pseudotypes resulted also in induction of
HIV-1 LTR-dependent reporter gene activity but to a smaller extent. Similar observations
were made when JAR cells were treated instead with IL-1α (data not shown). Further
studies revealed that the positive effect of TNF-α, IL-1α, and IL-1β on virus transcriptional
activity was dose-dependent (Fig. 4). To demonstrate that the noticed effect was not cell
169
type-specific, we tested the effect of TNF-α, IL-1α, and IL-1β on two other trophoblastic
cell lines, i.e. BeWo and JEG-3. Following virus infection, HIV-1 LTR-driven luciferase
expression was enhanced in a dose-dependent manner by the three tested cytokines in
BeWo cells (Fig. 5). The highest levels of reporter gene activity were seen following
treatment of BeWo cells with TNF-α (i.e. 8.2-fold increase with the highest dose of TNFα). Exposure of BeWo cells to IL-1α and IL-1β produced a 4-fold increase in HIV-1 LTR
activity. Similar data were obtained when using JEG-3 cells (data not shown).
2.3.5 Production of fully infectious HIV-1 particles by trophoblastic cells
is only seen following treatment with TNF-α and co-culture with
indicator cells
In order to investigate whether the cytokine-mediated up-regulation of HIV-1
transcriptional activity could be seen in the context of the complete viral genome, JAR cells
were inoculated with fully infectious HIV-1NL4-3 viruses before exposure to TNF-α. Virus
production was found to be near the detection limit of our p24 enzymatic assay (i.e. less
than 50 pg/ml) despite exposure to TNF-α (data not shown). We next attempted to rescue
the seemingly low amount of produced viruses by co-cultivation with the CXCR4expressing LuSIV cell line. Previous experiments performed in our laboratory suggest that
such indicator cells are susceptible to infection with very low levels of HIV-1, i.e. less than
1 pg of p24 (G. Vidricaire, M.R. Tardif, and M.J. Tremblay, unpublished observations). No
noticeable increase in luciferase activity was obtained in LuSIV co-cultured with virusinfected JAR cells that were left unstimulated (Fig. 6A). However, the co-cultivation of
LuSIV cells with TNF-α-treated JAR cells that were initially infected with NL4-3 resulted
in a dramatic augmentation of luciferase activity. To more closely parallel the physiological
conditions, similar studies were carried out using PBMCs as indicator cells. When PBMCs
were co-cultured with unstimulated virus-infected JAR cells, virus production was again
below the detection limit of our p24 assay (Fig. 6B). Interestingly, virus production was
rescued when PBMCs were instead co-cultured with NL4-3-infected JAR cells that were
also treated with TNF-α. Again, these data fully support the notion that human trophoblast
cells produced only low amounts of mature virus progeny, levels that can be significantly
augmented upon treatment with a pro-inflammatory cytokine such as TNF-α.
170
2.3.6 The major limiting step of HIV-1 infection in trophoblasts is at the
level of the route of entry and is not related to intracellular
restrictions
The natural low susceptibility of trophoblast cells to be productively infected with HIV-1
could be due, in addition to the demonstrated significant vesicular uptake, to some
undefined intracellular restrictions to virus replication. To shed light on this issue, JAR
cells were infected with fully competent HIV-1NL4-3 viruses that bear also the VSV-G
envelope glycoproteins before exposure to TNF-α. This technical strategy permits the
bypassing of the natural inefficient route of HIV-1 entry in trophoblasts and ultimately to
the release of complete HIV-1 particles. In JAR cells infected with complete NL4-3 virions
pseudotyped with VSV-G envelope glycoproteins, the release of a significant amount of
p24 was detected throughout the course of infection, and virus production was again
markedly augmented by a treatment with TNF-α (Fig. 7). Thus no intracellular restriction is
present in trophoblastic cells, and together these studies suggest that the route of HIV-1
entry is the major limiting step of HIV-1 infection in trophoblasts.
2.3.7 Different HIV-1 LTR subtypes are transactivated by TNF-α and
IL-1β in trophoblasts
To assess whether changes in the LTR architecture due to the recognized genetic
heterogeneity of HIV-1 can influence the cytokine-mediated modulatory effect seen in
trophoblast cell lines, transfection experiments were conducted with molecular constructs
made of various LTR subtypes. JAR cells were transiently transfected with luciferaseencoding vectors carrying the LTR region from clades A to G before treatment with TNF-α
and IL-1β. As shown in Fig. 8, virus transcription was triggered by both TNF-α and IL-1β
for all the HIV-1 LTR clades tested. This indicates that the up-regulating effect of these
cytokines on HIV-1 transcription is not restricted to a specific HIV-1 LTR subtype.
2.3.8 Cytokine-dependent up-regulation of HIV-1 LTR activity in
trophoblasts is mediated via NF-κB
Finally, we investigated the molecular events leading to TNF-α-induced transactivation of
HIV-1 by transiently transfecting the JAR cell line with various expression vectors before
171
exposure to TNF-α. As depicted in Fig. 9, TNF-α triggered a 4.4-fold increase in luciferase
activity in JAR cells transfected with the luciferase reporter gene placed under the control
of wild-type HIV-1HXB2 LTR when compared with untreated JAR cells. However, this
induction was lost when JAR cells were transfected with a vector that bears mutations at
the two NF-κB-binding sites within the HIV-1HXB2 LTR domain. The involvement of NFκB in this process was confirmed by the observation that a 7.4-fold increase in luciferase
activity was obtained upon the addition of TNF-α to JAR cells that were transfected with a
κB-driven reporter gene vector.
2.4 Discussion
The overall objectives of the present study was to provide additional information on the
possible mechanism(s) responsible for the weak susceptibility of trophoblastic cells to
productive HIV-1 infection and to define if cytokines present in the environment
surrounding HIV-1-infected trophoblasts could positively modulate virus expression. In the
present report, a strong spontaneous activation of the HIV-1 LTR domain was seen in the
three choriocarcinoma cell lines tested (BeWo, JAR, and JEG-3) following infection with
HIV-1 particles pseudotyped with VSV-G. This set of data clearly indicates that virus
transcription is highly efficient in trophoblastic cells. These results are in agreement with a
previous work that showed that choriocarcinoma cell lines support basal and Tat
transactivated transcriptional activity of HIV-1 reporter gene constructs (66). However, a
minimal HIV-1 LTR-mediated reporter gene activity was detected when infection of
trophoblastic cells was allowed to proceed with viruses bearing macrophage-tropic and Ttropic HIV-1 envelope glycoproteins. This series of investigations suggest that the most
proximal events in HIV-1 biology represent major limiting steps of virus infection in
trophoblasts.
It has been proposed that the reason behind the limited HIV-1 infection of trophoblastic
cells is due to a block at virus entry, which could be caused by a minimal expression of
CD4 and appropriate chemokine co-receptor (1, 16, 17, 38). In the present study, contrary
to what was assumed, we provide evidence that HIV-1 enters massively into trophoblastic
cells. Subcellular fractionation techniques that segregate between vesicular and cytosolic
172
fractions revealed that a major part of intracellular p24 is found in endosomal vesicles,
implying thus that HIV-1 enters trophoblastic cells predominantly via endocytosis. This
route of entry reveals important consequences for the virus life cycle in trophoblastic cells.
Indeed, recent findings have shown that HIV-1 entry can occur through plasma membrane
fusion and endocytosis in both HeLa and Jurkat cells. The latter mode of entry usually
leads to a nonproductive process of infection because viruses will ultimately be degraded in
lysosomes (51). In trophoblastic cells, phagocytosis is thought to play an important role in
the extensive tissue remodeling that occurs during trophoblastic invasion of the decidua and
in the control of exchanges between the maternal and fetal circulations. Moreover,
trophoblastic cells actively transcytose several molecules including immunoglobulins and
even pathogens such as HIV-1 (28). Thus, based on our findings and the current literature,
it is likely that a fraction of HIV-1 entering trophoblasts is transcytosed and another part is
trapped in endocytic vesicles and ultimately degraded. The sum of these two mechanisms
would account for the low permissiveness of trophoblasts to productive HIV-1 infection.
The pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-1α, and IL-1β were found to act as potent
inducers of HIV-1 LTR-dependent activity in trophoblasts when these cells were infected
with VSV-G pseudotypes. Interestingly, the same cytokines also induced viral transcription
in trophoblastic cells exposed to replication-defective reporter viruses bearing HIV-1 AdaM or HXB2 envelope glycoproteins. These findings are supported by a recent study (64)
showing that HIV-1 LTR activity is increased by TNF-α and IL-1β in primary isolated
human trophoblast cells that were transiently transfected with an HIV-1-based reporter
vector. Data from this study were entirely based on transient transfection of HIV-1 LTRbased reporter constructs in trophoblast cells. In contrast, our observations are founded on
integrated proviruses, i.e. following infection of trophoblasts with either complete HIV-1
particles or HIV-1-based pseudotyped viruses. This is important to note because recent
findings indicate that integrated proviral DNA behaves quite differently from transfected
plasmids. Indeed, expression of integrated human retroviruses such as HIV-1 and HTLV-1
has been shown to require cellular factors different from those necessary for expression of
transiently transfected retroviral based plasmids (6, 20, 37, 40). More specifically, it has
been demonstrated that transcription from integrated versus transiently introduced retroviral
173
LTRs does not proceed via identical signal transduction pathways. This suggests that the
signaling requirements necessary to achieve expression of an integrated proviral DNA can
differ from a transfected viral plasmid. Because the process of integration into the host
chromosome is an obligatory step in HIV-1 life cycle, the series of investigations that we
performed with integrated HIV-1 provide physiological significance to our work.
Concerning possible restrictions at late events in the HIV-1 life cycle, we found that
trophoblast cells sustained high virus production when infection was performed with VSVG pseudotypes HIV-1-based viruses. Thus, it can be concluded that, apart from an
inefficient route of virus entry, there is no blockade at late steps in the replicative cycle of
HIV-1 in trophoblast. The minor fraction of intracellular p24 that is found in trophoblast is
not sufficient to lead to a measurable virus production because a co-culture step with
indicator cells is necessary to detect virus production. Under in vivo situations, trophoblasts
are in close contact with cells such as lymphocytes that show a higher susceptibility to
HIV-1 entry and productive infection. Thus, it can be proposed that despite an inefficient
mode of HIV-1 entry in trophoblasts, spreading of the virus to the fetus via infection of
trophoblasts is a possible scenario. Indeed, viral production in trophoblasts could be
triggered under natural conditions upon exposure to TNF-α and/or IL-1. These newly
released virions, as we observed when HIV-1-infected trophoblasts were treated with TNFα and co-cultured with PBMCs, could next productively infect underlying susceptible fetal
cells including Hofbauer cells (45).
In line with our results, the relative importance of TNF-α and IL-1 during vertical
transmission of HIV-1 has been indirectly put forward in previous studies. First,
trophoblastic cells from HIV-1-infected placentas were found to express higher levels of
TNF-α, IL-1β, and IL-6, and such levels also correlated with the amounts of HIV-1 Gag
transcripts found in trophoblastic cells (30, 45). Second, pretreatment of trophoblastic cells
with TNF-α and IL-1β increased lymphocytic cell adhesion to trophoblastic cells (19).
Third, cell contact between macrophages and trophoblasts resulted in up-regulation of HIV1 expression that was mediated by the release of TNF-α and IL-6 by macrophages (4).
Based on these published data together with the present findings, it can be proposed that
174
TNF-α and IL-1 are produced by HIV-1-infected trophoblastic cells and/or macrophages
upon cell contact with trophoblasts. As a consequence, these cytokines would in turn upregulate HIV-1 LTR activity and virus production. This may represent a potential
mechanism of HIV-1 replication in trophoblastic cells leading ultimately to vertical
transmission.
TNF-α was able to activate HIV-1 LTR-driven transcriptional activity in trophoblast cells
at a concentration as low as 1 ng/ml. The physiological significance of such findings is
provided by the demonstration that TNF-α was reported to range from 1.1 to 2.8 ng/ml in
placental supernatants and from 3.9 to 8.5 ng/ml in decidual supernatants (25). IL-1α and
IL-1β, on the other hand, triggered significant activation of the regulatory elements of HIV1 at a concentration up to a 100-fold less than TNF-α. Considering that IL-1 was previously
reported to be at a concentration of 0.19 ng/ml at term and 0.68 ng/ml at the onset of labor
(41), it can be proposed that IL-1 is also an extremely potent activator of the LTR of HIV-1
in trophoblastic cells. Moreover, the strong effect mediated by TNF-α and IL-1 on LTR
activity was neither cell line- nor clade-specific, therefore providing credence to the
observed phenomenon. At the molecular level, the cytokine-mediated augmentation of
HIV-1 transcriptional activity appears to be mediated via the ubiquitous mammalian
transcriptional factor NF-κB. The TNF-α-dependent signaling pathway has been
extensively studied in lymphocytic and monocytic cells, and NF-κB is thought to play a key
role in triggering HIV-1 expression in these cells, which are considered as major cellular
reservoir of this retrovirus (46).
The roles played by TNF-α during gestation are thought to include the following: control of
cell migration and placental growth, cell death, immune privilege, hormone production
(progesterone, estradiol, and human chorionic gonadotropin), and parturition (60, 62, 63). It
is interesting to note that both TNF-α and IL-1 exert their effect primarily at the onset of
pregnancy and again during labor (12, 23-25, 27, 42-44, 48, 54). Interestingly, it coincides
with the timing of a higher risk of HIV-1 vertical transmission (14, 49). Moreover,
concomitant viral and bacterial infections are among the risk factors associated with
vertical transmission of HIV-1 (53). Given that certain microbial infections lead to a
175
transient expression of IL-1 and TNF-α during pregnancy (47), it is tempting to speculate
that the presence of pro-inflammatory cytokines creates conditions leading to higher HIV-1
expression and thus an increased probability of its vertical transmission.
Taken together, the data presented in this report provide important novel pieces of
information in regard to the possible mechanism of in utero transmission of HIV-1. We
have shown that HIV-1 enters massively into trophoblastic cells, and data from infection
studies with VSV-G pseudotypes HIV-1 particles suggest that there are no other
intracellular restrictions in this cell type. The natural low susceptibility of trophoblast cells
to a productive HIV-1 infection is linked with a block at the initial stage(s) of the virus life
cycle and more precisely with a vesicular uptake of p24, a process that leads to degradation
by lysosomal enzymes and/or transcytosis of the virus. We further show that these
limitations can be partially overcome by a treatment with pro-inflammatory cytokines such
as TNF-α and IL-1. The expression profile of these cytokines suggests that productive HIV1 infection of trophoblasts may be favored at two different time points during the course of
pregnancy, i.e. first at the onset of pregnancy, where there are highly proliferative and
invasive trophoblastic cells, and later at term. Because there is a limited time frame of
TNF-α and IL-1 expression and a bias toward Th2-type cytokine expression during
pregnancy, this may help to explain in part why HIV-1 transmission may be limited during
pregnancy.
2.5 Acknowledgements
We thank Dr. M. Duffour for technical assistance in flow cytometry studies. This work was
supported in part by Canadian Institutes of Health Research HIV/AIDS Research Program
Grant HOP-15575 (to M. J. T.). The costs of publication of this article were defrayed in
part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked
“advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.
Gaël Vidricaire performed this work in partial fulfillment for the Ph.D. Degree in the
Program of Microbiology-Immunology, Faculty of Medicine, Laval University. Gaël
Vidricaire and Mélanie R. Tardif are recipients of Canadian Institutes of Health Research
176
Doctoral Research Awards from the HIV/AIDS Research Program. Michel J. Tremblay
holds a Tier 1 Canada Research Chair in Human Immuno-Retrovirology.
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Section 3
Figure legends
Fig. 1. HIV-1 enters massively in trophoblastic cells. JAR cells were exposed to VSV-G
pseudotypes (A), Ada-M pseudotypes (B), or complete NL4-3 viruses (C) for 5 min to 4 h
at 37 °C. The cells were then washed, trypsinized, and lysed. The process of virus entry
was measured by evaluating the amount of p24 in the cell lysates. Data shown are
expressed as the means ±S.D. of triplicate samples and are representative of three
independent experiments.
Fig. 2. Intracellular p24 is primarily localized in endosomal vesicles in trophoblastic
cells. JAR (A) and PM1 cells (B) were exposed to HIV-1 particles pseudotyped with AdaM envelope glycoproteins for the indicated times at 37 °C. After viral exposure, cells were
washed, trypsinized, and resuspended in a swelling buffer. Cells were next disrupted by
Dounce homogenization, and levels of p24 were evaluated in each cellular fraction. Data
shown are expressed as the means ±S.D. of triplicate samples and are representative of
three independent experiments.
Fig. 3. HIV-1 transcriptional activity is increased upon treatment of trophoblasts with
TNF-α and IL-1β. JAR cells were infected with HIV-1 reporter viruses bearing M-tropic
(A and B) or T-tropic (C and D) envelope glycoproteins and were either left untreated or
treated with increasing doses of TNF-α (A and C) or IL-1β (B and D). Cells were lysed at
24 h post-stimulation, and HIV-1-encoded luciferase activity was monitored in each cell
lysate. Values from the luminometer are expressed as relative light units (RLU). Data
shown are expressed as the means ±S.D. of quadruplicate samples and are representative of
three independent experiments. Fold increase over untreated cells is indicated at the top of
each data point.
Fig. 4. Cytokine-mediated increase in HIV-1 LTR activity is dose-dependent in
trophoblasts. JAR cells were first infected with HIV-1 particles bearing VSV-G envelope
glycoproteins and were either left untreated or treated with increasing doses of TNF-α (A),
IL-1α (B), or IL-1β (C). Cells were lysed either at 8 (C) or 24 h (A and B) poststimulation,
and HIV-1-encoding luciferase activity was assessed in each cell lysate. Values from the
183
luminometer are expressed as relative light units X 103 (kRLU). Data shown are expressed
as the means ±S.D. of quadruplicate samples and are representative of three independent
experiments.
Fig. 5. Cytokine-mediated induction of HIV-1 transcription is also seen in BeWo
trophoblastic cells. BeWo cells were inoculated with VSV-G pseudotypes and were either
left untreated or treated with TNF-α (A), IL-1α (B), or IL-β (C). Cells were lysed at 24 h
poststimulation, and HIV-1-encoded luciferase activity was monitored in each cell lysate.
Values from the luminometer are expressed as relative light units X 103 (kRLU). Data
shown are expressed as the means ±S.D. of quadruplicate samples and are representative of
three independent experiments. Fold increase over untreated cells is indicated at the top of
each bar.
Fig. 6. Production of fully infectious HIV-1 particles is seen when virus-infected
trophoblasts are treated with TNF-α and co-cultured with indicator cells. JAR cells were
inoculated with fully infectious NL4-3 virions and were either left untreated or treated with
TNF-α at 10 ng/ml. The infected JAR cells were next co-cultured for 24 h with indicator
LuSIV cells (A) or primary human PBMCs (B). Luciferase activity in the indicator LuSIV
cell line was measured on days 3, 5, 7, 9, and 12 post-coculture (A), whereas levels of p24
were evaluated in cell-free culture media from PBMCs on days 1, 3, 5, 7, 9, and 12 postcoculture (B). Luciferase activity is depicted as relative light units X 103 (kRLU). Data
shown are expressed as the means ±S.D. of quadruplicate samples and are representative of
three independent experiments.
Fig. 7. Limited HIV-1 infection in trophoblast cells is not related to intracellular
restrictions other than the route of virus entry. JAR cells were inoculated with complete
NL4-3 virions pseudotyped with VSV-G envelope glycoproteins and were left untreated or
treated with TNF-α at 10 ng/ml. Cell-free culture media were collected on days 1, 2, 3, 5,
and 7 days post-stimulation, and levels of p24 were evaluated. Levels of p24 were
monitored in cell-free culture media at the indicated times. Data shown are expressed as the
means ±S.D. of quadruplicate samples and are representative of three independent
experiments.
184
Fig. 8. Different HIV-1 LTR subtypes are transactivated by TNF-α and IL-1β in
trophoblasts. JAR cells were co-transfected with an expression vector coding for the
luciferase reporter gene under the control of an HIV-1 LTR subtype and an actin-driven βgalactosidase vector. Cells were next either left untreated or treated with TNF-α or IL-1β
and were lysed at 8 h post-stimulation. HIV-1-encoded luciferase activity and actindependent β-galactosidase values were monitored in each cell lysate. Standardization of the
luciferase counts was achieved by dividing each luciferase activity mean value by the
measured β-galactosidase activity mean value. Data shown are from quadruplicate samples
and are representative of three independent experiments. Fold increase over untreated cells
is indicated at the top of each bar.
Fig. 9. Cytokine-dependent transactivation of HIV-1 LTR in trophoblasts is mediated via
NF-κB. JAR cells were transiently transfected with pLTR-Luc, pmκBLTR-Luc, or pNF
κB-Luc and were either left untreated or treated with TNF-α. Cells were lysed at 8 h poststimulation, and luciferase activity was monitored in each cell lysate. Values from the
luminometer are expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed as the
means ±S.D.
of quadruplicate samples and are representative of three independent
experiments. Fold increase over untreated cells is indicated at the top of each bar.
185
Section 4
4.1 Table 1
Tables
186
Section 5
5.1 Figure 1
Figures
187
5.2 Figure 2
188
5.3 Figure 3
189
5.4 Figure 4
190
5.5 Figure 5
191
5.6 Figure 6
192
5.7 Figure 7
193
5.8 Figure 8
194
5.9 Figure 9
195
Chapitre 3. LE RÔLE DE LA GP120 ET DE LA GP41
DANS LE CYCLE REPLICATIF DU VIH-1
Section 1
Deuxième article scientifique
1.1 Title page
1.1.1 Title
HIV-1 infection of trophoblasts is independent of gp120/CD4 interactions but relies on
heparan sulfate proteoglycans.
1.1.2 Authors
Gaël Vidricaire, Sonia Gauthier and Michel J. Tremblay
1.1.3 Affiliation
Research Center in Infectious Diseases, CHUL Research Center, and Faculty of Medicine,
Laval University, Quebec, Canada.
1.1.4 Running title
HIV-1 infection of human trophoblasts
1.1.5 Keywords
HIV, trophoblast. endosome, polarization, heparan sulfate proteoglycans
1.1.6 Corresponding author
Mailing address:
Laboratory of Human Immuno-Retrovirology
Research Center in Infectious Diseases, RC709
CHUL Research Center
2705 Laurier Blvd.
Quebec (QC), Canada, G1V 4G2
Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2212
196
1.2 Résumé
La transmission mère-enfant du VIH-1 est la principale cause d’infection par ce rétrovirus
chez le nouveau-né. L’infection directe des trophoblastes, cellules constituant la charpente
du placenta, est l’un des modèles postulés pour expliquer la transmission verticale du VIH1. Le mécanisme par lequel il infecte les trophoblastes est inhabituel pour ce rétrovirus. En
effet, il consiste en l’internalisation des virions, suivie d’un transit par les endosomes.
Cependant,
puisque
les
trophoblastes
n’expriment
pas
ou
très
peu
les
récepteurs/corécepteurs requis pour l’entrée du VIH-1 dans une cellule-cible, les étapes
précoces du cycle réplicatif de ce virus dans les trophoblastes demeurent inconnues. Nous
montrons dans cette étude que l’entrée et l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes
polarisés sont indépendantes non seulement du CD4, mais aussi des glycoprotéines de
l’enveloppe, la gp120 et la gp41. En effet, lorsque l’on utilise des virus incapables de
fusionner ou des virus déficients en enveloppe, l’internalisation, l’accès au cytoplasme, la
transcription inverse, l’intégration et l’expression génique du VIH-1 ont quand-même lieu,
et ce, à des niveaux comparables aux virus de type sauvage. On obverse ce phénomène en
utilisant des virus produits non seulement dans les 293T mais aussi dans des cellules
humaines primaires. Finalement, nous avons montré que l’internalisation du VIH-1 par les
trophoblastes polarisés requiert la participation des héparans sulfates. Dans l’ensemble, nos
résultats montrent que le VIH-1 utilise une voie inhabituelle pour pénétrer à l’intérieur des
trophoblastes polarisés. Nous postulons que l’accès au cytoplasme des virions, à l’intérieur
des trophoblastes, se produit par fusion des virus avec la membrane externe des endosomes,
et ce, grâce à la machinerie protéique de la cellule-hôte.
1.3 Abstract
Mother-to-child transmission of HIV-1 is the leading cause of infection in infants. Direct
infection of the trophoblasts, structural cells of the placenta, is one of the postulated
mechanisms for vertical transmission of HIV-1. The mechanism whereby HIV-1 infects
trophoblasts is unusual for this retrovirus. Indeed, internalization and a massive transit via
the endosomes are required. However, given that trophoblasts express no or little receptors
and coreceptors required for HIV-1 entry, the early events associated with the virus life
197
cycle in these cells are still a mystery. We show here that HIV-1 entry and infection of
polarized trophoblasts are not only independent of CD4, but also of envelope (Env)
glycoproteins gp120 and gp41. Virus internalization, cytoplasmic release, reverse
transcription, integration and HIV-1 gene expression occurred with both fusionincompetent and Env-deficient viruses and at comparable levels to wild type virions.
Importantly, Env-independent infection of trophoblasts was observed when using viruses
produced not only in 293T cells but also in primary human cells. Finally, we found that
HIV-1 requires heparan sulfate proteoglycans for uptake in polarized trophoblasts.
Altogether our findings illustrate that HIV-1 utilizes an unusual pathway for entering into
human polarized trophoblasts. We are postulating that the cytoplasmic delivery of incoming
virions inside trophoblasts might occur upon a back fusion process that involves the host
cell machinery.
Section 2
2.1 Introduction
More than two million children under fifteen years old are currently living with the human
immunodefiency virus type 1 (HIV-1) worldwide and 90% of these infections are
associated with mother-to-child transmission (MTCT) of this retrovirus (60). Vertical
transmission of HIV-1 may occur in utero, at birth or through breastfeeding (reviewed in
(53)). Attempts to determine the timing of infection associated with vertical transmission by
mathematical modeling revealed that one third of transmissions occurred in utero, the
majority within two months of delivery, and two thirds at birth (50). Given that millions of
children are infected with HIV-1, it may thus be inferred that several hundreds of thousands
of them were contaminated during pregnancy. In agreement with that statement, HIV-1 was
detected not only in newborns at delivery (32, 39, 69) but also in aborted fetuses as early as
8 weeks of gestation and in second trimester fetuses (18, 34, 36, 55). Recent estimates
indicate that women are becoming infected at a higher frequency than men (59) and both
pre-birth counseling for preventing MTCT and access to antiretroviral treatments are
198
extremely limited in developing countries (41). In this context, defining the mechanism(s)
underlying vertical transmission is urgently needed.
For in utero HIV-1 transmission to occur, the virus must first cross the highly selective
placental barrier in order to reach the fetal circulation. This barrier is composed of a double
layer of polarized epithelial-type cells, i.e. the cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts.
Four models have been postulated for in utero HIV-1 transmission: i) trans-annexial
passage of the virus, ii) accessing the fetal circulation through micro-breaches within the
placental barrier, iii) via a direct infection of the trophoblasts, and iv) endocytic uptake of
virions by the trophoblasts followed by a transit through these cells (reviewed in (53, 63)).
The last process is called transcytosis and occurs independently of infection (31). Infection
of placental cells and HIV-1 transcytosis across these cells may concomitantly take place
such that these two models are not mutually exclusive. However, the relative importance of
either pathway in vivo to in utero transmission is still unknown.
Supporting the notion that trophoblasts can sustain virus infection, we and others have
shown that trophoblasts can be productively infected by HIV-1 in vitro (31, 47, 62, 68) and
virus infection of placental trophoblasts in vivo is a relatively frequent event (23, 33, 39,
70). This being said, like other epithelial cells, trophoblasts exhibit a much lower
susceptibility to productive HIV-1 infection than CD4+ T lymphocytes, the primary target
of HIV-1 infection. Indeed, proinflammatory cytokines such as TNF-α or IL-1 coupled with
a subsequent contact with cells highly permissive to virus infection (i.e., indicator cells) are
needed to detect the low levels of virions produced by HIV-1-infected trophoblasts (20, 62,
68). We and other have postulated that the natural presence during pregnancy of specific
macromolecules in the vicinity of trophoblastic cells (such as TNF-α and IL-1) may create
favorable conditions leading to vertical transmission of this retrovirus (42, 62, 67).
We have reported in the past that upon contact with human trophoblasts, HIV-1 is rapidly
and massively endocytosed, and as a consequence, virions are predominantly trapped
within the endosomal compartments of these cells (61). Noteworthy, we made the
surprising observation that this internalization event of viral particles by trophoblasts,
contrary to what is seen in CD4+ T cells (54), is crucial for HIV-1 infection to proceed in
199
these cells. Indeed, drugs that inhibit the function of the endosomes completely block HIV1 infection in these cells (61, 64). In addition, expression of both Rab5 and Rab7 are
mandatory for HIV-1 infection to take place in these cells (64). Hence, HIV-1 entry in
trophoblastic cells requires trafficking of incoming virions via the endosomal
compartments. It can thus be concluded that HIV-1 infection in these cells is thus endocytic
in nature (61, 64). On the other hand, HIV-1 entry in CD4+ T cells occurs upon fusion of
viral and cellular membranes. The virus-encoded envelope (Env) glycoproteins gp120 and
gp41 interact with the primary cellular receptor CD4 and coreceptors such as CXCR4 or
CCR5. This tight association leads to the formation of a fusion pore in the plasma
membrane, and the subsequent delivery of the viral nucleocapsid into the host cell
cytoplasm (reviewed in (26)). Based on this, two important elements can be foreseen
concerning HIV-1 infection of trophoblasts. First, it is completely different from what is
known for CD4+ T cells (61, 62, 64). Second, the natural low susceptibility of trophoblasts
to productive HIV-1 infection may be due to this peculiar entry route. Indeed, endocytic
uptake of viral particles is an event recognized to generate poor viral yields due to
degradation of internalized viral particles within the endosomes/lysosomes (37, 62).
Although it is now clear that HIV-1 infection in trophoblasts relies heavily on endocytosis,
the initial events of the virus life cycle in this cell type are still ill defined. Indeed, although
marked inter-individual variability in CD4 and co-receptor (i.e., CCR5, CXCR4) expression
has been observed in primary trophoblasts, the expression of CD4 remains very low to
absent in these cells while the expression of coreceptors may vary in the course of
pregnancy (30, 42, 68). Some previous studies have addressed the contribution of CD4,
CXCR4 and CCR5 in HIV-1 infection of trophoblasts and the published reports are
contradictory. For example, the uptake of HIV-1 in primary trophoblasts and immortalized
trophoblastic cell lines (i.e., JAR, BeWo and JEG-3) has been proposed to occur via
gp120/CD4 interactions (20, 21). However, others studies have failed to confirm these data
as the addition of a blocking anti-CD4 antibody to the cultures did not inhibit virus entry (2,
42, 47). Interestingly, it has also been shown that blocking the interactions between HIV-1
and CXCR4 or CCR5 does not impact on viral entry (2, 42). Hence, the role of CD4 and
coreceptors for HIV-1 entry into trophoblastic cells is still unclear but it is reasonable to
200
assume that CD4, CXCR4 and CCR5 are unlikely to play a significant role because they are
expressed at such low levels if present. In this context, we made two hypotheses. First,
other attachment receptors must be involved to compensate for the low level of
CD4/CXCR4/CCR5 in these cells. Thus, HIV-1 might use yet to be defined alternate
receptor(s)/coreceptor(s) for entry. Second, if HIV-1 infection of trophoblasts is
independent of the known receptor/coreceptors for entry, the virus may not rely on the Env
glycoproteins gp120 and gp41 for such event. The central objective of the present work was
to test the validity of these postulates.
In this report, we demonstrate that HIV-1 entry and infection of polarized trophoblasts are
not only independent of CD4, but also of the viral Env glycoproteins gp120 and gp41. We
present evidence that viruses carrying non-functional gp41 or completely lacking both
gp120 and gp41 can be internalized and infect polarized trophoblasts as efficiently as wild
type viruses. These mutated viruses were shown not only to access the cytoplasm, but also
to integrate into the host cell genome. In addition, we found that heparin and heparinase
treatments severely impeded on viral internalization, implying that interactions between
HIV-1 and trophoblasts involve, at least in part, heparan sulfate proteoglycans (HSPGs).
These data demonstrate that HIV-1 gains entry in human polarized trophoblasts through an
unusual pathway for this retrovirus. These findings suggest that interventions to reduce
MTCT, particularly those aimed at blocking virus entry, will need to take into account the
fact that HIV-1 infection in trophoblasts does not follow the events known to occur in CD4+
T cells. Finally, the previous demonstration that HIV-1 accumulates within late endosomes
(61) and the present work revealing that infection does not rely on gp120 and gp41 greatly
resemble retrograde transport of major histocompatibility complex class-II (MHC-II)
molecules and mannose-6 phosphate receptor (M6PR) from inner vesicles via a putative
back fusion process (14, 29, 40, 44). HIV-1 infection of trophoblastic cells may thus
provide a unique model system to elucidate this yet to be defined crucial pathway.
201
2.2 Material and methods
2.2.1 Cells
The human trophoblastic cell line JAR, malignantly transformed human cell line of
trophoblast lineage JEG-3, human embryonic kidney 293T cells and human leukemic T cell
line Jurkat (clone E6.1) were obtained from the American Type Culture Collection
(Manassas, VA). The cell lines were maintained as previously described (62). Human
PBMCs from healthy donors were isolated by centrifugation through a Ficoll-Paque density
gradient. PBMCs were resuspended at a density of 106 cells/ml in RPMI-1640 medium
supplemented with 20% fetal bovine serum, 15 mM NaOH, 25 mM HEPES, glutamine (2
mM), penicillin G (100 units/ml), streptomycin (100 mg/ml), 3 µg/ml of PHA-P (Sigma)
and 50 units/ml of human recombinant IL-2 (kind gift of M. Gately, Hoffmann-La Roche
Molecular Biochemicals).
2.2.2 Molecular constructs and preparation of virus stocks
pNL4-3 (X4) and pJR-CSF (R5) are full length infectious molecular clones of HIV-1. The
NL4-3-Luc E-R+ vector was constructed by inserting a frameshift mutation near the env
gene and the firefly luciferase reported gene into the nef gene (3, 17). This expression
vector was used to generate Env-deficient reporter viruses (called NL4-3∆Env). pHXB2env is a mammalian expression vector coding for the HIV-1 HXB-2 (X4) Env glycoprotein.
These constructs were obtained through the AIDS Repository Reagent Program
(Germantown, MD). The pcDNA-1/Amp-based expression vector coding for the HIV-1
Ada-M (R5) complete Env glycoprotein was generously provided by N. R. Landau (The
Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA). The fusion-competent pSM-WT and
fusion-incompetent pSM-570R Env expression vectors (HXB-2 backbone) were kind gifts
from C.D. Weiss (Center for Biologics Evaluation and Research, Food and Drug
Administration, Bethesda, MD) (65). The pHCMV-G molecular construct codes for the
broad-host-range vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G (VSV-G) under the
control of the human cytomegalovirus promoter (66). Viruses were produced by calcium
phosphate transfection of 293T cells as described previously (62). Viruses loaded with β-
202
lactamase were produced by co-transfection of 293T cells with a vector encoding for a βlactamase-Vpr fusion protein (pCMV-βlaM-Vpr) (provided by W.C. Greene, Gladstone
Institute of Virology and Immunology, San Francisco, CA) together with some of the
expression vectors described above. In some experiments, PBMCs (1 x105) were infected
with fully infectious NL4-3 and JR-CSF (20 ng of p24). Next, cells were trypsinized,
washed three times in phosphate-buffered saline (PBS) and cultured in complete culture
medium for seven days. Virus stocks were collected as follows: the cells were centrifuged
at 1,200 rpm for 5 min and the media were filtered through 0.45 mm filters, aliquoted and
frozen at -800C until used.
2.2.3 Infection assays
JAR cells were seeded in 24-well cell culture inserts containing a 0.4 μm pore size PET
track-etched membrane (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NY) and the
trophoblastic cells were allowed to polarize and grow to confluence for 4 days as previously
described (61). Polarized JAR or Jurkat cells were incubated at 37˚C for 24 h with
recombinant luciferase-encoding viruses pseudotyped with SM-WT or SM-570R or
luciferase-encoding viruses lacking Env glycoproteins (NL4-3∆Env) produced in 293T
cells (1 x106 target cells with escalading doses of virus ranging from 0 to 500 ng of p24, or
in some experiments 250 ng of p24 together with 10 µM of zidovudine/AZT). JEG-3 cells
(1 x106) were first incubated at 37˚C for 24 h with reporter viruses (250 ng of p24).
Following virus exposure, TNF-α (10 ng/ml) (generously provided by P. Naccache, CHUL
Research Center, Quebec, QC) was added for 24 h to induce virus gene expression as
described previously (62). Finally, the cells were lysed and luciferase activity was
monitored in each cell lysate as shown previously (4). To block the primary CD4 receptor
before virus infection, polarized JAR cells were incubated for 30 min at 4˚C with either an
isotype-matched irrelevant control antibody (i.e., IgG2a at 10 µg/ml) or a blocking anti-CD4
antibody (i.e., SIM.2 at 10 µg/ml) following which Ada-M or HXB-2 pseudotyped viruses
(250 ng of p24) were added. For Jurkat, cells were exposed to the control antibody or
SIM.2 for 30 min at 37°C before inoculation with pseudotyped viruses (100-150 ng of p24).
Due to the high endocytic activity of JAR cells, pre-incubation with inhibitors were always
203
performed at 4°C to block endocytosis and prevent internalization of the inhibitors by the
cells. This strategy was found to optimize all blocking assays in these cells (unpublished
observations). For the experiment with the fusion inhibitor T-20 (Roche Bioscience, Palo
Alto, CA), the drug was added at various doses (0, 0.2, 1.0 and 5.0 μg/ml) at 4˚C to
polarized JAR cells concomitantly with Ada-M or HXB-2 pseutdotyped viruses (250 ng of
p24). In some experiments, Jurkat cells were treated with 1 μg/ml of T-20 before exposure
to HXB-2 pseutdotypes or wild type NL4-3 viruses (100-150 ng of p24). The cells were
then incubated at 37˚C for 24 h. At this time point, TNF-α (10 ng/ml) was added for 24 h
together with a second dose of T-20. Finally, infected cells were lysed and luciferase
activity was monitored in each cell lysate. For Jurkat cells infected with wild type NL4-3
viruses, following infection and stimulation for 24 h with TNF-α, cell supernatants were
harvested and frozen at -20°C until enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) specific
for the viral core protein p24 were performed as previously described (9).
2.2.4 Virus binding and internalization assays
Polarized JAR cells were exposed to SM-WT pseudotyped, SM-570R pseudotyped, wild
type NL4-3, or Env-deficient viruses (NL4-3∆Env) (250 ng of p24 for 1 x 106 cells) for 0 to
4 h at either 4˚C (to test virus binding) or 37˚C (to test virus internalization). At this point,
for kinetics of virus binding, the cells were washed three times with ice-cold PBS to remove
all unbound viruses. As for kinetics of virus internalization, the cells were acid-treated (0.5
M NaCl, 1% acetic acid) at 4˚C for 1 min and washed three times with ice-cold PBS to
remove all uninternalized viral particles. Finally, the cells were lysed in ice-cold lysis
buffer (20 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl and 0.5% Triton X-100) and viral content
was monitored by the p24 assay. In experiments aimed at blocking virus entry, heparin
sodium (0, 50, 250 and 500 IU/ml) (Leo-Pharma, Thornhill, ON) was added at 4˚C together
with NL4-3∆Env, Ada-M or HXB-2 pseudotypes (250 ng of p24) to polarized JAR cells.
The cells were incubated for 1 h at 37˚C before the cells were washed and lysed. Of note,
all heparin preparations are formulated according to biological activity provided by the
manufacturer (i.e., a formulation containing 1,000 IU/ml would contain no less than 6.67
mg/ml of heparin sodium). For treatment with heparinase (Sigma-Aldrich), polarized JAR
204
cells were pre-treated with 0, 2, 20, 200 and 400 mU/ml of heparinase for 1.5 h at 37°C.
Subsequently, the cells were washed three times with ice-cold PBS and viral particles were
added as described above.
2.2.5 βlaM-Vpr-mediated cleavage of CCF2/AM
Polarized JAR cells were exposed to wild type, pseudotyped (i.e., VSV-G, SM-WT and
SM-570R), or Env-deficient (NL4-3∆Env) viruses which were all loaded with βlaM-Vpr
fusion protein (400 ng of p24 for 1 x 106 cells) for 2 h at 37°C. The virus-cell mixture was
next extensively washed with PBS before incubation with the CCF2/AM dye as described
by the manufacturer (Aurora Bioscience, San Diego, CA). Briefly, 2 µl of CCF2/AM (1
mM) were mixed with 8 µl of a solution made of 0.1% acetic acid containing 100 mg of
Pluronic-F127R/ml in 1 ml of CO2-independent medium (Invitrogen Canada Inc.,
Burlington,ON) to constitute the loading solution. The cells were incubated for 1 h at room
temperature and then washed twice with CO2-independent medium. The βlaM reaction was
maintained for 24 h at room temperature in 1 ml of CO2-independent medium supplemented
with 10% FCS and 2.5 mM probenecid (Sigma-Aldrich), an inhibitor of anion transport.
Finally, the cells were washed two times with PBS and fixed in 1 ml of a 2% solution of
paraformaldehyde. The emission spectra of CCF2/AM (520 nm) and its cleaved product
(447 nm) upon excitation at 409 nm were monitored with an 8000C spectrofluorometer
(SLM AMINCO; SLM Instruments Inc., Urbana, IL). The cleavage of the β-lactam ring in
CCF2-AM by βlaM prevents the FRET between the coumarin and fluorescein moieties of
the dye upon excitation at 409 nm. As a result, the fluorescence emission spectrum of
CCF2-AM changes from green (uncleaved substrate at 520 nm) to blue (cleaved substrate
at 447 nm) (12, 13). The degree of βlaM-mediated cleavage is expressed as the ratio of the
intensities of the cleaved substrate (447 nm) over uncleaved substrate (520 nm) as
described previously (71).
2.2.6 Cell fractionation assays
Polarized JAR cells were exposed to pseudotyped viruses (i.e., SM-WT, SM-570R and
VSV-G), wild type NL4-3, or NL4-3∆Env viruses (250 ng of p24 for 1 million cells) for 4
205
h at 37°C. At this point, the cells were washed rapidly three times with PBS, tryspinized for
5 min at 37°C to remove uninternalized viruses. The cells were pelleted down by
centrifugation (1,200 rpm for 5 min at 4°C) and washed two times with ice-cold PBS. To
disrupt cellular membranes, cells were resuspended in 600 μl of ice-cold hypotonic buffer
(10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM KCl and 1 mM EDTA) for 1 min and broken down by
Dounce homogenization (three strokes, 7-ml B pestles). Nuclei, cell debris and undamaged
cells were pelleted by centrifugation (1,800 rpm for 5 min at 4°C). Supernatants containing
cytosol and vesicles (including endosomes) were centrifuged at 12,000 rpm for 90 min at
4°C in a Heraeus centrifuge. Supernatant that represents the cytosolic fraction was adjusted
to 0.5% Triton X-100 while the pellet (i.e., vesicular fraction) was resuspended in lysis
buffer (20 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl and 0.5% Triton X-100). The level of p24
present in each fraction was assessed using the p24 test.
2.2.7 Real-time PCR
Polarized JAR cells (1 x 106) were either left untouched or exposed to pseudotyped (i.e.,
SM-WT, SM-570R and VSV-G) or NL4-3∆Env viruses (250 ng of p24) (a ratio of 1 x 106
cells for 100 ng of p24 was used for Jurkat cells) for 48 h at 37°C. For the experiment with
the fusion inhibitor T-20, the drug was added (1.0 μg/ml) at 4˚C to polarized JAR cells (1 x
106) concomitantly with NL4-3 or JR-CSF viruses produced in PBMCs (110 ng of p24).
Cells were then incubated at 37˚C for 48 h and then washed twice with PBS and trypsinized
at 37°C for 5 min. The cells were then pelleted down by centrifugation (1,200 rpm for
5 min at 4°C) and washed twice with PBS. Total cellular DNA was isolated using the
DNeasy Tissue Kit as described by the manufacturer (QIAGEN Inc., Mississauga, ON). To
quantify the amount of integrated viral DNA, we used the real-time PCR approach
described by Suzuki and colleagues (57). Briefly, a first round of PCR amplification was
carried out using 100 ng of DNA and Taq DNA polymerase (Promega, Nepean, Ontario).
The primers were: Alu-specific sense primer (5’-TCC CAG CTA CTC GGG AGG CTG
AGG-3’) and an antisense HIV-1 specific primer (M661) (5’-CCT GCG TCG AGA GAT
CTC CTC TG-3’, 673-695). Cycling conditions included an initial denaturation step (94°C
for 3 min), followed by 22 cycles of denaturation (94°C for 30s), annealing (66°C for 30s),
206
and extension (70°C for 10 min) followed by a final extension (72°C for 10 min). The first
PCR products were subsequently diluted 10-fold (2,500-fold for VSV-G pseudotypes) and
subjected to a real-time PCR assay targeting the HIV-1 R/U5 region. The primers were:
R/U5 DNA sense primer (M667) (5’-GGC TAA CTA GGG AAC CCA CTG C-3’, 496517) and the antisense primer (AA55) (5’-CTG CTA GAG ATT TTC CAC ACT GAC-3’,
612-635). The fluorogenic probe HIV-FAM (Biosearch Technologies, Novato, CA) was
designed to anneal to the target between the sense primer M667 and the antisense-primer
AA55 in the R-U5 region: 5'-(FAM) TAG TGT GTG CCC GTC TGT TGT GTG AC
(BHQ-1)-3'. PCR was performed using the Rotor-Gene 3000TM four-channel multiplexing
system (Corbett Research, Sydney, Australia) and Taq DNA polymerase. Cycling
conditions included 40 cycles of denaturation (95°C for 20s) and extension (60°C for 1
min). In order to detect retro-transcribed viral DNA, isolated DNA was subjected to the
real-time PCR assay without undergoing the first round of PCR amplification.
2.3 Results
2.3.1 HIV-1 entry and infection of polarized human trophoblasts occur
independently of CD4 and gp120/gp41
Trophoblasts are the structural component of the placenta in which they are tightly attached
to each other forming a polarized-like epithelium under natural conditions. Cell polarity is
essential to carry out the biological properties (e.g. to act as a physical barrier) and
functions of simple epithelia (e.g. apical and basolateral endocytic pathways). Given that
HIV-1 infection of trophoblasts relies heavily on the cellular endocytic machinery (61),
maintaining cell polarity when studying such process is of prime importance in these cells.
Purification of primary trophoblasts is extremely difficult and more importantly it results in
the loss of cell polarity (8). Fortunately, the human trophoblastic JAR cell line exhibits
many characteristics of the early placenta (48) and can be cultivated into a polarized
epithelium-like monolayer that closely resembles the in vivo trophoblastic barrier (61).
Thus, this model system represents a highly meaningful and elegant alternative to primary
cells.
207
We first tested the ability of the blocking anti-CD4 antibody SIM.2 to inhibit infection of
Jurkat cells (used as a control) with single-cycle reporter viruses pseudotyped with an X4tropic Env. Treatment with SIM.2 was found to reduce virus infection by 71% in
unstimulated Jurkat cells (Fig. 1A). The presence of physiologic doses of proinflammatory
cytokines such as TNF-α or IL-1α is required to promote HIV-1 gene expression in
trophoblasts (62). As this treatment is needed to detect virus infection in polarized JAR
cells, we next tested whether TNF-α treatment of Jurkat cells would affect the antiviral
activity of SIM.2. The tested anti-CD4 was still very efficient at inhibiting HIV-1 gene
expression of Jurkat cells despite addition of TNF-α (94% reduction) (Fig. 1A). On the
opposite, pretreatment of polarized JAR cells with SIM.2 did not significantly modulate
infection by R5 and X4 reporter viruses (Figs. 1B and 1C, respectively). This implies that
entry of HIV-1 in trophoblastic cells is independent of CD4. In addition, treatment of
polarized JAR cells with soluble CD4 also had no effect on infection with R5 and X4
viruses (data not shown), further supporting the CD4-independent entry mode of HIV-1 in
polarized trophoblasts. To expand on these observations, experiments were conducted also
with the fusion inhibitor T-20. The presence of up to 5 μg/ml of T-20 did not reduce
reporter gene activity of the two viral strains tested (Figs. 2A and 2B). In control studies,
virus production was inhibited by 76% in Jurkat cells in the absence of TNF-α and 87% in
its presence when Jurkat cells were infected with fully competent NL4-3 particles (Fig. 2C).
In summary, this first series of experiments surprisingly show that HIV-1 infection of
polarized JAR cells is not only independent of CD4 but also of gp41-mediated fusion.
Based on these intriguing results, we sought to further substantiate them. First, polarized
JAR cells were exposed to SM-WT pseudotypes (HXB-2 backbone) or wild type NL4-3
viruses for increasing time periods at 37°C to estimate the kinetics of virus internalization.
Subsequently, the cells were acid-treated to remove uninternalized viruses, washed and
lysed before assessing the amount of internalized virus (as monitored by measuring the p24
content). We found that the tested virus preparations were internalized with a high
efficiency and in a timely fashion in JAR cells (Figs. 3A and 3B). Experiments were also
performed with SM-570R pseudotypes and NL4-3∆Env viruses. The SM-570R construct
bears a mutation in gp41 that abolishes its fusogenic activity, whereas the NL4-3∆Env
208
viruses completely lack Env due to a frameshift mutation near the env gene. Surprisingly,
SM-570R and NL4-3∆Env viruses were both found to be internalized by JAR cells at a
comparable level to wild-type viruses (Figs. 3C and 3D). To test viral attachment to JAR
cells, cultures were exposed to the same virus preparations but at 4°C. At this temperature
cell movement and viral uptake are inhibited and, consequently, the amount of p24
measured corresponds to the amount of viruses attached to the cell surface. We found very
low amounts of viruses that were attached to the cells even after 4 h of incubation,
indicating a weak attachment of HIV-1 to polarized trophoblastic cells. Since internalized
viruses can be detected as early as 5 min after infection at 37°C, our data thus indicate that
HIV-1 is rapidly internalized in polarized trophoblasts.
We next addressed whether virus infection can still be observed independently of gp120
and gp41. To answer this question, polarized JAR cells were first exposed to increasing
doses of reporter viruses pseudotyped with SM-WT Env for 24 h at 37°C. Subsequently,
TNF-α was added for 24 h at 37°C to promote viral gene expression. As expected and in
agreement with previous observations (62), we found that SM-WT viruses were able to
infect the trophoblastic cell line JAR in a dose-dependent fashion (Fig. 4A). In this assay,
the TNF-α-mediated reporter gene activity was increased by 37- to 46-fold when compared
to unstimulated infected polarized JAR cells, thus implying robust HIV-1 LTR-driven gene
expression in these cells. Importantly, this infection was blocked by the presence of the
anti-retroviral drug AZT, indicating that reverse transcription has indeed occurred in
trophoblasts upon HIV-1 infection. Next, polarized JAR cells were exposed to SM-570R
pseudotyped and NL4-3∆Env viruses in escalating doses. Surprisingly, the Env-mutated
and -deficient viruses were both found to infect JAR cells and at an even higher level than
wild type viruses (Figs. 4B and 4C). Importantly, virus infection was inhibited by AZT,
thus supporting the notion of true viral infection. On the other hand, no LTR-driven
luciferase activity could be detected in the absence or presence of TNF-α when Jurkat cells
were inoculated with NL4-3∆Env virions in escalating doses ranging from 1 ng to 150 ng
of p24 (Fig. 4D). We also tested a high dose of SM-570R pseudotypes in Jurkat cells (i.e.,
500 ng of p24). The reason for using such a high viral concentration was to illustrate the
complete inability of this mutant virus to infect Jurkat cells. As a comparison, when Jurkat
209
cells were exposed to this high amount of viruses but this time using SM-WT pseudotyped
virions, a 13-fold increase in LTR-driven reporter gene activity was detected over
unstimulated infected Jurkat cells (data not shown). In summary, the important point made
is that Jurkat cells are not permissive to infection with HIV-1 particles that are either
fusion-defective or Env-deficient, which is in sharp contrast to what is seen in polarized
trophoblasts.
Experiments performed with another choriocarcinoma cell line, i.e. JEG-3, confirmed that
infection of human trophoblastic cells can be achieved in a gp120/gp41-independent
manner (Fig. 5). It should be noted that TNF-α-mediated induction of HIV-1 transcriptional
activity was lower in JEG-3 compared to JAR cells, which is in agreement with our
previous observations (62).
2.3.2 Env-mutated and -deficient HIV-1 can access the cytoplasm of
polarized JAR cells
The distribution of HIV-1 within vesicular and cytosolic compartments was assessed in
polarized JAR cells because productive HIV-1 infection has been proposed to result from
the release of p24 within the cytosol (37). Polarized JAR cells were exposed to the tested
virus preparations for 4 h at 37°C. The cells were then trypsinized, washed and the levels of
viruses present in the cytosolic and vesicular fractions were measured. First, to ensure that
the technical procedure is valid and does not result in cross contamination of either fraction,
the amounts of viruses present in the cytosolic and vesicular fractions were measured in
polarized JAR cells exposed to HXB-2 pseudotypes for 30 min. Indeed, at this time point,
HIV-1 has not yet accessed the cytoplasm and is therefore solely located within the
endosomal compartments. As we previously published using this technical strategy (62), we
found that at 30 min post-infection, the viral material was only located within the vesicular
fraction of the cells (data not shown), thus confirming the appropriateness of the strategy
used. VSV-G pseudotypes were used also as positive controls for the assay. The rationale
being that although VSV-G pseudotypes enter cells through endocytosis, there is a rapid
shift from the endocytic machinery to the cytoplasm (49). In agreement with this statement,
we found that VSV-G pseudotypes were predominantly located within the cytosolic
210
fraction of polarized JAR cells (Fig. 6). Next, subcellular distribution of internalized viral
particles was measured in JAR cells exposed for 4 h to SM-WT pseudotyped viral particles
or NL4-3 WT virions. We found that 37% and 58% of the total internalized p24 content
were located in the cytosplasm of polarized JAR cells upon infection with SM-WT
pseudotyped and NL4-3 viruses, respectively. Importantly, infection with SM-570R and
NL4-3∆Env viruses resulted respectively in 37% and 39% of the total intracellular p24
being cytosolic. Therefore, fusion-incompetent and Env-deficient viruses were found to
access the cytoplasm of polarized trophoblastic cells with efficiencies comparable to that of
wild type viruses.
An alternative strategy was used to confirm the capacity of HIV-1 to gain access to the
cytoplasm through a gp120- and gp41-independent process. The fluorescence resonance
energy transfer (FRET)-based HIV-1 fusion assay exploits the incorporation of βlactamase-Vpr chimeric proteins inside progeny viruses and their subsequent release into
the cytoplasm of target cells as a marker of fusion. The delivery of this fusion protein into
the cytoplasm of the host cell is monitored by the enzymatic cleavage of the CCF2-AM
dye, a fluorescent substrate of β-lactamase (βlaM) that is loaded into the target cells (12,
13). The results of three independent experiments for this assay in polarized JAR cells are
illustrated in Table 1. Infection with wild type viruses resulted in βlaM-mediated cleavages
ranging from 2.92% to 10.70% and 1.2% to 12% upon infection with NL4-3 and SM-WT,
respectively, when compared to mock-infected cells. βlaM-mediated cleavages ranged from
7.98% to 11.7% and 4.6 to 19.33% when infection was allowed to proceed with NL43∆Env and SM-570R viruses, respectively. VSV-G pseudotypes on the other hand led to
the highest values of βlaM-mediated cleavages ranging from 25.08% to 30.10%. These data
are in agreement with the cell fractionation assay performed above. Hence, in cells such as
polarized trophoblasts, where infection rates are lower than in CD4+ T lymphocytes, we do
not expect to see high βlaM-mediated CCF2/AM cleavage values. It is important to specify
that while HIV-1 is internalized primarily by endocytosis in polarized trophoblastic cells
(61), CCF2-AM is cytoplasmic and does not reach these compartments (12). Therefore, in
trophoblastic cells, βlaM-mediated cleavage of CCF2-AM occurs when HIV-1 is gaining
access to the cytoplasm upon escaping the endosomal compartments.
211
2.3.3 Fusion-incompetent and Env-deficient viruses can integrate within
the genome of polarized trophoblasts
The presence of integrated viral DNA was next assessed in polarized trophoblastic cells
upon infection with fusion-incompetent and Env-deficient viruses using a previously
reported real-time PCR test (57). First, as a positive control for this real-time PCR assay,
viral integration of VSV-G pseudotyped viruses was quantified upon infection of polarized
JAR cells. As expected, we found that the number of integrated viral DNA copies obtained
upon infection with VSV-G was much higher than when wild type HIV-1 was used (Fig.
7A). Next, integration levels were compared between wild type HIV-1 particles vs fusiondefective or Env-deficient viruses. High quantities of integrated HIV-1 DNA copies were
detected in polarized trophoblasts upon infection with SM-WT, agreeing with the notion of
true HIV-1 infection in these cells. Importantly, the number of viral DNA copies obtained
upon infection with SM-570R and NL4-3∆Env viruses was comparable to the ones
observed when using wild type HIV-1 virions. We next tested viral integration using Jurkat
cells as controls. Although integrated provirus was observed upon infection of Jurkat with
SM-WT, none was detected upon infection with SM-570R or NL4-3∆Env viruses (data not
shown).
The experiments conducted so far in this study were done using viral preparations produced
in human embryonic kidney 293T cells. An important question arises in this context.
Indeed, is the Env-independent virus infection of trophoblasts related to unique fusogenic
properties derived from 293T cells (virus producer cells) that would be in turn acquired by
HIV-1 upon budding, or could this phenomenon be also seen when using viruses produced
in more physiological cell types? To answer this important question, fully competent R5
(i.e., JR-FL) and X4 (i.e., NL4-3) viruses were harvested upon infection of peripheral blood
mononuclear cells (PBMCs) and were used to infect polarized trophoblasts in the presence
or absence of T-20 before assessing the amount of integrated viral DNA copies. In
agreement with our previous data, we found that T-20 had no impact on the levels of
integrated viral DNA copies upon infection of polarized trophoblasts with NL4-3 and JRCSF produced in PBMCs (Fig. 7B). In a control experiment, integration of NL4-3 particles
in Jurkat cells was reduced by 75% upon a treatment with T-20 (data not shown).
212
2.3.4 HIV-1 internalization in polarized trophoblasts is mediated at least
partly through HSPGs
Since entry of HIV-1 into polarized trophoblastic cells is CD4-, gp120- and gp41independent, we next investigated how this event could occur. HSPGs have been suggested
as putative HIV-1 attachment/entry receptors based on the demonstration that heparinase
treatment, which removes all cell surface heparan sulfate chains, diminishes HIV-1
infection of HeLa-CD4 epithelial cells and monocyte-derived macrophages (43, 52). We
first tested the effect of heparin with the aim at blocking interactions between HIV-1 and
heparan sulfate at the cell surface. Heparin strongly decreased entry of the two strains of
HIV-1 tested (Figs. 8A and 8B). In order to verify whether the effect induced by heparin
was indeed related to receptor inhibition and not due to a steric hindrance phenomenon
related to heparin, polarized JAR cells were treated with heparinase to remove heparan
sulfate from the cell surface of polarized JAR cells before the cells were exposed to Ada-M
or HXB-2 pseudotypes. A decrease in virus internalization was observed upon treatment
with heparinase (Figs. 8C and 8D). Moreover, internalization of NL4-3∆Env viruses was
also diminished upon a pre-treatment either with heparin (Fig. 8E) or heparinase (Fig. 8F).
2.4 Discussion
This paper addressed the early steps of HIV-1 replicative cycle in polarized trophoblasts, a
cell type considered as a portal of entry for in utero vertical transmission of this retrovirus.
We used different technical strategies to demonstrate that the process of virus infection
proceeds through a gp120/CD4-independent mechanism: i) a blocking anti-CD4 antibody
and soluble CD4; ii) the fusion inhibitor T-20; iii) fusion-incompetent viruses (i.e., SM570R); and iv) viral particles lacking both gp120 and gp41 Env glycoproteins (i.e., NL43∆Env). All of these approaches demonstrated that trophoblastic cells can be infected by
viruses lacking functional Env glycoproteins. Moreover, three important elements in this
paper are essential for making this determination. First, we have shown that gp120/gp41deficient viruses can access to the cell cytoplasm upon virus internalization. It is important
to point out that endosome inhibitors abolish infection of trophoblasts with such mutant
viruses (61, 64), implying that HIV-1 Env-deficient infection like wild type viruses in these
213
cells is endocytic in nature. Based on our current data, we conclude that HIV-1 endosomal
escape occurs in trophoblastic cells through a mechanism that is independent of the viral
Env glycoproteins. Second, virus gene expression upon infection with wild type and Envdeficient viral particles was inhibited by the presence of AZT. This indicates that reverse
transcription readily occurs when infection is performed with Env-deficient viruses. Third,
integrated viral DNA is detected in cells inoculated with gp120/gp41-deficient viruses,
supporting the concept that Env-deficient viral particles efficiently complete the early
events of virus life cycle. Importantly, integration was seen when using viruses produced
not only in 293T cells but also in physiological producer cells such as PBMCs. This fact
brings great credibility to the biological relevance of our findings. Given that the
cytoplasmic delivery of viral material, reverse transcription (controlled by AZT) and viral
DNA integration are potent markers of true HIV-1 infection in CD4+ T cells and
considering that these various events are observed in polarized trophoblasts following
exposure to Env-deficient viruses at levels comparable to wild type virions, we conclude
that the process of HIV-1 internalization leading to infection of polarized trophoblastic cells
is independent of the normal interactions between CD4 and coreceptors with gp120.
It has been suggested that the natural presence of certain cytokines (e.g. TNF-α) during
pregnancy in the vicinity of trophoblastic cells might create favorable conditions leading to
vertical transmission of this retrovirus (62). The expression of these cytokines is highly
regulated according to the stage of placental development and it has been postulated that
windows of opportunity are transiently created for the induction of viral expression by
extracellular factors in trophoblasts (42, 62, 67). We found that the presence of TNF-α was
required to promote viral gene expression of Env-deficient viruses in polarized
trophoblastic cells. Under these conditions, the levels of viral expression achieved were
comparable to, if not higher than when wild type viruses were used instead. Hence, we may
conclude that while infection with Env-deficient HIV-1 particles is low, it is nonetheless as
equally effective as with wild type viruses.
Infectivity experiments with HIV-1 are in most cases carried out in human cells that are
highly susceptible to HIV-1 infection due to expression of detectable levels of CD4 and
214
appropriate chemokine coreceptors (i.e., CXCR4 or CCR5), which is not the case in
trophoblasts (28, 42, 68). Because of this, these cells display a weak susceptibility to HIV-1
infection and, as a consequence, higher quantities of viruses are required to detect virus
infection in such cells. In keeping with this, previous published studies with cells that
express no or very little CD4 (e.g. macrophages, astrocytes and epithelial cells) have been
performed with amounts of viruses that exceeds what is normally used with CD4+ T
lymphocytes. For example, in several published reports the process of virus entry inside
such cell types was monitored upon exposure to a viral input ranging from 50 to 450 ng of
p24 (10, 15, 35, 38, 46). In the present study, HIV-1 infection was achieved with a viral
input as little as 10 ng of p24 per million of polarized JAR cells. This being said, it is
important to point out that viruses are constantly produced under natural conditions and
cells are thus continuously exposed to both cell-free and cell-associated viruses, which is
not the case under in vitro studies. Moreover, viral loads are always measured in peripheral
blood. It is possible that virus concentrations might be different in some specific tissues
such as the placenta. Indeed, as previously described during pregnancy, a complex cytokine
network is present at the maternal-fetal interface in order to support normal growth and
development of the placenta and fetus (51). It has been shown that the period around
parturition is associated with increased production of proinflammatory mediators by
gestational tissues. Therefore, viral loads can fluctuate in such a microenvironment due to
temporal changes of the levels of cytokines and it is possible that viral loads in the placental
environment can be more important at a specific time point compared to what is usually
found in peripheral blood. Although the susceptibility of polarized trophoblasts to HIV-1
infection is less than that of CD4+ T cells (64), the importance of these cells in vertical
transmission of HIV-1 is provided by the fact that the virus is detected in trophoblasts in
both early and term placentas (22, 34, 69). This suggests that viral loads that are seen in
HIV-1-infected individuals are sufficient to lead to infection of trophoblasts under natural
conditions. Based on theses notions, we are confident that our data represent an essential
starting point for a better comprehension of such complex in vivo process.
Internalization of HIV-1 through a process not relying on gp120/CD4 interactions has been
demonstrated to occur in other cell types (37). However the great novelty of our findings
215
resides in the fact that, contrary to most of these cell types, HIV-1 gp120/gp41-independent
entry within trophoblasts results in virus gene expression. In support of these findings, it
was reported that HIV-1 can productively infect several epithelial cell lines, with low but
significant efficiencies in a CD4- and Env-independent process (15, 46). On the other hand,
HIV-1 Env-independent infection of CD4+ T cells has been documented (15). Of note, these
latter data are surprising for two reasons. First, it was shown that internalization of Envdeficient viruses in HeLa-CD4 and Jurkat cells results in viral particles located exclusively
within the vesicular endosome fraction. Second, we and others have observed that infection
of Jurkat cells with Env-deficient viruses is not productive (this report and (37, 54)).
Therefore, Env-independent infection of target cells suggests an alternative pathway for
HIV-1 transmission that would be of importance in epithelial cells.
We also provide evidence that heparin and heparinase significantly reduced viral uptake in
polarized trophoblastic cells, implying that HSPGs play an important role in mediating
virus-cell interactions leading to a rapid and effective entry process. Moreover,
internalization of Env-deficient viruses was also affected by these treatments, which means
that HSPGs-mediated interactions between the viral entity and trophoblasts do not involve
virus-encoded gp120 and gp41. Supporting the notion that HSPGs may be involved in HIV1 trophoblast infection in vivo, syndecan-1 is expressed throughout pregnancy solely in the
syncytiotrophoblasts, while syndecan-2, -4 and glypican-1 are expressed in villous
cytotrophoblasts and extravillous cytotrophoblasts as well as in the syncytiotrophoblasts
(19). Moreover, heparan sulfate within HSPGs are linear, polysulfated and, thereby, highly
negatively charged GAG polysaccharides and their binding to a wide variety of ligands is
largely dependent on ionic interactions (5). This notion fully agrees with the observation
that although HIV-1 internalization is extremely rapid, binding of HIV-1 to trophoblasts is
weak (62).
The fact that HIV-1 uses unusual entry pathways or attachment molecules has been
documented in various cell types, albeit gp120 and gp41 are still required in these other
cells. Indeed, although some cells express low levels of CD4, CCR5 and CXCR4, they are
still susceptible to HIV-1 infection. For instance, SDF-1α, RANTES and MIP-1α/β do not
216
prevent HIV-1 entry into brain microvascular endothelial cells (BMVECs), which are CD4negative (1, 6). Similarly, in astrocytes, HIV-1 entry occurs in a CD4-, CCR5- and CXCR4independent fashion by receptor-mediated endocytosis of the human mannose receptor (10,
35). Moreover, there is now compelling evidence that HIV-1 infection of CD4-negative
cells such as epithelial cells is occurring via attachment to galactosyl ceramide (GalCer)
(25), while HSPGs serve as the main attachment receptor for HIV-1 on human umbilical
vein endothelial cells and macrophages (7, 52).
On the other hand, neither heparin nor heparinase completely blocked viral uptake in
trophoblasts, hence suggesting that other types of receptors may act concomitantly for HIV1 internalization in polarized trophoblastic cells. In this regard, it has been shown that
transcytosis of HIV-1 across the polarized trophoblastic cell line BeWo can be blocked by
antibodies to GalCer (31). In addition, several putative alternate HIV-1 receptors,
recognized to act as such on other cell types, are present on the surface of trophoblasts.
These include C-type lectins such as the mannose receptor and preliminary studies
conducted in our laboratory indicate that various sugars and glycolipids can partly block
internalization of HIV-1 in polarized trophoblastic cells (unpublished observations). Further
experiments are warranted to illustrate their biological significance. The fact that HIV-1
uses several attachment factors distinct from CD4/CCR5/CXCR4 on a given cell type is not
unique to trophoblasts. Indeed, HSPGs, C-type lectins such as DC-SIGN or the mannose
receptor as well as the Fc or complement receptors can all be used by HIV-1 for entry into
macrophages and dendritic cells (27, 45, 52, 58). Thus, HIV-1 is now recognized to use
diverse and multiple attachment receptors (other than CD4, CXCR4 and CCR5) on a given
cell type, not only that but also, these attachments factors will differ between different cell
types. Finally, it has been hypothesized that vertical transmission of HIV-1 may be favored
by the presence of DC-SIGN/DC-SIGNR-expressing cells within the placental environment
(56). However, this property would apply to transmission via micro breaches because these
attachment receptors are expressed in maternal macrophages, placental capillaries and
Hofbauer cells, but not in trophoblastic cells (56).
217
The precise mechanism through which HIV-1 can reach the cytoplasm and integrate within
the host chromatin of polarized trophoblasts is still undefined. However, it is important to
recall that HIV-1 infection of trophoblasts requires a transit via the endosomal
compartments (61). In this context, HIV-1 must escape the endosomes to reach the
cytoplasm in trophoblasts. On the other hand, it is well documented that HIV-1 carries a
lipid membrane and acquires a wide array of host cell proteins upon budding (reviewed in
(11)). Based on this information, two scenarios can be proposed to explain how HIV-1 can
escape the deleterious endosomal machinery. First, it can be proposed that HIV-1 has
evolved to exploit the endosomal hydrolases to escape into the cytoplasm, which represents
a more favorable environment for the virus. However, this hypothesis is not supported by
some recent data (64). Alternatively, HIV-1 might undergo fusion within the endosomes via
yet to be defined interactions between virus-anchored host proteins and endosomal proteins
within trophoblasts. It is recognized that HIV-1 infection from the endosomes is possible in
macrophages, lymphocytic cells and HeLa cells when viral particles are spared from
degradation (24, 54). Moreover, images of HIV-1 particles internalized in endocytic
vesicles and undergoing fusion with endosomal membrane have been observed in
macrophages and trophoblastic cells (38, 47). Interestingly, a retrograde pathway was
discovered whereby molecules, such as MCH-II and MP6R, return from the internal
vesicles to other cellular destination. It is thought that protein relocation within the
endosomes requires fusion between its membrane subcompartments – the so-called back
fusion event (14, 29, 40, 44). The cellular machinery involved in this process is currently
unknown. It is tempting to speculate that similar mechanisms are in action that would allow
virions to escape from the endosomal compartments in polarized trophoblastic cells.
Experiments are currently in progress to address this possibility but it is clear that defining
how HIV-1 can escape from the endosomes in polarized trophoblasts represent a unique
opportunity to unravel the cellular machinery controlling intra-endosomal fusion. Indeed,
HIV-1 has been a powerful tool in the past to elucidate crucial cell biology issues such as
the involvement of Hrs in endosomal sorting (reviewed in (16)).
In summary, the data presented in this study further support the notion that infection of
polarized trophoblastic cells by HIV-1 is fundamentally different from what is known for
218
CD4+ T lymphocytes. It was previously established that HIV-1 infection in human
trophoblasts relies heavily on the endosomes (61). Moreover, HIV-1 binding to trophoblasts
is weak but virus uptake by these cells is extremely rapid (starting within less than 5 min)
(62). We now provide key information on the early events associated with HIV-1 life cycle
in polarized human trophoblasts. Indeed, our experiments illustrate that HIV-1 infection
occurs independently of gp120 and gp41 whereas HSPGs serve as virus attachment
receptors on trophoblasts. Based on these observations, our current model proposes that
HIV-1 interacts with trophoblasts via weak interactions such as HSPG-mediated cell
adsorption. This process leads to a rapid and constitutive endocytosis of virions. Infection
ensues in the absence of the viral Env glycoproteins gp120 and gp41 through endosomal
escape and access to the cytoplasm. In the future, it will be of prime importance to define
how HIV-1 escapes the endosomal compartments to more fully understand the process of
HIV-1 infection in trophoblasts.
2.5
Acknowledgements
We express our appreciation to Sylvie Méthot for editorial assistance. This study was
supported by a grant to M.J.T. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR)
HIV/AIDS Initiative (HOP-67259). This work was performed by G.V. in partial fulfillment
of her Ph.D. Degree in the Program of Microbiology-Immunology, Faculty of Medicine,
Laval University. G.V. and S.G. are the recipient of a CIHR Doctoral Research Award from
the HIV/AIDS Research Program and M.J.T. holds a Tier 1 Canada Research Chair in
Human Immuno-Retrovirology.
219
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Section 3
Figure legends
Fig. 1. HIV-1 infection of polarized trophoblasts is independent of CD4. Jurkat cells were
pre-treated with PBS (vehicle), an isotype-matched irrelevant antibody (control
antibody/IgG2a) or a blocking anti-CD4 antibody (SIM.2) before exposure to reporter
viruses pseudotyped with SM-WT Env (panel A) for 24 h at 37°C. In some experiments,
polarized JAR cells were pretreated first with PBS (vehicle), the control antibody, or SIM.2
and then exposed to Ada-M (panel B) or HXB-2 (panel C) pseudotypes for 24 h at 37°C.
The cells were then either left unstimulated or stimulated for 24 h with TNF-α (10 ng/ml).
Viral infection was monitored by measuring luciferase activity in each cell lysate. Values
from the luminometer are expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed
as fold increase ± S.D. of treated cells over mock-infected cells without stimulation and are
representative of three independent experiments.
Fig. 2. The fusion inhibitor T-20 does not inhibit HIV-1 infection of polarized JAR cells.
Polarized JAR cells were exposed to Ada-M (panel A) or HXB-2 (panel B) pseudotyped
reporter viruses in the presence of the indicated concentrations of T-20 for 24 h at 37°C. In
some experiments, Jurkat cells were exposed to wild type NL4-3 viruses (panel C) in the
absence or presence of 1.0 μg/ml of T-20 for 24 h at 37°C. Cells were then either left
untreated or stimulated for 24 h with TNF-α (10 ng/ml) together with a second dose of T20. For cells infected with reporter viruses, luciferase activity was monitored in each cell
lysate. Values from the luminometer are expressed as relative light units (RLU). For Jurkat
cells infected with fully competent viruses (i.e., NL4-3), infection was evaluated by
estimating the amount of p24 in each cell lysate. Data shown are expressed as the
means ± S.D. of quadruplicate samples and are representative of three independent
experiments.
Fig. 3. Viral internalization in polarized trophoblasts occurs independently of
gp120/gp41. Polarized JAR cells were exposed to SM-WT pseudotyped (panel A), wild
type NL4-3 (panel B), SM-570R pseudotyped (panel C), or Env-deficient viruses (NL43∆Env) for the indicated time periods either at 4°C (to estimate binding) or 37°C (to
226
estimate internalization). The cells were then treated as described in Materials and Methods.
Viral binding and internalization were measured by evaluating the amount of p24 in each
cell lysate. Data shown are expressed as the means ± S.D. of triplicate samples and are
representative of three independent experiments.
Fig. 4. Viral infection in polarized trophoblasts occurs independently of gp120/gp41.
Polarized JAR cells were exposed to increasing concentrations of SM-WT pseudotyped
(panel A), SM-570R pseudotyped (panel B), or Env-deficient reporter viruses (NL4-3∆Env)
(panel C) in the absence or presence of AZT (10 µM) for 24 h at 37°C. In some
experiments, Jurkat cells (panel D) were exposed for 24 h at 37°C to SM-570R
pseudotyped (500 ng of p24) or Env-deficient viruses (NL4-3∆Env) (1, 10, 50 and 150 ng
of p24). The cells were then stimulated for 24 h with TNF-α (10 ng/ml). Luciferase activity
was monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are expressed as relative
light units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples
and are representative of three independent experiments.
Fig. 5. Trophoblastic JEG-3 cells are also infected through a gp120/gp41-dependent
mechanism. JEG-3 cells were exposed to Ada-M pseudotyped, HXB-2 pseudotyped, Envdeficient (NL4-3∆Env), SM-WT pseudotyped, or SM-570R pseudotyped reporter viruses
for 24 h at 37°C. The cells were then stimulated for 24 h with TNF-α (10 ng/ml).
Luciferase activity was monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are
expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of
quadruplicate samples and are representative of three independent experiments.
Fig. 6. Cytosolic release of p24 in polarized trophoblasts is comparable between wild type,
fusion-incompetent and Env-deficient viruses. Polarized JAR cells were exposed to SMWT pseudotyped, SM-570R pseudotyped, wild type NL4-3, Env-deficient pseudotyped
(NL4-3∆Env), or VSV-G pseudotyped viruses for 4 h at 37°C. The cells were then washed,
trypsinized and resuspended in a swelling buffer. The cells were next disrupted by Dounce
homogenization and p24 levels were evaluated in each cellular fraction (i.e., cytosolic and
vesicular). Data shown are expressed as the means ± S.D of the ratio of p24 present in the
227
cytosol or vesicles over the sum of p24 present in the two fractions. Data shown are
representative of three independent experiments.
Fig. 7. Fusion-incompetent and Env-deficient viruses undergo integration in the genome
of polarized trophoblasts. Polarized JAR were either left untreated or exposed to VSV-G
pseudotyped, SM-WT pseudotyped, SM-570R pseudotyped, or Env-deficient reporter
viruses (NL4-3∆Env) for 48 h at 37°C (panel A). Polarized JAR were either left uninfected
(mock) or exposed to fully competent viruses (i.e., NL4-3 or JR-CSF) that were produced
in PBMCs for 48 h at 37°C (panel B). Virus infection was performed either in the absence
or presence of the fusion inhibitor T-20. Total cellular DNA was isolated and real-time
PCR assays were conducted to quantify reverse transcribed and integrated HIV-1 specific
DNA. Data shown are expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples and are
representative of three independent experiments.
Fig. 8. HIV-1 internalization in polarized trophoblasts is reduced by heparin and
heparinase treatment. Polarized JAR cells were exposed to Ada-M pseudotyped (panel A),
HXB-2 pseudotyped (panel B), or NL4-3∆Env viruses (panel E) for 1 h at 37°C in the
absence or presence of increasing concentrations of heparin. In some experiments,
polarized JAR cells were first pretreated with increasing doses of heparinase before
exposure to Ada-M pseudotyped (panel C), HXB-2 pseudotyped (panel D), or NL4-3∆Env
viruses (panel F) for 1 h at 37°C. Cells were finally washed and lysed and HIV-1
internalization was assessed by evaluating the amount of p24 in each cell lysate. Data
shown are expressed as the means ± S.D. of triplicate samples and are representative of
three independent experiments.
228
Section 4
4.1 Table 1
Tables
229
Section 5
5.1 Figure 1
Figures
230
5.2 Figure 2
231
5.3 Figure 3
232
5.4 Figure 4
233
5.5 Figure 5
234
5.6 Figure 6
235
5.7 Figure 7
236
5.8 Figure 8
237
Chapitre 4. PARCOURS INTRACELLULAIRE DU
VIH-1 DANS LES TROPHOBLASTES
Section 1
Troisième article scientifique
1.1 Title page
1.1.1 Title
The endocytic host cell machinery plays a dominant role in the intracellular trafficking of
incoming HIV-1 in human placental trophoblasts.
1.1.2 Authors
Gaël Vidricaire, Michael Imbeault and Michel J. Tremblay.
1.1.3 Affiliation
Research Center in Infectious Diseases, CHUL Research Center, and Faculty of Medicine,
Laval University, Quebec, Canada.
1.1.4 Corresponding author
Mailing address:
Laboratory of Human Immuno-Retrovirology
Research Center in Infectious Diseases, RC709
CHUL Research Center
2705 Laurier Blvd.
Quebec (QC), Canada, G1V 4G2
Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2212
1.2 Résumé
La transmission verticale du VIH-1 est la première cause d’infection par ce rétrovirus chez
le nouveau-né. Dans cet article, nous décrivons pour la première fois qu’il existe, dans les
trophoblastes polarisés, un lien entre l’internalisation par endocytose du VIH-1 et
238
l’expression génique du virus. Pour clarifier l’association entre l’endocytose et le devenir
du VIH-1 dans les trophoblastes polarisés, nous avons suivi pas à pas, par microscopie
confocale, les mouvements du VIH-1 dans les compartiments endocytaires. Les virions sont
d’abord localisés dans les endosomes précoces, puis plus tard, ils se rendent aux endosomes
tardifs. Nous avons aussi détecté la présence du VIH-1 dans les endosomes de recyclage et
au pôle basolatéral des cellules. Nous avons observé, en utilisant des cellules indicatrices,
que le VIH-1 est recyclé et transcytosé. Ces résultats indiquent que le transport du VIH-1, à
la suite de son internalisation par les trophoblastes humains, est un processus complexe
requérant l’active participation de la machinerie endocytaire de la cellule-hôte.
1.3 Abstract
Vertical transmission of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is the primary
cause of infection by this retrovirus in infants. In this study, we report for the first time that
there is a correlation between endocytic uptake of HIV-1 and virus gene expression in
polarized trophoblasts. To shed light on the relationship between endocytosis and the fate of
HIV-1 in polarized trophoblasts, the step-by-step movements of HIV-1 within the endocytic
compartments were tracked by confocal imaging. Incoming virions were initially located in
early endosomes. As time progressed, virions accumulated in late endosomes. HIV-1 was
also found in apical recycling endosomes and at the basolateral pole. Experiments
performed with indicator cells revealed that HIV-1 is recycled and transcytosed. These data
indicate that the intracellular trafficking of HIV-1 upon entry into polarized human
trophoblasts is a complex process which requires the active participation of the endocytic
host cell machinery.
Section 2
2.1 Introduction
Worldwide, 3.2 million children under the age of 15 years are infected with human
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) (36). Mother-to-child transmission of HIV-1 is the
primary cause of infection with this retrovirus in children (36). Antiretroviral therapies
239
significantly reduce the incidence of vertical transmission (25). However, access to the
treatments currently available is extremely limited in developing countries. As a result,
initiatives to prevent mother-to-child transmission of HIV-1 are now aimed at developing
strategies that are readily available to women. In this context, it is well recognized that a
better understanding of how and when vertical transmission occurs is crucial.
The mechanism of in utero transmission of HIV-1 is poorly understood, but several lines of
evidence support direct implication of the placenta, which is composed of a double layer of
cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts. These cells separate the maternal and fetal blood
circulations and control fluxes between them. HIV-1 undergoes productive replication in
the placenta both in vitro and in vivo (2, 20, 39), and the permissiveness of trophoblasts to
infection by HIV-1 is an order of magnitude lower than that of CD4+ T lymphocytes, the
primary target of HIV-1 (26). It has been shown that HIV-1 may also transcytose across the
trophoblastic cell layer (15). Transcytosis is a process whereby virions (or molecules such
as immunoglobulin G [IgG]) are internalized by endocytosis at one pole of the cells, then
transported in a vesicular system, and released intact at the opposite pole. This process
occurs independently of virus replication but may take place simultaneously. It has been
postulated that following infection of trophoblasts and/or transcytosis across these cells,
HIV-1 is released from the basolateral pole of the trophoblasts (facing the fetal circulation),
leading to productive infection of the underlying fetal cells.
HIV-1 enters CD4+ T lymphocytes by fusion at the cell surface upon interaction between
the viral envelope glycoprotein gp120 and the primary cellular receptor CD4 and coreceptor
CXCR4 or CCR5 (33). The question of viral entry in trophoblasts is still a matter of debate,
since these cells express no or very little CD4, while expression of the HIV-1 coreceptors,
CXCR4 and CCR5, may decline from the first to the third trimester of pregnancy. Contrary
to what was assumed, evidence that HIV-1 enters massively into trophoblasts,
predominantly via endocytosis, has been published. These cells were also found to sustain
virus production (37). Whether a functional correlation exists between endocytic uptake and
infection in trophoblasts is an important question that remains to be answered.
240
Interestingly, trophoblasts form a polarized epithelium-like monolayer in vivo. One of the
consequences of cell polarity is the presence of polarized (apical and basolateral) endocytic
pathways, each of which uses a complex succession of intracellular compartments (which
include the early, late, and recycling endosomes). These pathways lead to recycling,
degradation, and transcytosis of internalized molecules on an ongoing basis. Given that
HIV-1 is thought to enter polarized trophoblasts by endocytosis, upon viral entry, incoming
virions will be trapped within endocytic compartments. Therefore, if HIV-1 takes different
endocytic pathways, as is the case for internalized molecules, the incoming viral particles
may have different fates. We hypothesize that these fates would be as follows. First, part of
the internalized virions is degraded in the lysosomal machinery. Second, infection may be
associated with early transit through the endosomes. Two other endocytic processes, which
are independent of virus replication, are also likely to occur: transcytosis of virions to the
basolateral pole and recycling to the apical pole. As discussed previously (15), transcytosis
has already been suggested. However, recycling of HIV-1 has never been described
previously. Recycling of HIV-1 would be the process whereby, upon internalizing HIV-1,
the cells would rapidly return part of these internalized virions to the place from which they
initially came, the apical pole. This is an interesting concept, because recycling may be a
mechanism through which vertical transmission of HIV-1 may be avoided or reduced by the
cells. Based on these avenues, knowing where HIV-1 particles are located within the
intracellular vesicles upon internalization becomes crucial for (i) defining the pathway
associated with the infectious cycle of HIV-1 in trophoblasts and (ii) unveiling the early
steps of the HIV-1 life cycle associated with transcytosis and recycling.
In this paper, we provide the first evidence that there is a functional link between the
presence of HIV-1 within the endosomes and infection of trophoblasts. In addition, we
demonstrate that internalized HIV-1 particles are both transcytosed to the basolateral pole
and recycled to the apical pole upon entry into these cells. By use of confocal imaging,
incoming virions were found broadly distributed within the different endocytic
compartments in polarized trophoblasts. The endocytic host cell machinery thus participates
actively in HIV-1 replication in polarized human trophoblasts, fully supporting the notion
that HIV-1, upon internalization by endocytosis, has several possible fates, including
241
degradation, infection, recycling, and transcytosis in these cells. The clinical relevance of
the data presented is high, since trophoblasts are believed to play a pivotal role in motherto-infant transmission of this deadly retrovirus.
2.2 Material and Methods
2.2.1 Cells
The JAR cell line was obtained from the American Type Culture Collection (Manassas,
Va.). 293T cells were provided by W. C. Greene (J. Gladstone Institutes, San Francisco,
Calif.). The LuSIV reporter cell line, kindly provided by J. E. Clements (The John Hopkins
University School of Medicine, Baltimore, Md.), was derived from the CEMx174 parental
cell line and carries the luciferase reporter gene under the control of the SIVmac239 long
terminal repeat. All three cell lines were maintained as previously described (37).
2.2.2 Molecular constructs and preparation of virus stocks
pNL4-3 is a full-length infectious molecular clone of HIV-1. The NL4-3-Luc E–R+ vector
was constructed by inserting a frameshift mutation near the env gene and inserting the
firefly luciferase reporter gene into the nef gene (4, 12). Both constructs were obtained
through the AIDS Repository Reagent Program (Rockville, Md.). The pcDNA-1/Ampbased expression vector coding for the HIV-1 Ada-M (M-tropic) full-length envelope
protein was generously provided by N. R. Landau (The Salk Institute for Biological Studies,
La Jolla, Calif.). Viruses were produced by calcium phosphate transfection of 293T cells, as
described previously (8, 10, 37).
2.2.3 Infection assays
JAR cells were seeded in 24-well cell culture inserts containing a 0.4-µM-pore-size
polyethylene terephthalate track-etched membrane (Becton Dickinson Labware, Franklin
Lakes, N.J.). The cells were grown to complete confluence and polarized for 4 days.
Transepithelial electric resistance (TEER) was measured by using a Millipore (Billerica,
Mass.) instrument. The polarized JAR cells were pretreated at 37°C for 30 min with
bafilomycin A1 (0.1 µM) or NH4Cl (10 mM). HIV-1 particles pseudotyped with Ada-M
242
envelope (250 ng of p24) were then added, and the cells were incubated at 37°C for 24 h. At
this point, tumor necrosis factor alpha (10 ng/ml) (generously provided by P. Naccache,
CHUL Research Center, Quebec, Quebec, Canada) was added for 24 h to induce virus gene
expression (37). Finally, luciferase activity was monitored in cell lysates as described
previously (5).
2.2.4 Viral entry and fluorescence labeling
JAR cells were seeded in 24-well cell culture inserts as described above. HIV-1 particles
pseudotyped with Ada-M envelope (250 ng of p24) were added in the upper chamber for 5
min to 24 h at 37°C. To remove all noninternalized viral particles, the cells were then acidtreated for 1 min (0.5 M NaCl, 1% acetic acid) and rapidly washed three times with cold
phosphate-buffered saline (PBS). Cells were fixed with 2% paraformaldehyde for 20 min,
permeabilized for 4 min with 0.3% Triton X-100, and blocked with 1% bovine serum
albumin for 10 min. At this point, JAR cells were incubated for 1 h on ice with primary
antibodies (diluted in PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.03% Triton X-100)
and subsequently with fluorescently conjugated secondary antibodies (diluted in the same
way as the primary antibody). The membranes were peeled off from the transwells and
placed on a slide, with the apical side facing up. A drop of 90% glycerol was added on the
membrane, and a glass coverslip was placed on top.
2.2.5 Entry assay with bafilomycin A1
JAR cells were seeded in 24-well cell culture inserts (as described above). The polarized
JAR cells were pretreated at 37°C for 30 min with 95% ethanol (vehicle) or bafilomycin A1
(0.1 µM). HIV-1 particles pseudotyped with Ada-M envelope (250 ng of p24) were then
added, and the cells were incubated at 37°C for 4 h. The cells were washed, fixed, and
stained as described in the preceding section.
2.2.6 Recycling and transcytosis assays
JAR cells were seeded in 24-well cell culture inserts as described above. NL4-3 (400 ng of
p24) was added in the upper chamber for 5 min to 4 h at 37°C or for 1 h at 4°C. Each time
243
point was done in triplicate. The medium was removed from the cells, and trypsin was
added for 8 min at 4°C (this treatment did not affect the integrity of the cell barrier). The
cells were washed with cold PBS three times on ice with mild agitation. The transwells were
placed in new 24-well plates, fresh Dulbecco's modified Eagle medium was added to the
lower and upper chambers, and the cells were incubated at 37°C for 3.5 h to allow recycling
or transcytosis of internalized virions. At this point, the media in the upper and lower
chambers were collected. LuSIV cells were added to the collected media and grown for 6
days. Luciferase activity was monitored in the LuSIV cell lysates as described previously
(5).
2.2.7 Antibodies
Purified human anti-HIV-1 (from pooled sera of HIV-1-infected patients) was prepared in
our laboratory. Pooled sera from healthy individuals were used as controls (generously
provided by P. Naccache). The following reagents were also used in this work: rhodaminephalloidin, mouse anti-golgin-97 (Molecular Probes, Eugene, Oreg.), mouse anti-ZO-1,
mouse anti-EEA1 (BD Biosciences, Mississauga, Ontario, Canada), mouse antiCD63/tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)-conjugated Lamp3 (Santa Cruz
Biotechnologies, Santa Cruz, Calif.), rabbit anti-Rab11 (Zymed Laboratories Inc, South San
Francisco, Calif.), and mouse anti-PDI (Stressgen Biotechnologies, Victoria, British
Columbia, Canada). The secondary antibodies were an Alexa 488-conjugated goat antihuman antibody, Texas Red goat-anti mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 633-conjugated goat
anti-rabbit IgG (Molecular Probes), and Cy5-conjugated goat anti-mouse IgG (BioCan
Scientific Inc., Mississauga, Ontario, Canada).
2.2.8 Confocal laser scanning, colocalization analysis and digital image
preparation
Samples were analyzed by using a Fluoview FV300 confocal laser scanning biological
microscope (Olympus America, Melville, N.Y.). Data were captured by using a 60x oil
objective. Slides were scanned at 1-µm intervals and at a dimension of 512 by 512 pixels
with a x3 zoom magnification. For a given time course, all the settings on the microscope
244
were kept constant for all the samples. Each experiment was repeated five times, and for
each individual experiment, all the samples were scanned at three different locations.
Colocalization analyses and statistics were generated using the MetaMorph Offline software
(version 6.1; Universal Imaging Corp., West Chester, Pa.). Digital images were produced
using the MetaMorph Offline software (version 6.1), Adobe Photoshop (version 8), and
Adobe Illustrator (version 9; Adobe Systems Inc., Ottawa, Ontario, Canada).
To calculate colocalization, the following sequential operations were performed by the
Metamorph software. The threshold was defined for each dye individually and applied to
each cell layer and at all time points of a time course. The mock-infected sample (also
labeled with anti-HIV-1) was used to define the background signal for HIV-1. Next, the
area of signals and the integration were calculated for both HIV-1 and the marker of interest
(EEA-1, CD63, or Rab11) sequentially for all the planes of a given stack (i.e., a time point).
The area of a signal corresponds to the total number of pixels present on a given plane (cell
layer). The integration corresponds to the total number of pixels multiplied by the average
of the signal on a particular plane. Finally, colocalization events were calculated based on
algorithms defined in the Metamorph software. Colocalization events are expressed as the
ratio of the integration of Ada-M to the integration of the marker of interest and vice versa.
The area of the signal, the integration, and the colocalization were calculated individually
for Ada-M and the marker of interest, sequentially for all the planes of a given stack over
the studied time course. Excel log files were generated to compile the calculations, and
graphs were plotted. The overlay panel is a superimposition of both labels. The
colocalization panel is a binary image corresponding to the simultaneous presence of both
signals at the same location.
2.3 Results
2.3.1 HIV-1 rapidly enters polarized trophoblasts
Experimental models for studying virus entry into, and infection of, epithelial cells include
primary cells. However, purification of primary trophoblasts is extremely difficult and
results in the loss of cell polarity (7). The human trophoblastic cell lines BeWo, JAR, and
245
JEG-3 offer an attractive alternative, since they exhibit many characteristics of the early
placenta (29). Moreover, they can form tight polarized barriers when cultured on permeable
supports (17). To more closely mimic the trophoblastic barrier in vivo, we used the cell line
JAR, which was grown for 4 days on permeable supports, leading to formation of a
polarized epithelium-like monolayer. Indeed, as monitored by confocal microscopy, they
formed a compact cell monolayer that expressed the tight junction marker ZO-1. Moreover,
they developed a TEER of 45 per cm2. JAR cells were chosen over BeWo and JEG-3 cells
because HIV-1 expression was higher in the former (37).
Following exposure to the macrophage-tropic HIV-1 strain Ada-M for 5 min to 12 h, the
intracellular behavior of HIV-1 in polarized human trophoblasts was visualized by confocal
microscopy. Purified polyclonal antibodies isolated from pooled human sera from HIV-1positive patients were used (34), followed by an Alexa 488-conjugated goat anti-human
antibody. The specificity of the signal was tested by incubating mock- and virus-infected
polarized JAR cells with pooled sera from uninfected healthy donors (data not shown). Via
actin staining (rhodamine-phalloidin), we clearly see that the cells are confluent and cover
the entire field of view (Fig. 1), confirming that the cells form a tight layer. Interestingly,
HIV-1 was found to enter the cells rapidly, since viruses were already detected 5 min after
exposure. The amount of viruses gradually increased to reach a peak by 4 h after entry. At 4
h, the amount of viral internalization was truly impressive and HIV-1 had penetrated into
virtually 100% of the cells. These data are perfectly in line with a previous study evaluating
the kinetics of HIV-1 entry by use of a p24 assay (37). We estimated that the number of
viral particles internalized by polarized trophoblasts corresponds to approximately 25% of
the initial viral inoculum added to these cells. Of note, similar results were obtained with a
T-tropic variant of HIV-1, NL4-3 (data not shown). Studies were also conducted with HIV1 virions loaded with an enhanced green fluorescent protein-Vpr fusion protein. The
intensity of the HIV-1-specific signal was much lower when this technical strategy was
used, probably because of the low number of Vpr molecules known to be inserted per single
mature virus (an average of 100 to 200). Moreover, different HIV-1 proteins are most likely
recognized by polyclonal anti-HIV-1 antibodies, a factor resulting in enhancement of HIV1-specific signal intensity. Therefore, the intracellular behavior of HIV-1 in polarized
246
human trophoblasts was visualized by using purified polyclonal antibodies isolated from
pooled human sera from HIV-1-positive patients.
2.3.2 Correlation between endocytic uptake and subsequent infection in
trophoblasts
If a correlation exists between HIV-1 endocytosis and infection of trophoblasts, then the
endosomes must play a pivotal role in this process. Therefore, blocking the function of the
endosomes would translate into a reduction of virus gene expression. To verify this
hypothesis, endosome inhibitors of two classes were tested: the inhibitor of vacuolar proton
ATPase bafilomycin A1 and the lysosomotropic weak base NH4Cl. Both drugs are known to
block vesicle acidification as well as endosomal and lysosomal degradation systems (1, 6).
Polarized JAR cells were inoculated with single-cycle reporter virus pseudotyped with the
Ada-M envelope. Of note, tumor necrosis factor alpha was added in our infection assays
because its presence is required to promote viral gene expression in trophoblasts (37). When
cells were pretreated with either bafilomycin A1 or NH4Cl, the HIV-1 promoter-driven gene
activity was nearly completely abolished (Fig. 2A and B). Moreover, both inhibitors acted
within a few hours of HIV-1 exposure to trophoblasts (data not shown). This implies that for
viral expression to ensue in trophoblasts, HIV-1 must first transit through the endosomes.
Therefore, a strict association between the presence of HIV-1 within the endocytic
compartments upon internalization and viral replication exists in polarized trophoblasts. To
ensure that the drugs did not act on the cells at the level of viral entry, JAR cells were
pretreated with bafilomycin A1 and then exposed to Ada-M particles for 4 h. The samples
were analyzed by confocal microscopy. We observed comparable amounts of staining for
HIV-1 particles in cells exposed or not to bafilomycin A1, implying that the drug does not
impact viral entry (Fig. 2C to E).
2.3.3 HIV-1 particles recycle to the apical pole and transcytose to the
basolateral pole
During transcytosis, it is presumed that fully infectious viruses are endocytosed by the cells
at the apical pole, transported within vesicles across the cells, and released intact from the
basolateral pole into the underlying medium. This process is independent of virus
247
replication. We reasoned that if such a process occurs, perhaps HIV-1 can also be released
from the apical end. More specifically, upon internalization of HIV-1, the cells could
rapidly not only send virions to the basolateral pole but also return a fraction of the
internalized viruses to the place from which they came initially—the apical pole. We called
this process recycling of HIV-1. To verify whether HIV-1 was indeed recycled and/or
transcytosed, polarized JAR cells were exposed to NL4-3 for 5 min to 2 h (for recycling) or
4 h (for transcytosis). As a control, the cells were exposed to HIV-1 for 1 h at 4°C.
Endocytosis is inhibited at this temperature such that viral internalization and fusion should
also be repressed. At this point, cells were treated with trypsin and extensively washed to
remove all noninternalized viral particles. This step is crucial to assess the recycling
process. The cells were incubated for another 3.5 h at 37°C to allow internalized virions
either to be returned to the apical pole (recycling) or to be transported across the cell layer
and released in the lower chamber (transcytosis). Since the total incubation period of JAR
cells with HIV-1 was short, a replication cycle of HIV-1 could not have been completed yet.
Therefore, virions that were collected in the upper or lower chambers could only be the
result of recycling or transcytosis, respectively. The amounts of virions released by the cells
were too small to be readily detected by a p24 test (detection limit, 50 pg/ml).
Consequently, the medium from the upper and lower chambers were collected and put in
contact with LuSIV indicator cells. These cells are susceptible to infection with very low
levels of HIV-1 (unpublished data). Fully competent viruses were released in the lower
chamber by the cells, implying transcytosis (Fig. 2F). Interestingly, we also observed that
fully infectious virus particles were returned to the upper chamber, i.e., the apical pole of
the cells, thus suggesting recycling of HIV-1 (Fig. 2G).
2.3.4 Monitoring the movements of HIV-1 within the endocytic
compartments
Defining exactly where HIV-1 is located within the endocytosis complex is crucial for
unveiling the early steps of HIV-1 replication in trophoblasts. The step-by-step movements
of HIV-1 within the endocytic compartments in polarized JAR cells were tracked by
confocal analyses. EEA-1 served as a marker of early endosomes, CD63 was used for late
endosomes, and Rab11 was used for recycling endosomes. To estimate the colocalization
248
events, a series of operations were performed with Metamorph software as described in
Materials and Methods.
2.3.5 Incoming HIV-1 partly colocalizes with early endosomes
On the basis of the calculations described in Materials and Methods, the relationship
between Ada-M and EEA-1 is presented in Fig. 3. Following a contact period of 5 min, 5 to
7% of the HIV-1-specific signal colocalized with EEA-1 at 2 to 4 µm (Fig. 3A). Within 15
min, the majority of the virions were located on the second and third cell layers, with 15 and
36%, respectively, of the internalized virions present on these cell layers colocalizing with
EEA-1. Of note, few virions migrated into the cells to reach 6 µm, where 60% of the signal
detected colocalized with EEA-1, but this may not be significant given the small amount of
HIV-1 that reached this layer at this time point. Moreover, between 4 and 7 µm, the signal
for Ada-M is not apparent on the graph because it is very weak and thus below the scale's
units. The virions then continued their path as the percentage of colocalization declined by
30 min following incubation with HIV-1. A small percentage of colocalization remained
because virions are continuously entering the cells. The distribution of EEA-1 was fairly
broad over the entire depth of the cell monolayer. However, its peak level was located at the
apex of the cells (3 to 4 µm). Where EEA-1 was most present (3 µm), the percentages of
colocalization of EEA-1 with Ada-M were between 0.5 and 3%. Digital images of the cells
at 3 µm following a 15-min exposure to HIV-1 are shown to provide a clear representation
of the colocalization events (Fig. 3E to H).
2.3.6 HIV-1 strongly colocalizes with late endosomes
Next, by determining the relationship between Ada-M and CD63, we investigated whether
HIV-1 can migrate to late endosomes. The percentages of colocalization between HIV-1
and CD63 progressively increased over the entire time course such that, as entry evolved,
HIV-1 steadily reached late endosomes and accumulated in these organelles (Fig. 4). By 4
h, most of the virions were located in CD63-expressing organelles: from 4 to 9 µm of the
cells' depth, 40, 55, 57, 66, 69, and 62% of the signal detected for Ada-M colocalized with
CD63, respectively. The frequency of colocalization events declined on deeper cell layers.
249
On the other hand, CD63 showed a fairly constant signal and broad distribution over the
entire depth of the cells. This being said, the highest signal value could be found at the apex
of the cells (4 to 6 µm). The highest percentages of colocalization of CD63 with Ada-M
were 4, 8, 13, and 47% upon exposure of polarized trophoblasts to HIV-1 for 5 min and 1,
2, and 4 h, respectively. This indicates that the late endosomes gradually became occupied
by incoming HIV-1.
2.3.7 HIV-1 colocalizes with the apical recycling endosomes
The possible location of HIV-1 in the apical recycling endosomes was also studied, by use
of Rab11 (Fig. 5). A small fraction of incoming virions reached the Rab11+ recycling
endosomes. The peak was seen after 1 h of exposure to HIV-1, and colocalization events
after that time point remained at 9 to 11% at the cell layers where most of the signal
associated with HIV-1 was present. The distribution of the signal for Rab11 was
concentrated over the first half of cells' depth, and its maximum was located at the apex of
the cells (4 to 5 µm). Where HIV-1 was most present (3 to 5 µm), the percentages of
colocalization of Rab11 with Ada-M were low at first: 1% after 5 min and 2 to 6% after 1 h
of incubation with HIV-1. However, these percentages reached 10% by 2 h and 11% by 4 h,
suggesting that recycling endosomes are also involved in the transit of HIV-1 in polarized
trophoblasts.
2.3.8 HIV-1 is predominantly located at the apex but also migrates to the
basolateral pole
If HIV-1 is transcytosed across the trophoblastic cell barrier to reach the basolateral pole,
then it can be argued that HIV-1 particles must be seen traveling from the apex of the cells
to the bottom. To test this hypothesis, infected polarized JAR cells were fixed and triple
labeled with anti-HIV-1, anti-ZO-1, and rhodamine-phalloidin. Confocal scanning was then
performed, and the Z-stages were set to ensure that the entire depth of the cell monolayer
was encompassed. The presence of HIV-1 was monitored over the entire stack of cell layers
over a 4-h time course. Figure 6 presents images of the cell layers corresponding to 3 µm
(Fig. 6A, E, I, and M), 4 µm (Fig. 6B, F, J, and N), the middle of the stack (Fig. 6C, G, K,
250
and O), and the bottom of the stack (Fig. 6D, H, L, and P). We found that after 5 min, HIV1 was located solely at the top of the cells (Fig. 6A to D). With time, viral entry
progressively increased and virions gradually moved deeper into the cells. Thirty minutes
after the initial contact, virions were present at the 4-µm layer (Fig. 6F), and after 2 h, some
were present at the 6-µm layer (Fig. 6K). Interestingly, a few virions had reached the
basolateral pole of the cells at 4 h following incubation with HIV-1 (Fig. 6P). The majority
of the internalized virions accumulated at the apex of the cells (the 3- to 4-µm area).
2.3.9 Quantification of the migration of HIV-1 in trophoblasts
In order to quantify the intracellular distribution of HIV-1 in polarized trophoblasts, the
signal intensities specific for HIV-1 and rhodamine-phalloidin were determined by
Metamorph software. The bar graphs in Fig. 7 illustrate the number of pixels for Ada-M at
30 min (Fig. 7A) or 4 h (Fig. 7C) postinfection. The actual numbers of pixels are provided
for both Ada-M and rhodamine-phalloidin (Fig. 7B and D). The data are vertically tiled in
order to match the physical appearance of a cell monolayer. The first layer of the stack
corresponds to the apex, while the last layer represents its bottom. The data indicate that
HIV-1 is located within the first six layers as early as 30 min following the initial virus
exposure. The majority of the internalized virions are present on the third layer. In
comparison, the number of internalized viruses is significantly increased at a later time point
(4 h). However, 85% of the virions remained within the first six layers of the cells, with the
highest number of virions located on the fourth layer. Fifteen percent of the virions moved
deeper, and a small fraction even reached the basolateral pole of the cells (Fig. 7D). The
data underscore the distribution of HIV-1 in polarized trophoblasts and demonstrate for the
first time the ability of HIV-1 to migrate across the entire depth of the cell layer.
2.4 Discussion
In this study, treatment with endosome inhibitors resulted in a significant reduction of HIV1 expression in polarized trophoblasts but did not affect viral entry. Several explanations
can be suggested to account for these findings. First, HIV-1 may require an acid pH for
fusion within the endosomes (as is the case, for instance, for vesicular stomatitis virus) in
251
trophoblasts. Alternatively, endosomal hydrolases may be required for HIV-1 to be released
into the cytoplasm. In either case, these data underscore that (i) a functional correlation
between the endocytic uptake of HIV-1 and subsequent trafficking leads to infection in
these cells and (ii) the mechanism through which HIV-1 escapes the endosomes to access
the cytoplasm is completely different from what is known for other cell types. Indeed, when
endosomal acidification is inhibited in epithelial HeLa CD4+ cells and T lymphocytes, viral
replication is increased. Under such conditions, the incoming virions are believed to be
spared from degradation (13, 14, 21, 30).
We do recognize that aside from infecting trophoblasts, part of the incoming virions might
be degraded within the lysosomal machinery. Interestingly, we found that HIV-1 may not
only be degraded but may also infect polarized trophoblasts and be transcytosed to the
basolateral pole, a process also documented by other scientists. We also observed that HIV1 was in part returned to the medium facing the apical pole upon its internalization, a
process we called recycling of HIV-1. Since the risks of in utero transmission of HIV-1 are
directly related to viremia, reducing the presence of HIV-1 within the placental cells would
therefore be associated with smaller chances of vertical transmission of HIV-1. Both
transcytosis and recycling of molecules involve the endocytic machinery, and as discussed,
viral expression in trophoblasts requires the active participation of the endosomes. It would
therefore appear that the endocytic machinery plays a critical role in the biology of HIV-1
in trophoblasts. The fact that incoming HIV-1 is present within several endocytic
compartments fully supports this notion.
Dissection of the endocytic pathway associated with viral entry and infection is the focus of
intense research. Previous reports have elegantly addressed the behavior of HIV-1 in CD4expressing HeLa cells, lymphocytes, and dendritic cells in relation to CD4 and the
coreceptors for HIV-1 (22, 23, 32, 35). However, data showing the progression of HIV-1 in
epithelial cells were still completely lacking. In this study, we addressed this key question in
polarized trophoblasts, a cell type thought to play a pivotal role in the vertical transmission
of HIV-1. We provide for the first time an accurate and broad representation of the route
taken by HIV-1 in polarized trophoblasts. In contrast to a previous study (24), we have
252
successfully grown JAR cells as a polarized tight monolayer. Indeed, for the time JAR cells
were grown in our assays, they (i) spread in a single plane, (ii) expressed the tight junction
marker ZO-1, and (iii) developed a TEER of 45 per cm2. The human trophoblastic cell line
BeWo can also form a tight, polarized monolayer when cultured in a two-chamber culture
system, an experimental strategy similar to that used in our experiments. As a comparison,
BeWo gives a TEER of 65
· cm2 (16). One reason that may explain the inability of
Mitchell and coworkers (24) to grow JAR cells as a tight polarized monolayer could relate
to the maintenance of such trophoblasts in culture flasks. When epithelial cells are cultured
on glass or plastic, they are forced to feed from the apical surface, which faces the culture
medium. Hence, the basolateral surface becomes isolated from the growth medium as the
monolayer is sealed by the formation of tight junctions. This difficulty is overcome by
growing the epithelial cells on permeable supports (31).
EEA-1 is one of the most specific early endosomal markers; it is associated with both the
sorting domain of the apical early endosome and the basolateral early endosome. Consistent
with published results (38), the distribution of EEA-1 in polarized JAR cells was fairly
broad over the cell layers' depth; however, its maximal expression was located at the apex
of the cells. If we look at the entire time course, the overall percentage of colocalization
between HIV-1 and EEA-1 was low. In parallel, EEA-1 weakly colocalized with HIV-1,
indicating that few of these organelles were occupied by HIV-1. Two conclusions can be
drawn from these data. First, the transit of HIV-1 via EEA-1+ organelles might occur so
rapidly that the percentage of colocalization is underestimated. Alternatively, it is possible
that only a fraction of the incoming virions transit through the EEA-1-positive organelles,
while the majority use EEA-1-negative early endosomes.
The signal associated with CD63 appears as punctate dots evenly distributed over the entire
cell, while an intense signal is also present in the perinuclear region (3). A similar pattern
was observed in JAR cells, although the signal was strongest within the top layers of the
cells. In contrast to the early and recycling endosomes, where incoming virions appeared to
transit quickly, HIV-1 clearly accumulated within CD63+ organelles over time, as these
organelles became increasingly occupied by HIV-1. The presence of molecules in late
253
endosomes has typically been associated with a degradative pathway. However, the ultimate
fate of molecules reaching late endosomes is a complex phenomenon. Molecules present on
the limiting membranes of late endosomes are recycled, whereas constituents targeted to the
inner membranes (i.e., inner vesicles) of late endosomes are destined for degradation. A
selected set of proteins are also stable in the late endosome's internal vesicles (28). If we
now consider the case of HIV-1, upon reaching late endosomes, this retrovirus as an
enveloped virus will be among the inner vesicles present in these compartments. Therefore,
it is possible that a yet undefined portion of HIV-1 is degraded in trophoblasts upon
reaching CD63+ organelles. On the other hand, it is also conceivable that some HIV-1
particles fuse within the endocytic compartment, possibly in the late endosomes, to reach
the cytoplasm as part of the virus's infectious cycle in trophoblasts. This model is in
agreement with our finding that bafilomycin A1 and NH4Cl severely reduced virus gene
expression in trophoblasts. Interestingly, bafilomycin A1 not only affects endosomal pH but
also affects the transit from early to late endosomes (30). Thus, it is possible that the transit
of HIV-1 to the late endosomes is required for viral infection to proceed. Further
experiments are needed to confirm this hypothesis.
The small GTPase Rab11 is an established marker protein associated with recycling
endosomes (11). In polarized MDCK cells, Rab11 was observed in a punctate vesicular
pattern, concentrated to a single focus around the centrosome (9). Although we did not label
the centrosome in this study, Rab11 in trophoblasts presented a similar pattern of
expression. Interestingly, HIV-1 was seen to partly colocalize with Rab11 at a fairly
constant rate. This indicates that there is a continuous transit of HIV-1 particles through
these organelles as they migrate from the plasma membrane. This is the first report showing
the presence of a retrovirus in Rab11+ organelles. A subpopulation of mouse polyomavirus
was also recently found in perinuclear areas associated with Rab11 GTPase (19). The
colocalization of HIV-1 with Rab11 has important consequences for the virus. Indeed, some
molecules found in recycling endosomes are returned to the plasma membrane (9), while
others are directed to the Golgi apparatus (18). In contrast to other types of virus (27), we
found that HIV-1 did not colocalize with either the Golgi complex or the endoplasmic
reticulum in polarized human trophoblasts (data not shown). On the other hand, we did
254
observe that a fraction of incoming virions in trophoblasts is rapidly returned to the apical
pole (i.e., the maternal circulation) upon internalization, a process we called recycling of
HIV-1. It will be important to verify whether this process is Rab11 dependent.
Transcytosis of virions has been postulated previously, but HIV-1 had never been visualized
migrating from one pole to the opposite pole before. In this study, although HIV-1 was
predominantly concentrated at the apex of the cells, we showed that a fraction of the
internalized viruses migrated below the tight junctions and reached the basolateral pole.
These data are fully in support of the notion that HIV-1 is able to reach the basolateral pole
in trophoblasts. From there, it is possible that HIV-1 is exocytosed from the basolateral side
to reach the fetal circulation. Interestingly, it has been reported that only 1% of the virus
inoculum crosses the blood-brain barrier in a similar fashion (17). Two pathways of
transcytosis in trophoblasts are possible: through a transit via the common endosome and
basolateral endosome and/or concomitantly with the release of exosomes via CD63expressing organelles.
All in all, the data presented in this work provide crucial information on the intracellular
trafficking and fates of HIV-1 in polarized human trophoblasts. A summary of the different
pathways of HIV-1 within the endocytic compartments is depicted in Fig. 7E. The
requirement for HIV-1 to transit through the endocytic compartments in order for virus gene
expression to ensue stresses a completely novel mode of entry process associated with
infection in these cells. Moreover, we provide evidence that at least two other fates are
possible in these cells: recycling and transcytosis. These data underscore the complexity of
the biology of this retrovirus, and the physiological significance of these results is high,
since the human polarized trophoblast barrier is considered a primary target for maternal
blood-borne HIV-1 infection. The data obtained also increase our understanding of the HIV1 infection process in adults. Indeed, epithelial cells are the portal of entry for HIV-1 during
primary infection in adults, and viral internalization is associated with endocytosis in these
cells. Moreover, as discussed, endocytosis may be important for macrophages and dendritic
cells, cell types that play key roles in the pathogenesis of HIV-1 infection.
255
2.5 Acknowledgements
We thank Ms. Karen Vandal for technical assistance and Mr. Jim Sims (Universal Imaging)
for programming done in Metamorph. This work was performed by G.V. in partial
fulfillment of her Ph.D. Degree in the Program of Microbiology-Immunology, Faculty of
Medicine, Laval University. This study was supported by grants to M.J.T. from the
Canadian Institutes of Health Research (CIHR) HIV/AIDS Research Program (HOP67259). G.V. is the recipient of a CIHR Doctoral Research Award from the HIV/AIDS
Research Program and M.J.T. holds a Tier 1 Canada Research Chair in Human ImmunoRetrovirology.
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259
Section 3
Figure legends
Fig. 1. Time course of HIV-1 entry in polarized trophoblastic cells. Polarized JAR cells
were either mock-infected (panel A) or exposed to Ada-M for 5 min (panel B), 30 min
(panel C), 2 h (panel D), 4 h (panel E) and 12 h (panel F). Cells were co-labeled with
rhodamine-phalloidin (in red) and purified human anti-HIV-1/Alexa 488-conjugated goat
anti-human (in green). The samples were scanned through confocal laser microscope and
the images shown are the arithmetic sum of entire stacks of the cell monolayer. Bar, 10 μm.
Fig. 2. HIV-1 expression is suppressed by endosomal acidification inhibitors and viruses
are recycled and transcytosed in polarized trophoblasts. Polarized JAR cells were
pretreated with bafilomycin A1 (A) or NH4Cl (B). Viral expression was measured
(luciferase activity) in these cells subsequent to a 24-h exposure to Ada-M followed by a
24-h treatment with TNF-α. Polarized JAR cells were also exposed to NL4-3 at 4°C for 1 h
or at 37°C for 5 min to 2 h (C-D). After extensive washes, fresh medium was added to the
upper and lower chambers, and the cells were incubated for 3.5 h at 37°C. Media from the
upper chamber (recycling) (C) and lower chamber (transcytosis) (D) were collected, and
LuSIV indicator cells were added and grown for 6 days. Luciferase activity was monitored
in each cell lysate. Values from the luminometer are expressed as relative light units (RLU).
Data shown are means ± standard deviations from triplicate samples and are representative
of three independent experiments.
Fig. 3. HIV-1 co-localizes with early endosomes. Polarized JAR cells were co-labeled with
purified human anti-HIV-1/Alexa 488-conjugated goat anti-human and mouse anti-EEA1/Texas Red-conjugated goat-anti mouse IgG. The x-axis corresponds to the cell layers
from the apex to the bottom. The left y-axis illustrates the number of pixels (HIV-1 in green
bars and EEA-1 in red bars) present over the entire depth of the cells and this after 5 min,
15 min, 30 min, or 2 h following exposure to HIV-1. The right y-axis refers to the
percentage of co-localization of Ada-M vs EEA-1 (yellow triangle line) or EEA-1 vs AdaM (blue square line) over the entire depth of the cells. Confocal images of the 3 μm cell
layer following a 15 min exposure period to HIV-1 (panels E to H). Ada-M is shown in
260
green (panel E), EEA-1 is depicted in red (panel F), overlay of signals specific for HIV-1
and EEA-1 (panel G), binary image showing the regions of co-localization between Ada-M
and EEA-1 on this cell layer is represented by yellow dots (panel H). Bar, 10 μm.
Fig. 4. HIV-1 co-localizes with late endosomes. Polarized JAR cells were co-labeled with
purified human anti-HIV-1 followed by Alexa 488-conjugated goat anti-human and
TRITC-conjugated mouse anti-CD63. For panels A to D, the bars indicate the number of
HIV-1- (shown in green) and CD63-specific pixels (shown in red) over the entire depth of
the cells and this after 5 min, 1 h, 2 h or 4 h following virus exposure. The curves represent
the percentage of co-localization of HIV-1 vs CD63 (yellow triangle line) or CD63 vs HIV1 (blue square line) over the entire depth of the cell monolayer. Confocal images of the 5
μm cell layer following a 4 h exposure period to HIV-1 are presented in panels E to H.
Ada-M is shown in green (panel E), CD63 is depicted in red (panel F), overlay of signals
specific for HIV-1 and CD63 (panel G), binary image showing the regions of colocalization between HIV-1 and CD63 on this cell layer is represented by yellow dots
(panel H). Bar, 10 μm.
Fig. 5. HIV-1 co-localizes weakly with recycling endosomes. Polarized JAR cells were colabeled with purified human anti-HIV-1 followed by Alexa 488-conjugated goat antihuman and rabbit anti-Rab11/Alexa Fluor 633-conjugated goat anti-rabbit IgG. For panels
A to D, the bars indicate the number of HIV-1- (shown in green) and Rab11-specific pixels
(shown in magenta) over the entire depth of the cells and this after 15 min, 1 h, 2 h or 4 h
following exposure to HIV-1. The curves represent the percentage of co-localization of
Ada-M vs Rab11 (yellow triangle line) or Rab11 vs Ada-M (blue square line) over the
entire depth of the cells. Digital images of the 4 μm cell layer following a 1 h exposure
period to HIV-1 are presented in panels E to H. Ada-M is shown in green (panel E), Rab11
is depicted in magenta (panel F), overlay of signals specific for HIV-1 and Rab11 (panel
G), binary image showing the regions of co-localization between HIV-1 and Rab11 on this
cell layer is represented by yellow dots (panel H). Bar, 10 μm.
Fig. 6. Migration of HIV-1 in polarized trophoblastic cells. Polarized JAR cells were
exposed to Ada-M for 5 min (panels A to D), 30 min (panels E to H), 2 h (panels I to L), or
261
4 h (panels M to P). Cells were triple-labeled with rhodamine-phalloidin, mouse anti-ZO1/Cy5-conjugated goat anti-mouse IgG (shown in blue, to detect the tight junctions) and
purified human anti-HIV-1/Alexa 488-conjugated goat anti-human (in green). The first row
corresponds to 3 μm from the apex of the cells (panels A, E, I and M), the second row
corresponds to 4 μm (panels B, F, J and N), the third row corresponds to the middle of the
cells (7 to 9 μm) (panel C, G, K and O) and the fourth row corresponds to the basolateral
pole of the cells (14 to 18 μm) (panels D, H, L and P). Bar, 10 μm.
Fig. 7. HIV-1 migrates to the basolateral pole of trophoblasts and the intracellular
itinerary of incoming HIV-1 in trophoblasts. Polarized JAR cells were exposed to Ada-M
for 30 min (panels A and B) or 4 h (panels C and D). Cells were double-labeled with
rhodamine-phalloidin and purified human anti-HIV-1/Alexa 488-conjugated goat antihuman. The bar charts illustrate the number of pixels (specific for HIV-1) present on each
cell layer from the apex to the bottom after 30 min or 4 h of virus exposure (panels A and
C, respectively). The tables provide the number of pixels (specific for HIV-1 and actin
cytoskeleton) present on each cell layer from the apex to the bottom after 30 min or 4 h of
virus exposure (panels B and D, respectively). The dashed red lines indicate the
correspondence between the bar charts and the tables. The intracellular itinerary of
incoming HIV-1 in trophoblasts is summarized in panel E. Upon endocytic entry in
polarized trophoblastic cells, HIV-1 is associated with EEA-1+ organelles and possibly with
EEA1-negative organelles. The virions rapidly traffic to CD63+ late endosomes where they
accumulate. Infection and degradation may be associated with events occurring in these
organelles. Also, HIV-1 may recycle to the apical pole via Rab11+ organelles. Finally, HIV1 virions migrate to the basolateral pole. Transcytosis of HIV-1 may occur through a transit
via the common endosome and basolateral endosome and/or concomitantly with the release
of exosomes via CD63+ organelles. Yellow arrow line: demonstrated pathway. Blue arrow
line: postulated pathway.
262
Section 4
4.1 Figure 1
Figures
263
4.2 Figure 2
264
4.3 Figure 3
265
4.4 Figure 4
266
4.5 Figure 5
267
4.6 Figure 6
268
4.7 Figure 7
269
4.8 Figure 7E
270
Chapitre 5. LA VOIE D’ENDOCYTOSE DU VIH-1
DANS LES TROPHOBLASTES
Section 1
Quatrième article scientifique
1.1 Title page
1.1.1 Title
HIV-1 infection of trophoblasts requires clathrin, caveolae and dynamin-independent
endocytosis and free cholesterol.
1.1.2 Authors
Gaël Vidricaire and Michel J. Tremblay
1.1.3 Affiliation
Research Center in Infectious Diseases, CHUL Research Center, and Faculty of Medicine,
Laval University, Quebec, Canada.
1.1.4 Corresponding author
Mailing address:
Laboratory of Human Immuno-Retrovirology
Research Center in Infectious Diseases, RC709
CHUL Research Center
2705 Laurier Blvd.
Quebec (QC), Canada, G1V 4G2
Phone: (418) 654-2705. Fax: (418) 654-2212
1.2 Résumé
Le mécanisme qui sous-tend l’infection des trophoblastes humains (cellules placentaires)
par le VIH-1 est différent de celui établi pour les lymphocytes T CD4+ puisque
l’endocytose des virions est obligatoire pour que l’infection se produise dans les
trophoblastes. Cependant, la voie d’endocytose menant à l’infection productive de ces
271
cellules demeure inconnue. Cet article aborde cette question essentielle. Nous montrons que
l’infection des trophoblastes polarisés est indépendante de l’endocytose par les puits de
clathrine et de la macropinocytose. Le traitement des cellules avec un agent qui fixe le
cholestérol membranaire, soit la filipine, réduit considérablement l’internalisation du virus,
alors que le MtβCD, qui a pour effet d’extraire le cholestérol membranaire, ne produit
aucun effet dans ce contexte. De plus, l’internalisation du VIH-1 n’est pas affectée par la
surexpression du mutant K44A de la dynamine, ni par l’inhibiteur des protéines kinases, le
PP2 ou par l’inhibiteur des protéines phosphatases de type tyrosine, le bpV(pic). Ainsi,
l’internalisation du VIH-1, menant à l’infection des trophoblastes, se produit principalement
par une voie indépendante de la clathrine, des cavéoles et de la dynamine, mais nécessitant
que le cholestérol membranaire soit libre. Il faut noter qu’alors qu’initialement le VIH-1 ne
co-localise pas avec la transferrine, certains virions migrent ultérieurement vers des
endosomes contenant ce marqueur. Ceci suggère qu’il se produit un transit inhabituel des
endosomes non classiques vers les endosomes classiques. Finalement, l’internalisation du
VIH-1 dans les trophoblastes polarisés entraîne la polymérisation des filaments d’actine et
cette endocytose est inhibée par la jasplakinolide. Par ailleurs, l’internalisation du VIH-1 est
indépendante des microtubules. Ces résultats constituent une avancée importante sur le
mécanisme d’entrée du VIH-1 dans les trophoblastes humains.
1.3 Abstract
Although endocytosis of HIV-1 is mandatory for infection to proceed in trophoblasts,
which is different from what is known for CD4+ T cells, the exact endocytic pathway(s)
resulting in true infection of the former cell type is still unknown. We demonstrate that
HIV-1 infection of polarized trophoblasts is independent of clathrin-mediated endocytosis
and macropinocytosis. Interestingly, treatment with the cholesterol-sequestering drug filipin
severely impaired virus internalization, whereas the cholesterol-depleting compound
methyl-β-cyclodextrin did not impact on this pathway. Moreover, viral internalization was
unaffected by overexpression of a mutant dynamin 2 or treatment with a kinase or tyrosine
phosphatase inhibitor. Thus, HIV-1 infection of trophoblasts occurs primarily via a clathrin,
caveolae and dynamin-independent pathway requiring free cholesterol. Importantly, even
272
though HIV-1 did not initially co-localize with transferrin, some virions migrated at later
time points to transferrin-enriched endosomes, suggesting an unusual transit from the nonclassical pathway to early endosomes. Finally, internalization of HIV-1 in polarized
trophoblasts triggered new actin polarization and virus internalization in these cells was
inhibited by jasplakinolide but was independent of microtubules. Collectively these
findings provide unprecedented information on the route of HIV-1 internalization in
polarized human trophoblasts. Moreover, HIV-1 internalization into trophoblastic cells
provides a compelling example of clathrin-independent endocytosis.
Section 2
2.1 Introduction
Mother-to-child transmission (MTCT) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is
the primary cause of infection by this retrovirus in children. An estimated 2.1 millions
children are currently living with HIV-1 worldwide, this being the case of 8% children in
sub-Saharan Africa (70). Recent statistics published by UNAIDS indicate that women are
now becoming infected at a higher frequency than men (70). For example, the risks of
acquiring HIV-1 is 1.3 fold higher in adult African women than in men of the same age,
and, among young women aged between 15 to 24, this disparity is even more important
since a three-fold difference is reported (70). Hence women of child-bearing age are at
greater risks to become infected by HIV-1 and in this context, MTCT is becoming a serious
public health concern to which great attention is currently devoted (70). MTCT may occur
in utero, at birth during delivery or through breastfeeding (reviewed in (62, 73)). The in
utero transmission of HIV-1 has been documented by several groups (9, 36, 58, 79), and
when considering the timing of vertical transmission, it is estimated that approximately
30% of the infants becomes infected during pregnancy (60). HIV-1 has been detected in
aborted foetuses as early as after 8 weeks of gestation (31) and in first and second trimester
foetuses (8, 17, 37, 66). However, the mechanism underlying in utero HIV-1 transmission
remains poorly understood.
273
The placenta is composed of a double layer of polarized epithelial-type cells (i.e.
cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts). These cells separate the maternal and foetal
blood circulations and control fluxes between them throughout pregnancy. In order for in
utero transmission to occur, HIV-1 must first cross this highly protective placental barrier
to ultimately reach the fetal circulation. Current working models propose that, following
infection of trophoblasts and/or transcytosis across these cells, HIV-1 is released from the
basolateral pole of the trophoblasts (facing the fetal circulation) leading to productive
infection of the underlying fetal cells (30, 42, 72, 78). The precise mechanism through
which HIV-1 can infect trophoblastic cells is poorly characterized and some of the crucial
questions that need to be addressed relate to the process of viral entry.
Expression of the primary cellular receptor CD4 and coreceptors (i.e., CXCR4 and CCR5)
known to be required for HIV-1 entry is low or absent in trophoblasts (1, 3, 20, 28, 77). In
spite of this, trophoblasts can be productively infected by HIV-1 both in vitro and in vivo
(30, 42, 72, 78). However, like other epithelial cells, the permissiveness of trophoblasts to
HIV-1 infection is lower than that of CD4+ T cells (75). For instance, pro-inflammatory
cytokines (e.g. TNF-α or IL-1) and a rescue with cells highly permissive to HIV-1 infection
are necessary to reveal virus production in such cells (72). Importantly, recent findings
indicate that the mechanism whereby HIV-1 infects trophoblasts is fundamentally different
from what is known for CD4+ T cells. First, viral entry leading to infection is unexpectedly
independent of the viral envelope (Env) proteins gp120 and gp41 (74, 75). Second, upon
contact with trophoblasts, HIV-1 is massively internalized by endocytosis (72), a
phenomenon that is characterized by a transit through several intracellular organelles (71).
This intracellular itinerary is thought to translate into weak virus production due to two
important elements: inefficient endosomal escape by HIV-1 combined to a rapid
degradation of the majority of virions in endosomal compartments of the infected cells.
However, although inefficient in terms of progeny virions being produced by the cells, this
endosomal trafficking of incoming virions in trophoblasts is nonetheless mandatory for
HIV-1 infection to take place in this cell type. This is exemplified by the reported inhibition
of virus infection following treatment with bafilomycin A1 and ammonium chloride, two
endosome acidification inhibitors (71). Moreover, transient expression of a dominant
274
negative Rab5 or Rab7 construct greatly reduces HIV-1 infection in these cells (75). Hence,
internalization of HIV-1 by a still incompletely defined endocytic route seems to be an
obligatory step for virus infection to ensue in trophoblasts. This is radically different from
CD4+ T lymphocytes whereby HIV-1 infection is pH-independent and results from fusion
at the cell membrane (50, 67). It is thus of prime importance to define the endocytic
pathway(s) responsible for virus internalization in trophoblastic cells considering the
postulated role of this cell type in MTCT of HIV-1. This paper addresses this key question.
Previous studies revealed the rather high complexity of the endocytic pathways occurring at
the plasma membrane of mammalian cells. These include i) phagocytosis, ii)
macropinocytosis, iii) the classical clathrin-mediated endocytosis, iv) dynamin-dependent
endocytosis via caveolae or v) glycolipid rafts, vi) clathrin, caveolae and dynaminindependent endocytosis that requires lipid rafts, and vii) dynamin-independent endocytosis
that does not involve clathrin-coated pits, caveolae or lipid rafts (reviewed in (52, 53)).
Macropinocytosis is a cell-type specific and receptor-independent endocytic pathway that
requires activation by growth factors or phorbol esters. However, it operates constitutively
in dendritic cells. Upon cell stimulation, large vacuoles called the macropinosomes are
formed from the closure of plasma membrane ruffles (43). During clathrin-dependent
endocytosis, specific receptors are recognized by the adaptor protein 2 complex and
directed into clathrin-coated pits. Vesicles fuse with early endosomes (positive for EEA-1
marker), where receptors are sorted for either recycling or transit to late endosomes and
lysosomes (reviewed in (40)). Caveolae and caveolae-related relying on glycolipid rafts are
related endocytic pathways characterized by their clathrin independence, dynamin
dependence and sensitivity to cholesterol depletion, and the morphology and lipid
composition of the vesicular intermediates (43). However, the former is caveolin-dependent
while the latter is independent of caveolin. Caveolae-mediated endocytosis involves i)
clustering of lipid raft components on the plasma membrane into caveolae and ii) signal
transduction pathways leading to invagination and internalization. The caveolar vesicles are
delivered to pre-existing caveolin-1-enriched organelles, the caveosomes, which are
cholesterol-rich structures that are devoid of markers of the classical endocytic pathway
(reviewed in (52)). It is also emerging that aside from these pathways, two other less
275
characterized pathways also exist. First, clathrin, caveolae and dynamin-independent
endocytosis that requires lipid rafts. For instance, internalization of non-clustered
glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins (e.g. folate receptor, decay
accelerating factor and CD59), which resides in lipid rafts at the plasma membrane, is
independent of clathrin and dynamin. Moreover, these proteins do not co-localize with
caveolin-1 (44, 61). Secondly, evidences suggest that dynamin-independent endocytosis
that does not involve clathrin-coated pits, caveolae or lipid rafts, is also possible. Indeed,
major histocompatibility class-I (MHC-I) molecules and Tac (alpha subunit of the IL-2
receptor) are endocytozed through this rather unusual pathway (45).
Viruses take advantage of these various internalization pathways to gain access into target
cells. Examples include macropinocytosis for vaccinia virus, clathrin-coated pits for
vesicular stomatitis virus, caveolar-mediated endocytosis for Simian virus 40 (SV40), lipid
raft-mediated pathway present in cells that are devoid of caveolin for SV40 and rotavirus,
and uptake by dynamin- and caveolin-independent pathways that are either dependent and
independent of lipid rafts for echovirus 11 and polyomavirus, respectively (reviewed in
(52)). In regards to HIV-1, as specified above, it is an enveloped virus that gains entry into
susceptible cells upon fusion of its outer membrane with the host plasma membrane (35,
67). Endocytosis of HIV-1 particles is known to occur in most cells, including CD4+ T cells
but it is thought that this event does not significantly contribute to productive infection (38).
Although true for CD4+ T cells, endocytosis of HIV-1 is now postulated to be associated
with three important events: i) transcytosis of HIV-1 across mucosal surfaces (14, 23) and
blood-brain barrier (4, 10), ii) internalization and retention of intact infectious virus within
dendritic cells with subsequent exit and transfer of virions to CD4+ T cells (11, 29) and iii)
infection of CD4-negative cells such as astrocytes and epithelial cells (33, 48). These
pathways are poorly characterized but provide credential to the hypothesis that HIV-1
infection is endocytic in nature in trophoblasts. Several putative modes of internalization
are possible in trophoblastic cells. The fact that trophoblasts are epithelial-like cells that
have been shown to resemble macrophages (25) supports the possibility of
macropinocytosis. Caveolae-dependent endocytosis is excluded because caveolin-1 and -2
are not expressed by trophoblasts (34). However, endocytosis via glycolipid rafts requiring
276
dynamin or dynamin- and lipid raft-independent internalization may operate also in these
cells.
By using polarized trophoblastic cells, we set out to define which one of the putative
endocytic pathways operating in trophoblastic cells is associated with HIV-1 infection. The
data presented in this study collectively illuminate an internalization route which was up to
now unforeseen for HIV-1. Our findings also underscore the complexity of the biology of
this retrovirus and have great implication in MTCT of HIV-1. The internalization route
discovered in this study is a striking example of a clathrin, caveolae and dynaminindependent endocytic pathway, which emphasizes its biological importance. Moreover,
given that HIV-1 infection is modulated by Rab5 and Rab7 (75), our data thus reveal an
intriguing relationship between the non-classical and classical endocytic pathways.
2.2 Material and Methods
2.2.1 Cells
The human trophoblastic cell line JAR, 293T cells and human leukemic T cell line Jurkat
(clone E6.1) were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, VA).
JAR cells were grown into a polarized monolayer of cells as previously described (71).
Briefly, JAR cells were seeded in 24-well cell culture inserts containing a 0.4 μm pore size
PET track-etched membrane (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, N.Y.) and the
cells were grown to complete confluence and polarized for 4 days.
2.2.2 Reagents
The listed compounds were used at the following concentrations: bpV(pic) at 20 μM,
chlorpromazine at 10 μg/ml, cholera toxin B at 0.1 mg/ml, water-soluble cholesterol at
1mM, colchicine at 50 μM, cytochalasin B at 10 µM, DMA at 100 mM, filipin at 5 μg/ml,
jasplakinolide at 1 μM, lactose at 200 mM, MtβCD at 15 mM, paclitaxel (taxol) at 10 μM,
phorbol myristate acetate (PMA) at 20 ng/ml, PP2 at 10 μM, TNF-α at 10 ng/ml, and
vinblastine at 5 nM (Sigma-Aldrich). The pre-treatments were done at 37˚C for 30 min,
277
except for DMA and lactose which were added at 4˚C simultaneously with HIV-1 before
transferring the samples to 37˚C. All the drugs were maintained upon addition of viruses
except for MtβCD and filipin which were washed off.
2.2.3 Molecular constructs and preparation of virus stocks
The pNL4-3, pNL4-3-Luc+E-R+, pHXB2-env, pcDNA-1/Amp-based Ada-M Env and
pHCMV-G expression vectors have been described elsewhere (71, 72). The expression
vector Vpr-GFP was a kind gift of C. Tremblay (Centre Hospitalier Universitaire de
Montréal, Montréal, QC). Viruses were produced by calcium phosphate transfection of
293T cells as described previously (72). Using the same protocol, pNL4-3-Luc+E-R+
expression vector was used to produce NL4-3 Env-deficient reporter viruses (NL4-3∆Env).
2.2.4 Transfection of JAR cells
The EGFP expression vector (used as a control) codes for an enhanced green-fluorescence
protein. The EGFP-Eps15∆95/295 is a dominant negative form of Eps15 upon deletion of
the second and third EH domain of Eps15 (position 95 to 295) (herein called
Eps15∆95/295) (7) (generous gifts from R. Lodge, INRS-Institut Armand Frappier, Laval,
QC). The plasmid coding for dynamin 2 K44A mutant (dynK44A) was kindly provided by
M.A. McNiven (Mayo Cancer center, Rochester, MN). Polarized JAR cells were transiently
transfected using lipofectamine as described by the manufacturer (Invitrogen Canada Inc.,
Burlington,ON).
2.2.5 Inhibition of transferrin endocytosis in polarized trophoblasts
Polarized JAR cells seeded on glass coverslips and grown overnight at 37°C were exposed
to 5 μg/ml of Cell Tracker Green (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON) for 30 min at
37°C. The labeled cells were left untreated or pre-treated with chlorpromazine before being
exposed to 5 μg/ml of tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn for 5 min at 37°C. In some
experiments, polarized JAR cells were transiently transfected with EGFP control,
Eps15∆95/295 or dynK44A vector before exposure to tetramethyl rhodamine-conjugated
Tfn. The samples were acid-treated (0.5 M NaCl, 1% acetic acid) at 4˚C for 1 min and
278
washed with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) to remove all uninternalized Tfn.
The cells were fixed with paraformaldehyde (2%) and mounted on a slide with 90%
glycerol. Alternatively, the membranes were pealed off from the transwells and placed on a
slide, the apical side facing up. A drop of 90% glycerol was added on the membrane and a
glass coverslip was put on top.
2.2.6 Viral internalization and fluorescence labeling
Following transfection or pre-treatment with drugs (described above), polarized JAR cells
were exposed to pseudotyped (i.e., Ada-M and HXB-2) and Env-deficient viruses (250 ng
of p24) for 1 h at 37˚C. At this point, the cells were acid-treated at 4˚C for 1 min and
washed with ice-cold PBS to remove all uninternalized viruses. Finally, the cells were lysed
in ice-cold lysis buffer (20 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100) and
the virus content was monitored by ELISA of the viral core protein p24 as previously
described (15). In some experiments, polarized JAR cells were exposed to Ada-M
pseudotyped viruses for 0, 5, 20, or 45 min. To remove all uninternalized viral particles, the
cells were then acid-treated for 1 min at 4˚C and rapidly washed with ice-cold PBS. Cells
were fixed and labeled using purified human anti-HIV-1 (from pooled sera of HIV-1infected patients) (71) and biotin-tagged cholera toxin B (Sigma-Aldrich). The secondary
antibodies were Alexa 488-conjugated goat anti-human antibody and Alexa 546-labeled
streptavidin (Molecular Probes). The membranes were mounted as described above.
Alternatively, Ada-M pseudotyped viruses that were loaded with the Vpr-GFP fusion
protein (250 ng of p24) together with 5 μg/ml of tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn
were added to polarized JAR cells for a period of 5, 20, or 45 min at 37˚C. The cells were
acid-treated, washed, fixed and mounted. In some experiments, JAR cells were pre-treated
or not with MtβCD, and rapidly washed with ice-cold PBS. Cells were fixed with 2%
paraformaldehyde, quenched with glycine and labeled with filipin. Of note, antibody
labeling requires cell permeabilization. This treatment is incompatible with Tfn labeling
because it leads to Tfn leak out. Hence, co-localization between Tfn and HIV-1 were
conducted using HIV-1 virions loaded with a Vpr-GFP fusion protein. However, the
intensity of HIV-1-specific signal is low when using this technical strategy, probably
279
because of the low number of Vpr molecules known to be inserted per single mature virus.
Hence, when cell permeabilization is possible (which is the case when detecting GM1 via
cholera toxin), polyclonal anti-HIV-1 polyclonal antibodies are used because they
recognize different HIV-1 proteins, a factor resulting in an enhancement of HIV-1-specific
signal intensity. It is important to stress that HIV-1 particles loaded with a Vpr-GFP fusion
protein or detected via polyclonal anti-HIV-1 polyclonal antibodies behave similarly in
polarized JAR cells (71).
2.2.7 Cell fractionation assay
Following pre-treatment (described above), polarized JAR cells were exposed to Ada-M or
HXB-2 pseudotyped viruses (250 ng of p24) for 4 h at 37°C. At this point, the cells were
washed with PBS and tryspinized for 5 min at 37°C. The cells were pelleted by
centrifugation (1,200 rpm for 5 min at 4°C) and washed two times with ice-cold PBS.
Cytosolic and vesicle fractions were prepared as previously described (72). The level of p24
present in each fraction was assessed using the p24 test.
2.2.8 Infection assay
Following pre-treatment with drugs (described above), polarized JAR cells were exposed to
pseudotyped (i.e. Ada-M and HXB-2) and Env-deficient reporter viruses (250 ng of p24) at
37˚C for 24 h. At this time point, TNF-α (10 ng/ml) (PeproTech EC Ltd, London, United
Kingdom) was added for 24 h to induce virus gene expression as described previously (72).
Finally, the cells were lysed and luciferase activity was monitored in each cell lysate as
described previously (5). Of note, controls with the antiviral agent zidovudine (AZT) were
not utilized in this study because productive HIV-1 infection of JAR cells has been already
demonstrated (71, 74). In some experiments, polarized JAR cells or Jurkat cells were
exposed to VSV-G pseudotypes at 37˚C for 24 h (0.025 – 0.05 ng of p24 per 1 x 106 cells).
At this point, the cells were extensively washed to remove all uninternalized viral particles
and then treated for 24 h with bpV(pic) or pre-treated for 30 min with 10 μM PP2 and then
PMA was added for 24 h. Finally, the cells were lysed and luciferase activity was monitored
in each cell lysate.
280
2.2.9 De novo actin polymerization
Polarized JAR cells were first serum-starved for 16 h. Next, the cells were pre-treated with
jasplakinolide for 1 h at 4˚C. The cells were then washed with PBS and exposed in
complete DMEM medium (10% fetal bovine serum, glutamine (2 mM), penicillin G
(100 units/ml), and streptomycin (100 mg/ml)) to conditioned media from 293T cells or
wild type NL4-3 particles for 5, 20, or 45 min. The cells were subsequently washed with
PBS, fixed with paraformaldehyde (2%), permeabilized with 0.3% Triton X-100 and
blocked with 1% BSA. The cells were incubated with rhodamine-tagged phalloidin
(Molecular Probes) and mounted as described above. To prepare conditioned-media, 293T
cells were grown to confluence in complete DMEM (described above). The media was
collected and filtered through a 0.22-µm pore size cellulose acetate membrane (Millipore,
Bedford, MA).
2.2.10 Confocal laser scanning, co-localization analysis and digital image
preparation
The samples were analyzed using an Olympus Fluoview FV300 confocal laser scanning
biological microscope (Olympus America, Melville, NY). The data were captured using a
60X oil-objective (100X for filipin labeled-cells). The slides were scanned at 1 μm interval
and at a dimension of 512 X 512 with a 3X zoom magnification (1X for JAR cells ±
chlorpromazine, ± Eps15∆95/295, ± dynK44A vs Tfn and 1.5X for filipin-labeled cells).
For a given experiment, all the settings on the microscope were kept constant for all the
samples. Each experiment was repeated 3 times and for each individual experiment, all the
samples were scanned at 5 different locations. Digital images were produced using the
MetaMorph Offline software 6.1 (Universal Imaging Corp., West Chester, PA), Adobe
Photoshop 8 and Adobe Illustrator 10 (Adobe Systems Inc., Ottawa, ON). The images
shown are the arithmetic sum of entire stacks of the cell monolayer, except for the colocalization images where a single layer of the stacks is presented. To calculate colocalization, the following sequential operations were performed by the Metamorph
software. The threshold was defined for each dye individually and applied to each cell layer
and at all the time points of a time course. The mock-infected sample (labeled also with
281
anti-HIV-1) was used to define the background signal for HIV-1. Next, the signal
integration was calculated for both HIV-1 and the marker of interest (i.e. Tfn or cholera
toxin B) and this sequentially for all the planes of a given stack (i.e. a time point). The
signal integration corresponds to the total number of pixels for a given dye multiplied by
the average of that signal on a particular plane. Finally, co-localization events were
calculated based on algorithms defined in the Metamorph software. The co-localization
events are expressed as the ratio of the integration of HIV-1-specific signal over the
integration of the marker of interest and vice versa. Excel log files were generated to
compile the calculations and graphs were plotted. Five consecutive cell layers of the entire
stack of layers scanned from the apex to the bottom of the cell monolayer are shown in the
figures. To calculate the total integration within a scanned stack of a monolayer of cells, the
sum of the integration over all the planes was calculated by the Metamorph software.
2.3 Results
2.3.1 Blocking the clathrin-associated endocytic pathway does not inhibit
HIV-1 internalization or infection
Trophoblasts form in vivo a polarized like-epithelium. The physiological properties
associated with cell polarity in trophoblasts are critical for maintaining the integrity of the
placental barrier and controlling all the exchanges between the maternal and fetal
circulations throughout pregnancy. Cell polarity leads to two plasma membrane domains,
apical and basolateral, which display distinct protein and lipid compositions and as such
have different biochemical properties and functions. In addition, polarized endocytic
pathways (apical and basolateral) are established, each of which uses appropriate early
endosomes as well as shared late and recycling endosomes. These pathways lead to
recycling, degradation and transcytosis of specific internalized molecules on an ongoing
basis. Purification of primary human trophoblasts is difficult and, more importantly, it
results in the lost of cell polarity (13), which is a serious drawback when studying endocytic
uptake and barrier function. Fortunately, the human trophoblastic cell line JAR exhibits
many characteristics of the early placenta (59) and can be grown on permeable supports,
leading to the formation of a polarized epithelium-like monolayer closely resembling the
282
trophoblastic barrier in vivo. This model system has been shown previously to provide an
elegant alternative to primary cells (71) and was thus used in this study.
The main objective of this work was to define among the putative endocytic pathways in
trophoblasts the one(s) leading to HIV-1 internalization and infection. Of note, we have
previously shown that upon virus exposure of polarized trophoblastic cells, viral particles
are initially found exclusively in the vesicular fraction (72). It is only with time that HIV-1
particles will access the cytoplasm, indicating that endocytosis is the main pathway leading
to cytoplasmic release of virus material and ultimately infection of these cells (72). Based
on this demonstration, we have used the term viral internalization in this study to
differentiate this event from viral entry which is typically associated with the presence of
virus material within the cytoplasm. However, it is important to bear in mind that viral
internalization is directly associated with infection in these cells. Indeed, blocking the
function of the endosomes or introducing a dominant negative mutant of Rab 5 or Rab7 in
trophoblasts translates into poor infection rates (71, 75).
Chlorpromazine is known to inhibit clathrin-mediated uptake and we initially tested its
effect in polarized JAR cells. As depicted by confocal analysis, in Cell Tracker Greenloaded JAR cells, chlorpromazine treatment inhibited internalization of transferrin (Tfn)
(Fig. 1A), a glycoprotein constitutively delivered to the cells through clathrin-mediated
endocytosis (CME) (reviewed in (16)). The sum of the integration for Tfn on each plane of
the stacks scanned through confocal microscopy was calculated in control and
chlorpromazine-treated cells and was found severely inhibited in the presence of
chlorpromazine (Fig. 1B). To define the role of CME in the internalization pathway leading
to HIV-1 infection of trophoblasts, virus infection was assessed upon treatment with
chlorpromazine in polarized JAR cells inoculated with recombinant luciferase-encoding
viruses. In this assay, viruses pseudotyped with Ada-M (R5-tropic) and HXB-2 (X4-tropic)
Env glycoproteins were used. In addition, Env-deficient viruses (called NL4-3∆Env) were
also tested since it has been shown that HIV-1 entry and infection of polarized trophoblasts
occur independently of gp120/gp41 (74, 75). It is important to emphasize that, due to weak
infection rates in trophoblasts, physiologic doses of pro-inflammatory cytokines (e.g. TNF-
283
α or IL-1α) are required to promote HIV-1 LTR-driven gene expression in these cells (72).
It is thought that the presence of these pro-inflammatory cytokines mimics in vivo situation
whereby vertical transmission is favored via enhanced viral production in trophoblasts (42,
72, 76). Therefore, TNF-α was added in the infection assays conducted in this study. Viral
gene expression, as monitored by measuring HIV-1 LTR-driven luciferase activity,
remained unchanged following a chlorpromazine treatment for all the three virus
preparations tested (Figs. 1C to 1E). It can be concluded that HIV-1 infection of polarized
trophoblasts is therefore independent of CME.
To ensure the validity of these data, a second strategy was undertaken. The Eps15 protein
establishes interactions with endocytic/sorting proteins associated with the CME pathway.
It has been shown that Eps15 lacking EH-domains inhibits clathrin-coated pit formation and
CME (7). As expected, the dominant negative mutant Eps15∆95/295 was found to block
the CME pathway in polarized JAR cells since Tfn internalization was inhibited (Figs. 2A
and 2B). It is important to recall at this point that HIV-1 infection of trophoblasts strictly
requires internalization by endocytosis because inhibiting the function of the endosomes
blocks HIV-1 infection in these cells (71, 75). Quantitative measurements of the viral
capsid p24 with an enzymatic assay has the distinct advantage to measure the total amount
of the viral material present in the cells (irrespectively of its localization in the endosomes
or the cytoplasm) upon virus-cell contact. Because the transit via the endosomes is a
required step for HIV-1 infection in trophoblasts, the p24 assay therefore provides an
adequate indication of HIV-1 infection in polarized trophoblasts. Importantly, an endocytic
inhibitor that does not inhibit internalization of HIV-1 indicates that the pathway affected
by this compound is not linked to HIV-1 infection. In other words, the absence of an effect
by a given treatment helps discriminating the endocytic pathway(s) that does not lead to
productive HIV-1 infection in trophoblasts. Internalization of HXB-2 pseudotypes and
NL4-3∆Env viruses was unaffected upon expression of Eps15∆95/295 in polarized JAR
cells, whereas internalization of Ada-M pseudotypes was weakly reduced (by 26%) in these
conditions (Fig. 2C). To define if this diminution in Ada-M internalization translated into
reduced viral infection, infection assays were conducted in polarized JAR cells transiently
expressing Eps15∆95/295. The diminished internalization for Ada-M was not paralleled
284
with a reduction in virus infection (data not shown). Therefore, these data confirm that
CME is not involved in internalization of HIV-1 in polarized trophoblasts.
We next evaluated whether macropinocytosis was involved in virus internalization and
infection. Dimethyl amiloride (DMA), a Na+/H+ channel inhibitor that selectively blocks
membrane ruffling and subsequent macropinocytosis, is a drug widely used to assess
macropinocytosis (39). When tested in polarized JAR cells, although it did not modulate
internalization of VSV-G pseudotyped viral particles, DMA reduced internalization of Tfn
(data not shown). This means that DMA acts in the same pathway as CME or has
overlapping unspecific effects in this assay. In addition, although DMA could partly reduce
HIV-1 internalization in polarized JAR cells (data not shown), we could not ascertain
whether DMA had any effects on macropinocytosis per se in trophoblasts since this
pathway may not be active in these cells. Indeed, when polarized JAR cells were exposed to
FITC-dextran (70 kDa), which is a marker of macropinocytosis (18), no JAR labeling could
be detected, indicating that dextran was not internalized in theses cells (data not shown).
Moreover, phorbol myristate acetate (PMA) can be used to promote macropinocytosis in
certain cell types (68). When added to polarized JAR cells, we did not observe an
enhancement of HIV-1 internalization in these cells (data not shown). Based on these data,
we conclude that macropinocytosis is not operating in trophoblasts. Hence, it is unlikely
that macropinocytosis plays an active role in the endocytic pathway leading to HIV-1
infection of trophoblasts.
2.3.2 HIV-1 internalization requires free cholesterol whereas rafts are
needed for more downstream events
Lipid rafts are recognized as a significant portal of entry into host cells for numerous
pathogens including HIV-1 (26, 57). One widely used criterion to reveal involvement of
lipid rafts in endocytosis is pharmacological depletion of cholesterol from cell membranes
(reviewed in (46)). As demonstrated by filipin staining of JAR cells treated with methyl-βcyclodextrin (MtβCD) (a cholesterol-depleting compound), MtβCD markedly depleted
cellular cholesterol (Figs. 3A and 3B). When assessing viral internalization in such
conditions, a potent reduction was observed for Ada-M pseudotyped viruses (45%
285
reduction), a process that was restored upon adding soluble cholesterol to MtβCD-treated
JAR cells (Fig. 3C). Surprisingly, MtβCD did not modulate internalization of HXB-2
pseudotyped or Env-deficient viruses. When tested on infectivity assays, the percentages of
MtβCD-mediated inhibition of infection with HXB-2 pseudotypes and Env-deficient
viruses were more important than the effect this drug had when tested on internalization of
these viruses, reaching 50% and 37% inhibition, respectively (Figs. 3E and 3F). On the
other hand, all the HIV-1 preparations tested were strongly affected by filipin (a
cholesterol-sequestering reagent), reaching a 70%, 33% and 60% reduction in viral
internalization for Ada-M pseudotypes, HXB-2 pseudotypes and NL4-3∆Env viruses,
respectively (Fig. 4A). Moreover, the effect filipin had on infectivity was more dramatic
than the effect this drug had when tested on internalization, reaching 75%, 66% and 83%
inhibition for Ada-M pseudotyped, HXB-2 pseudotyped and Env-deficient viruses,
respectively (Figs. 4B to 4D). Three series of controls were performed to assess for the
specificity of filipin. First, cell viability was not affected by filipin (data not shown).
Second, binding of cholera toxin subunit B (Ctx) to its receptor, the sphingolipid GM1,
leads to internalization of the toxin via several endocytic pathways. Although Ctx is often
reported as a marker of caveolae-mediated endocytosis, a fraction of Ctx can be
endocytosed by clathrin-dependent as well as clathrin- and caveolae-independent
endocytosis (47, 65, 69). Importantly, filipin may not significantly modulate Ctx
internalization (65). Based on this notion, mock-treated or filipin-treated polarized JAR
cells were exposed for 30 min to FITC-labeled Ctx. Internalization of Ctx in these cells was
measured by flow cytometry analysis. In agreement with the published report described,
25% of the control JAR cells were found positive, whereas 19% of filipin-treated cells were
positive (data not shown). Third, we verified whether filipin affects LTR-driven gene
expression in trophoblasts independently of viral internalization. To this end, polarized JAR
cells were infected with VSV-G pseudotypes for 24 h, washed extensively to remove
uninternalized virions and treated or not with filipin in the presence of TNF-α. We
observed in these conditions a 30% reduction in LTR-driven gene expression. Using this
same technical strategy, MtβCD did not modulate LTR-gene expression (data not shown).
Hence, part of the reduction in HIV-1 infectivity observed in trophoblasts in the presence of
286
filipin may be related to an indirect effect of the drug on TNF-α-mediated LTR-driven gene
expression. Collectively, our data indicate two elements. First, given that endocytosis of
HIV-1 in polarized trophoblasts is only sensitive to the cholesterol-sequestering drug,
filipin, we conclude that this pathway requires free membrane cholesterol rather than rafts
per se. Second, although rafts are unlikely to play an active role in viral internalization, it
would appear that they may be involved at later points, such as endosomal trafficking
and/or sorting. Indeed, both MtβCD and filipin reduced HIV-1 infection in these cells.
2.3.3 HIV-1 is associated with lipid rafts and does not initially co-localize
with Tfn
We have previously demonstrated that upon internalization in polarized trophoblasts, part
of HIV-1 is found in early endosomes and is subsequently localized in late endosomes (71).
In addition, blocking the function of Rab7 or Rab5 in trophoblasts severely impedes on
HIV-1 infection (75). On the other hand, our current observations indicate that the
endocytic pathway leading to HIV-1 infection of polarized trophoblasts is independent of
clathrin. This suggests an intriguing relationship between clathrin-independent endocytosis
and the classical endocytic pathway resulting in HIV-1 infection. In order to define the
localization of HIV-1 upon internalization in relation to clathrin-mediated endocytosis,
movements of HIV-1 in regards to Tfn were monitored in polarized JAR cells. The cells
were exposed to Ada-M pseudotypes loaded with the Vpr-GFP fusion protein together with
tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn for increasing length of time. To estimate colocalization events between HIV-1 and Tfn, a series of operations were performed with the
Metamorph software as described in Materials and Methods. Following a contact period of
5 min, no HIV-1-specific signal was found to co-localize with Tfn and vice versa (Figs. 5A
and 5B). After 20 min, a small proportion of HIV-1-specific signals co-localized with Tfn
at 7 μm to reach 8.5%. This number reached 24.7% at 8 μm (Fig. 5A). After 45 min, colocalization between HIV-1 and Tfn increased to 38.6% at 5 μm. This indicates that initially
upon internalization HIV-1 and Tfn use different endocytic pathways within the cells.
However, after 45 min, a portion of internalized HIV-1 particles go to the same location as
Tfn, most likely early/sorting endosomes. Similar results were found when using wild type
287
NL4-3 viruses loaded with Vpr-GFP fusion protein (data not shown). Digital images of the
cells at 6 μm following a 45 min exposure time to HIV-1 and Tfn are shown to provide a
clear representation of the co-localization events (Fig. 5C). Thus, it is reasonable to
conclude that although HIV-1 and Tfn use initially different endocytic pathways in
polarized human trophoblasts, internalized virions intersect with the classical endocytic
pathway at later time points in these cells.
Given that HIV-1 internalization and infection were reduced upon treatment with
cholesterol-disrupting drugs, the localization of HIV-1 in regards to raft-rich regions was
monitored following virus internalization in polarized JAR cells. The cells were exposed to
Ada-M pseudotypes for increasing time periods and were stained with purified polyclonal
antibodies isolated from pooled human serum from HIV-1-postive patients followed by
fluorophore-conjugated secondary antibodies. The cells were co-labeled with biotin-tagged
Ctx followed by fluorescent-tagged streptavidin. Following a contact period of 5 min,
already 10% of the HIV-1-specific signal co-localized with Ctx (Fig. 5D). The peak of colocalization between HIV-1 and Ctx was seen after 20 min where 48% of HIV-1-specific
signals co-localized with Ctx at 5 μm. After 45 min, co-localization between HIV-1 and Ctx
declined to 24% at 5 μm. Digital images of the cells at 6 μm following a 45 min exposure
time to HIV-1 and Ctx labeling are shown to provide a clear representation of the colocalization events (Fig. 5F). This indicates that during the internalization process into
polarized JAR cells, HIV-1 reaches lipid raft-rich organelles.
2.3.4 Internalization of HIV-1 is insensitive to overexpression of the
dynK44A mutant
Trophoblastic cells do not express caveolin-1 and-2, implying that no endocytic events in
these cells can be associated with caveolae. However, we next verified whether endocytosis
of HIV-1 via lipid rafts in polarized trophoblasts met the definition of caveolae-related
endocytosis, i.e. glycolipid raft-endocytosis, by evaluating the role of dynamin in HIV-1
internalization. Overexpression of a dominant-negative dynamin 2 K44A mutant
(dynK44A) deficient in GTP hydrolysis leads to inhibition of clathrin-dependent
endocytosis and also prevents the caveolae- and raft-mediated internalization (reviewed in
288
(43)). While, dynK44A successfully blocked the CME pathway in JAR cells (Figs. 6A and
6B), the internalization of Ada-M and HXB-2 pseudotypes as well as Env-deficient viruses
remained unaffected upon expression of this mutant, implying that dynamin is not involved
in HIV-1 uptake in polarized trophoblasts (Fig. 6C). Blockade of dynamin function can
modulate expression of virus receptors at the cell surface and result in increased virus
binding (49). This is not an issue in trophoblastic cells for two important reasons. Firstly,
we have previously established that HIV-1 shows poor attachment to these cells (74).
Secondly, nonspecific sugar interactions mediate viral internalization of HIV-1 into
polarized trophoblasts (74).
We would like to emphasize that a strict correlation exists between endocytic uptake and
HIV-1 infection in trophoblasts (71, 75). Hence, only treatments that reduce viral
internalization will provide information on the endocytic pathway leading to infection in
these cells. Hence, because overexpressing dynK44A did not modulate viral internalization,
this protein is not involved in the endocytic pathway associated with HIV-1 infection in
trophoblasts. In this study, infection assays were not conducted in dynK44A-transfected
cells because this mutant may not only modulate endocytosis but also more downstream
events that are not related to internalization per se. Indeed, overexpressing dynK44A, in
addition to endocytic defects, results in an elevated endosomal pH, thereby affecting
infection of pH-sensitive viruses and most likely endosomal sorting and processing (27).
Given that HIV-1 infection in trophoblasts is greatly sensitive to endosomal pH (71, 75),
and that expression of dynK44A did not modulate viral internalization in these cells, any
effect mediated by overexpression of dynK44A on HIV-1 infection in trophoblasts would
therefore be associated with events occurring more downstream of virus internalization. As
such, conducting such an experiment was deemed irrelevant for the purpose of this study.
Altogether our data indicate that not only clathrin-coated pits but also caveolae and
caveolae-related pathways are not involved in HIV-1 internalization. This statement was
further ascertained upon the observation that the kinase inhibitor PP2 and the potent
tyrosine phosphatase inhibitor bpV(pic) did not modulate in a significant manner virus
internalization (Fig. 6D). These experiments were prompted by the observation that
289
caveolae is inhibited by tyrosine kinase inhibitors and enhanced by tyrosine phosphatase
inhibitors (reviewed in (43)). To control for the efficacy of the tested drugs, PP2
successfully inhibited PMA-mediated induction of HIV-1 LTR-driven gene expression
(Fig. 6E), which is in agreement with previous findings (2). Similarly, as previously
reported (22), HIV-1 LTR-driven gene expression was triggered by the protein tyrosine
phosphatase inhibitor bpV(pic) (Fig. 6F). Given that the HIV-1 internalization pathway is in
part sensitive to raft-depletion drugs, we conclude that HIV-1 internalization into polarized
trophoblastic cells occurs via a dynamin-independent pathway requiring free cholesterol.
2.3.5 HIV-1 internalization requires the actin cytoskeleton but is
independent of microtubules
To assess whether actin reorganization was triggered upon HIV-1 internalization, polarized
JAR cells were either left untreated or pre-treated with jasplakinolide. The cells were then
washed and exposed to either wild type NL4-3 viruses or conditioned media. The cells were
next stained with rhodamine-tagged phalloidin. Jasplakinolide binds permanently to actin
but does not prevent new actin polymerization. This drug “masks” the existing
microfilaments and prevents actin de-polymerization. Upon its removal, phalloidin, which
binds the same location on actin as jasplakinolide, will only recognize newly formed actin
filaments. Therefore, if de novo actin polymerization is induced by HIV-1 upon entering
polarized JAR cells, phalloidin will only be able to bind these areas and will then be
observable by confocal microscopy. Exposure of polarized trophoblasts to HIV-1 was
found to lead to a rapid induction of de novo actin polymerization that was not seen with
conditioned media (Fig. 7). The data presented also show that jasplakinolide is an effective
drug to investigate the role of F-actin in the endocytic pathway used by HIV-1 in polarized
JAR cells. Indeed, this drug successfully competed with rhodamine-phalloidin in actin
filament binding.
To better define the internalization pathway(s) of HIV-1 into polarized trophoblasts, the
involvement of the cytoskeleton and microtubules was next evaluated. Treating the cells
with jasplakinolide resulted in a 46% and 40% reduction in internalization of Ada-M and
HXB-2 pseudotypes, respectively (Figs. 8A and 8B). On the other hand, the cytoskeleton
290
inhibitor cytochalasin B only had a modest effect on internalization of Ada-M and HXB-2
pseudotyped viruses in polarized JAR cells. Jasplakinolide and cytochalasin B are both
inhibitors of the cytoskeleton. However, they act differently. Jasplakinolide binds actin and
prevents actin de-polymerization while cytochalasin B promotes actin de-polymerization.
Hence, if only jasplakinolide blocked HIV-1 internalization, it means that this process
requires actin de-polymerization. On the other hand, the microtubule inhibitor, colchicine,
did not significantly modulate internalization of Ada-M and HXB-2 pseudotypes in
polarized JAR cells (Figs. 8C and 8D). To ensure that these data were valid, two other
inhibitors, vinblastine and paclitaxel (taxol), were tested and we made similar observations.
Hence, microtubules are not involved in HIV-1 internalization in trophoblasts. These drugs
were not tested in infectivity assays given their toxic nature when used for prolonged time
periods.
To circumvent the toxicity issue of these drugs, the following technical strategy was
undertaken. Because HIV-1 needs to access the cytoplasm for infection to ensue, cytosolic
release of the viral nucleocapsid p24 is believed to be an indicator of productive infection
(38). Consequently, drugs causing a reduction in cytosolic release would be associated with
reduced infection resulting from diminished endosomal escape. This strategy allows
investigating the role of the cytoskeleton and the microtubules, not at the onset of
endocytosis, but rather during subsequent steps including endosomal escape and/or
endocytic trafficking. Fractionation assays were performed in the presence of cytoskeleton
and microtubule inhibitors. In control cells, the distribution of HIV-1 was similar to
published observations (72). However, although jasplakinolide and cytochalasin B slightly
reduced cytosolic release of the two HIV-1 strains tested, these treatments reached
insufficient power to achieve statistical significance (Figs. 8E and 8F). Moreover, taxol did
not modulate significantly the presence of Ada-M and HXB-2 pseudotypes within the
cytoplasm (Figs. 8E and 8F). Therefore, both viral uptake and subsequent cytoplasmic p24
release are independent of microtubules. However, the actin cytoskeleton appears to be
playing an active function particularly at the level of internalization.
291
2.4 Discussion
Characterization of the endocytic pathway(s) taken by HIV-1 in human polarized
trophoblasts was up to now undefined. Given that the transit of HIV-1 within the
endosomal compartments is mandatory to achieve virus production in trophoblasts (71, 75),
this knowledge is pivotal to defining the early steps of the virus life cycle in such human
placental cells. We found that HIV-1 internalization occurs primarily via a clathrin,
caveolea and dynamin-independent pathway which is sensitive to a cholesterol-sequestering
drug. These findings provide unprecedented information on the intracellular itinerary taken
by HIV-1 inside trophoblasts. Moreover, data presented in this work suggest that HIV-1 can
now be regarded as a powerful tool to provide answer on the unusual mechanism of
dynamin-independent endocytic pathway.
Three strategies were used to demonstrate that clathrin-coated pits were not involved in
HIV-1 internalization inside polarized trophoblasts: i) treatment with chlorpromazine, ii)
overexpression of a dominant negative mutant (i.e., Eps15∆95/295) and iii) no early colocalization between Tfn and HIV-1. Caveolae and caveolae-related relying on glycolipid
rafts are related endocytic pathways characterized by their clathrin independence, dynamin
dependence and sensitivity to cholesterol depletion. However, the former is caveolindependent while the latter is independent of caveolin. Caveoale-mediated internalization is
not involved in the studied process because trophoblasts do not express caveolin-1 and -2
(34) while the caveolae-related pathway mediated through glycolipid rafts was also
dismissed. Indeed, although the trophoblasts were partly sensitive to raft-disrupting drugs,
the internalization of HIV-1 was not modulated by the expression of dynK44A. Moreover,
internalization of caveolae has been shown to be inhibited by the tyrosine kinase inhibitors
staurosporin and genistein, and enhanced by the tyrosine phosphatase inhibitors okadaic
acid and vanadate (reviewed in (43)). We demonstrated that although the kinase inhibitor
PP2 and phosphatase inhibitor bpV(pic) were effective drugs in our system, they did not
modulate viral internalization in trophoblastic cells. Overall, these data support a model in
which internalization of HIV-1 into polarized trophoblastic cells is mediated primarily via a
clathrin, caveolae and dynamin-independent pathway.
292
This being established, the question now is whether this pathway was relying or not on
membrane rafts. We observed that filipin reduced internalization of all the tested strains,
whereas MtβCD only modulated the uptake of Ada-M. Although we cannot explain why
Ada-M was the only virus affected by a treatment with MtβCD, the simplest interpretation
for the difference in sensitivity to these drugs is that free cholesterol rather than rafts per se
is required for HIV-1 internalization in trophoblasts. This agrees with a previous
publication showing that endocytosis of MHC-I molecules occurs through a clathrin,
dynamin, caveolae and raft-independent pathway. Yet, this process required free membrane
cholesterol since it was inhibited by filipin (44). A second element to consider in this matter
is the following. The apical membrane of epithelial cells, by mediating many of the
functions specific to these cells and by being exposed to the environment, needs to be
particularly sturdy. The unusual robustness of the apical membrane is largely due to its
special lipid composition. Indeed, it is strongly enriched in sphingolipids (reviewed in
(64)). Rafts have been estimated to cover 30-40% of the plasma membrane of nonpolarized
cells. However, the high proportion of sphingolipids and cholesterol in the apical membrane
could make it a continuous raft membrane in which non-raft domains are embedded
(reviewed in (64)). Hence, it is possible that filipin, by binding cholesterol, induced a higher
state of cell membrane rigidity. This would translate into poor membrane invagination and
hence, reduced HIV-1 internalization. Such effect would not be seen with MtβCD because
this drug, rather than binding to cholesterol, removes it from the cell membrane.
On the other hand, the two raft-disrupting drugs that were used in this study produced a
more dramatic effect on HIV-1 infection than on virus internalization, which leads to
several hypotheses. First, cholesterol depletion/disruption may have more effects on cell
physiology than specifically perturbing lipid rafts. Although true, the fact remains that
clathrin-independent endocytic pathways are more sensitive to depletion of cholesterol from
cell membranes than is uptake by clathrin-coated pits, suggesting that clathrin-independent
endocytic pathways display additional requirements in terms of biophysical properties of
the membrane itself (reviewed in (46)). This brings a second possibility where lipid rafts
are not only required for HIV-1 endocytosis per se but also for subsequent steps leading to
infection. These may include escaping the endosomes and accessing the cytoplasm. In
293
keeping with this notion, it has been shown that cholesterol controls the intracellular
targeting of sphingolipids and the sorting of the mannose 6-phosphate receptor out of late
endosomes to the Golgi (41). On the other hand, reduced cholesterol favours recycling of
GPI-linked proteins to the plasma membrane due to a reduced residence time in endosomal
rafts (21). Based on these published observations, we can speculate that lower cholesterol
may impede on the sorting of HIV-1 out of late endosomes upon reaching these organelles
and/or favour recycling to the apical pole towards the maternal circulation. It can thus be
proposed that membrane cholesterol and rafts are needed at two distinct moments during
HIV-1 early life cycle. Initially, free membrane cholesterol is required to participate to
virus internalization. Subsequently, upon reaching intracellular organelles, increased
interactions between the incoming viral particles and glycolipid rafts become required for
proper sorting. This is fully supported by our observation showing that HIV-1 accumulates
within GM1-enriched locations (i.e., labelled with Ctx).
The internalization of HIV-1 within polarized trophoblastic cells was incompletely reduced
by cytochalasin B and jasplakinolide. The requirement for microfilaments and microtubules
during endocytosis (except for macropinocytosis) is not strict and frequently cell-type
specific (56). This being said, HIV-1 induces new actin polymerization upon its contact
with trophoblasts but its internalization in these cells is only moderately affected by
jasplakinolide. These data are in agreement with previous observations made by others.
Indeed, it is known that several accessory proteins associated with clathrin-mediated uptake
interact either directly or indirectly with the endocytic cell machinery and with the
cytoskeleton. Moreover, although actin polymerization is stimulated by such proteins,
inhibitors of the cytoskeleton often do not impede on clathrin-mediated endocytosis. Hence,
it is thought that actin may serve as an anchor for the scaffolding of proteins involved in
clathrin-mediated endocytosis and/or act to propel newly formed vesicles out of the actin
network at the cell cortex (reviewed in (16, 63)). It is quite conceivable that similar events
are operating in trophoblasts.
The discovery that endosomal escape is independent of microtubules was surprising given
that microtubules control movements along the intracellular endocytic route. However, it is
294
established that microtubule-disrupting agents, such as nocodazole, inhibit the transport to
late endosomes by accumulating markers in endosomal carrier vesicles, an intermediate
compartment between early and late endosomes. Interestingly, it was shown that lysosomal
degradation of the human rhinovirus serotype 2 is suppressed, whereas its conformational
change and infectivity remain unaffected by this drug (6). Assuming that infection can take
place from these organelles in polarized trophoblastic cells, these data provide a good
explanation as to why the drugs tested did not impact on endosomal escape.
HIV-1 was found to colocalize with Tfn only by 45 min. We had shown in a previous work
that approximately 40% of HIV-1 is located inside early endosomes (EEA-1+) within 15
min of viral internalization, and 20% within recycling endosomes (Rab11+) by 1 h, thus
illustrating a movement of the virus from one organelle to the other (71). On the other hand,
it is established that Tfn reaches early endosomes before being recycled through recycling
endosomes. Therefore, the co-localization between HIV-1 and Tfn observed in this study
likely represents the sum of HIV-1 within early endosomes and recycling endosomes.
Although different kinetics of internalization between HIV-1 and Tfn cannot be dismissed,
these data illustrate that HIV-1 and Tfn initially take on different endocytic routes.
Interestingly, their pathways eventually intersect since at later time points HIV-1 is found
associated with Tfn. It will be important to define the mechanism of such intracellular
movement and whether cholesterol/rafts play a role in this process. There are few reports in
the literature that show convergence of non-clathrin and clathrin-derived endosomes (e.g.
MCH-I, SV40 and Ctx) (45, 51). In agreement with a merger between these two endocytic
pathways, we have recently shown that expression of a dominant negative vector coding for
Rab5 (controls trafficking to early endosomes) or Rab7 (controls movements towards late
endosomes) in trophoblasts severely impeded on HIV-1 infection (75). Upon internalization
in brain microvascular endothelial cells by macropinocytosis, HIV-1 does not co-localize
with Tfn but with Ctx (32). Subsequently, cytoplasmic HIV-1-containing-vesicles fused
with lysosomes. However, contrary to our data, these authors saw no evidence of
productive infection.
295
Previous electron microscopic studies revealed that upon attachment of HIV-1-infected T
cells to the trophoblastic cell line BeWo, virions bud from the lymphocyte donor cells at the
point of cell-cell contact and are rapidly taken up by the trophoblasts via coated pits (19, 54,
55). The differences between these observations and our report might be associated with the
cell lines used and in the fact that we used trophoblasts grown into a polarized monolayer,
which is a more physiological approach. Alternatively, cell-free viruses versus cellassociated viruses may use different endocytic internalization pathways.
In summary, infection of trophoblastic cells upon HIV-1 internalization occurs through an
unusual clathrin, caveolae and dynamin-independent pathway relying on free cholesterol. In
addition, our data provide not only a unique understanding of the biology of HIV-1 within
human placental cells but valuable information on some other cell types involved in HIV-1
pathogenesis. Indeed, infection of mucosal cells as well as transcytosis and viral transfer
from dendritic cells to CD4+ T cells are poorly understood events thought to be associated
with endocytosis of viral particles (12, 24). Finally, HIV-1 internalization into trophoblastic
cells provides a compelling example of clathrin-independent endocytosis. It will now be
important to define how HIV-1 escapes the endosomal machinery and establish a
productive infection in polarized human trophoblasts.
2.5 Acknowledgements
We thank the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) HIV/AIDS Research Program
(grant #HOP-67259) for financially supporting our research. This work was performed by
G.V. in partial fulfillment of her Ph.D. Degree in the Program of MicrobiologyImmunology, Faculty of Medicine, Laval University. G.V. is the recipient of a CIHR
Doctoral Research Award from the HIV/AIDS Research Program and M.J.T. holds the
Canada Research Chair in Human Immuno-Retrovirology (Tier 1 level).
296
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302
Section 3
Figure legends
Fig. 1. HIV-1 infection is not inhibited by chlorpromazine. (A) Polarized JAR cells were
labeled with Cell Tracker Green and were either left untreated (a to c) or treated with
chlorpromazine (d to f) before addition of tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn. The
images shown are the arithmetic sum of entire stacks of the cell monolayer. Tetramethyl
rhodamine-conjugated Tfn is shown in red, whereas Cell Tracker Green is depicted in
green. Overlay of signals are depicted in panels c and f (Bar: 30 μm). (B) Arithmetic sum of
signal integrations (for tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn) of entire stacks of the cell
monolayer treated or not with chlorpromazine. (C to E) Polarized JAR cells were either left
untreated or treated with chlorpromazine. Next, the cells were exposed to recombinant
luciferase-encoding pseudotyped (Ada-M and HXB-2) or Env-deficient viruses for 24 h at
37°C. The cells were then stimulated for 24 h with TNF-α. Luciferase activity was
monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are expressed as relative light
units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples and
are representative of three independent experiments.
Fig. 2. Internalization of HIV-1 is unaffected by blocking the clathrin endocytic pathway.
(A) Polarized JAR cells transfected with EGFP control (a) or Eps15∆95/295 expression
vector (b) were exposed to tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn. The images shown are
the arithmetic sum of entire stacks of the cell monolayer (Bar: 15 μm). (B) Arithmetic sum
of signal integrations (for tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn) of entire stacks of the cell
monolayer transfected with EGFP control or Eps15∆95/295 expression vector. (C) Cells
were first transfected with EGFP control or Eps15∆95/295 expression vector before
exposure to the listed HIV-1 stocks. Viral internalization was assessed by measuring the
p24 content in each cell lysate. Data shown are expressed as the means ± S.D. of triplicate
samples and are representative of three independent experiments.
Fig. 3. HIV-1 infection is reduced upon cholesterol depletion. (A) Polarized JAR cells
were either left untreated (a) or treated with MtβCD (b). The cells were fixed and labeled
with filipin. The images shown are the arithmetic sum of entire stacks of the cell monolayer
303
(Bar: 20 μm). (B) Arithmetic sum of signal integrations (for filipin) of entire stacks of the
cell monolayer treated or not with MtβCD. (C) Polarized JAR cells were left untreated or
treated with MtβCD with or without subsequent rescue with soluble cholesterol. The cells
were exposed to pseudotyped (Ada-M and HXB-2) or Env-deficient viruses and viral
internalization was measured by evaluating the amount of p24 in each cell lysate. Data
shown are expressed as the means ± S.D. of triplicate samples and are representative of
three independent experiments. (D to F) For estimating HIV-1 infection, polarized JAR
cells were either left untreated or treated with MtβCD. Next, the cells were exposed to the
listed virus stocks for 24 h at 37°C and stimulated for 24 h with TNF-α. Luciferase activity
was monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are expressed as relative
light units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples
and are representative of three independent experiments. Asterisks denote statistically
significant data (**, p<0.01). Statistical analysis was achieved using the Student’s paired ttest, with a two-tailed distribution. Homogeneity of variances was also tested and deemed
as such in each case.
Fig. 4. Filipin severely diminishes HIV-1 internalization and infection. (A) Polarized JAR
cells were left untreated or treated with filipin and the cells were exposed to pseudotyped
(Ada-M and HXB-2) or Env-deficient viruses. Viral internalization was measured by
evaluating the amount of p24 in each cell lysate. Data shown are expressed as the means ±
S.D. of triplicate samples and are representative of three independent experiments. (B to D)
For estimating HIV-1 infection, polarized JAR cells were left untreated or treated with
filipin. Next, the cells were exposed to the listed reporter viruses for 24 h at 37°C and
stimulated for 24 h with TNF-α. Luciferase activity was monitored in each cell lysate.
Values from the luminometer are expressed as relative light units (RLU). Data shown are
expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples and are representative of three
independent experiments. Asterisks denote statistically significant data (**, p<0.01).
Statistical analysis was achieved using the Student’s paired t-test, with a two-tailed
distribution. Homogeneity of variances was also tested and deemed as such in each case.
304
Fig. 5. HIV-1 does not initially co-localize with transferrin. (A to C) Polarized JAR cells
were exposed to both Ada-M pseudotypes loaded with Vpr-GFP and tetramethyl
rhodamine-conjugated Tfn. (D to F) Polarized JAR cells were first exposed to Ada-M
pseudotypes. Next, the samples were co-labeled with purified human anti-HIV-1 followed
by Alexa 488-conjugated goat anti-human and biotin-tagged Ctx used in combination with
Alexa 546-labelled streptavidin. All samples were scanned through confocal laser
microscope. Percentage of co-localization (5, 20 and 45 min post internalization) of Ada-M
vs Tfn (A), Tfn vs Ada-M (B), Ada-M vs Ctx (D) and Ctx vs Ada-M (E) are shown and this
over five consecutive cell layers (μM) of the entire stack of layers scanned from the apex to
the bottom of the cell monolayer. (C and F) Digital images of the 6 μm cell layer following
a 45 min exposure period to HIV-1: Ada-M pseudotypes tagged with Vpr-GFP (C-a) or
Ada-M pseudotypes labeled with human anti-HIV-1 followed by Alexa 488-conjugated
goat anti-human (F-a) are shown in green while Tfn (C-b) or Ctx (F-b) are depicted in red.
Overlay of signals specific for HIV-1 and Tfn (C-c), HIV-1 and Ctx (F-c) are displayed.
Zoom in of the specified region are illustrated (C-d and F-d) (Bar: 10 μm).
Fig. 6. Virus internalization is not affected upon expression of the dynK44A mutant and
treatment with a tyrosine kinase or tyrosine phosphatase inhibitor. (A) Polarized JAR
cells transfected with EGFP control (a) or dynK44A expression vector (b) were exposed to
tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn. The images shown are the arithmetic sum of entire
stacks of the cell monolayer (Bar: 30 μm). (B) Arithmetic sum of signal integrations (for
tetramethyl rhodamine-conjugated Tfn) of entire stacks of the cell monolayer transfected
with EGFP control or dynK44A expression vector is shown. Polarized JAR cells were (C)
transfected with EGFP control vector or dynK44A expression vector, or (D) left untreated
or pretreated with PP2 or bpV(pic). Next, the cells were exposed to Ada-M pseudotyped
viruses. Viral internalization was measured by evaluating the amount of p24 in each cell
lysate. Data shown are expressed as the means ± S.D. of triplicate samples and are
representative of three independent experiments. (E) Polarized JAR cells or (F) Jurkat cells
were exposed to VSV-G pseudotyped reporter viruses and subsequently treated with the
indicated drugs. Luciferase activity was monitored in each cell lysate. Values from the
305
luminometer are expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed as the
means ± S.D. of quadruplicate samples.
Fig. 7. De novo synthesis of actin is induced upon HIV-1 internalization. Serum-starved
polarized JAR cells were either left untreated (A) or treated with jasplakinolide (B to G).
Next, the cells were exposed to conditioned media (B, D and F) or fully competent NL4-3
viruses for 5 (C), 20 (E) and 45 min (G) (Bar: 10 μm).
Fig. 8. HIV-1 internalization requires the cytoskeleton but is independent of
microtubules. (A and B) Polarized JAR cells were pre-treated with the appropriate vehicle
(control), jasplakinolide (Jasplk.), or cytochalasin B (Cyto. B). (C and D) Cells were pretreated with the appropriate vehicle (control), colchicine, vinblastine, or taxol. Next, the
cells were exposed to pseudotyped viruses (Ada-M and HXB-2). Viral internalization was
measured by evaluating the amount of p24 in each cell lysate. Data shown are expressed as
the means ± S.D. of triplicate samples and are representative of three independent
experiments. (E and F) The levels of p24 present in cytosolic and vesicular fractions were
estimated upon cell disruption by Dounce homogenization. Data shown are expressed as the
means ± S.D of the ratio of p24 present in the cytosol or vesicles over the sum of p24
present in the two fractions. Data shown are representative of three independent
experiments. Asterisks denote statistically significant data (*, p<0.05 and **, p<0.01).
Statistical analysis was achieved using the Student’s paired t-test, with a two-tailed
distribution. Homogeneity of variances was also tested and deemed as such in each case.
306
Section 4
4.1 Figure 1
Figures
307
4.2 Figure 2
308
4.3 Figure 3
309
4.4 Figure 4
310
4.5 Figure 5
311
4.6 Figure 6
312
4.7 Figure 7
313
4.8 Figure 8
314
Chapitre 6. LE ROLE DU RAB5 ET DE RAB7 DANS
LES ETAPES PRECOCES DU CYCLE
REPLICATIF DU VIH-1
Section 1
Cinquième article scientifique
1.1 Title page
1.1.1 Title
Rab5 and Rab7, but not ARF6, govern the early events of HIV-1 infection in polarized
human placental cells1.
1.1.2 Authors
Gaël Vidricaire and Michel J. Tremblay2.
1.1.3 Affiliation
Research Center in Infectious Diseases, CHUL Research Center, and Faculty of Medicine,
Laval University, Quebec, Canada.
1.1.4 Running title
Endocytosis of HIV-1 in human polarized trophoblasts.
1.1.5 Keywords
HIV, Viral, Trophoblast, Endocytosis, Rab proteins.
1.2 Résumé
Nous pensons que les trophoblastes, cellules formant la charpente du placenta, jouent un
rôle déterminant dans la transmission in utero du VIH-1. Des résultats précédemment
obtenus nous permettent de croire que, d’une part, l’infection des cellules par le VIH-1 est
315
associée à une internalisation par une voie indépendante de la clathrine et des cavéoles et
que, d’autre part, cet évènement est suivi par un transit intracellulaire des virions vers de
multiples organelles. De plus, une partie de ce transit intracellulaire implique le
déplacement du VIH-1 d’endosomes qui sont négatifs pour la transferrine vers des
endosomes positifs pour la transferrine et pour l’EEA-1, suggérant que les voies
d’endocytose classique et non classique se rencontrent dans les trophoblastes. Dans cet
article, nous avons étudié la relation entre la présence du VIH-1 à l’intérieur d’endosomes
spécifiques dans les trophoblastes et le processus infectieux. Nous avons démontré que
l’infection virale est essentiellement perdue lorsque des inhibiteurs des endosomes sont
ajoutés peu de temps après l’infection. Ainsi, contrairement à ce que l’on observe dans les
lymphocytes T CD4+, la présence initiale du VIH-1 à l’intérieur des endosomes est
obligatoire pour que se produise l’infection. De plus, ce processus est indépendant des
protéines de l’enveloppe virale, la gp120 et la gp41. Les protéines Rab, faisant partie de la
famille des petites GTPases, coordonnent le transport vésiculaire entre les différentes
organelles endocytaires. L’utilisation de divers vecteurs d’expression nous a permis de
montrer que l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes polarisés dépend à la fois du Rab5
et du Rab7 mais ne requiert pas l’Arf6 ou le Rab11. De plus, nous concluons que le Rab5
contrôle les mouvements vésiculaires de régions riches en radeaux lipidiques aux
endosomes précoces et que ce transit est requis pour que les virions atteignent
subséquemment les endosomes tardifs par l’action de Rab7. Ce déplacement complexe des
virions dans la cellule est nécessaire pour que l’infection du VIH-1 puisse avoir lieu dans
les trophoblastes humains polarisés.
1.3 Abstract
Trophoblasts, the structural cells of the placenta, are thought to play a determinant role in in
utero HIV-1 transmission. We have accumulated evidence suggesting that HIV-1 infection
of these cells is associated with uptake by an unusual clathrin/caveolae-independent
endocytic pathway and that event is followed by trafficking through multiple organelles.
Furthermore, part of this trafficking involves the transit of HIV-1 from transferrin-negative
to EEA1 and transferrin-positive endosomes, suggesting a merger from non-classical to
316
classical endocytic pathways in these cells. In the present paper, the relationship between
the presence of HIV-1 within specific endosomes and infection was studied. We
demonstrate that viral infection is virtually lost when endosome inhibitors are added shortly
after exposure to HIV-1. Thus, contrary to what is seen in CD4+ T lymphocytes, the initial
presence of HIV-1 within the endosomes is mandatory for infection to take place.
Importantly, this process is independent of the viral envelope proteins gp120 and gp41. The
Rab family of small GTPases coordinates the vesicular transport between the different
endocytic organelles. Experiments performed with various expression vectors indicated that
HIV-1 infection in polarized trophoblasts relies on Rab5 and Rab7 without the contribution
of Arf6 or Rab11. Furthermore, we conclude that Rab5 drives movements from raft-rich
region to early endosomes and this transit is required for subsequently reaching late
endosomes via Rab7. This complex trafficking is mandatory for HIV-1 infection to proceed
in human polarized trophoblasts.
Section 2
2.1 Introduction
Vertical transmission of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a serious
global health problem. Currently, 2.1 millions children less than fifteen years of age are
infected by HIV-1 worldwide and 90% of these infections are associated with mother-tochild transmission (MTCT) of this retrovirus (60). The risk of vertical transmission lies
within the range of 15 to 25% in industrialized countries and reaches 35% in developing
countries (60). MTCT may occur in utero, at birth during delivery, or through breastfeeding
(reviewed in (48)). Vertical transmission occurring through breastfeeding or at birth most
likely involves ingestion of contaminated fluids (e.g., milk, vaginal secretion and blood) by
the infant. On the other hand, in utero HIV-1 transmission requires a direct implication of
the placenta (reviewed in (48)).
Mathematical modeling has estimated that while 65% of the infections occur at birth, onethird of the infants are considered to become infected in utero less than two months before
delivery (47). This being said, in utero HIV-1 transmission has been documented by several
317
groups (7, 28, 43, 69). In addition, vertical transmission can occur early during pregnancy
since HIV-1 has been detected in aborted foetuses as early as after 8 weeks of gestation
(25) and in first and second trimester foetuses (6, 13, 29, 52). In utero transmission of HIV1 is poorly understood and the importance of studying such a process is related to the
following facts. If we consider again the mathematical modeling cited above, it can be
estimated that amongst the 2 millions children currently living with HIV-1/AIDS, hundreds
of thousands of these infections occurred in utero. Hence, although in utero transmission is
unlikely the primary cause of infection in infants, given the scale of the pandemic, the
resulting numbers are substantial. Additionally, the risks of acquiring HIV-1 is 1.3 fold
higher in adult African women than in men of the same age, and among young women aged
between 15 to 24 this disparity is more important since a three-fold difference is reported.
As a result, women are becoming infected at a higher frequency than men (58, 59).
Antiretroviral therapies are known to significantly reduce the incidence of vertical
transmission (33). However, according to recent UNAIDS statistics gathered in developing
countries, only 10% of pregnant women received pre-birth counselling for preventing
MTCT and only 7% of people had access to antiretroviral treatments in 2003 (58, 59).
Consequently, initiatives to prevent vertical transmission of HIV-1 are now aimed at
developing strategies that are readily available to women. In this context, it is well
recognized that a better understanding of how and when vertical transmission occurs is
crucial (58, 59).
The placenta functions as a barrier composed of a double layer of polarized epithelial-type
cells, i.e. the cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts. Trophoblasts separate the maternal
and foetal blood circulations and control fluxes between them. Thus HIV-1 must first cross
this natural barrier before reaching the foetal circulation. Current models propose that
following infection of trophoblasts and/or transcytosis across these cells, HIV-1 is released
from the basolateral pole of the trophoblasts (facing the foetal circulation) leading to
productive infection of the underlying foetal cells (2, 3, 17, 24, 42, 64, 65, 67). The
mechanisms associated with these events are ill-defined and it is also unknown in which
proportions each pathway contributes to vertical transmission.
318
HIV-1 is an enveloped virus that gains entry into susceptible cells upon fusion of its outer
membrane with the plasma membrane of a target cell. This process involves coordinated
interactions between the viral envelope (Env) glycoproteins gp120 and gp41 and the
primary cellular receptor CD4 and a co-receptor such as CXCR4 or CCR5. HIV-1 infection
is pH-independent and does not require endocytosis of CD4 (27, 53). Several reports have
documented that trophoblasts sustain HIV-1 infection both in vitro and in vivo (2, 3, 16, 24,
42, 62, 64, 65, 67). However, like other epithelial cells, macrophages, dendritic cells and
astrocytes, their permissiveness to HIV-1 infection is estimated to be lower than that of
CD4+ T lymphocytes, the primary target of HIV-1 infection (unpublished observations and
(62)). One of the reasons postulated for such a restricted susceptibility to virus infection is
linked with the low to absent expression of CD4, CXCR4 and CCR5 in trophoblasts (21,
23, 30, 34, 66). At the same time, the process of viral entry is enigmatic given the absence
of the appropriate receptor and co-receptors. Contrary to previous assumptions, we made
the surprising discovery that HIV-1 is massively endocytosed within trophoblastic cells
(61, 62). However, as a consequence, virions are predominantly trapped within the
endosomal compartments of the cells. This event is believed to translate into weak HIV-1
production due to an inefficient endosomal escape by HIV-1 combined to a rapid
degradation of the majority of the viral particles in the endosomal/lysosomal compartments
of the infected cells. Because of this entry pathway, although trophoblasts display no
blocking mechanism for viral transcription or viral production, pro-inflammatory cytokines
are required to promote virus gene expression in these cells. It is postulated that such
cytokines, transiently expressed during pregnancy, sporadically create favorable conditions
leading to in vivo vertical transmission of this retrovirus (34, 62, 64). It is important to state
that virus entry leading to infection of trophoblasts is unexpectedly independent of gp120
and gp413. Finally, inhibitors of the function of the endosomes block HIV-1 infection of
trophoblasts (61). This last observation is particularly meaningful since it implies that
internalization of HIV-1 by endocytosis, which results in the presence of viral material
within the endosomes, is an obligatory step for infection to proceed in human trophoblasts.
This is radically different from what is seen in CD4+ T lymphocytes (27, 31, 53). Given
that internalization of HIV-1 within trophoblasts is required for infection to take place in
319
these cells, defining how the presence of HIV-1 within the endocytic compartments relates
to infection in trophoblastic cells is crucial. This paper addresses this key question.
Upon internalization, macromolecules (or pathogens) travel through a number of endocytic
sub-compartments where sorting decisions are made for recycling to the plasma membrane
or targeting to the lumen of late endosomes/lysosomes. Hence, the fate of
macromolecules/pathogens is dictated by their intracellular endocytic route. Importantly,
the precise location in endocytic compartments where viral escape is occurring is often
critical in yielding productive infection or not (39). The Rab family of small GTPases
coordinates the vesicular transport between the different endocytic organelles. Distinct Rab
proteins have been identified and each is specifically associated with a particular organelle
or pathway. For instance, Rab5 is needed for early endosomes, Rab7 for transport from
early to late endosomes and from late endosomes to lysosomes, whereas Rab11 is enriched
in recycling endosomes (68). Dominant-negative or active mutant versions of Rab proteins
have proven to be powerful tools for analyzing defined trafficking pathways within cells
(reviewed in (51)). The dominant negative Rab5 mutant (Rab5 S34N), defective in
guanine-nucleotide binding, inhibits early endosome fusion and causes the accumulation of
small vesicles at the cell periphery. By contrast, the constitutively active Rab5 mutant
(Rab5 Q79L) enhances endocytosis and early endosome fusion, causing the formation of
enlarged early endosomes. Similar observations are obtained upon overexpression of wild
type Rab5 (54). The dominant-negative Rab7 mutant (Rab7 T22N) blocks the transport of
receptors to late endosomes and results in its retention in Rab5-positive early endosomes.
Cells expressing a wild type or a constitutively active Rab7 mutant (Rab7 Q67L) exhibit
enhanced association with lysosomes (10, 19). The Rab11 mutant defective in GTP binding
(Rab11 S25N) impairs recycling by inhibiting transport from sorting endosomes (early
endosomes) to the recycling endosomes (57). Overexpression of wild type Rab11 or
dominant active Rab11 (Rab11 Q70L) promotes recycling in some instances (14).
An important issue arises for macromolecules/pathogens internalized independently of
clathrin-coated pits. Indeed, these macromolecules may or may not intersect with the
classical endocytic pathway, and if indeed they do, the mechanism underlying such an
320
event is poorly understood. The Ras-related protein Arf6 can return glycosylphosphatidyl
inositol-anchored proteins to the plasma membrane. Alternatively, inactivation of Arf6
leads to convergence with the classical early endosomes and traffic to late
endosomes/lysosomes (38).
As described earlier, the contact between HIV-1 and trophoblasts results in massive and
rapid uptake of virions within these cells by endocytosis, a process that is required for
infection to proceed in trophoblasts (61, 62). We have recently provided evidence that the
internalization pathway leading to HIV-1 infection of trophoblasts is independent of
clathrin-coated pits and caveolae but is sensitive to raft-perturbing drugs4. Moreover, the
early events associated with HIV-1 infection in polarized human trophoblasts involve an
active participation of the endocytic machinery (61). For instance, confocal studies
demonstrated that, although HIV-1 particles do not initially co-localize with transferrin in
polarized JAR cells, a marker of the classical endocytic pathway, they do at later time
points4. Moreover, we found that HIV-1 is in part associated with EEA1-expressing early
endosomes (61). Given that HIV-1 internalization does not rely on clathrin-mediated
endocytosis, the taken intracellular endocytic route most likely involves a merger between
non-classical endocytic and classical pathways4. On the other hand, with time, some virions
also reach Rab11+ recycling endosomes. However, the majority of the virions accumulate
within CD63+ late endosomes (61). Given that HIV-1 is located within different organelles
upon internalization into trophoblasts and its presence within endosomes is necessary for
infection to ensue (61), defining which organelle(s) is required for infection to proceed in
polarized trophoblasts might provide critical information on in utero HIV-1 transfer. In this
study, the involvement of specific Rab proteins (i.e. Rab5, Rab7 and Rab11) and Arf6 was
analyzed in the context of viral infection in polarized trophoblasts. We found an intriguing
relationship between trafficking of HIV-1 within the endocytic compartments and viral
infection. Collectively, our data provide unprecedented information on the identity of
subcellular organelles that might be involved in vertical transmission of HIV-1.
321
2.2 Material and Methods
2.2.1 Cells
The human trophoblastic JAR and 293T cell lines were obtained from the American Type
Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cells were maintained as previously described
(61). For the experiments performed in this work, JAR cells were grown into a polarized
monolayer. This goal was achieved by seeding JAR cells in 24-well cell culture inserts
containing a 0.4 μm pore size PET track-etched membrane (Becton Dickinson Labware,
Franklin Lakes, NY, USA) and the cells were grown to complete confluence and polarize
for 4 days as described previously (61).
2.2.2 Molecular constructs and preparation of virus stocks
The pNL4-3 (X4-tropic) (herein referred as to NL4-3 wild type) is a full length infectious
molecular clone of HIV-1. The NL4-3 Luc+E-R+ vector was constructed by inserting a
frameshift mutation near the env gene and the firefly luciferase reported gene into the nef
gene (kindly supplied by N. R. Landau, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla,
CA) (12). pHXB2-env is a mammalian expression vector coding for the HIV-1 HXB2 (X4tropic) Env glycoprotein. This construct was obtained through the AIDS Repository and
Reagent Program (Germantown, MD). The pcDNA-1/Amp-based expression vector coding
for the HIV-1 Ada-M (R5-tropic) full-length Env protein was generously provided by N. R.
Landau. The pHCMV-G molecular construct codes for the broad-host-range vesicular
stomatitis virus Env glycoprotein G (VSV-G) under the control of the human
cytomegalovirus promoter (63). Viruses were produced by calcium phosphate transfection
of 293T cells as described previously (62). Using the same protocol, the NL4-3 Luc+E-R+
expression vector was used to produce Env-deficient reporter viruses (called NL4-3∆Env).
2.2.3 Transfection of polarized JAR cells
The cDNAs of the small GTPase proteins and their mutants are all fusion proteins with the
enhanced green fluorescent protein (EGFP). The EGFP, EGFP-Rab5 (i.e. Rab5 WT, Rab5
S34N and Rab5 Q79L) and EGFP-Rab11 expression vectors (i.e. Rab11 WT, Rab11 S25N
322
and Rab11 Q70L) were kindly provided by S.S. Ferguson (Robarts Research Institute,
London, Canada). The EGFP-Rab7 expression vectors (i.e. Rab7 Q67L and Rab7 T22N)
were supplied by B. van Deurs (The Panum Institute, University of Copenhagen, Denmark)
and the EGFP-Arf6 expression vectors (i.e. Arf6 WT, Arf6 T27N and Arf6 Q67L) were
kind gifts from J.G. Donaldson (NIH, Bethesda, MD). Polarized JAR cells (as described
above) were transfected using lipofectamine (Invitrogen Canada Inc., Burlington, Canada).
Cells were either mock-transfected or transfected with 0.2 µg of carrier DNA and 5, 6, 15
or 25 ng of the expression vector of interest. The following day, cells were washed three
times with phosphate-buffered saline (PBS). Viral entry and infection assays were
performed 12 to 24 h later as described below. Transfection efficiencies when using the
various Rab expression vectors reached 50% as monitored by EGFP expression (data not
shown).
2.2.4 Viral entry assay
Polarized JAR cells were pre-treated with vehicle, 0.1 μM bafilomycin A1, 10 mM
ammonium chloride (NH4Cl), or 10 nM wortmannin (Sigma-Aldrich) for 30 min at 37°C.
These pre-treated cells or the transiently transfected JAR cells were exposed to
pseudotyped and Env-deficient viruses (250 ng of p24) for 1 h at 37˚C. At this point, the
cells were acid-treated (0.5 M NaCl and 1% acetic acid) at 4˚C for 1 min and washed three
times with ice-cold PBS to remove all uninternalized viral particles. Finally, the cells were
lysed in ice-cold lysis buffer (20 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl and 0.5% Triton X100) and virus content was measured using a homemade p24 enzymatic test (9).
2.2.5 Infection assay
Polarized JAR or Jurkat cells (1 x 106 cells) were exposed to recombinant luciferaseencoding viruses pseudotyped with HXB-2 (0, 100, 125, 250 ng of p24 or 250 ng together
with 10 μM of zidovudine/AZT) at 37˚C for 24 h. In some experiments, untransfected or
transiently transfected polarized JAR cells were exposed to pseudotyped viruses (Ada-M or
HXB-2) (250 ng of p24), Env-deficient viruses (250 ng of p24), or VSV-G pseudotypes
(0.2 ng of p24) at 37˚C for 24 h. At this time point, TNF-α (10 ng/ml) (PeproTech EC Ltd,
323
London, United Kingdom) was added for 24 h at 37˚C to induce virus gene expression (62).
Finally, the cells were lysed and luciferase activity was monitored in each cell lysate as
described previously (4). For experiment aimed at blocking virus infection, the cells were
pre-treated for 30 min at 37˚C with vehicle (used as a control), 0.1 μM bafilomycin A1, 10
mM NH4Cl, or 1 mg/ml leupeptin (Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, Canada). In these
assays, the drugs were present throughout the duration of the experiment. For estimating
kinetics of inhibition of HIV-1 infection, bafilomycin A1 or NH4Cl was added 30 min prior
to virus exposure for 6 h at 37˚C. Cells were next washed two times with PBS and fresh
media was added. Bafilomycin A1 or NH4Cl was added at this point (i.e. 6 h after the onset
of infection) or 12 h or 24 h following the onset of virus infection. The proinflammatory
cytokine TNF-α (10 ng/ml) was also added at 6 h following the initial exposure to HIV-1.
Finally, the cells were lysed 24 h later and luciferase activity, which is indicative of virus
gene expression, was monitored in each cell lysate.
2.2.6 Cell fractionation assay
Polarized JAR cells were pre-treated with vehicle, 0.1 μM bafilomycin A1, 10 mM NH4Cl,
or 10 nM wortmannin for 30 min at 37°C. The cells were then exposed to viruses
pseudotyped with VSV-G, Ada-M or HXB-2 Env (250 ng of p24) for 4 h (for 30 min and 2
h in some experiments) at 37°C. At this point, the cells were washed three times with PBS
and trypsinized for 5 min at 37°C. The cells were pelleted by centrifugation (1,200 rpm for
5 min at 4°C) and washed two times with ice-cold PBS. To disrupt cellular membranes,
cells were resuspended in 600 μl of ice-cold hypotonic buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.5],
10 mM KCl and 1 mM EDTA) for 1 min and broken down by Dounce homogenization
(three strokes, 7-ml B pestles). Nuclei, cell debris and undamaged cells were pelleted by
centrifugation (1,800 rpm for 5 min at 4°C). Supernatants containing cytosol and vesicles
(including endosomes) were centrifuged at 12,000 rpm for 90 min at 4°C in a Heraeus
centrifuge. Supernatant that represents the cytosolic fraction was adjusted to 0.5% Triton X100 while the pellet which is the vesicular fraction was resuspended in lysis buffer (20 mM
HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl and 0.5% Triton X-100). The level of p24 present in each
fraction was assessed using the p24 test.
324
2.2.7 Real-time PCR
Polarized JAR and Jurkat cells (1 x 106 cells) were either left untouched or exposed to NL43 wild type viruses (250 ng of p24) in the absence or presence of AZT (10 µM ) for 48 h at
37°C. Infected cells were then washed twice with PBS and trypsinized at 37°C for 5 min.
The cells were pelleted down by centrifugation (1,200 rpm for 5 min at 4°C) and washed
twice with PBS. Total cellular DNA was isolated using the DNeasy Tissue Kit as described
by the manufacturer (QIAGEN Inc., Mississauga, ON). To quantify the amount of
integrated viral DNA, we used the real-time PCR approach described by Suzuki and
colleagues (55). Briefly, a first round of PCR amplification was carried out using 100 ng of
DNA and Taq DNA polymerase (Promega, Nepean, Ontario, Canada). The primers were:
Alu-specific sense primer (5’-TCC CAG CTA CTC GGG AGG CTG AGG-3’) and an
antisense HIV-1 specific primer (M661) (5’-CCT GCG TCG AGA GAT CTC CTC TG-3’,
673-695). Cycling conditions included an initial denaturation step (94°C for 3 min),
followed by 22 cycles of denaturation (94°C for 30s), annealing (66°C for 30s), and
extension (70°C for 10 min) followed by a final extension (72°C for 10 min). The first PCR
products were subsequently diluted 5-fold and subjected to a real-time PCR assay targeting
the HIV-1 R/U5 region. The primers were: R/U5 DNA sense primer (M667) (5’-GGC TAA
CTA GGG AAC CCA CTG C-3’, 496-517) and the antisense primer (AA55) (5’-CTG
CTA GAG ATT TTC CAC ACT GAC-3’, 612-635). The fluorogenic probe HIV-FAM
(Biosearch Technologies, Novato, CA) was designed to anneal to the target between the
sense primer M667 and the antisense-primer AA55 in the R-U5 region: 5'-(FAM) TAG
TGT GTG CCC GTC TGT TGT GTG AC (BHQ-1)-3'. PCR was performed using the
Rotor-Gene 3000TM four-channel multiplexing system (Corbett Research, Sydney,
Australia) and Taq DNA polymerase. Cycling conditions included 40 cycles of
denaturation (95°C for 20s) and extension (60°C for 1 min). In order to detect retrotranscribed viral DNA, isolated DNA was subjected to the first PCR reaction in the absence
of Taq DNA polymerase and then the samples were subjected to the real-time PCR
reaction.
325
2.3 Results
2.3.1 Trophoblastic cells are less susceptible to HIV-1 infection than T
lymphocytes
Trophoblasts form in vivo a polarized-like epithelium. Cell polarity is essential to the
biological properties and functions of simple epithelia because it leads to polarized
endocytic pathways (apical and basolateral), each of which uses a complex succession of
intracellular compartments that include the early, late and recycling endosomes. These
endocytic pathways control the fate of endocytosed macromolecules/pathogens. Hence, to
study endocytic pathways in these cells, it is of utmost importance that cell polarity be
maintained. Purification of primary trophoblasts is extremely difficult, but more
importantly, it results in the loss of cell polarity (8). To resolve this issue, the human
trophoblastic cell line JAR, which exhibits many characteristics of the early placenta (44),
was used. Indeed, when grown on permeable supports, they form a polarized epitheliumlike monolayer closely resembling the trophoblastic barrier in vivo. This model system,
which provides an elegant alternative to primary cells (61), was used in this study.
To define the susceptibility to HIV-1 infection of polarized trophoblasts, comparative
analyses were performed with a T lymphoid cell line (i.e. Jurkat) and unseparated
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). First, polarized JAR cells were exposed to
reporter viruses pseudotyped with HXB-2 Env (X4-tropic). Although a weak luciferase
activity was detected following incubation with the two tested concentrations of viruses in
the absence of TNF-α, this activity was not due to true infection but was probably
associated with the residual transfected DNA, transfection reagent left in the harvested
virus preparations and/or free secreted luciferase protein present in our viral stocks. Indeed
an inhibitor of reverse transcription, AZT, did not reduce these observed RLU values (Fig.
1A). In contrast, luciferase activity could be readily detected in Jurkat cells in the absence
of TNF-α. Indeed, a 24-fold increase in reporter gene activity was seen when compared to
mock-infected Jurkat cells (Fig. 1B). We have demonstrated in a previous publication that
physiological concentrations of TNF-α are important for inducing HIV-1 LTR-driven gene
expression in trophoblasts (62). Several cytokines, including TNF-α, play pivotal roles
326
during gestation and are mandatory for a successful pregnancy. It is postulated that the
presence of TNF-α in our assays parallels in vivo situations by creating conditions that lead
to higher HIV-1 expression and thus increased probabilities of vertical transmission of this
retrovirus (62). In agreement with this statement, when TNF-α was added to HXB-2infected polarized JAR cells, we observed a marked induction in LTR-driven gene
expression, reaching 28- and 46-fold increase following infection with 125 and 250 ng of
p24, respectively (Fig. 1A). Importantly, AZT severely reduced this cytokine-induced
LTR-driven gene expression, indicating that true infection had occurred in polarized JAR
cells (Fig. 1A). In these conditions, the induction triggered by TNF-α was more potent in
Jurkat cells where a 159-fold increase in HIV-1 LTR-driven gene expression was detected
(Fig. 1B).
Next, the presence of integrated viral DNA was assessed in polarized trophoblastic cells
upon infection with wild type NL4-3 viruses. JAR cells were either left untreated or
exposed to wild type NL4-3 viruses for 48 h and total cellular DNA was isolated. To
quantify the amount of integrated viral DNA, we used a previously reported real-time PCR
test which provides a measure of true viral integration into the host cell chromatin. Indeed
this technical strategy uses primer sets designed to encompass both cellular and HIV-1specific DNA sequences (55). Briefly, a first round of PCR amplification was carried out
using Alu-specific (Alu) and HIV-1-specific (M661) primers. This allows for amplification
of a region that encompasses both cellular and HIV-1 specific DNA sequences and
therefore amplifies only integrated viral DNA. The first PCR product was subsequently
subjected to a real-time PCR assay targeting the HIV-1 R/U5 DNA region. This second
PCR step allows for quantification of the amount of integrated viral DNA. The sum of
these two PCRs is herein called integrated viral DNA. It is important to state that because
the second round of PCR uses HIV-1-specific primers, it is necessary to control this
experiment by conducting PCR on samples that have not undergone the first round since
retro-transcribed DNA would be amplified by the second PCR. Samples that underwent
only the second PCR are herein referred to as “Reverse-transcribed viral DNA”. High
quantities of integrated HIV-1 DNA copies were detected in polarized trophoblasts upon
infection with wild type NL4-3 virions (Table 1). Importantly, the number of viral DNA
327
copies obtained upon infection with NL4-3 was severely reduced upon treatment with AZT
(i.e. 66%), agreeing with the notion of true HIV-1 infection in these cells. We next tested
viral integration using PBMCs and Jurkat cells. High quantities of integrated HIV-1 DNA
copies were also detected in both cell types and, as expected, such levels were diminished
by AZT. Interestingly, the number of integrated HIV-1 DNA copies was two logs higher in
PBMCs and Jurkat cells compared to polarized JAR cells. Access to the cytoplasm, reverse
transcription (as controlled with AZT in LTR-reporter gene expression assay) and viral
DNA integration are potent markers of true HIV-1 infection in CD4+ T lymphocytes.
Because all these events are also observed in trophoblasts following exposure to HIV-1
(this manuscript and (62)), it can be concluded that true virus infection has indeed occurred
in these cells.
2.3.2 Blocking the function of the endosomes inhibits HIV-1 infection
We have recently shown that the contact between HIV-1 and trophoblasts results in
massive and rapid uptake of virions within cells by endocytosis (62). Importantly, blocking
the function of endosomes in these cells inhibits infection with the R5-tropic strain Ada-M,
suggesting that events associated with HIV-1 infection in these cells are endocytic in nature
(61). In the present work, we extended this notion and studied infection with an X4-tropic
variant in the presence of two classes of endosome inhibitors, i.e. the inhibitor of vacuolar
proton ATPase bafilomycin A1 and the lysosomotropic weak base NH4Cl. Both drugs
block vesicle acidification as well as endosomal and lysosomal degradation systems (1, 5).
Because, we have shown that HIV-1 infection of trophoblasts occurs independently of the
viral Env proteins gp120 and gp413, Env-deficient HIV-1 particles were also tested in this
study. Polarized JAR cells were inoculated with single-cycle reporter viruses pseudotyped
with Ada-M and HXB-2 (X4-tropic) Env or with Env-deficient reporter viruses (NL43∆Env). Of note, a physiological concentration of TNF-α is added in all our infection
studies because its presence is important for inducing LTR-driven gene expression in
trophoblasts and as such was used in these assays (62). When cells were pretreated with
bafilomycin A1, virus gene expression was virtually lost for all virus preparations tested
(Fig. 2A). In regard to NH4Cl, although the effect was strong it was slightly less potent than
328
bafilomycin A1 (Fig. 2B). Collectively these data indicate that R5- and X4-tropic viruses
are equally susceptible to the endosome inhibitors tested. Moreover, the process is
independent of Env since infection with NL4-3∆Env viruses was also inhibited by
bafilomycin A1. Because scientists have relied extensively on endosome inhibitors such as
bafilomycin A1 and NH4Cl to differentiate between pH-dependent (e.g., influenza virus
and Semliki Forest virus) and pH-independent viral entry (reviewed in (22)), it can be
concluded that HIV-1 infection of trophoblasts is pH-dependent.
2.3.3 Endosome inhibitors act at an early stage of HIV-1 replication
To determine the kinetics of HIV-1 travel inside the endosomal machinery and of its
eventual escape from acidic endosomal compartments, the time required for HIV-1 to
become resistant to inhibition by bafilomycin A1 or NH4Cl was determined. Polarized JAR
cells were exposed to the studied drugs either before virus infection or at various time
points following it. In this experimental setting, viral particles were added to the cells for
6 h at 37°C in the absence of inhibitors to allow viral infection to proceed. At this time
point, infected cells were washed and treated with TNF-α to promote viral gene expression.
The endosome inhibitors were added 6, 12, or 24 h after the onset of HIV-1 infection. As a
control, the cells were pre-treated with bafilomycin A1 or NH4Cl prior to infection. The
determination of the time points for adding the inhibitors to the cells was based on the
following criteria. First, for productive infection to be seen, polarized JAR cells need to be
in contact with HIV-1 for 6 h (unpublished observations). Second, adding the endosome
inhibitors prior to infection and then only 6 h post-infection (i.e. once viral particles have
been washed off the cells) allows differentiating the effect of the drugs on HIV-1 life cycle
without impacting the process of HIV-1 uptake. Treating polarized JAR cells with
bafilomycin A1 30 min before virus infection yielded a 99% inhibition in viral gene
expression for Ada-M and HXB-2 pseudotypes and a 94% reduction for Env-deficient
viruses (Fig. 2C), which is in agreement with the results presented in Figs. 2A and 2B.
However, when bafilomycin A1 was added 6, 12, or 24 h after initiation of virus infection,
the effect of the drug was gradually lost. Similar observations were made with NH4Cl (Fig.
2D), although this drug was initially less potent than bafilomycin A1. It would therefore
329
appear that both drugs act within the first six hours of virus infection. Hence, the
requirement for low pH is associated with early events of the HIV-1 life cycle.
Interestingly, this timing coincides with the presence of HIV-1 within the endosomal
machinery (61, 62).
2.3.4 Endosome inhibitors versus HIV-1 internalization
We next verified whether the drugs had an impact on virus internalization. JAR cells were
pre-treated with bafilomycin A1 or NH4Cl and then briefly exposed to pseudotyped or Envdeficient viruses (i.e. 1 h) before an acid treatment to remove uninternalized viruses. The
level of the viral core protein p24 in the cell lysates was quantified through the use of an
enzymatic assay. Bafilomycin A1 induced a 31%, 43% and 55% reduction in
internalization of Ada-M, HXB-2 and NL4-3∆Env viruses, respectively (Fig. 3A).
Bafilomycin A1 blocks not only vesicle acidification but also organelle movements from
early to late endosomes (5). In the presence of bafilomycin A1, internalized molecules
cannot proceed beyond early endosomes and are thus returned to the extracellular milieu. In
such conditions, it is quite conceivable that bafilomycin A1 triggers in part the recycling of
HIV-1 to the apical pole, thus creating the impression of reduced viral entry. Bafilomycin
A1 was also tested on HIV-1 binding to trophoblasts at 4°C and did not modulate this event
(data not shown). On the opposite, comparable amounts of internalized viruses were found
in cells treated or not with NH4Cl and this for the three virus preparations tested (Fig. 3B).
2.3.5 Endosome inhibitors induce a diminution in HIV-1 p24 cytosolic
release
Although a reduction in virus uptake is seen with bafilomycin A, it is unlikely to be the sole
reason for the marked decrease in HIV-1 infection observed in polarized trophoblasts.
Indeed, NH4Cl which also blocks infection did not reduce significantly viral uptake. We
next sought to define how blocking the endosome translates into a lost of HIV-1 infection.
Because HIV-1 needs to access the cytoplasm for infection to ensue, cytosolic release of
the viral nucleocapsid p24 is believed to be an indicator of productive infection (31).
Consequently, drugs causing a reduction in cytosolic release of p24 might be associated
330
with reduced infection resulting from diminished endosomal escape. In other words, we
verified whether blocking the function of the endosomes translates into diminished
cytoplasmic release of viral material. First, in a control experiment, polarized JAR cells
were exposed to HXB-2 pseudotypes for either 30 min or 2 h. The infected cells were then
trypsinized, washed and the amounts of viruses present in the cytosolic and vesicular
fractions were measured. We found that at 30 min post-infection, the viral material was
exclusively located within the vesicular fraction of the cells, whereas at 2 h post-infection,
20% of the internalized viral particles had already reached the cytoplasm (Fig. 3C). These
data are fully in agreement with a previous report published by this laboratory on JAR cells
using this same technique (62) and underscore two important notions. First, the technical
procedure used in this study for separating cytosolic and vesicular fractions is valid because
it does not result in cross-contamination of either fraction. Second, they illustrate clearly
the endocytic nature of HIV-1 uptake in polarized JAR cells. A second series of controls
were also performed. It is well established that entry of vesicular stomatitis virus (VSV)
occurs by receptor-mediated endocytosis. Subsequently, during its itinerary through the
endosomal compartments, the VSV-G protein acquires a low-pH-induced fusion-competent
form, allowing for fusion of the viral membrane with endosomal and lysosomal membranes
(45). Based on this notion, polarized JAR cells were pre-treated or not with bafilomycin A1
or NH4Cl and then exposed for 2 h to NL4-3∆Env viruses pseudotyped with the VSV-G
envelope and fractionation assays were conducted. Although VSV-G is internalized by
endocytosis, we found that VSV-G viral particles were predominantly located within the
cytosolic fraction of polarized JAR cells. This indicates that VSV-G efficiently reaches the
cytoplasm upon internalization in trophoblasts in such a way that the duration of its
presence within the endosomes is short. These data are in agreement with a previous report3
and with the fact that VSV-G is highly infectious in polarized JARs. However, upon
treatment with bafilomycin A1, no viral particles could escape the endosomes because all
viral particles were located within the vesicular fraction (Fig. 3D). This shows both the
validity of the fractionation procedure and the potency of the drug. Although NH4Cl
reduced the cytoplasmic presence of VSV-G pseudotypes from 83% to 56%, the effect was
less potent than that of bafilomycin A1. Hence, we may conclude that NH4Cl is not as
efficient as bafilomycin A1 for blocking the cytoplasmic release. Next, fractionation assays
331
were performed in polarized JAR cells that were pre-treated with bafilomycin A1 or NH4Cl
and then exposed to Ada-M and HXB-2 pseudotyped viruses. The presence of bafilomycin
A1 resulted in a diminution of HIV-1 within the cytoplasm. Indeed, a shift from 36% to
23% (p<0.01) of p24 present in the cytoplasm was seen for Ada-M and a shift from 45% to
17% (p<0.01) was observed for HXB-2 (Figs. 3E and 3F, respectively). NH4Cl did not
significantly alter the cytosolic release of Ada-M or HXB-2. Given that NH4Cl only partly
modulated the cellular distribution of VSV-G pseudotypes, it is not surprising that it did not
modulate the cellular distribution of HIV-1. We may conclude that bafilomycin A1, by
blocking the function of the endosomes, inhibits HIV-1 infection of polarized JAR cells.
The mechanism may be in part associated with a reduced access to the cytoplasm
2.3.6 Rab5 regulates HIV-1 infection
In the next series of experiments, the role played by specific Rab proteins in HIV-1
infection of polarized trophoblasts was studied. The primary objective of these experiments
was to define the endocytic compartment(s) involved in the process of HIV-1 infection in
this cell type. We recently provided evidence that HIV-1 is internalized in trophoblasts via
a clathrin/caveolae-independent endocytic pathway that is sensitive to cholesteroldisrupting drugs4. Interestingly, additional results show that although HIV-1 is initially
localized in transferrin-negative organelles, internalized viral particles will eventually
transit to transferrin-positive endosomes, suggesting a merger between non-classical and
classical endocytic pathways in trophoblasts (61). In order to define the relationship
between the presence of HIV-1 within early endosomes and the infection of polarized
trophoblasts, we investigated the role played by the small GTPase Rab5, which regulates
the biogenesis of these endosomes. Polarized JAR cells were transiently transfected with
expression vectors coding for wild type, dominant active and dominant inactive Rab5.
Substitution of glutamine to leucine at amino acid 79 (Rab5 Q79L) results in a Rab5
protein that cannot hydrolyze GTP, leaving it in an active state. On the other hand,
mutation of the serine to an asparagine at position 34 (Rab5 S34N) causes the protein to
have an affinity for GDP that is one hundred-fold greater than that of GTP, therefore
maintaining the protein in an inactive state. As controls, the cells were either mock-
332
transfected or transfected with the EGFP expression vector. Contrary to the dominant
negative Rab5 (i.e. Rab5 S34N), the Rab5 WT and Rab5 Q79L molecular constructs tested
produced a potent but incomplete inhibition of infection with Ada-M pseudotypes in
polarized trophoblasts that ranged from 50% to 76% (Fig. 4A). The effect observed was
proportional to the amount of DNA used for transfection and held true for the two others
virus preparations tested (Figs. 4B and 4C). On the other hand, HIV-1 particles
pseudotyped with VSV-G Env were weakly affected by the expression of the Rab5 proteins
(Fig. 4D). We may conclude that the effects observed by expression of the Rab5 mutants in
trophoblasts are i) specific to HIV-1, ii) related to early events in HIV-1 replication and iii)
not related to downstream events affecting HIV-1 LTR-driven gene expression. Hence, by
blocking access to early endosomes with dominant negative Rab5 or conversely by
preventing movements beyond early endosomes with wild type or dominant active Rab5,
virus infection is reduced in polarized JAR cells. The effect cannot be due to decreased
HIV-1 internalization since similar amounts of viral particles are found in polarized JAR
cells expressing these Rab5 mutants (see below).
2.3.7 Viral uptake and cytosolic p24 release are not affected by
wortmannin
Previous work has shown that inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-kinase)
with wortmannin leads to the release of EEA1 from early endosomes, which reduces early
endosome fusion (41). To better define the requirement for HIV-1 to transit via Rab5+
organelles, the subsequent experiments were performed with the PI3-kinase inhibitor
wortmannin. Although wortmannin slightly increased Ada-M uptake in polarized JAR
cells, internalization of HXB-2 pseudotypes was not affected by wortmannin (Fig. 5A).
This is in agreement with the fact that internalization of HIV-1 does not proceed via the
classical endocytic pathway in trophoblasts4. PI 3-kinase-dependent signaling pathway also
controls receptor sorting out of early endosomes but not membrane transport (41). Keeping
this in mind, the effect of wortmannin was tested on cytosolic release of the viral
nucleocapsid p24 in polarized JAR cells. Wortmannin did not modulate in a statistically
significant manner the cellular distribution of pseudotyped viruses in polarized trophoblasts
(Fig. 5B). It can thus be proposed that HIV-1 cytoplasmic access from the endosomal
333
machinery is most likely independent of PI3-kinase activity. In agreement with these
results, wortmannin did not modulate HIV-1 infection of trophoblasts (data not shown).
2.3.8 Arf6 does not modulate HIV-1 infection
Some trans-membrane proteins internalized by a clathrin- and lipid-raft-independent
mechanism return to the plasma membrane in an Arf6-dependent manner (Ras-related
small GTP protein). Alternatively, they can fuse with the classical early endosomes and
traffic to late endosomes/lysosomes upon inactivation of Arf6. Expression of a
constitutively active Arf6 mutant (Arf6 Q67L) prevents molecules internalized in this
clathrin/lipid rafts-independent pathway to fuse with clathrin cargo-containing endosomes
and their subsequent routing to late endosomes. By contrast, exogenous expression of wild
type Arf6 has no discernable effect on cells (38). Transient transfection of polarized JAR
cells with wild type Arf6, dominant active Arf6 Q67L and dominant negative Arf6 T27N
had no discernable effect on infection with HIV-1 pseudotyped with Ada-M, HXB-2, or
VSV-G Env (Fig. 6). Therefore, HIV-1 is unlikely to transit via Arf6-expressing
endosomes in trophoblasts.
2.3.9 Rab7 regulates HIV-1 infection
HIV-1 migrates and accumulates inside late endosomes within the first hours of
internalization into polarized trophoblasts (61). To determine whether there is a correlation
in polarized JAR cells between the presence of HIV-1 within these organelles and the
process of infection, the effect of Rab7 was tested. The small GTPase Rab7 controls
movements of vesicles from early to late endosomes and the formation of lysosomes.
Polarized JAR cells were transiently transfected with dominant negative and dominant
active Rab7 expression vectors. The two Rab7 proteins tested resulted in an almost
complete blockade of HIV-1 gene expression in trophoblasts. Indeed, up to 88% inhibition
in viral expression was observed (Fig. 7). The effect observed was proportional to the
amount of DNA used for transfection and held true for all three strains of HIV-1 tested. On
the other hand, HIV-1 particles pseudotyped with the VSV-G envelope were minimally
affected by the expression of the Rab7 proteins (Fig. 7D). Hence, when blocking access to
334
late endosomes with dominant negative Rab7 or conversely by promoting movements to
lysosomes with wild type or dominant active Rab7, HIV-1 infection is inhibited in
polarized JAR cells. The effect cannot be due to decreased HIV-1 internalization since
comparable amounts of viral particles are found in polarized JAR cells expressing these
Rab7 mutants (Fig. 8). Similar data on viral uptake were obtained when testing the Rab5
expression vectors.
2.3.10 HIV-1 infection is independent of Rab11
Having shown in a previous study that a small proportion of internalized HIV-1 reaches
Rab11-expressing recycling organelles upon uptake into polarized trophoblastic cells (61),
the possible modulatory effect of different Rab11 constructs on HIV-1 infection was tested
(i.e. Rab11 WT, dominant negative Rab11 S25N and dominant active Rab11 Q70L). None
of the Rab11 expression vectors tested had an effect on HIV-1 infection of polarized JAR
cells with reporter viruses (data not shown), thus suggesting that virus infection of placental
cells does not require a transit through these organelles.
2.4 Discussion
The placenta is thought to play a central role during in utero HIV-1 transmission. However,
the molecular events associated with HIV-1 infection of placental cells are still a mystery.
Here, we investigated the role played by specific Rab proteins, known to dictate the
vesicular transport between the various endocytic compartments, in the process of HIV-1
infection of polarized human placental cells. The rationale of this study being that HIV-1
circulates through multiple organelles upon internalization into trophoblasts and the
presence of HIV-1 within the endosomes is a required step for infection to proceed in these
cells. How both events are interconnected is still unknown. We found an unprecedented
relationship between placental infection and the presence of HIV-1 within endosomes.
It is known that both HIV-1 fusion and endocytosis can occur simultaneously in CD4+ T
lymphocytes, but with sharply different functional consequences. Indeed, in this particular
cell type fusion promotes productive infection whereas endocytosis leads to viral
335
degradation. Given that endosome inhibitors increase HIV-1 infectivity in CD4+ T cells and
in an epithelial cell line (i.e. MAGI), it was proposed that fusion within the endosomes is a
possible process when viral particles are spared from degradation (20, 49). We found that
the mechanism associated with HIV-1 infection of polarized trophoblasts is utterly
different. For all HIV-1 strains tested, viral replication was not increased, but rather
virtually lost when endosome inhibitors were added within the first moments of infection.
However the endosome inhibitors did not reduce infection when added at a later time point
following exposure to HIV-1, most likely because a fraction of the virus had proceeded
beyond the low-pH-sensitive step. We conclude that the initial presence of HIV-1 within
the endosomes in trophoblasts is mandatory for the subsequent steps leading to infection.
HIV-1 infection of trophoblasts, unlike CD4+ T cells, is thus endocytic in nature.
Endocytosis of the retrovirus as a mechanism required for infection of a target cell is rare
and poorly characterized. Inhibition of macropinocytosis in macrophages leads to reduced
viral infection. Although, most virions are subsequently degraded, fusion leading to capsid
release in the cytosol is postulated to take place inside vesicles. Infection of macrophages is
weakly affected by treatment with bafilomycin A1 (32). Human mannose receptormediated HIV-1 infection of astrocytes was inhibited by bafilomycin A and NH4Cl, thus
suggesting that infection in these cells also results from HIV-1 endocytosis (26).
The key question we asked in this paper is how the presence of HIV-1 within the endocytic
compartments relates to infection. Among other events, Rab5 regulates clathrin-mediated
endocytosis and fusion of coated pits with early endosomes (68). We found that Rab5 did
not modulate viral uptake into polarized trophoblasts. This agrees with our earlier
observation that internalization of HIV-1 in these cells is independent of clathrin-coated
pits4. However, we observed that dominant negative Rab5 mutant, which blocks fusion of
incoming vesicles to early endosomes, inhibited HIV-1 infection in trophoblasts. Hence,
Rab5-dependent transport to early endosomes is a necessary step for HIV-1 infection in
these cells. Remarkably, these observations also imply that HIV-1-containing endocytic
vesicles derived from a Rab5-independent process are able to fuse with early endosomes
that are presumably Rab5-positive. Indeed, HIV-1 transits from the non-classical to the
classical pathway following uptake by trophoblasts via a clathrin/caveolae-independent
336
pathway4. This constitutes an unusual and poorly characterized event; one elegant example
includes caveolar vesicles moving from caveosomes to early endosomes in a Rab5dependent manner (39). Of note, the reason why Ada-M pseudotypes were not affected by
the dominant negative Rab5 vector is intriguing. Given that the difference between Ada-M
and HXB-2 relates to Env and that infection of trophoblasts is Env-independent, this point
is difficult to interpret. It is possible that post-translation modifications of Env (e.g.
glycosylation pattern) differ between Ada-M and HXB-2. These differences, although not
impacting on the early steps in HIV-1 life cycle, might modulate the fate of the viral
material within endocytic compartments. We also found that wild type and constitutively
active Rab5 proteins inhibited HIV-1 infection. Dominant active Rab5 Q79L causes the
accumulation within endosomes of lysosomal proteins that normally cross the endosome
compartments before reaching lysosomes (46). Likewise, small and large dextran molecules
remain co-localized after endocytosis in Rab5 Q79L-expressing cells and their separation
into distinct endocytic organelles is severely delayed (18). Hence, by causing entrapment of
HIV-1 within early endosomes, Rab5 Q79L or Rab5 WT was detrimental to HIV-1
infection in trophoblasts. We conclude that although reaching early endosomes is required
for the biology of HIV-1 within trophoblasts, this step is not sufficient per se for infection
to take place.
Importantly, we found that HIV-1 infection was virtually lost upon expression of a
dominant-negative Rab7 mutant, which blocks the transport to late endosomes and results
in retention in Rab5-positive early endosomes. Because dominant active Rab5 and
dominant negative Rab7, which both prevent access to late endosomes, inhibited infection,
we can conclude that HIV-1 trafficking to late endosomes is a mandatory step for infection
to proceed in trophoblasts. This also implies that infection is related to events not occurring
within early endosomes but rather within late endosomes. In this context, the role of Rab5
is to promote HIV-1 transit to early endosomes, a step known to be important for
subsequently reaching late endosomes via Rab7. Of note, expression of Rab5 expression
vectors in polarized trophoblasts reduced HIV-1 infectivity by 50 to 76%, whereas the
observed Rab7-mediated inhibition was much more dramatic. Transfection efficiencies
obtained in this study (i.e. 50%) parallel the inhibition achieved by the Rab5 expression
337
vectors and as such may explain the extent of inhibition obtained with these vectors. This
being said, this argument is difficult to make because it would imply that a direct
correlation exists between transfection efficiency, viral uptake and infection in trophoblasts.
However, a direct association between viral uptake and infection is unlikely to be the case
in these cells. Indeed, even though virtually 100% of polarized JAR cells internalize HIV-1
viral particles (61), infection rates are expected to be much lower in these cells. This is
based on the idea that a maximum of 10% of CD4+ T cells are infected by HIV-1 both in
vivo and in vitro (unpublished observations and (15)) and that trophoblasts are recognized
to be even less susceptible to HIV-1 infection. In other words, all trophoblastic cells
internalize HIV-1 but only a subset of them becomes infected. Hence, our data raise the
alternative and intriguing possibility that HIV-1 particles reach late endosomes not solely
via Rab5-positive early endosomes but possibly via yet to be defined Rab5-negative early
endosomes as well.
On the other hand, we provide evidence that infection is unlikely to be associated with a
transit via Arf6- or Rab11-containing organelles given that Arf6 and Rab11 mutants did not
modulate HIV-1 infection in polarized trophoblasts. It has been previously demonstrated
that the bulk transport from early to late endosomes is not affected after inhibition of the
PI3-kinase pathway by wortmannin but that the sorting of down-regulated receptor
molecules out of early endosomes is inhibited (41). In apparent contradiction with a
mandatory transit to late endosomes for HIV-1, we observed that wortmannin failed to
inhibit HIV-1 cytoplasmic access in polarized trophoblasts. Consequently, HIV-1 particles
reach late endosomes in a process resembling bulk transport and as such do not require PI
3-kinase. This is supported by our earlier finding that uptake of HIV-1 in trophoblasts
occurs via numerous and rather non-specific virus-cell interactions3.
It is important to point that our data also illustrate the existence of a delicate balance
between the organelles. Indeed, if movements from late endosomes towards lysosomes are
favored upon expression of dominant active Rab7, HIV-1 infection is inhibited. This may
be due to increased viral degradation within lysosomes based on the idea that Rab7 Q67L
increases perinuclear aggregation and fusion of lysosomes. It is surprising that infection by
338
HIV-1 pseudotyped with VSV-G was poorly modulated by a dominant negative Rab5
mutant as previously described (50). The difference in cell lines may account for such a
discrepancy. It is unlikely to be due to VSV-G infection rates that may not be overcome by
the levels of expression achieved by Rab expression vectors. Indeed, when performing
these experiments with a titer of VSV-G pseudotypes giving more comparable luciferase
readouts to HIV-1 pseudotypes, VSV-G remained unaffected (data not shown).
Internalization of viruses within a given target cell is in itself generally not sufficient per se
for productive infection because incoming viruses are still part of the extracellular space
once located within endosomes. The acidification of endocytic vesicles triggers a
conformational change in the viral Env protein of enveloped viruses causing fusion of the
virus with the endocytic inner membrane and the release of viral genome at appropriate
locations (reviewed in (11)). On the other hand, naked viruses are released upon rupture of
the cargo endocytic vesicles; alternatively, they generate a pore through which the genome
can enter the cytosol (reviewed in (11, 40)). In trophoblastic cells, the cytosolic p24 content
decreased in the presence of bafilomycin A1, suggesting that when endosomal function is
blocked, the mechanism whereby viral particles present in vesicles are released into the
cytosol is inhibited and as such infection is lost. Hence, these data support the notion that
HIV-1 infection in polarized trophoblasts is associated with a pH-dependent endosomal
escape. If a strict correlation between the presence of viral material within the cytoplasm
and infection exists in trophoblasts like it is the case in CD4+ T cells, it is intriguing that the
cytosolic p24 content was reduced and not blocked by bafilomycin A1 and was not affected
by NH4Cl. Controls were performed to ensure that the technical procedure to separate
cytosolic and vesicular fractions was proper; hence it is unlikely due to cross-contamination
between the fractions. On the other hand, the fact that the cytosolic release of VSV-G was
completely blocked by bafilomycin A1 but only partly inhibited by NH4Cl indicates that
bafilomycin A1 was more potent in this assay than NH4Cl, and explains why only
bafilomycin A1 modulated the cytoplasmic release of HIV-1. Hence, we believe that an
incomplete blockade in cytoplasmic access triggered by the drugs used is related to the
nature of the assay. This being said, both drugs blocked viral infection within the first six
hours of infection, implying that they abrogate steps within the early events of HIV-1
339
infectious cycle. We therefore cannot exclude that these drugs also affect some events
leading to viral integration that occur beyond endosomal escape. Further experiments are
warranted to resolve this issue.
Among other events, low endosomal pH regulates activation of lysosomal hydrolases, and
viral Env protein conformational changes needed for intra-endosomal fusion. No reduction
in HIV-1 LTR-directed reporter gene expression was seen upon addition of leupeptin
(lysosomal protease inhibitor) to polarized trophoblasts infected with pseudotyped or Envdeficient viruses (data not shown). Therefore, HIV-1 must escape the endosomes and reach
the cytoplasm through a different mechanism. On the other hand, we found that endosome
inhibitors blocked infection of polarized trophoblasts with wild type and Env-deficient
viruses. We can therefore conclude that HIV-1 endosomal escape in trophoblasts does not
occur by leakage upon the action of cellular hydrolase and is independent of the Env
proteins. Pivotal information is now to be considered. First, HIV-1 is primarily located
within late endosomes upon internalization in trophoblasts (61). Second, inhibiting access
to late endosomes through dominant negative Rab7 blocks HIV-1 infection. Third, HIV-1
bears a lipid membrane and host-derived cell membrane proteins acquired upon budding
(56). Consequently, HIV-1 intra-endosomal fusion is expected to take place. This process
most likely parallels recycling of molecules targeted to the inner vesicles of late
endosomes. Indeed, fusion between the exoplasmic leaflets of the late endosome and inner
vesicles, i.e. back fusion, is thought to mediate recycling from inner vesicles (36, 37). The
intracellular machinery that controls such an event has yet to be defined but HIV-1 as an
enveloped virus amongst inner vesicles within the endosomes is likely to use such a
strategy. Interestingly, low endosomal pH promotes back-fusion.
Our current working model proposes that, upon internalization by a clathrin/caveolaeindependent pathway in polarized trophoblasts, HIV-1 reaches regions enriched in lipid
rafts. From this location, the internalized viral particles transit to Rab5-expressing early
endosomes. This movement is required for subsequently reaching late endosomes via Rab7.
We propose that infection is related to events occurring within late endosomes because
HIV-1 infection is lost when access to late endosomes is blocked by expression of Rab5
340
mutants or dominant negative Rab7. This is further supported by the fact that HIV-1
infection was inhibited by bafilomycin A1, which not only neutralizes endosomal pH, but
also blocks early to late organelle movements. In addition, HIV-1 accumulates within
CD63-positive organelles within four hours of viral uptake (61). On the other hand, when
movements from late endosomes to lysosomes are favored by dominant active Rab7,
infection is inhibited presumably because increased degradation of viral particles is taking
place. Our data are in support of endosomal escape occurring upon intra-endosomal HIV-1
back-fusion. The process is independent of the viral Env proteins gp120 and gp41 but
requires an acidic environment (i.e. low pH).
In summary, this study provides an unprecedented understanding of the intracellular route
taken by HIV-1 within human placental cells. The results presented herein are highly
significant. First, the mechanism underscored in this work has never been described for
HIV-1. Second, the human polarized trophoblast barrier is considered as a primary target
for maternal blood-borne HIV-1 infection. Third, the results obtained can also enhance our
understanding of the biology of HIV-1 in adults. Indeed, epithelial cells are the portal of
entry for HIV-1 during primary infection in adults and viral internalization is associated
with endocytosis in these cells. Moreover, endocytosis may be important for macrophages
and dendritic cells, which are cell types playing key roles in the pathogenesis of HIV-1
infection. Furthermore, the findings presented in this paper raise concerns in terms of
treatment strategy. Administration of clinically-approved drugs such as amantadine or
chloroquine has been postulated to increase HIV-1 infectivity by sparing viruses from
degradation in late endosomes and lysosomes (20, 49). Based on the present data, it can be
proposed that an opposite effect would be seen with these drugs with respect to vertical
transmission of HIV-1. On the other hand, our data raise the interesting possibility that
altering the endocytic Rab content by intervention in appropriate signal transduction events
may offer a new strategy for modulating the targeting of HIV-1 to a degradative
compartment (35). Additional studies are needed to define the validity of this approach.
341
2.5 References
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346
2.6 Footnotes
1
This work was supported by a grant to M.J.T. from the Canadian Institutes of Health
Research (CIHR) HIV/AIDS Research Program (HOP-67259). The work was performed by
G.V. in partial fulfillment of her Ph.D. Degree in the Program of MicrobiologyImmunology, Faculty of Medicine, Laval University. G.V. is the recipient of a CIHR
Doctoral Research Award from the HIV/AIDS Research Program and M.J.T. holds the
Canada Research Chair in Human Immuno-Retrovirology (Tier 1 level).
2
Address correspondence and reprint requests to Dr. Michel J. Tremblay, Laboratory of
Human Immuno-Retrovirology, Research Center in Infectious Diseases, RC709, CHUL
Research Center, 2705 Laurier Blvd., Quebec (QC), Canada, G1V 4G2. E-mail address:
[email protected]
3
Vidricaire, G. and M.J. Tremblay. HIV-1 entry and infection of human trophoblastic cells
occurs through a mechanism independent of the viral envelope glycoproteins gp120 and
gp41 but requiring carbohydrate-mediated virus-cell interactions (submitted for
publication).
4
Vidricaire, G. and M.J. Tremblay. HIV-1 infection of human polarized trophoblasts is
clathrin/caveolae-independent but involves lipid rafts (submitted for publication).
347
Section 3
Figure legends
Fig. 1. Susceptibility of polarized trophoblasts to HIV-1 infection. Polarized JAR cells
(panel A), or Jurkat cells (panel B) were exposed to HXB-2 pseudotyped reporter viruses
for 24 h at 37°C. The cells were then stimulated for 24 h with TNF-α (10 ng/ml).
Luciferase activity was monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are
expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of
quadruplicate samples and are representative of three independent experiments.
Fig. 2. Blocking the function of the endosomes inhibits HIV-1 infection. Polarized JAR
cells were pre-treated with bafilomycin A1 (panel A) or NH4Cl (panel B) and exposed to
pseudotyped and Env-deficient viruses for 24 h. The cells were next stimulated with TNFα. For kinetics of infection, polarized JAR cells were exposed to HIV-1 particles for 6 h
and next stimulated with TNF-α for 24 h. In such experiments, bafilomycin A1 (panel C) or
NH4Cl (panel D) was either omitted (0’) or added 30 min prior to virus infection (30’ pre)
or 6 h, 12 h and 24 h after HIV-1 infection. The cells were lysed and luciferase activity was
monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are expressed as relative light
units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples and
are representative of three independent experiments.
Fig. 3. Virus internalization and cytosolic delivery are reduced by bafilomycin A1.
Polarized JAR cells were first pre-treated or not with bafilomycin A1 (panel A) or NH4Cl
(panel B). The cells were then exposed to pseudotyped and Env-deficient viruses for 1 h at
37°C. Viral entry was assessed by evaluating the amount of p24 in each cell lysate. Data
shown are expressed as the means ± S.D. of triplicate samples and are representative of
three independent experiments. For fractionation assays, polarized JAR cells were pretreated or not with bafilomycin A1 or NH4Cl and then exposed to HXB-2 (panels C and F)
VSV-G (panel D) and Ada-M (panel E) pseudotypes. The cells were disrupted by Dounce
homogenization and levels of p24 were evaluated in each cellular fraction. Data shown are
expressed as the means ± S.D of the ratio of p24 present in the cytosol or vesicles over the
sum of p24 present in the two fractions. Data shown are representative of three independent
348
experiments. Asterisks denote statistically significant data (**, p<0.01). Statistical analysis
was achieved using the Student’s paired t-test, with a two-tailed distribution. Homogeneity
of variances was also tested and deemed as such in each case.
Fig. 4. Rab5 regulates HIV-1 infection. Polarized JAR cells were either mock-transfected
or transfected with EGFP (control), Rab5 WT, Rab5 S34N and Rab5 Q79L expression
vectors. The cells were exposed to Ada-M pseudotypes (panel A), Env-deficient viruses
(panel B), HXB-2 pseudotypes (panel C), or VSV-G pseudotypes (panel D) and stimulated
with TNF-α. Luciferase activity was monitored in each cell lysate. Values from the
luminometer are expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed as the
means ± S.D. of quadruplicate samples and are representative of three independent
experiments.
Fig. 5. Viral internalization and p24 cytosolic release are not affected by wortmannin.
Polarized JAR cells were pre-treated or not with wortmannin and then exposed to Ada-M
or HXB-2 pseudotyped viruses for 1 h (panel A). Viral entry was measured by evaluating
the amount of p24 in each cell lysate. Data shown are expressed as the means ± S.D. of
triplicate samples and are representative of three independent experiments. For
fractionation assays, polarized JAR cells were pre-treated or not with wortmannin and then
exposed to Ada-M or HXB-2 pseudotyped viruses for 4 h (panel B). The cells were
disrupted by Dounce homogenization, and levels of p24 were evaluated in each cellular
fraction. Data shown are expressed as the means ± S.D of the ratio of p24 present in the
cytosol or vesicles over the sum of p24 present in the two fractions. Data shown are
representative of three independent experiments.
Fig. 6. HIV-1 infection is independent of Arf6. Polarized JAR cells were either mocktransfected or transfected with EGFP (control), Arf6 WT, Arf6 T27N and Arf6 Q67L
expression vectors. Next, the cells were exposed to Ada-M (panel A), HXB-2 (panel B), or
VSV-G (panel C) pseudotyped viruses and stimulated with TNF-α. Luciferase activity was
monitored in each cell lysate. Values from the luminometer are expressed as relative light
units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D. of quadruplicate samples and
are representative of three independent experiments.
349
Fig. 7. Rab7 regulates HIV-1 infection. Polarized JAR cells were either mock-transfected
or transfected with EGFP (control), Rab7 T22N and Rab7 Q67L expression vectors. Next,
the cells were exposed to HXB-2 pseudotypes (panel A), Ada-M pseudotypes (panel B),
Env-deficient viruses (panel C), or VSV-G pseudotypes (panel D) and stimulated with
TNF-α. Luciferase activity was monitored in each cell lysate. Values from the luminometer
are expressed as relative light units (RLU). Data shown are expressed as the means ± S.D.
of quadruplicate samples and are representative of three independent experiments.
Fig. 8. HIV-1 uptake is not modulated by Rab5 and Rab7. Polarized JAR cells were either
mock-transfected or transfected with EGFP (control), Rab5 WT, Rab5 S34N, Rab5 Q79L,
Rab7 T22N and Rab7 QP67L expression vectors. Next, the cells were exposed to Ada-M
(panels A and C) or HXB-2 (panels B and D) pseudotyped viruses for 1 h. Viral entry was
measured by evaluating the amount of p24 in each cell lysate. Data shown are expressed as
the means ± S.D. of triplicate samples and are representative of three independent
experiments.
350
Section 4
4.1 Table 1
Tables
351
Section 5
5.1 Figure 1
Figures
352
5.2 Figure 2
353
5.3 Figure 3
354
5.4 Figure 4
355
5.5 Figure 5
356
5.6 Figure 6
357
5.7 Figure 7
358
5.8 Figure 8
359
Chapitre 7.
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Section 1
1.1 Paramètres définissant la susceptibilité à l’infection des
trophoblates par le VIH-1
Dans cette thèse, nous avons tenté de définir, dans un premier temps, si certaines étapes du
cycle réplicatif du VIH-1 se produisent inefficacement dans ces cellules. En effet, si la
suceptibilité des trophoblastes à l'infection par ce rétrovirus n'est pas reconnue par tous
dans la littérature scientifique, même ceux qui affirment que ces cellules permettent la
production virale admettent qu'elle est réduite (339, 364, 655, 658). Nous avons découvert
qu’une quantité similaire de particules virales se retrouve dans les trophoblastes et dans les
cellules lymphoïdes. Par contre, et c’est là l’élément distinctif à retenir, la proportion de
virions ayant accédé au cytoplasme est nettement supérieure dans les lymphocytes T. Ceci
signifie que le VIH-1 est davantage endocytosé par les trophoblastes, et se retrouve alors
principalement dans les endosomes cellulaires.
Il est connu que l’endocytose du VIH-1 se produit dans les cellules HeLa et les cellules
lymphoïdes. Toutefois, cet événement entraîne la dégradation de la majorité des particules
virales : seuls les virions présents dans le cytosol complèteraient leur cycle réplicatif (340,
532). De plus, il est reconnu que les trophoblastes expriment peu ou pas le CD4 et les
corécepteurs CCR5 et CXCR4 (21, 248, 382). Or, dans les lymphocytes T CD4+ primaires,
lorsque la liaison du VIH-1 à son corécepteur est bloquée par des inhibiteurs spécifiques,
l’endocytose des particules virales est favorisée au détriment de la fusion à la membrane
(532). En s’appuyant sur ces observations, nous pensons que parce que les trophoblastes
n’expriment pas les récepteurs/corécepteurs requis pour l’entrée du virus par fusion,
l’endocytose des virions y est alors favorisée. Puisque l’endocytose est un mode d’entrée
peu productif pour le VIH-1 (340, 532), nous concluons que la permissivité limitée des
360
trophoblastes à ce virus est donc associée au mode d’entrée emprunté par ce virus dans ces
cellules.
Ceci dit, des particules virales se retrouvent tout de même en faible quantité dans le
cytoplasme des trophoblastes, et nous croyons qu’elles peuvent alors infecter de façon
productive ces cellules. Par contre, nous pensons que des facteurs précis doivent être
présents dans l’environnement cellulaire pour favoriser cet évènement. En effet, ils
pallieraient au faible nombre de virions retrouvés dans le cytoplasme en augmentant
l’efficacité de certaines étapes subséquentes du cycle réplicatif du VIH-1. En accord avec
ce principe, nous avons montré que l’expression virale est quasi indétectable si le milieu de
culture ne contient pas de cytokine pro-inflammatoire. En revanche, l’IL-1 et le TNF-α, se
retrouvant au contact des trophoblastes in vivo, activent de façon soutenue l’expression
génique du VIH-1 dans les trophoblastes in vitro. Ces cytokines permettent donc de
déclencher l’expression virale et de la détecter de façon constante et reproductible in vitro.
Cette découverte explique en partie les divergences retrouvées dans la littérature
scientifique au sujet de la susceptibilité à l’infection des trophoblastes. En effet, puisque ces
cytokines pro-inflammatoires sont nécessaires pour activer la transcription virale dans ces
cellules, on peut comprendre, qu’en leur absence certains auteurs n’aient pu la détecter in
vitro, et qu’ils concluent que les trophoblastes ne permettent pas la réplication du VIH-1
(138, 268, 339, 364, 382).
Plusieurs chercheurs estiment que le contact des trophoblastes avec des cellules
chroniquement infectées ou avec des PBMCs infectés est requis pour détecter la réplication
du VIH-1 dans les trophoblastes. Or, on a montré que ce contact cellulaire permettait la
production de TNF-α dans l’environnement, évènement associé à une meilleure infection
des trophoblastes (32). Il n’est donc pas étonnant que nous n’ayons pas eu recours à cette
stratégie puisque nous avons ajouté les cytokines pro-inflammatoires directement dans le
milieu de culture. Cependant, l’équipe d’Élisabeth Menu affirme que la présence d’un
contact cellulaire est obligatoire, et ce, même en présence dans le milieu de culture de tels
facteurs (130). Les raisons qui sous-tendent cette divergence entre nos résultats et cette
étude méritent d’être éxaminées. Premièrement, nous avons noté que l’induction de
361
l’activité du LTR du VIH-1 par le TNF-α est supérieure dans les JAR que dans les BeWo,
cellules que cette équipe a utilisées. De plus, d’autres chercheurs ont postulé que le contact
cellule-cellule crée une synapse virologique permettant le transfert de particules
infectieuses et/ou l’induction d’une cascade de signalisation conduisant à l’infection des
trophoblastes (21, 144, 172, 472, 473). La plupart de ces études ont été faites, soit avec des
BeWo, soit avec des cellules trophoblastiques primaires isolées de placentas. Or, les
cellules primaires ont des propriétés/caractéristiques différentes des cellules immortalisées :
celles-ci pourraient faire en sorte que la réplication du VIH-1 dans les cellules primaires
nécessite d’autres éléments qui ne sont pas requis par les cellules JAR.
En se basant sur les résultats abordés ci-haut, nous estimons que, malgré un mode d’entrée
inefficace du VIH-1 dans les trophoblastes, la dissémination du virus au fœtus est possible
car la production virale pourrait être déclenchée in vivo par l’IL-1 ou le TNF-α. Toutefois,
comme plusieurs de ces facteurs solubles sont exprimés de façon transitoire durant la
grossesse (521), l’infection des trophoblastes y serait favorisée pendant de courtes périodes
seulement. Nous estimons qu’in vivo cette expression transitoire des cytokines se refléterait
donc, en partie, par une susceptibilité à l’infection des trophoblastes variant en fonction du
stade de la grossesse. En accord avec cette thèse, alors que l’IL-1 et le TNF-α sont présents
au début de la grossesse puis au moment de l’accouchement (92, 240, 475, 510), une étude
a montré que la contamination fœtale se produit rarement durant le deuxième trimestre
(397, 448). Remarquons que la présence des tels facteurs n’est pas incompatible avec l’idée
que des cellules sanguines maternelles infectées puissent simultanément venir en contact
avec des trophoblastes et ainsi accroître davantage l’infection des trophoblastes.
Le fait que les trophoblastes requièrent des facteurs extracellulaires pour activer la
transcription génique n’est pas unique à ce type cellulaire. Par exemple, quoiqu’il soit
connu que les tissus adipeux des sujets séropositifs comportent des anomalies
morphologiques et métaboliques, l’infection des cellules adipeuses par le VIH-1 demeure
limitée. On a montré que la transcription virale est présente dans ce type cellulaire mais elle
se traduit par une production virale quasi nulle. On pense que cette limitation découle d’une
activation insuffisante de la voie de signalisation associée à l’expression génique du VIH-1.
362
En revanche, la présence du TNF-α augmente la production de Gag p24 et lève cette
restriction (355). La présence du TNF-α induit également l’expression génique du VIH-1
dans les macrophages (34, 175). En résumé, le niveau de production virale est donc modulé
par la composition en cytokines du milieu où se retrouvent les cellules visées par le VIH-1.
Outre une limitation lors de l’entrée virale, nous avons affirmé au chapitre 2 de cette thèse,
qu’il n’existe pas d’autre restriction majeure dans le cycle réplicatif du VIH-1 dans les
trophoblastes. Par exemple, nous avons montré que l’activité du LTR du VIH-1 y est
efficace, suggérant que la transcription virale s’y déroule adéquatement. Toutefois, il est
important de remarquer que les virus que nous avons utilisés, pour en arriver à cette
conclusion, étaient pseudotypés avec l’enveloppe du VSV. Or, nous avons remarqué depuis
que les trophoblastes sont particulièrement susceptibles à l’infection par ce virus :
l’intégration et la transcription virale du VIH-1 sont plus de 1000 fois supérieures lorsqu’il
porte l’enveloppe du VSV plutôt que sa propre enveloppe. De plus, puisque le VSV entre
dans une cellule par endocytose (580), l’utilisation de cette enveloppe permet de contourner
certaines étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1, tel le transit dans le cytoplasme. En
se référant à ces éléments, si certaines étapes en aval de l’entrée du VIH-1 de type sauvage
s’opéraient inefficacement dans les trophoblastes, elles pourraient être évitées et ainsi
passer inaperçues. En accord avec ce principe, malgré une transcription virale soutenue
induite par le TNF-α, la production virale du VIH-1 demeure extrêmement limitée dans les
trophoblastes et nécessite, en plus de cette induction, que les cellules soient mises en
contact avec des cellules indicatrices pour être détectée. Ceci nous permet donc d’imaginer
qu’il existe des facteurs restrictifs, dans les trophoblastes, touchant les étapes tardives du
cycle réplicatif du VIH-1.
En accord avec ce principe, une transcription élevée du VIH-1 dans les trophoblastes ne se
traduit pas automatiquement par une contamination fœtale. En effet, s’il existe une
corrélation positive entre la production d’IL-1, d’IL-6 et de TNF-α par les trophoblastes et
le taux de transcrits de Gag produits par ces cellules ex vivo (311), en revanche il n’y a pas
d’association entre le taux de transcription virale et d’infection fœtale, ni même entre le
niveau d’expression de TNF-α par les trophoblastes et la TME (311). De plus, chez les
363
femmes recevant de la zidovudine en prophylaxie, l’infection des cellules placentaires ne se
traduit pas systématiquement par une contamination du fœtus (137). Il nous semble donc
justifier d’établir si les étapes tardives du cycle réplicatif du VIH-1 s’opèrent normalement
dans les trophoblastes. Par exemple, il serait intéressant d’y investiguer l’efficacité de la
transcription, de la traduction et du bourgeonnement de ce virus afin d’éclaircir cette
notion. En effet, aucune étude scientifique n’a encore abordé ce sujet.
Si des limitations existent dans les étapes tardives du cycle viral, elles n’excluent pas la
possibilité que d’autres types d’éléments puissent également être présents et influencer la
contamination fœtale : ceci nous amène à considérer l’environnement placentaire dans son
ensemble. Les facteurs de croissance, les cytokines, les chimiokines et les hormones
secrétés par les cellules placentaires durant la grossesse agissent de façon concertée pour
créer un environnement suppressif à l’interface materno-fœtal, permettant ainsi la tolérance
du fœtus par le système immunitaire maternel (510, 521). Nous avons déjà dit que parmi
ces facteurs, certains tels que l’IL-1 et le TNF-α, facilitent l’expression génique du VIH-1
dans les trophoblastes. Cependant, des substances possédant une activité antivirale naturelle
sont également produites par le placenta. Par exemple, l’hCG bloque la production virale
dans les lymphocytes T chroniquement infectées par le VIH-1 et le transfert de virions de
ces cellules aux trophoblastes in vitro (69). De plus, si l’on compare l’expression du LIF
dans l’environnement placentaire des femmes enceintes qui transmettent et qui ne
transmettent pas le VIH-1 à leur nouveau-né, on remarque une augmentation de cette
protéine chez ces dernières. Le LIF bloque également le cycle réplicatif du VIH-1 dans les
lymphocytes in vitro, ce qui à terme, pourrait empêcher l’infection des trophoblastes (451).
L’élément à considérer est que ces facteurs inhibiteurs peuvent être exprimés par les
cellules placentaires en même temps que ceux activant la réplication virale (dans l’exemple
décrit plus haut, nous avons des facteurs qui bloquent l’infection du VIH-1 dans les
lymphocytes aux abords des trophoblastes, et d’autres induisant la transcription du VIH-1
dans ces dernières) (510, 521). Cette particularité pourrait être un autre élément explicatif
du fait que l’activation génique du VIH-1 dans les trophoblastes ne soit pas toujours
suffisante pour entraîner une contamination fœtale. En effet, nous pouvons postuler que
364
puisque des facteurs ayant une action opposée sur la transmission fœtale sont présents en
même temps dans l’environnement placentaire, ce processus sera alors soumis
simultanément à des signaux contradictoires. Nous pensons que la conséquence nette sur la
transmission verticale sera déterminée par les effets combinés de chacun de ces facteurs. En
d’autres termes, l’effet global des facteurs placentaires solubles pourraient dicter la
présence, ou au contraire l’absence de transmission verticale.
Si les chercheurs ont testé l’effet des facteurs solubles retrouvés dans le placenta, pris
individuellement, sur l’infection des trophoblastes par le VIH-1 in vitro (656), en revanche
on connaît peu de choses sur leur effet lorsqu’ils sont combinés (i.e. tels qu’on les retrouve
in vivo) : est-ce que l’activité inhibitrice de ces facteurs prédomine sur celle qui augmente
l’infection, ou est-ce l’inverse? Pour tenter de répondre à cette question, un groupe a utilisé
l’ensemble des facteurs solubles issus de grossesses normales et a évalué l’infection des
trophoblastes par le VIH-1 en leur présence in vitro. Ils ont observé que ceux-ci possèdent
effectivement à la fois des propriétés activatrice et inhibitrice de l’infection. Par contre,
quoique les substances endogènes antivirales limitent l’induction de la réplication virale,
les effets activateurs dominent (130). Ces résultats sont fort intéressants parce qu’ils
soulignent la complexité de la transmission verticale lorsqu’on tient compte de l’ensemble
des éléments solubles de l’environnement placentaire.
Nous pouvons, à partir de cette étude, soulever deux questions d’intérêt en lien avec la
compréhension de la transmission verticale du VIH-1. D’abord, il serait intéressant
d’analyser si ce contexte de cytokines/protéines change en fonction du stade de la
grossesse, de même qu’en fonction du statut sérologique de la mère (i.e. infectées vs non
infectées). Ensuite, si nous voulons contrer l’action positive sur le cycle viral des cytokines
pro-inflammatoires, il serait important de déterminer la nature exacte des facteurs
inhibiteurs présents dans l’environnement placentaire. À partir de cette connaissance, nous
pourrions envisager des moyens pour augmenter leur production in vivo. Par exemple,
certains auteurs ont proposé de valider l’utilisation de la progestérone pour prévenir la
transmission verticale du VIH-1. En effet, la progestérone, hormone essentielle à la
grossesse, promeut le développement de lymphocytes T produisant des cytokines de type 2,
365
telles que l’IL-4 et l’IL-10. L’IL-4 induit à son tour la production de LIF par ces cellules, ce
qui pourrait avoir des effets préventifs (477).
1.2 L’infection des trophoblastes se produit indépendamment
de la gp124 et de la gp41
Nous avons jusqu’à maintenant traité des facteurs qui déterminent la susceptibilité à
l’infection des trophoblastes. Le second élément tout à fait particulier que nous avons
découvert concernant l’infection des trophoblastes par le VIH-1 est qu’elle se produit
indépendamment des protéines de l’enveloppe virale, la gp120 et la gp41. En effet, ceci
suggère un tout autre mode d’entrée virale. Nous aborderons plus en détail cette notion plus
loin dans cette discussion. En revanche, nous avons observé que l’attachement du VIH-1
aux trophoblastes nécessite en partie les HSPG. Il faudrait maintenant déterminer
précisément quels types de HSPG sont impliqués. De plus, rappelons que le VIH-1 est
massivement internalisé par les trophoblastes. Or, cet évènement mène à l’infection des
trophoblastes. Dans ce contexte, évaluer le rôle exact des HSPG dans l’endocytose des
particules virales pourrait fournir des renseignements significatifs sur les mécanismes qui y
sont associés. En effet, il est connu que l’interaction d’un ligand avec ces macromolécules
entraîne l’une des conséquences suivantes : i) déclencher l’endocytose du complexe, ii)
entraîner le recrutement d’un récepteur auxiliaire, qui à son tour induit l’internalisation du
ligand, iii) induire un changement de conformation dans le ligand qui permet alors la
reconnaissance et la liaison à un récepteur cellulaire (revu par (191)). En d’autres termes,
l’attachement et l’endocytose peuvent être des événements séquentiels. D’autre part, outre
les HSPG, divers sucres, tels que le mannose et le lactose, de même que la toxine
cholérique, bloquent également l’internalisation de ce virus (résultats préliminaires non
publiés). C’est donc que les HSPG ne sont pas les seules molécules servant à l’attachement
du VIH-1 à la surface des trophoblastes. Nous pouvons donc conclure que le VIH-1 se lie
aux trophoblastes grâce à des interactions de type électrostatique (par les HSPG), sucressucres (par exemple par des sphingolipides) et/ou encore nécessitant des lectines. Ceci
permet au virus d’être rapidement endocytosé par les trophoblastes de façon constitutive
par un mécanisme indépendant de la clathrine et des cavéoles (voir plus bas).
366
1.3 L’entrée du VIH-1 se produit par endocytose
L’infection des trophoblastes se produit dans un contexte où la majorité des virions est
initialement rapidement endocytosée par ces cellules. En se basant sur cette observation,
nous avons donc voulu savoir s’il existe une relation obligatoire entre la présence initiale
du VIH-1 dans les endosomes et les étapes subséquentes de son cycle réplicatif menant à
l’infection productive des cellules. Rappelons que la bafilomycine A1 et le chlorure
d’ammonium sont des inhibiteurs des endosomes largement utilisés par les chercheurs pour
établir si le pH acide endosomal est requis pour l’entrée d’un virus enveloppé. Si un tel type
de virus est sensible à ces inhibiteurs, on considère alors qu’il fusionne dans les endosomes
et non à la membrane plasmique (267). Or, de façon fort surprenante, nous avons
documenté pour le VIH-1 que ces inhibiteurs perturbent l’accès des particules virales au
cytoplasme des trophoblastes, et bloquent ainsi toute expression génique dirigée par le
LTR. Nous pouvons donc conclure que l’infection des trophoblastes découle du transit des
particules virales par les endosomes cellulaires. L’endocytose du VIH-1 par ces cellules est
donc un évènement précoce et nécessaire au processus infectieux de ce virus.
Le fait que l’infection des trophoblastes nécessite l’endocytose des virions est inhabituel.
En effet, il est maintenant clairement reconnu que le VIH-1 entre dans une cellule-cible à la
suite de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane plasmique de cette cellule (333,
570). Inversement, quoiqu’il soit admis que l’endocytose du VIH-1 se produise de façon
parallèle à la fusion du virus à la membrane, cet évènement est sans issue puisqu’il mène à
la dégradation de la majorité des particules virales (340, 532). Ceci étant dit, le fait que les
virions soient dégradés dans les endosomes n’exclut pas la possibilité que certains y
échappent dans certaines conditions, et ce faisant, fusionnent dans les endosomes. En
accord avec ce principe, la bafylomicine A1 et le chlorure d’ammonium augmentent
l’infection du VIH-1 dans les cellules HeLa CD4 et dans les lignées lymphoïdes en
bloquant la dégradation des virions internalisés (185, 532). Une récente étude a également
montré que l’expression d’un dominant négatif de la dynamine et de l’Eps15 dans les
cellules HeLa CD4, inhibant l’endocytose par les puits de clathrine, y perturbe fortement
les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 (116). C’est donc que l’endocytose par les
puits de clathrine des particules virales peut effectivement mener à l’infection productive
367
d’une cellule-cible. Que le virus emprunte la voie d’endocytose pour pénétrer dans le
cytoplasme peut lui être avantageux. Par exemple, à la suite de la fusion à la membrane, les
virions font face au cytosquelette cortical d’actine constituant une barrière qui doit être
franchie. La fusion à partir des endosomes a l’avantage de livrer les particules virales
directement dans le cytoplasme et d’éviter cette barrière. Dans ce contexte, nous pouvons
envisager que la contribution relative de la fusion à la membrane, par rapport à celle se
produisant dans les endosomes, dépend en partie de la densité du cytosquelette cortical.
Toutefois, cette proportion de l’endocytose, versus la fusion membranaire, pourrait
également être modulée par le taux d’endocytose, la cinétique d’acidification des
endosomes, de même que par la cinétique de fusion virale, propriétés qui varient d’un type
cellulaire à l’autre. L’endocytose du VIH-1 pourrait donc avoir des conséquences
différentes en fonction des cellules visées par ce virus.
En accord avec ce principe, ce qui distingue l’infection des trophoblastes par le VIH-1, par
rapport à celle des lymphocytes T CD4+, est que l’endocytose des particules virales n’est
pas un évènement aléatoire mais bien obligatoire pour infecter ces cellules. Outre les
trophoblastes, il existe deux types cellulaires, les macrophages et les astrocytes, où
l’endocytose des virions semble aussi être un évènement préalable et nécessaire à leur
infection. Dans le cas des macrophages, l’inhibition de la macropinocytose réduit
considérablement l’entrée et l’infection (341). En ce qui concerne les astrocytes, on a
montré que la liaison des particules virales au récepteur du mannose entraîne leur
endocytose, évènement requis pour l’infection de ces cellules. Par contre, on n’a pas établi
de quelle voie d’endocytose il s’agissait (326).
1.4 Caractérisation de la voie d’endocytose menant à
l’internalisation du VIH-1
Considérant que l’endocytose du VIH-1 est une étape essentielle de son cycle réplicatif
dans les trophoblastes, il devenait impératif de définir, parmi les voies d’endocytose
possibles dans ces cellules, celle(s) responsable(s) de l’internalisation du VIH-1 menant à
l’infection cellulaire. D’abord, quoique l’on n’ait encore jamais rapporté dans la littérature
scientifique que la macropinocytose se produise dans les trophoblastes, elle nous semblait
368
possible. En effet, la macropinocytose a lieu dans les cellules épithéliales et dans les
macrophages (583). Or, les trophoblastes sont des cellules épithéliales qui possèdent des
caractéristiques s’apparentant à celles des macrophages (221). Toutefois, dans les
conditions de culture que nous avions, la macropinocytose n’a pu être détectée dans ces
cellules. Il nous appert donc que l’internalisation du VIH-1 se produit par un autre mode.
Ensuite, nous avons observé que lorsque la voie d’endocytose par les clathrines est bloquée,
soit par un inhibiteur pharmacologique ou par l’expression transitoire d’un dominant
négatif de l’Eps15, l’infection des trophoblastes par le VIH-1 n’est pas modulée. Ceci nous
permet d’exclure cette voie d’endocytose. Deux éléments confirment cette affirmation.
Premièrement, les particules virales se retrouvent initialement dans des organelles distinctes
de ceux contenant la transferrine. Deuxièmement, l’expression par les trophoblastes d’un
dominant négatif de la dynamine, protéine associée à l’endocytose par la clathrine (121),
n’a eu aucun impact sur l’endocytose du VIH-1. D’autre part, puisque la dynamine n’est
pas requise pour l’internalisation du VIH-1, nous estimons que l’endocytose par les
cavéoles et l’endocytose par les radeaux lipidiques de type cavéolaire ne participent pas
non plus à cet évènement. En effet, il s’agit ici de deux modes d’endocytose qui l’exigent
(460). Cette dernière conclusion est corroborée par deux faits. D’abord, les trophoblastes
n’expriment pas la cavéoline (331). Ensuite, un inhibiteur des kinases de la famille des Src,
le PP2, et un inhibiteur des tyrosine phosphatases, le bpV(pic), ne réduisent pas
l’internalisation du VIH-1 dans les trophoblastes. En s’appuyant sur l’ensemble de ces
résultats, nous en venons à la conclusion que l’endocytose du VIH-1 dans les trophoblastes
se produit par une voie indépendante de la clathrine, des cavéoles/des radeaux lipidiques de
type cavéolaire et de la dynamine.
Qu’en est-il du rôle des radeaux lipidiques? La question semble épineuse. Rappelons
d’abord qu’il est généralement admis que les voies d’endocytose nécessitant les radeaux
lipidiques sont sensibles à la fois au MtβCD et à la filipine. En revanche, le MtβCD est
moins spécifique, lorsque lui seul réduit l’endocytose d’une molécule donnée, on ne peut
conclure que les radeaux lipidiques y sont requis (511). Dans le cas de l’endocytose du
VIH-1 par les trophoblastes, elle se produit normalement en présence du MtβCD. C’est
369
donc que le cholestérol membranaire n’est pas en soi requis et, par conséquent, les radeaux
lipidiques ne le sont pas non plus (en absence de cholestérol, les radeaux lipidiques sont
désassemblés). En revanche, la filipine affecte grandement l’endocytose du VIH-1 dans ces
cellules. Puisque le MtβCD n’a eu aucun impact sur cet évènement, nous pensons donc que
les effets induits par la filipine ne sont pas directement associés aux radeaux lipidiques.
Nous estimons plutôt que les effets de cet inhibiteur démontrent que le cholestérol
membranaire doit se retrouver libre à la membrane.
En accord avec ce principe, on a remis en cause les répercussions de la filipine sur les
radeaux lipidiques proprement dits. En effet, l’internalisation et l’action de la toxine
cholérique (Ctx) sont réduites par la filipine dans les cellules intestinales, les CaCo-2, ainsi
que dans la lignée cellulaire dérivée d’un lymphome à cellules T (les Jurkat), cellules
exprimant peu ou pas la cavéoline (437). De même, l’internalisation du CMH-I est sensible
à la filipine. Pourtant, il s’agit d’une endocytose qui est indépendante de la clathrine, de la
dynamine, des cavéoles et des radeaux lipidiques (409). Ainsi, on estime que l’inhibition
induite par ce composé est davantage associée à des modifications des caractéristiques
biochimiques des régions membranaires impliquées dans l’endocytose, résultant de
l’association de la filipine et du cholestérol, qu’aux cavéoles/radeaux lipidiques (437).
Une autre hypothèse pouvant expliquer la différence entre la filipine et le MtβCD lors de
l’endocytose du VIH-1 est la suivante. La membrane apicale des épithéliales polarisées est
particulièrement rigide en raison d’une concentration accrue de sphingolipides
membranaires (537). Dans ce contexte, nous présumons que la filipine, en liant le
cholestérol membranaire, accroît cette rigidité de la membrane et, ce faisant, elle perturbe
sa capacité à s’invaginer. Puisqu’il s’agit d’un évènement requis pour la formation des
vésicules d’endocytose, la filipine inhibe ainsi profondément l’internalisation du VIH-1.
Par contre, contrairement à la filipine, la perte du cholestérol membranaire, induite par le
MtβCD, provoque une augmentation de la fluidité membranaire (revue par : (80)), ce qui
semble être un évènement sans conséquence sur le processus d’internalisation du VIH-1
dans les trophoblastes. En résumé, nous pensons que les radeaux lipidiques/le cholestérol
ne jouent pas un rôle actif dans l’endocytose du VIH-1 dans les trophoblastes. Par contre,
370
nous pensons que pour que cet évènement puisse se produire normalement, le
cholestérol doit se retrouver libre de circuler dans la membrane, ou bien la rigidité de la
membrane ne doit pas être accrue.
Il y a une exception au fait que le MtβCD n’affecte pas l’endocytose du VIH-1 dans les
trophoblastes : celle des virions de type Ada-M y est partiellement sensible. Or, nous avons
également noté que seule l’internalisation de ce virus est également légèrement affectée par
l’expression du dominant négatif de l’Eps15. Puisque le MtβCD module l’endocytose par
les puits de clathrine (511), nous pensons donc que le Ada-M est partiellement internalisé
par cette voie d’endocytose. Il serait important de vérifier la co-localisation de souches à
tropisme R5 et X4 dans les trophoblastes en relation avec la transferrine, marqueur de
l’internalisation par les clathrines, pour voir si des différences existent.
Il est important de remarquer que l’hypothèse que nous avons soulevée à l’effet que les
radeaux lipidiques ne participent pas à l’endocytose du VIH-1 tient essentiellement au fait
que cet évènement est insensible au MtβCD. Or la sensibilité ou l’insensibilité à un ou
plusieurs agents pharmacologiques perturbant ces structures membranaires ne constitue pas
un critère très sélectif (447). Nous pensons alors que certaines expériences supplémentaires
sont requises. D’abord, nous pourrions établir si les virions se lient à des régions riches en
radeaux lipidiques à la surface des trophoblastes. Pour ce faire, les trophoblastes sont mis
en contact avec des particules virales pour permettre leur attachement à la surface des
cellules. Ensuite, les cellules sont traitées ou non au détergent, le Triton X-100, puis fixées
et marquées par des anticorps anti-VIH-1, et observées par microscopie confocale (122). Si
le VIH-1 ne se lie pas à des régions riches en radeaux lipidiques, ce traitement occasionnera
la solubilisation des protéines virales associées aux trophoblastes et donc la perte du signal.
Il faut noter que la corrélation entre la résistance à des détergents et la formation de
domaines membranaires fait présentement l’objet de débat dans la littérature (402, 416).
Dans ce contexte, il serait approprié d’investiguer également par microscopie confocale si
le VIH-1 s’associe aux trophoblastes à des régions membranaires où on retrouve des
marqueurs reconnus des radeaux lipidiques, tels que les GPI-AP (le récepteur du folate ou
371
le DAF), ou encore le LacCer, en procédant à un double marquage, i.e. VIH-1 et l’un des
marqueurs des radeaux lipidiques que l’on vient d’énumérer.
La voie d’endocytose empruntée par le VIH-1 dans les trophoblastes, processus
indépendant de la clathrine, des cavéoles, de la dynamine et probablement aussi des
radeaux lipidiques, constitue un mode d’internalisation peu commun et peu connu. Ainsi,
aucun marqueur spécifique à cette endocytose n’est encore défini ((272). Toutefois, cette
voie d’endocytose du VIH-1 que nous avons identifiée partage des points communs avec
l’internalisation de certains virus et macromolécules. Avant de procéder à la comparaison
entre nos résultats et ceux publiés, nous tenons à revenir ici sur trois exemples importants
d’endocytose atypique menant soit vers : i) les cavéosomes, ii) les GEEC (GPI-AP
enriched early endosome compartments), ou iii) les endosomes de triage Arf6+.
Premièrement, tout comme le VIH-1, l’entrée du virus SV40 dans les fibroblastes
embryonnaires déficients en cavéoline est insensible à l’expression d’un dominant négatif
de l’Eps15, de la dynamine-2 ou de l’Arf6 mais elle est perturbée par la nystatine (effet
semblable à la filipine). De plus, le SV40 internalisé ne co-localise ni avec des marqueurs
des endosomes classiques (la Tfn et l’EEA-1), ni avec des marqueurs de l’endocytose par la
phase fluide (le dextran et le LY). Par contre, cette endocytose est sensible à la génistéine.
De plus, le SV40, se retrouvant à la surface des cellules, est résistant à l’extraction par les
détergents. Ces deux derniers éléments corroborent le fait qu’il s’agit d’une endocytose
dépendante des radeaux lipidiques. Les virus se retrouvent dans de petites vésicules à pH
neutre qui se rendent ensuite à des organelles qui sont semblables aux cavéosomes (122).
Deuxièmement, l’endocytose des GPI-AP (i.e. le récepteur du folate, le DAF et le GPIGFP) dans les cellules CHO et Cos-7, à la suite de leur liaison par un ligand monomérique,
est insensible à l’expression d’un dominant négatif de l’Eps15 ou de la dynamine, et elle se
produit normalement en absence de la cavéoline. La différence notable, entre l’endocytose
de ces protéines et celle du SV40 décrite dans l’exemple précédent, est qu’immédiatement
après leur endocytose, les GPI-AP se retrouvent dans des compartiments intracellulaires
contenant également le dextran, l’HRP et le LY. Ces organelles, qui sont distincts de ceux
contenant le transferrine et le LDL, sont nommées les GEEC. L’endocytose de la
372
cytotoxine VacA de l’Helicobacter pylori par les cellules HeLa (202), de même que celle
de la Ctx par les fibroblastes embryonnaires déficients en cavéoline (272), répondent
essentiellement à ces mêmes critères. Soulignons qu’au plan ultra-structurel, les vésicules
primaires dans lesquelles la Ctx se retrouve (formées dans les 15 s à 5 min suivant
l’endocytose), que l’on considère être semblables aux GEEC, sont situées à la périphérie de
la membrane plasmique et présentent une forme tubulaire caractéristique. Cet élément
distinctif des GEEC facilite la caractérisation par microscopie électronique d’autres
macromolécules/virus internalisés par ces mêmes vésicules/voie d’endocytose (272). Les
GEEC sont formés en absence de Rab5 et ne sont pas associés au Rab4 ni au Rab7.
Toutefois, leur formation nécessite la participation du Cdc42 (519).
Troisièmement, l’endocytose dans les cellules HeLa du CMH-I et de la protéine Tac (sousunité alpha du récepteur de l’IL-2), protéines membranaires ne possédant pas de signal de
reconnaissance de l’endocytose contrôlée par l’AP-2/clathrine, est insensible à l’expression
d’un dominant négatif de la dynamine. De plus, ces deux protéines se retrouvent dans des
vésicules ne contenant ni la transferrine, ni le LDL. Finalement, elles ne co-localisent pas
avec la cavéoline et elles sont sensibles à l’extraction par les détergents : elles ne sont donc
pas associées aux radeaux lipidiques. Toutefois, rappelons que leur endocytose demeure
sensible à la filipine. Il s’agit donc d’une endocytose indépendante de la clathrine, des
cavéoles, de la dynamine et des radeaux lipidiques mais qui nécessite que le cholestérol
membranaire soit libre (272, 409, 410). L’élément distinctif de cette endocytose est que,
contrairement aux deux exemples précédents, elle est augmentée par l’expression d’un
dominant actif de l’Arf6 et réprimée par l’expression d’un dominant négatif de cette
protéine. De plus, les protéines internalisées sont acheminées vers des endosomes de triage
positifs pour l’Arf6, lesquels sont distincts des endosomes de triage classiques associés à la
transferrine. Quoique certaines GPI-AP s’y retrouvent également, on estime toutefois que
ces organelles sont distincts des GEEC (272, 409, 410).
En résumé, l’endocytose du SV40, de la Ctx, des GPI-AP, de la VacA et du CMH-I répond
aux critères suivants : premièrement, elle est indépendante de la clathrine, des cavéoles et
de la dynamine. Deuxièmement, si ces virus/macromolécules ne co-localisent pas avec la
373
transferrine et/ou le LDL, à l’exception du SV40, ils se retrouvent par contre dans les
mêmes vésicules que le dextran ou le LY. Troisièmement, sans pouvoir affirmer que ces
voies d’endocytose requièrent réellement la participation des radeaux lipidiques, on a tout
de même montré qu’elles sont toutes sensibles aux agents perturbant les radeaux lipidiques
et/ou que les macromolécules/virus internalisés se retrouvent associés à de telles régions à
la membrane plasmique. Quatrièmement, un élément distinctif qui semble déterminant
quand on considère ces types d’endocytose est la sensibilité à l’Arf6 : l’endocytose des
macromolécules/virus sensible à cette protéine mène vers des endosomes de triage Arf6+,
alors que celles qui y sont insensibles conduiraient vers les GEEC ou encore aux
cavésosomes. Un résumé de ces données est présenté au Tableau 7.
Si nous faisons maintenant un parallèle entre l’endocytose de ces macromolécules/virus et
les observations concernant l’internalisation du VIH-1 par les trophoblastes, nous en
venons aux conclusions suivantes. D’abord, nous excluons d’emblée que ce processus
mène les particules virales, comme le SV40, vers les cavéosomes/organelles apparentés. En
effet, ces structures intracellulaires ont un pH neutre (122). Or, nous avons montré que le
pH endosomal est intimement lié à l’infection des trophoblastes par le VIH-1. L’endocytose
de ce virus s’apparente donc davantage à celle des GPI-AP, de la Ctx, de la VacA et du
CMH-I. Toutefois, quelques éléments propres à l’internalisation de chacune de ces
macromolécules divergent par rapport à l’endocytose du VIH-1. Premièrement, en ce qui
concerne les GPI-AP et la Ctx (dont le récepteur cellulaire est le GM1), la participation des
radeaux lipidiques, quoiqu’elle n’ait pas été clairement démontrée, semble implicite. Or,
dans le cas du VIH-1 cette dépendance est moins claire. Deuxièmement, en ce qui concerne
l’endocytose du CMH-I, elle nécessite l’Arf6, ce qui n’est pas le cas du VIH-1. Les
différences importantes entre l’endocytose du VIH-1 par les trophoblastes et celles
dirigeant l’internalisation des macromolécules citées nous empêchent de pouvoir conclure
que cette internalisation correspond à l’un ou l’autre des deux modes présentés (i.e. vers les
GEEC ou les endosomes Arf6+). S’agit-il alors d’une voie d’endocytose tout à fait
différente? Avant de pouvoir l’affirmer, toute une série d’expériences devrait être
entreprise.
374
Premièrement, pour éliminer la voie d’endocytose utilisée par le SV40 vers les
cavéosomes, une approche intéressante serait de voir si, dans les trophoblastes, l’albumine
peut toujours être internalisée (i.e. en l’absence de la cavéoline), et le cas échant, si le VIH1 emprunte la même voie d’endocytose que cette molécule. En effet, l’albumine est un
marqueur reconnu de l’endocytose par les cavéoles (539). Le suivi du récepteur de l’IL-2
exprimé de façon transitoire par les trophoblastes serait aussi une option (295). De plus,
quoique l’on ait noté que l’internalisation du SV40 requiert la phosphorylation par des
protéines kinases (122), ce n’est pas le cas de l’internalisation de la VacA vers les GEEC
(202), ni celui du VIH-1 dans les trophoblastes. Ceci étant dit, tester l’impact de la
genistéine sur l’endocytose du VIH-1, qui a un effet plus large sur les tyrosine kinases que
le PP2, pourrait être révélateur. Des inhibiteurs des sérine/thréonine kinases pourraient
éventuellement aussi faire l’objet d’une analyse (463).
(122)
Cellules fibroblastes
embryonnaires
déficientes en cavéoline
(-)
(-)
(-)
n.d.
Cellules déficientes
n.d.
(+)
(-)
(-)
n.d.
(-)
Vésicules à pH neutre,
puis à un organelle
semblable au cavéosome
(519)
(-)
(-)
(-)
n.d.
Cellules déficientes
n.d.
n.d.
n.d.
(+)
(+)
n.d.
GEEC
CHO et Cos-7
GPI-AP
(272)
Cellules fibroblastes
embryonnaires
déficientes en cavéoline
(-)
(-)
Partielle
n.d.
Cellules déficientes
(+)
n.d.
n.d.
(+)
n.d.
(-)
GEEC
Ctx
(202)
(-)
(-)
(-)
n.d.
(-)
(+)
n.d.
(-)
(+)
n.d.
(-)
GEEC
Cellules HeLa
VacA
(272, 409, 410)
n.d.
(-)
(-)
(-)
(-)
n.d.
(+)
(+)
n.d.
n.d.
(+)
Arf6(+)
Cellules HeLa
CMH-I
Légende : dn = dominant négatif, (-) = traitement sans effet, (+) = sensible au traitement, n.d. = non déterminé.
Références
dn Eps15
dn dynamine
Co-localisation Tfn
LDL
Cavéoline
Sensibilité
MtβCD
Filipine/nystatine
Solubilisation par les détergents
Co-localisation Dextran
LY
Sensibilité
dn Arf6
Vésicules/organelles initiaux
Sensibilité
Type cellulaire étudié
SV40
Macromolécules/virus
(-)
(-)
(-)
n.d.
Cellules déficientes
(-)
(+)
n.d.
n.d.
n.d.
(-)
n.d.
JAR
HIV-1
Comparaison entre les propriétés connues de l’endocytose indépendante de la clathrine et des cavéoles et de la dynamine
et celles de l’endocytose du VIH-1 dans les JAR.
Propriétés de l’endocytose
Tableau 7
375
375
376
Deuxièmement, en ce qui concerne la voie d’endocytose menant vers les GEEC, nous
pourrions vérifier si l’internalisation de GPI-AP, telles que le récepteur du folate (exprimé
par les trophoblastes) ou la protéine GPI-GFP (exprimée de façon transitoire) emprunte le
même parcours que le VIH-1 dans les trophoblastes. Nous pourrions également établir si ce
virus co-localise avec des marqueurs de l’endocytose par la phase fluide tels que le HRP et
le LY. De plus, il nous apparaît intéressant de caractériser le transporteur intracellulaire
primaire du VIH-1 dans les trophoblastes avant qu’il ne fusionne avec d’autres
compartiments cellulaires. Une approche semblable à celle que l’on a utilisée pour définir
le transporteur associé à l’endocytose de la Ctx semble adéquate (272). Pour ce faire, les
trophoblastes sont exposés à 4 ˚C à des particules virales présentant à leur surface une
protéine couplée au HRP, puis incubés pendant de très courtes périodes à 37 ˚C. Les
cellules sont alors exposées à un substrat du HRP, le DAB (diaminobenzidine), en présence
de l’acide ascorbique (AA). Seules les particules virales internalisées sont détectées par
cette technique puisque l’AA est un agent réducteur imperméable à la membrane plasmique
qui désactive la réaction par le HRP. Les cellules sont ensuite préparées pour être observées
par microscopie électronique. Nous pourrions ainsi établir si le VIH-1 est transporté vers
les GEEC. Finalement, nous devrions investiguer la participation des petites protéines G
dans l’endocytose du VIH-1. En effet, on a montré que l’internalisation des GPI-AP et de la
VacA vers les GEEC dépend du Cdc42 (202, 519). Pour ce faire, les trophoblastes peuvent
soit être traités à la toxine B de Clostridium difficile (inhibiteur des protéines Rho et de
l’endocytose par phase fluide), et/ou transfectés avec des vecteurs d’expression codant pour
des dominants négatifs de Cdc42. Il serait également pertinent d’évaluer le rôle de RhoA et
de Rac1 qui participent à l’endocytose « non classique » de l’IL-2 et de la VacA par
exemple (202, 294).
Troisièmement, en ce qui concerne l’internalisation vers les endosomes de triage Arf6+, il
faut souligner que l’expression d’un dominant actif ou négatif de l’Arf6 dans les cellules
perturbe l’endocytose du CMH-I dans les 16-20 h suivant la transfection des cellules. Plus
tard, cet effet n’est plus observable (409). Or, nous avons procédé à l’analyse de l’impact
de ces mutants sur l’endocytose du VIH-1 plutôt dans les 30 h suivant la transfection des
trophoblastes. Il serait donc essentiel de répéter cette expérience à des temps plus courts
377
post-transfection afin de déterminer si l’Arf6 ne participe réellement pas à l’endocytose du
VIH-1 dans les trophoblastes.
Remarquons finalement que si nous avons affirmé que l’endocytose du VIH-1 dans les
trophoblastes a lieu par une voie distincte des clathrines, pour pouvoir le conclure hors de
tout doute, nous proposons de suivre le parcours de la transferrine et du LDL, deux
marqueurs de cette endocytose, par rapport à celui des virions. Initialement, ces marqueurs
devraient se retrouver dans le même organelle, alors que le VIH-1 ne devrait pas s’y
retrouver. Par contre, alors que la transferrine est très rapidement recyclée, le LDL est
acheminé des endosomes de triage aux endosomes tardifs. Ainsi, puisque le LDL et le VIH1 vont tous deux aux endosomes tardifs, leur co-localisation devrait augmenter dans le
temps, alors que celle entre le LDL et la transferrine, devrait diminuer. En résumé, le VIH1 est internalisé par une voie d’endocytose indépendante de la clathrine, de la dynamine, de
l’Arf6, des cavéoles et probablement des radeaux lipidiques. Par contre, elle nécessite que
le cholestérol demeure libre à la membrane plasmique. Il reste à préciser, en relation avec
des marqueurs précis que nous avons énumérés précédemment, si cette endocytose
s’apparente à celle conduisant les cargos aux GEEC ou encore aux endosomes de triage
Arf6+. L’ensemble des expériences suggérées permettraient de mieux caractériser les
paramètres régissant l’endocytose du VIH-1 dans les trophoblastes.
1.5 Le parcours intracellulaire du VIH-1 dans les trophoblastes
Après le processus d’endocytose du VIH-1, le deuxième aspect clé à considérer pour
comprendre les évènements précoces menant à l’infection des trophoblastes par le VIH-1
est le suivant : il nous faut caractériser les étapes qui se produisent immédiatement après
l’internalisation des particules virales. Nous avons utilisé deux stratégies expérimentales
dans cette thèse pour y parvenir : la première est de nature cellulaire, alors que la deuxième
est de nature moléculaire. D’abord, nous avons étudié par microscopie confocale le
parcours intracellulaire des virions à la suite de leur internalisation. Rappelons que les
trophoblastes sont des cellules de type épithélial qui sont polarisées. Ils possèdent donc un
transport endosomal polarisé bidirectionnel permettant le recyclage, la transcytose et la
dégradation des molécules internalisées (51). Globalement, nous pouvons conclure qu’à la
378
suite de son internalisation dans les trophoblastes, le VIH-1 se trouve largement distribué
dans les endosomes cellulaires, suggérant que l’ensemble de la machinerie endosomale de
la cellule-hôte est sollicitée par ce virus. Or, nous avons observé que le VIH-1 pouvait avoir
dans les trophoblastes différents devenirs qui requièrent tous la participation des
endosomes. En effet, outre le fait qu’une proportion des virions internalisés soit dégradée,
le VIH-1 peut infecter de façon productive ces cellules, il peut être transcytosé, et il peut
être recyclé vers le pôle apical. Le fait que le VIH-1 se retrouve dans de nombreux types
d’endosomes est en accord avec le fait qu’il puisse accomplir diverses fonctions dans les
trophoblastes.
De façon plus précise, nous avons observé que le VIH-1 co-localise peu avec le marqueur
des endosomes de triage, l’EEA1 : le maximum, variant de 15 à 36%, est observé après
quinze minutes d’internalisation. Nous pensons que le transit du VIH-1 par ces endosomes
est soit trop rapide pour être détecté adéquatement et nous le sous-estimons ou bien, ce qui
nous semble plus probable, le VIH-1 est principalement acheminé vers des endosomes
EEA1(-). Ainsi, deux options sont possibles pour expliquer la présence du VIH-1 dans les
endosomes de triage EEA1(+) : i) un transport direct dirige les virions de la membrane
plasmique à ces organelles, ou ii) un transit par les endosomes de triage EEA(-) permet
d’atteindre les endosomes EEA1(+). Trois éléments corroborent cette seconde hypothèse.
Premièrement, nous savons que l’endocytose du VIH-1 est indépendante des puits de
clathrine. Deuxièmement, nous avons observé que le VIH-1 suit un parcours qui est
initialement différent de celui emprunté par la transferrine, un marqueur des endosomes dits
« classiques ». Ce n’est que plus tard qu’on les retrouve tous deux dans les mêmes
compartiments. Finalement, nous avons établi que l’endocytose du VIH-1 est indépendante
de Rab5 dont l’activité régule, entre autres, la fusion des vésicules issues de l’endocytose
par les puits de clathrine aux endosomes de triage EEA1+ (573). Nous traiterons
spécifiquement de cette notion de transport du VIH-1 à des organelles EEA1(-) un peu plus
loin dans cette discussion.
D’autre part, nous avons également observé qu’après avoir atteint les endosomes de triage,
le VIH-1 est ensuite dirigé aux endosomes tardifs. Par contre, contrairement aux
379
endosomes de triage où la présence du VIH-1 n’est que transitoire, la présence du VIH-1
dans les endosomes tardifs s’accroît dans le temps, indiquant qu’il y ait une accumulation
des particules virales dans ces organelles.
Il est à remarquer que la cinétique de co-localisation du VIH-1 et de l’EEA1 ne ressemble
pas à celle observée pour la transferrine et le VIH-1. En effet, alors qu’après 15 min
d’internalisation, on obtient le maximum de co-localisation entre le VIH-1 et l’EEA1, ce
maximum est atteint après 45 min lorsqu’on considère la transferrine. Ces résultats sont
étonnants considérant que la transferrine est d’abord acheminée aux endosomes de triage
pour ensuite être recyclée à la membrane plasmique (544). Une hypothèse pouvant
expliquer ce décalage entre ces deux cinétiques est que le VIH-1 co-localise davantage avec
la transferrine, non pas dans les endosomes de triage, mais plutôt dans les endosomes de
recyclage. En accord avec ce principe, le VIH-1 se retrouve partiellement dans ces
organelles en raison d’une co-localisation avec le Rab11. Afin de résoudre cette apparente
contradiction, il serait important de suivre simultanément le parcours du VIH-1 et de la
transferrine en relation à l’EEA1, de même que leur transit vis-à-vis du Rab11. Ceci nous
permettrait en effet d’établir leur présence respective dans les endosomes de triage et dans
les endosomes de recyclage. De plus, nous pourrions effectuer ces expériences à 20 ˚C
plutôt qu’à 37 ˚C. En effet, à cette température, quoique l’endocytose soit toujours
fonctionnelle, les mouvements intracellulaires sont ralentis, et de ce fait, le transit des
virions pourrait être mieux cerné.
Si quelques études ont porté sur le parcours intracellulaire du VIH-1 à la suite de son
internalisation, particulièrement dans les cellules dendritiques, aucune n’avait encore porté
sur le transit du VIH-1 dans les muqueuses. D’après les résultats que nous présentons dans
cette thèse, il appert que le transit de ce virus dans les cellules dendritiques et dans les
trophoblastes est fort différent. En effet, on a observé que les virions sont endocytosés par
les cellules dendritiques par une voie qui serait en partie dépendante de la clathrine (182,
198, 289). Par contre, la majorité des particules virales sont rapidement ségréguées hors des
endosomes classiques : seulement une faible proportion de celles-ci se retrouvent dans les
endosomes EEA1(+) ou dans les endosomes tardifs/corps vésiculaires (198, 289, 609). Les
380
virions internalisés se retrouvent plutôt dans des organelles légèrement acides mal
caractérisés qui sont enrichis en CD82, CD81, CD9 et CD53, évitant ainsi la dégradation
pendant un certain temps (198).
1.6 Le rôle de Rab5 et de Rab7 dans l’entrée virale
Sachant que l’endocytose du VIH-1 est une étape nécessaire à l’infection des trophoblastes
et ayant déterminé que le VIH-1 transite par les endosomes de triage, de recyclage et
tardifs, nous avons ensuite tenté de définir la relation, au plan moléculaire, entre la présence
du VIH-1 dans ces compartiments cellulaires et les étapes subséquentes de son cycle
réplicatif. Pour ce faire, nous avons transfecté de façon transitoire, dans les trophoblastes,
les vecteurs d’expression codant pour des dominants négatifs et actifs des protéines Rab5,
Rab7, Arf6 et Rab11. L’idée étant que si l’une ou l’autre de ces protéines, qui modulent le
transit entre les endosomes cellulaires, sont impliquées dans le transport des virions menant
à l’infection des trophoblastes, alors si on perturbe leur fonction ceci se répercutera sur le
cycle viral du VIH-1. D’abord, nous avons observé que la protéine Rab11 ne participe pas à
ce processus. Il en va tout autrement des protéines Rab5 et Rab7 qui y jouent un rôle clé.
Nous présentons une description de ces résultats importants dans les sections qui suivent.
Afin de comprendre l’impact de Rab5 sur l’infection du VIH-1, il nous faut réconcilier des
résultats qui semblent, de prime abord, contradictoires. D’un côté, nous savons que
l’endocytose de ce virus se produit par un mécanisme indépendant des puits de clathrine et
de Rab5. De plus, les particules virales se retrouvent initialement dans des organelles
distincts de ceux contenant la transferrine. De l’autre coté, nous avons établi que le Rab5
régule l’infection du VIH-1 et que les virions co-localisent partiellement avec les
endosomes de triage EEA1+. L’ensemble de ces données nous permettent de conclure deux
choses : i) le VIH-1 se retrouve initialement dans des organelles primaires différents de la
voie classique d’endocytose, et ii) la voie d’endocytose indépendante de la clathrine
empruntée par le VIH-1 se fond éventuellement avec celle, classique, menant aux
endosomes de triage EEA1(+). En d’autres termes, nous pensons que le VIH-1 est d’abord
acheminé à des organelles primaires EEA1(-), puis ensuite aux endosomes de triage
classiques EEA1(+) grâce à un mouvement vésiculaire entre ces deux types d’endosomes.
381
Nous croyons que ce transport dépend de Rab5. Cette hypothèse permet d’expliquer le fait
que le Rab5 ne soit pas requis pour l’endocytose proprement dite du VIH-1 mais qu’il soit
essentiel au processus infectieux. Ceci nous permet également de penser que, si le VIH-1
doit se rendre aux endosomes EEA1(+) pour que l’infection se produise, par contre, ce
transit n’est pas suffisant en soi. En effet, lorsque les particules virales s’y trouvent
bloquées (par l’expression d’un dominant actif de Rab5), l’infection n’a pas lieu non plus.
Le fait que le VIH-1 puisse transiter d’organelles primaires EEA1(-) aux organelles
EEA1(+) constitue une observation étonnante considérant que le Rab5 contrôle la fusion de
vésicules primaires issues de l’endocytose de la clathrine aux endosomes de triage
classiques, de même que la fusion homotypique de ces organelles (642). En fait, peu de cas
dans la littérature font état d’un tel mouvement intracellulaire. L’exemple le plus élégant est
l’endocytose du SV40 et de la Ctx par les cavéoles. Cette endocytose conduit aux
cavéosomes. Or, on a récemment montré qu’il existe un transport des cavéoles entre les
cavéosomes et les endosomes de triage classiques qui dépend de Rab5 (458). En effet,
l’expression d’un dominant actif de Rab5 promeut, non pas l’endocytose de ces marqueurs
(ce qui serait le cas de la transferrine), mais plutôt le transport du SV40 et de la Ctx hors
des cavéosomes aux endosomes de triage classiques. C’est donc que le Rab5 peut contrôler,
non seulement l’attachement/la fusion des vésicules dérivées de l’endocytose par les puits
de clathrine aux endosomes de triage, mais aussi celle des cavéoles issues des cavéosomes
(458). De plus, la VacA (vers les GEEC), le CMH-I et le Tac (vers les endosomes de triage
Arf6+), qui empruntent un parcours différent de la transferrine, se retrouvent tous trois
après 30 min dans les endosomes de triage EEA1+, puis ensuite aux endosomes tardifs
(202, 409, 410). Ceci illustre qu’un transport des GEEC et des endosomes de triage Arf6+
vers les endosomes de triage EEA1+ a lieu. En s’appuyant sur ces exemples, nous pensons
donc que le Rab5, sans contrôler l’endocytose du VIH-1 dans les trophoblastes, dirige le
transport des virions des endosomes primaires EEA1(-) aux endosomes de triage
classiques, évènement essentiel pour ensuite atteindre les endosomes tardifs.
Le fait que le VIH-1 puisse se retrouver dans des endosomes EEA1(-) soulève d’autres
hypothèses. Avant d’y venir, spécifions que le Rab5, conjointement avec la protéine
382
hVPS34, régulent le recrutement aux endosomes de triage de protéines effectrices, dont
l’EEA1. Si cette dernière participe activement à l’attachement/la fusion des vésicules aux
endosomes de triage classiques (99, 550), d’autres protéines effectrices de Rab5,
notamment la rabankyrine-5, peuvent également assurer cette fonction (536). En effet, au
même titre que l’EEA1, la rabankyrine-5 promeut la fusion des vésicules primaires issues
de l’endocytose par les clathrines avec les endosomes de triage, de même que la fusion
homotypique des endosomes de triage. Dans cette situation, l’EEA1 et la rabankyrine-5 se
retrouvent toutes deux aux endosomes de triage (536). L’élément intéressant à considérer
est que la rabankyrine-5 favorise également l’endocytose indépendante de la clathrine de
marqueurs de la phase fluide, tels que le HRP et le dextran, se produisant au pôle apical des
cellules épithéliales polarisées (536). Dans ce processus, la rabankyrine-5, à la suite de son
association au Rab5, se retrouve à la membrane d’organelles EEA1(-) (536). En s’appuyant
sur ces données, nous formulons l’hypothèse que le transit des virions entre les endosomes
EEA1(-) et les endosomes EEA1(+), dirigé par le Rab5, peut impliquer, non seulement
l’EEA1, mais également la rabankyrine-5. De plus, sachant que les endosomes de triage
classiques comportent plusieurs domaines caractérisés par une composition protéique
différente (par exemple, l’EEA1 n’y est pas uniformément distribué) (662), on peut alors
penser que la rabankyrine-5 permet aux vésicules de transport, en provenance des
endosomes EEA1(-) où se situe le VIH-1, de s’arrimer/fusionner à des domaines des
endosomes de triage classiques qui sont EEA1(-). Si cette hypothèse s’avérait juste, elle
fournirait une certaine explication au fait que le VIH-1 co-localise peu avec l’EEA1(+). Un
résumé de ces hypothèses est présenté à la Figure 25.
Si l’on pense que la rabankyrine-5 participe au transit du VIH-1, la question qui s’impose
maintenant est celle-ci : quelle est l’importance relative de l’EEA1 et de la rabankyrine-5
dans le processus infectieux du VIH-1 dans les trophoblastes? D’abord, si nous croyons que
le transit des virions aux endosomes de triage classiques impliquant l’EEA1 y joue un rôle
essentiel, cette affirmation devrait être vérifiée. Pour ce faire, nous pourrions bloquer
l’interaction de l’EEA1 avec le Rab5 en sur-exprimant de façon transitoire dans les
trophoblastes un vecteur d’expression codant pour un mutant de l’EEA1 qui est incapable
d’interagir avec le Rab5 (305), ou encore un vecteur d’expression codant pour l’extrémité
383
terminale COOH du domaine FYVE de l’EEA1, qui agit comme un dominant négatif et
bloque la fusion endosomale (420). Si l’infection du VIH-1 se produit normalement en
présence de ces mutants, c’est que l’association entre l’EEA1 et le Rab5 n’est pas
nécessaire à cet évènement. Deuxièmement, en ce qui concerne le rôle de la rabankyrine-5
dans les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes, nous devrions
établir par microscopie confocale si les particules virales se retrouvent au même endroit que
cette protéine à la suite de leur internalisation. Le rôle fonctionnel de cette protéine dans ce
processus pourrait être évalué par la suite en supprimant son expression par la technique
d’ARN à interférence (siRNA).
Figure 25
Le transit intracellulaire du VIH-1 par les endosomes EEA1(-) et EEA1(+)
À la suite d’une endocytose indépendante du Rab5, le VIH-1 est acheminé soit, directement
aux endosomes de triage classiques (1), ou plus probablement, à des endosomes primaires
EEA1(-) (2). Par la suite, un transit dirigé par le Rab5 conduit le VIH-1 aux endosomes de
triage classiques (3). Ce transport pourrait impliquer l’EEA1 et/ou la rabankyrine-5.
Finalement, le VIH-1 atteint les endosomes tardifs sous l’action de Rab7 (4).
384
D’autre part, nous avons observé que la wortmannine n’inhibe pas l’internalisation du VIH1 dans les trophoblastes. Il s’agit d’une donnée surprenante puisque comme nous l’avons
dit les activités du Rab5 impliquent la participation de la PI3K hVPS34. En effet, le Rab5
sous la forme activée (i.e. GTP) recrute l’hVps34 au site de fusion endosomale, qui produit
alors localement le PtIns3P. Celui-ci permet l’attachement des protéines effectrices, l’EEA1
et la rabenosyne-5, par l’intermédiaire de leur domaine en doigt de zinc FYVE. À la suite
de cet évènement, le complexe protéique coordonne l’attachement/la fusion endosomale
(revu par (607)). Ainsi, la wortmannine, en bloquant les PI3K, perturbe l’association de
l’EEA1 aux endosomes de triage et inhibe la fusion endosomale dirigée par le Rab5. Si ce
modèle prévaut dans les cellules non polarisées, il semble que la situation ne soit pas la
même dans les cellules épithéliales polarisées. En effet, une étude a montré que la
wortmannine (ou l’inhibition spécifique de la protéine VPS34p) induit la redistribution des
protéines membranaires endogènes situées au pôle apical des cellules hépatiques polarisées
à de larges vacuoles définies comme étant « pré-lysosomales ». De plus, l’EEA1 demeure
associée à la membrane des endosomes ce qui signifie qu’elle est toujours active. Ces
résultats montrent que lorsque la PI3K est inhibée, la fusion endosomale impliquant
l’EEA1 au pôle apical des cellules épithéliales polarisées a toujours lieu (607). Ceci
explique pourquoi la wortmannine ne module pas l’endocytose du VIH-1 dans les
trophoblastes. Notons également que la liaison de la rabankyrine-5 à la membrane
endosomale est insensible à la wortmannine (536).
Outre le Rab5, le Rab7 régule également les étapes précoces du cycle de vie du VIH-1 dans
les trophoblastes. En effet, nous avons observé que l’expression d’un dominant négatif de
cette protéine bloque de façon quasi totale l’expression génique virale dirigée par le LTR.
Nous concluons que le transit des virions vers les endosomes tardifs constitue un passage
obligé, faute de quoi le processus d’infection des trophoblastes avorte. Toutefois,
l’expression
d’un
dominant
actif
de
Rab7,
qui
entraîne
le
transport
aux
endosomes/lysosomes (118), perturbe également fortement l’infection des trophoblastes.
Nous pensons donc qu’un certain équilibre dans le transit des virions vers ces organelles
385
doit exister, autrement la dégradation des virions peut être favorisée au détriment de
l’infection.
Puisque le Rab5 et le Rab7 participent activement à l’infection du VIH-1, nous proposons
que les particules virales internalisées transitent d’abord par des endosomes régulés par le
Rab5. Cet évènement, quoiqu’insuffisant, est tout de même pré-requis puisqu’il permet
d’atteindre ensuite, sous le contrôle de Rab7, les endosomes tardifs. Cette conclusion est
fondée sur le fait que le transport entre les endosomes de triage et les endosomes tardifs
serait régulé par un équilibre entre le Rab5 et le Rab7 (508, 634). En effet, contrairement à
ce que l’on imaginait, le Rab7 s’associe de façon transitoire avec les endosomes de triage
où il co-localise partiellement avec le Rab5. On pense que le Rab7 y crée ainsi des
domaines particuliers (508, 634). Lors du transit entre ces organelles et les endosomes
tardifs, il se produit un échange entre le Rab5 et le Rab7, générant ainsi les MVB/ECV.
Cette conversion est régulée en partie par le complexe VPS/HOPS, qui a la particularité
d’interagir à la fois avec le Rab5 et d’être une protéine GEF (guanine exchange factor) de
Rab7 (508). Par la suite, le Rab7 se retrouve seul (i.e. sans le Rab5) sur les MVB/ECV,
permettant alors leur transport aux endosomes tardifs (508, 634). Nous croyons que le VIH1 profite de ce mécanisme pour infecter les trophoblastes. En accord avec cette idée,
l’expression d’un dominant négatif de Rab7, sans perturber l’internalisation du SFV
(Semliki Forest Virus), provoque la capture de particules virales dans les endosomes de
triage, lesquels ne peuvent plus alors atteindre les endosomes tardifs. L’expression d’un
dominant négatif de Rab7 bloque donc la progression du transport endosomal au-delà des
endosomes de triage EEA1(+) (634). Fait intéressant, le Rab7 pourrait servir non seulement
à la formation des vésicules mais aussi au triage des cargos aux vésicules de transport
(634).
Si nous connaissons maintenant l’identité de quelques protéines dirigeant le transit des
particules virales à travers la machinerie endosomale cellulaire, en revanche, nous
connaissons à toutes fins utiles très peu de choses sur les protéines/macromolécules qui
contrôlent le tri des virions vers les endosomes tardifs. En d’autre termes, nous savons
comment le VIH-1 atteint les endosomes tardifs (par le Rab5 et le Rab7) mais nous ne
386
savons pas pourquoi il y est arrivé. Certaines hypothèses peuvent être émises. D’abord, il
est important de remarquer que la signalisation par le PIns3P ne régule pas la machinerie
responsable de la biogénèse des MVB/ECV et du transport aux endosomes tardifs mais
uniquement le tri des récepteurs destinés aux MVB/ECV par le Hrs (468). En effet, le
transport de marqueurs de la phase fluide des endosomes de triage aux endosomes tardifs
n’est pas affecté par la wortmannine, ni même par une inhibition de l’Hrs, alors que le
récepteur de l’EGF n’est plus trié vers la voie de dégradation dans ces conditions (468).
C’est donc que le tri et le transport endosomaux sont deux évènements distincts. Puisque la
wortmannine n’affecte pas l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes, nous pensons que le
tri des particules virales aux MVB/ECV se fait indépendamment de l’Hrs. Il serait
important de le vérifier.
Deuxièmement, il est reconnu que les radeaux lipidiques/le cholestérol remplissent de
multiples fonctions dans les endosomes, certaines étant liées au tri des cargos internalisés.
En effet, une étude a montré que le devenir des GPI-AP est tributaire de leur association
aux radeaux lipidiques présents dans les endosomes : une association soutenue conduit aux
endosomes tardifs, alors qu’une interaction réduite mène aux endosomes de recyclage
(178). On a également montré que le MtβCD inhibe l’infection de l’ASLV (Avian sarcomaleukosis virus) en modifiant la stabilité des particules virales dans les endosomes, suggérant
ainsi que la présence du cholestérol dans ces organelles les protège de la dégradation
endolysosomale (408). Finalement, le cholestérol à la membrane endosomale accroît
l’association de Rab7 et inhibe l’inactivation de cette protéine (309). En s’appuyant sur ces
données, nous pensons que les radeaux lipidiques/cholestérol pourraient grandement
influencer le devenir du VIH-1 dans les endosomes, et par conséquent l’infection des
trophoblastes. En accord avec ce principe, nous avons noté que les effets de la MtβCD et de
la filipine sont plus marqués sur l’infection que sur l’internalisation du VIH-1 dans les
trophoblastes. De plus, nous avons remarqué que le VIH-1 co-localise avec le GM1 une
fois internalisé, observation qui pourrait corroborer la participation des radeaux
lipidiques/cholestérol aux évènements suivant l’internalisation des virions. Toutefois, il
serait intéressant de vérifier qu’il s’agit bel et bien de radeaux lipidiques. Pour ce faire, si le
VIH-1 s’accroche à des régions riches en radeaux lipidiques dans les endosomes, alors un
387
traitement au Triton X-100 ne perturbera pas cette association et les particules virales
seront toujours observables par microscopie confocale. Ensuite, nous devrions établir leur
rôle dans le tri du VIH-1 vers les endosomes tardifs. Par exemple, nous pourrions évaluer si
la proportion de virions qui atteint les endosomes tardifs est modulée dans les cellules
préalablement traitées au MtβCD ou à la filipine.
1.7 La fusion virale intra-endosomale
Le fait que le Rab5, et plus particulièrement le Rab7 contrôlent l’infection du VIH-1 dans
les trophoblastes sous-entend que le transit du VIH-1 par les endosomes tardifs est une
étape nécessaire à son cycle réplicatif. Mais pourquoi le virus doit-il absolument atteindre
ces organelles? Nous pensons que la réponse découle du mode employé par le VIH-1 pour
accéder au cytoplasme des trophoblastes. Rappelons que le VIH-1, une fois internalisé, se
retrouve dans les endosomes. Pour que l’infection se produise, le virus doit ensuite accéder
au cytoplasme afin de poursuivre les étapes de son cycle réplicatif. Deux mécanismes sont
envisagés. D’abord, sous l’action des hydrolases lysosomales présentes, les particules
virales seraient partiellement désassemblées et perdraient leur enveloppe, puis atteindraient
ensuite le cytoplasme par des brèches dans la membrane endosomale. Le réovirus,
quoiqu’il s’agisse d’un virus non enveloppé, utilise un tel mécanisme (150). Puisque nous
avons observé que la leupetine, un inhibiteur des protéases lysosomales, n’a pas modulé
l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes, nous pensons que le VIH-1 emprunte une autre
voie.
L’autre option est que le VIH-1, tout comme les vésicules intraluminales des endosomes
tardifs lors du recyclage du M6PR et du CMH-II (97, 379, 403), fusionne avec la
membrane externe de ces organelles, entraînant la relâche du virus dans le cytoplasme. En
d’autres termes, nous suggérons que l’accès du VIH-1 au cytoplasme résulte d’un processus
similaire à la fusion rétrograde (back fusion) se produisant entre les vésicules
intraluminales et la membrane endosomale (403). Trois éléments appuient cette thèse.
D’abord, nous avons montré que les particules virales s’accumulent dans des organelles
CD63+, suggérant qu’elles se retrouvent dans les MVE/endosomes tardifs parmi de
nombreuses vésicules intraluminales. Ensuite, le VIH-1, dont la taille correspond aux
388
vésicules intraluminales, possède à sa surface de nombreuses protéines dérivées de la
cellule-hôte (85) qui pourraient y jouer un rôle actif. Finalement, le transit aux endosomes
tardifs est requis pour qu’ait lieu l’infection virale. Le lien entre la fusion virale et la
nécessité d’atteindre les endosomes tardifs est le suivant : nous avons observé que
l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes est indépendante des protéines de l’enveloppe,
la gp120 et la gp41. Cette observation est cruciale parce qu’elle nous permet de postuler
que le VIH-1 requiert la machinerie cellulaire responsable de la fusion rétrograde des
vésicules intraluminales pour fusionner. Or, la fusion rétrograde se produit dans les
endosomes tardifs (ex. le M6PR et le CMH-II), ce qui laisse présupposer que les protéines
et/ou les macromolécules et/ou l’environnement qui y sont requis sont présents, non pas
dans les endosomes de triage, mais plutôt dans les MVB/endosomes tardifs (97, 379, 403).
Nous croyons donc que le VIH-1 doit se rendre à ces organelles parce que la machinerie
cellulaire nécessaire à sa fusion s’y retrouve.
Deux questions s’imposent maintenant si l’on considère la fusion du virus dans les
endosomes. Avant toute chose, il faudrait vérifier que le VIH-1 fusionne bel et bien dans
les endosomes. En effet, l’hypothèse de la fusion du virus dans les endosomes repose
largement sur le fait que l’infection dépend du transit par ces organelles. En revanche, si
nous avons présenté des expériences de fusion virale dans cette thèse, nous n’avons encore
aucune preuve qu’elle s’y produit plutôt qu’à la membrane plasmique: la technique
employée ne permet pas de discriminer entre ces deux évènements. Pour ce faire, nous
pourrions infecter les trophoblastes avec du VIH-1 porteur d’une protéine de surface
couplée au GFP, ou encore marqué par des lipides fluorescents, puis isoler les endosomes
tardifs des cellules infectées (275). Ensuite, nous pourrions appliquer la technique de TIRFM in vitro aux endosomes contenant les particules virales (cette technique est expliquée
plus loin dans cette discussion, c.f. Figure 27). Si le VIH-1 fusionne avec la membrane des
endosomes, alors nous pourrons l’observer. Une approche similaire mais plus simple serait
de mesurer la quantité de Gag (p24) relâchée par les endosomes isolés (307).
La deuxième question qui émerge est celle-ci : comment se produit une telle fusion? La
fusion rétrograde est fascinante du fait qu’elle est équivalente à la fusion extracellulaire (i.e.
389
qu’elle implique le feuillet exoplasmique). On pense donc que son mécanisme est différent
de celui de la fusion se produisant dans le cytoplasme (i.e. impliquant le feuillet interne
contenu dans la double couche lipidique). Toutefois, la machinerie cellulaire qui en est
responsable demeure un mystère pour les biologistes (revue par :(403, 612)). Ceci dit, nous
pouvons tout de même formuler quelques hypothèses. D’abord, une étude fort intéressante
a récemment montré que le VSV (virus de la stomatite vésiculaire) utilise les vésicules
intra-endosomales comme moyen d’éviter l’environnement hostile des endosomes tout en
profitant du transport endosomal pour atteindre la région péri-nucléaire de la cellule
infectée. En effet, le VSV, virus enveloppé, fusionne, non pas avec la membrane
endosomale, mais avec les vésicules intraluminales contenues dans les MVB/ECV (307). À
la suite de cette fusion, la capside du VSV se retrouve dans la lumière de ces vésicules et
pénètre à l’intérieur des endosomes tardifs grâce au transit des MVB/ECV. À cet endroit, la
fusion entre les vésicules intraluminales et la membrane des endosomes tardifs permet
finalement la relâche de la capside virale dans le cytoplasme. Dans ce modèle, la fusion du
virus et la relâche des capsides virales dans le cytoplasme sont donc des évènements
séquentiels (307) (c.f. Figure 26) .
La machinerie cellulaire responsable de ces évènements est mal caractérisée. Par exemple,
le LBPA (acide lysobisphophatidique) est un phospholipide presqu’exclusivement situé à la
membrane des vésicules intraluminales des endosomes tardifs. On pense qu’il favorise
l’invagination membranaire requise pour la formation des vésicules intraluminales,
possiblement sous le contrôle de la protéine cytosolique Alix (353). De plus, on croit que le
LBPA régule, conjointement avec les protéines Alix et sorting nexin Snx16, la fusion
rétrograde (307). En effet, ce phospholipide possède une activité fusogénique à pH acide in
vitro (275). De plus, son inhibition cause une diminution de l’infection du VSV,
vraisemblablement par un arrêt de la relâche de la nucléocapside dans le cytoplasme (307).
S’appuyant sur ces études, on peut se demander si l’infection des trophoblastes par le VIH1 suit un mécanisme semblable. Or, nous avons remarqué que des anticorps bloquants
dirigés contre le LBPA (le 6C4) inhibent l’infection du VIH-1 dans les trophoblastes
(observations préliminaires non publiées), ce qui corrobore cette proposition. Il serait
maintenant intéressant d’approfondir cette recherche en investiguant par exemple le rôle de
390
l’Alix dans l’infection du VIH-1 en bloquant son expression par la technique d’ARN à
interférence (siRNA).
Figure 26
Le devenir du récepteur de l’EGF, du CMH-II et du VSV dans les
MVB/ECV
Le récepteur de l’EGF est dégradé lorsqu’il atteint les vésicules intra-endosomales. Le
CMH-II au contraire est recyclé grâce à la fusion rétrograde de ces vésicules. La fusion du
VSV avec ces dernières, suivie de la fusion rétrograde des vésicules permet la relâche de la
capside dans le cytoplasme (tiré de : (612)).
Outre le fait que le LBPA puisse réguler la fusion rétrograde des vésicules intraluminales,
certains auteurs estiment plutôt que cet évènement est contrôlé par un mécanisme
semblable à celui dirigeant la fusion cellule-cellule. En effet, on pense que certaines
tétraspanines, telles que le CD9, le CD81 et le CD63, pourraient être impliquées dans la
fusion rétrograde (403, 612) puisqu’elles participent à certains évènements de fusion
cellulaire (tels que celle des gamètes, des myoblastes et de certaines cellules infectées par
391
des virus) (231). Or, le CD81 et le CD63 sont présents non seulement dans les
MVB/endosomes tardifs mais aussi à la surface du VIH-1 (85). Il serait donc fort pertinent
de tester la participation de ces protéines à la fusion du virus dans les trophoblastes, soit par
des anticorps neutralisants et/ou par la technique de siRNA. En accord avec cette hypothèse,
une étude a montré qu’un anticorps dirigé contre le CD63 bloque l’infection du VIH-1 dans
les macrophages (632). Sans pouvoir établir le mécanisme d’action impliqué, les auteurs de
cette étude ont montré que l’inhibition du CD63 perturbe le cycle viral en aval de la fusion
du VIH-1 mais en amont de la transcription inverse (632). Puisque l’infection des
macrophages nécessite l’endocytose des particules virales (341), il serait tentant de spéculer
que le CD63 participe à la fusion rétrograde des vésicules intraluminales contenant le VIH1.
La troisième option envisagée concernant la fusion intra-endosomale est la suivante : il est
connu que les cytotrophoblastes sont des cellules pluripotentes mononucléées, alors qu’en
revanche les syncytiotrophoblastes sont des cellules multinucléées issues de la fusion des
cytotrophoblastes; c’est donc que les trophoblastes expriment des protéines membranaires
leur permettant de fusionner. Est-il alors possible que le VIH-1 profite de ce processus pour
pénétrer à l’intérieur des trophoblastes? Le mécanisme qui sous-tend la fusion syncytiale
est mal défini. D’abord, la caspase 8 entraîne le clivage de la fodrine puis l’externalisation
de la phosphatidylsérine du feuillet interne au feuillet externe de la membrane. Ces
évènements déclenchent une réorganisation du cytosquelette et des lipides membranaires
propice à la fusion (54). Certains auteurs estiment que le CD98 (fusion regulatory protein1, FRP-1) y serait également impliqué (283). Ensuite, l’expression de la connexine 43 des
jonctions GAP, en favorisant la communication intercellulaire durant la fusion, serait
requise (187). Finalement, la fusion proprement dite serait en partie dirigée par une
glycoprotéine codant pour une enveloppe rétrovirale endogène, la syncytine-1 (HERV-W)
exprimée par les syncytiotrophoblastes (188, 372). Les récepteurs putatifs de la syncytine-1
sont l’ASCT1/2 (transporteurs d’acides aminés) (304). Récemment, on a identifié la
syncytine-2 (HERV-FRD) qui pourrait avoir un rôle similaire (55). L’idée que la syncytine
puisse permette la fusion du VIH-1 est basée sur l’élément suivant : les cellules JAR
(observation préliminaire non publiée), de même que les astrocytes (16) expriment la
392
syncytine-1. Or, les astrocytes constituent l’un des rares types cellulaires, où tout comme
les JAR, l’endocytose des particules virales est nécessaire pour que se produise l’infection
(326). Notons cependant que la limite de ce modèle est que la syncytine est une protéine
localisée à la membrane plasmique : il faudrait vérifier qu’elle se retrouve également dans
les endosomes, ou encore qu’elle s’y retrouve à la suite de l’internalisation du VIH-1. Le
cas échéant, nous pourrions évaluer si l’infection est inhibée en bloquant, ou inversement,
favorisée en augmentant l’expression de la syncytine dans les trophoblastes.
Au-delà des études que nous venons de proposer, nous pourrions entreprendre une analyse
exhaustive des protéines impliquées dans l’endocytose du VIH-1 et/ou dans la fusion intraendosomale. Ces études plus sophistiquées nous permettraient d’obtenir des résultats fort
intéressants. Rappelons d’abord que puisque l’infection des trophoblastes est indépendante
de la gp120 et de la gp41, le récepteur cellulaire du VIH-1, de même que la nature des
protéines servant à son attachement/fusion à ces cellules, sont inconnus. Pour identifier de
telles protéines cellulaires, nous formulons l’hypothèse que les trophoblastes sont
« permissifs », et les autres types cellulaires sont « non permissifs », à l’infection par le
VIH-1ΔEnv. Nous croyons qu’une protéine bien précise confère ce phénotype aux
trophoblastes, protéine que les types cellulaires réfractaires au VIH-1ΔEnv n’exprimeraient
pas. Dans ce contexte, l’hybridation soustractive de librairies d’ADNc, comparant le profil
d’ARNm de deux populations cellulaires, pourrait nous permettre d’identifier le gène
responsable de la susceptibilité au VIH-1ΔEnv, qui nous pensons, permet la fusion/l’entrée
du virus. Cette technique a permis de cloner le CEM15 (APOBEC3G) à partir de cellules
infectées par des virions exprimant ou non le Vif (543). Les deux librairies
d’ADNc utilisées dans cette étude seraient dérivées, d’une part, des cellules JAR
(permissives) et, d’autre part, d’un type cellulaire réfractaire à l’infection par le VIH1ΔEnv. Idéalement, ce type cellulaire devrait être génétiquement semblable aux
trophoblastes pour faciliter l’analyse des gènes candidats. Pour trouver de telles cellules, il
faudrait tester la susceptibilité à l’infection d’autres lignées cellulaires de trophoblastes afin
d’en identifier une qui serait réfractaire au VIH-1 : plus d’une vingtaine de lignées
cellulaires (de trophoblastes et de choriocarcinome) sont répertoriées dans la littérature
(270).
393
Une deuxième stratégie expérimental pourrait être la suivante : les petites librairies de
siRNA ou de shRNA (short hairpin RNA) synthétiques constituent une collection de ces
ARN ciblant, non pas un seul gène, mais plutôt une famille de protéines (113). Il s’agit
d’une approche puissante et novatrice pour identifier la fonction des gènes cellulaires en
bloquant leur expression. Grâce à cette technique, on a par exemple récemment identifié,
parmi plus de 500 protéines kinases, celles impliquées dans l’endocytose du VSV et du
SV40 dans les cellules HeLa (459). La tendance s’oriente maintenant vers un
développement de larges banques de siRNA afin de cribler le plus de gènes possible (113).
Quoiqu’étant une approche expérimentale techniquement difficile, elle pourrait s’avérer
fort intéressante pour connaître les protéines cellulaires impliquées dans la fusion intraendosomale du VIH-1. Dans ce cas précis, nous sommes confrontés à un problème de
taille : outre le fait que nous pensons que des protéines endosomales dirigent les étapes
précoces de l’infection (particulièrement la fusion), la nature des gènes cellulaires
responsables de cet évènement nous est inconnue. Il nous est donc difficile de cibler les
gènes que l’on veut étudier et de construire les siRNA correspondants. Une façon de
contourner ce problème serait de générer une banque d’ADNc dérivée des cellules JAR, à
partir de laquelle une librairie de shRNA ciblés (targeted shRNA library) serait ensuite
construite, puis clonée dans des vecteurs d’expression. L’infection des JAR (exprimant
cette librairie) par du VIH-1 codant pour un gène rapporteur sous le contrôle du LTR
servirait de test fonctionnel pour analyser les shRNA. En effet, on peut isoler les clones
cellulaires de JAR devenus réfractaires à l’infection et séquencer les shRNA modulateurs
qu’ils expriment. Finalement, les shRNA identifiés sont appariés par homologie de
séquence à des gènes cellulaires, donnant ainsi l’identité des gènes candidats (113).
1.8 La transcytose et le recyclage du VIH-1
Outre l’infection des trophoblastes, l’endocytose du VIH-1 conduit à deux autres
évènements : la transcytose et le recyclage des particules virales. Le premier permet de
traverser la barrière placentaire alors que le second retourne les virions au pôle apical vers
la circulation maternelle. La transcytose du VIH-1 est l’élément important à considérer
dans la transmission de ce rétrovirus. On estime que la transcytose du VIH-1 se produit
394
dans les cellules formant la barrière hémato-encéphalique (36, 37), dans les cellules
endométriales (88) et intestinales (61), de même que dans les cellules M (12, 180). En ce
qui concerne les cellules placentaires, si une équipe de chercheurs a précédemment rapporté
que la transcytose du VIH-1 semble possible in vitro dans les BeWo (292), en revanche,
personne n’avait jusqu’à maintenant même encore « vu » la transcytose se produire.
Puisque cet évènement implique le transport vésiculaire des virions de l’apex au pôle
basolatéral cellulaire, nous avons postulé que cet évènement devrait être observable par
microscopie confocale. Nous avons effectivement documenté, qu’à la suite de
l’internalisation du VIH-1 par les trophoblastes polarisés, les virions parviennent à
transmigrer à travers toute l’épaisseur des cellules, observation qui confère une crédibilité
additionnelle à la réalité biologique de ce processus. Par ailleurs, nous avons montré que
peu de particules virales atteignent le pôle basal des cellules, ce qui est en accord avec le
principe que les trophoblastes constituent une barrière relativement étanche au VIH-1. Nous
pouvons donc dire que, dans nos conditions de culture, la transcytose du VIH-1 par les
trophoblastes est un évènement possible mais peu fréquent.
Le recyclage des virions par les trophoblastes est un concept nouveau, particulièrement
intéressant, parce qu’il sous-entend que la cellule possède un moyen lui permettant d’éviter
à la fois sa propre infection et la trancytose des particules virales, deux évènements reliés à
la transmission verticale du VIH-1. Pour affirmer que le recyclage a lieu, il faut être certain
qu’aucune particule virale ne demeure attachée aux trophoblastes. Or c’est techniquement
difficile. Pour pouvoir affirmer hors de tout doute que le recyclage a lieu, il nous faudrait
démontrer que des vésicules intracellulaires contenant le VIH-1 fusionnent avec la
membrane plasmique apicale, et de ce fait, retournent les virions dans le milieu
extracellulaire. Deux moyens sont possibles : d’abord, nous pourrions faire appel à l’acide
tannique qui a pour fonction d’inhiber la fusion des vésicules intracellulaires avec la
membrane plasmique (apicale ou basolatérale selon l’endroit où on l’applique) dans les
quelques secondes suivant son ajout aux cellules (485). Cet inhibiteur constitue donc un
puissant outil pour étudier la fusion des vésicules à la membrane plasmique apicale lors du
recyclage. Si, lorsque les trophoblastes sont exposés d’abord au VIH-1 puis ensuite à cet
acide, le recyclage n’est plus détecté, on pourra affirmer qu’il existe réellement. Une fois ce
395
fait établi, nous pourrions avoir recours au TIR-FM (Total internal reflection fluorescence
microscopy) qui est une technique fort élégante permettant d’acquérir des images de haute
résolution de la fusion d’une vésicule individuelle avec la membrane plasmique. Dans le
TIR-FM, un faisceau lumineux d’excitation est dirigé au travers d’une lamelle à un angle
suffisant pour qu’il soit complètement réfléchi à l’interface eau/lamelle. Ceci se traduit par
un champ lumineux évanescent. Ainsi, seules les molécules fluorescentes, qui sont à une
faible distance de la lamelle, sont excitées, ce qui permet la visualisation d’évènements se
produisant à la membrane (c.f. Figure 27). C’est grâce à cette technique, par exemple, que
l’on a pu étudier la relâche de neurotransmetteurs (246, 535). Nous pourrions donc produire
des virions qui sont soit porteurs d’une protéine de surface couplée au GFP, ou encore qui
sont marqués par des lipides fluorescents, virions qui sont ensuite traités à l’AT-2
(aldrithiol-2) pour les rendre non infectieux. Les trophoblastes seraient exposés à ces
particules virales pour permettre leur internalisation et finalement observés pour visualiser
les évènements de fusion par le TIR-FM : seuls les virions retrouvés à la surface de la
cellule, donc qui ont été relâchés par la cellule, seront excités par le faisceau lumineux et
donc détectés. Une autre option serait d’observer les virions par microscope électronique
afin d’évaluer la présence d’éléments de fusion entre des vésicules contenant le VIH-1 et la
membrane plasmique.
Figure 27
TIR-FM (Total internal reflection fluorescence microscopy)
(Tiré de : (246)).
396
Afin de décortiquer le mécanisme associé à la transcytose et au recyclage du VIH-1 par les
cellules placentaires, nous envisageons maintenant plusieurs études. En effet, si nous avons
observé ces évènements, les mécanismes qui les sous-tendent demeurent toutefois
inconnus. D’abord, il serait important de définir la voie d’endocytose associée à ces deux
évènements. Nous avons déjà établi la voie menant à l’infection des trophoblastes par le
VIH-1. Il serait maintenant pertinent de vérifier que celle-ci s’applique à la transcytose et
au recyclage des virions : une stratégie expérimentale similaire à celle que nous avons
employée pour l’infection serait pertinente. Ceci dit, nous croyons qu’il est peu probable
que la voie d’endocytose menant au recyclage et à la transcytose diffère de celle menant à
l’infection. En effet, de façon globale, nos résultats montrent que les virions sont
internalisés par une voie unique d’endocytose, qui est indépendante de la clathrine, des
cavéoles et de la dynamine. Dans ce contexte, nous pensons que c’est le triage des virions
aux différents endosomes qui détermine les multiples devenirs du VIH-1 dans les
trophoblastes plutôt que la voie d’endocytose empruntée. Toutefois, comme nous l’avons
déjà mentionné, ce qui définit le triage du VIH-1 dans la machinerie endosomale cellulaire
est inconnu. Afin d’éclaircir cette question, il nous apparaît justifié d’investiguer la
participation du cholestérol membranaire, de même que celle des filaments d’actine et des
microtubules.
Un deuxième aspect essentiel à déterminer, si nous voulons clairement établir les
mécanismes associés à la transcytose et au recyclage du VIH-1 par les trophoblastes, est la
voie endolysosomale menant à ces évènements. En effet, si nous avons établi globalement
où se rend le VIH-1 à la suite de son internalisation dans les trophoblastes, nous ne savons
pas quel(s) endosome(s) en particulier est (sont) associé(s) à la transcytose et au recyclage
du VIH-1. Rappelons qu’en ce qui concerne le recyclage vers la membrane apicale, trois
modes de transport sont possibles selon la nature du cargo : i) directement des endosomes
de triage apicaux, ii) par les endosomes de recyclage, ou iii) en passant d’abord par les
endosomes communs, puis par les endosomes de recyclage (revue par : (18)). De plus,
différentes protéines Rab régulent en partie le recyclage à la membrane plasmique apicale.
Par exemple, des études antérieures ont impliqué les protéines Rab11, Rab17 et Rab25 dans
le transport à partir des endosomes de recyclage, les protéines Rab4 et Arf6 à partir des
397
endosomes de triage apicaux, et le Rab17 à partir des endosomes communs (revue par : (18,
512, 515)). Dans cette perspective, nous pourrions évaluer l’importance du transit du VIH-1
par ces différents types d’endosomes dans le recyclage du VIH-1 en exprimant de façon
transitoire dans les trophoblastes polarisés des vecteurs d’expression codant pour des
mutants des protéines énumérées. L’utilisation de siRNA dirigés contre ces protéines
pourrait être aussi une approche expérimentale appropriée. De plus, une étude a montré que
le Rab22 régule le recyclage des protéines membranaires internalisées de façon
indépendante de la clathrine (637). Évaluer l’impact de cette protéine sur le recyclage du
VIH-1 serait fort pertinent sachant que l’infection des trophoblastes est associée à
l’endocytose des virions de façon indépendante de la clathrine et que le recyclage est
possiblement associé à cette même voie d’endocytose.
En sus des voies que nous venons d’énumérer (impliquant les endosomes de triage,
communs et/ou de recyclage), nous envisageons que le recyclage du VIH-1 se fasse à partir
des endosomes tardifs/corps multi-vésiculaires par un processus analogue à la relâche
d’exosomes. Cette hypothèse est fondée sur les faits suivants : d’une part, nous savons que
le VIH-1 se retrouve massivement dans les endosomes tardifs à la suite de son
internalisation dans les trophoblastes. D’autre part, dans certains types cellulaires,
particulièrement les réticulocytes, les MVB/endosomes tardifs sont acheminés à la
membrane plasmique pour y fusionner. Cet évènement provoque la relâche simultanée des
vésicules internes, appelées alors « exosomes », dans le milieu extracellulaire. On pense
qu’un processus semblable a lieu dans les cellules dendritiques et les macrophages, de
même que dans certains types de cellules épithéliales (revue par : (174)). Or, certains
auteurs estiment que les trophoblastes, bien qu’étant des cellules épithéliales, possèdent
certaines propriétés semblables à celles des macrophages (221). Nous pensons donc qu’il
est possible que les virions soient relâchés dans le milieu extracellulaire à la suite du
déplacement des endosomes tardifs/MVB vers la membrane plasmique apicale. Le
mécanisme responsable de la fusion des MVB menant à la relâche des exosomes demeure,
dans l’ensemble, très peu connu : par exemple, on estime qu’il dépend du Ca2+. Il sera
donc difficile d’évaluer si le VIH-1 est recyclé par cette voie. Toutefois, nous savons que la
protéine Rab7 contrôle le mouvement vésiculaire des endosomes de triage aux endosomes
398
tardifs (634). Si le VIH-1 recycle à partir des endosomes tardifs, alors l’expression d’un
mutant de Rab7, bloquant l’accès du VIH-1 à ces organelles dans les trophoblastes,
résulterait en une inhibition du recyclage. De plus, le Rab11, quoique l’on ne sache pas s’il
module la formation des exosomes ou leur relâche, est une autre protéine qui pourrait y
jouer un rôle-clé (528, 529). Nous pourrions donc aussi investiguer la participation de cette
protéine dans le recyclage du VIH-1.
En ce qui concerne la transcytose, peu de choses sont connues sur la machinerie cellulaire
responsable de celle qui se produit depuis le pôle apical vers le pôle basolatéral. Toutefois,
le transport intracellulaire des IgG dans cette direction a été partiellement élucidé (154,
500, 515). Ainsi, nous pourrions exposer les trophoblastes polarisés simultanément à des
IgG et à des particules virales, puis ensuite suivre leur parcours par microscopie confocale.
Ceci nous permettrait de voir si le VIH-1 emprunte le même chemin que celui des IgG. De
plus, une co-localisation avec des marqueurs des différents endosomes permettrait de
confirmer la direction du VIH-1 dans la cellule. Par exemple, lorsque la transferrine est
internalisée par la membrane basolatérale, elle se rend aux endosomes de triage
basolatéraux de même qu’aux endosomes communs (revue par : (18)) : un suivi du VIH-1
dans la cellule, par rapport à ce marqueur, serait très informatif. Notons qu’idéalement,
suivre dans des cellules vivantes, par microscopie à fluorescence, le transit du VIH-1
conjointement aux IgG et/ou à la transferrine, plutôt que dans des cellules fixées, serait une
méthode plus élégante et instructive puisque que nous pourrions visualiser en temps réel le
transit du VIH-1.
Nous venons de décrire certains mécanismes qui pourraient contrôler le recyclage et la
transcytose du VIH-1 dans les trophoblastes. D’autres options sont également possibles. En
effet, nous avons déjà mentionné que les IgG sont transcytosés par les trophoblastes du pôle
apical vers le pôle basolatéral. Or, en sus de ce processus, une proportion des IgG est
dégradée et recyclée dans les endosomes à la suite de leur internalisation par ces cellules
((154, 155, 515) et revue par : (515)). C’est donc que tout comme le VIH-1, de multiples
devenirs sont possibles pour les IgG dans les trophoblastes. La transferrine peut aussi être
recyclée et transcytosée par les cellules BeWo polarisées (89). Or, le fait que des
399
molécules, telles que les IgG et la transferrine, puissent être recyclées et transcytosées par
les trophoblastes, signifie qu’il existe un équilibre entre ces deux processus. On pense que
cet équilibre est atteint en partie par la concentration des récepteurs de surface, de même
que par celle des ligands dans le milieu extracellulaire (500). De plus, on a fait
l’observation fort intéressante que la transcytose du VIH-1 double dans les cellules
endométriales lorsqu’elles baignent dans un environnement contenant des facteurs proinflammatoires (88).
Dans cette perspective, nous postulons que, tout comme pour les IgG, un équilibre s’opère
entre le recyclage et la transcytose du VIH-1 dans les trophoblastes. Nous pensons que
l’environnement placentaire est l’un des facteurs qui influencerait cette dynamique. Si cette
hypothèse s’avérait vraie, nous croyons que dans certaines conditions celui-ci favoriserait la
transcytose du VIH-1 au détriment du recyclage, et vice versa. Il serait donc important de
définir, parmi les facteurs solubles présents dans l’environnement placentaire, ceux qui
modulent la transcytose et/ou le recyclage. Cette évaluation servira à i) définir les
conditions dans lesquelles ces évènements ont lieu, et ii) identifier des composés qui
favoriseraient le recyclage au détriment de la transcytose, ce qui à terme réduiraient
possiblement la transmission verticale. Nous pourrions évaluer ces deux évènements dans
des trophoblastes polarisés préalablement incubés en présence de facteurs solubles
retrouvés dans l’environnement placentaire, soit : l’EGF, le GM-CSF, le M-CSF,
l’interféron gamma, l’IL-1, l’IL-3, l’IL-4, L’IL-6, l’IL-7, l’IL-8, l’IL-10, l’IL-12, le TNF-α,
le LIF, le TGF-β, l’hCG et la progestérone. De plus, il serait intéressant de comparer les
facteurs solubles présents dans l’environnement placentaire de femmes ayant transmis le
VIH-1 in utero et de celles ne l’ayant pas transmis.
Deux autres aspects, cette fois liés au phénotype viral, pourraient également influencer la
proportion de transcytose/recyclage des virions par les trophoblastes. D’abord, ces
évènements pourraient varier en fonction du tropisme du VIH-1 : les souches à tropisme R5
et à tropisme X4 sont-elles recyclées et transcytosées par les trophoblastes dans la même
mesure? Ensuite, il est connu que l’enveloppe virale est composée de lipides dérivés de la
membrane plasmique de la cellule-hôte d’où bourgeonne le virus, membrane à laquelle sont
400
recrutées, non seulement la gp120 et la gp41, mais également de nombreuses protéines de
la cellule-hôte. Dans ce contexte, on comprend que la nature de la membrane cellulaire
influence de façon marquée la composition de la membrane virale (85, 604), et par le fait
même l’attachement des virions avec une cellule-cible (85, 604). Puisque la liaison d’un
cargo à son récepteur détermine le devenir intracellulaire de ce cargo, alors le type de
macromolécules à la surface du virus pourrait diriger les virions vers différents organelles
intracellulaires, et ainsi moduler la transcytose et le recyclage. Il serait donc important de
tester des virions produits dans des 293T, de même que dans des cellules dites « plus
physiologiques » telles que les lymphocytes T CD4+ primaires et les macrophages, afin
d’évaluer si la transcytose et le recyclage s’en trouvent affectés.
1.9 Autres mécanismes de transmission verticale du VIH-1
Outre l’infection des trophoblastes, la transcytose des particules virales et le passage de
virions par des microlésions, nous estimons que le VIH-1 pourrait traverser la barrière
placentaire par deux autres voies. D’abord, le VIH-1 pourrait passer entre les trophoblastes.
En accord avec ce principe, on sait que la protéine Tat perturbe les jonctions étanches des
cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique (15). En ce qui concerne la
deuxième voie envisagée, rappelons que les cellules épithéliales simples sont polarisées et
que la présence de jonctions étanches entre les cellules empêchent les cellules immunitaires
sous-jacentes d’atteindre la lumière, de même que les microorganismes de traverser la
barrière épithéliale (51). Or, une étude a remis en cause ce principe. En effet, on a montré
que les cellules dendritiques ouvrent momentanément les jonctions serrées reliant les
cellules épithéliales polarisées, puis étendent leurs dendrites à l’extérieur de l’épithélium et
capturent ainsi les microorganismes présents. Toutefois, puisque ces cellules expriment
plusieurs protéines constituant les jonctions étanches, telles que l’occludine, la claudine 1 et
la ZO-1, elles préservent ce faisant l’intégrité de la barrière épithéliale en reformant, de
façon transitoire, les jonctions étanches avec les cellules épithéliales adjacentes (506). Ce
mécanisme permet le passage de bactéries par les cellules épithéliales polarisées de
l’intestin (506). Nous pensons qu’il s’agit d’un mécanisme fort propice pour le passage du
VIH-1 au travers de la barrière placentaire, et tout particulièrement, par les muqueuses
401
gastriques. Le modèle expérimental utilisé dans l’étude citée plus haut est la lignée de
cellules intestinales immortalisées, les CaCo-2, qui sont mises en contact avec des cellules
dendritiques primaires. Une approche semblable serait facilement applicable pour étudier le
passage du VIH-1.
1.10 L’infection précoce des cellules trophoblastiques
Nous abordons maintenant un tout autre aspect de la transmission in utero du VIH-1. On a
rapporté dans la littérature scientifique que la contamination fœtale se produirait moins
fréquemment durant le premier trimestre de la grossesse qu’en fin de grossesse (518). En
revanche, quoique les conclusions publiées à ce sujet divergent dans la littérature
scientifique, certains auteurs estiment qu’il existe un risque accru d’avortement spontané
chez les femmes infectées par le VIH-1 (72). Ce dernier énoncé nous fait croire qu’on sousestime la fréquence de contamination placentaire/fœtale précoce. Précisons d’abord qu’un
avortement spontané est la perte du fœtus à la suite de causes naturelles. Le terme « faussecouche » réfère à l’arrêt spontané de la grossesse avant que le développement fœtal n’ait
atteint 20 semaines. Après 20 semaines de grossesse, la perte de la grossesse est catégorisée
comme une naissance prématurée. On estime que jusqu’à 50% de tous les embryons
meurent et sont spontanément éliminés, généralement avant que la femme ne sache qu’elle
est enceinte. Parmi les cas de grossesses documentés, le taux d’avortements spontanés est
de 10-15%, et ils se produisent généralement entre la 7e et la 12e semaine de grossesse. Près
de 70% des arrêts de grossesse spontanés ont lieu durant le premier trimestre de grossesse
(369).
Nous croyons i) qu’en raison de la fréquence des avortements spontanés reliés à l’infection
à VIH-1, et ii) du fait qu’une fausse-couche puisse ne pas être remarquée par la mère et/ou
que la mère, particulièrement dans les pays en voie de développement, ne reçoive pas de
suivi obstétrical adéquat, la grossesse, et du même coup la contamination placentaire/fœtale
précoce, sont souvent non détectées. Nous formulons alors l’hypothèse que la
contamination fœtale ayant lieu durant le premier trimestre de la grossesse est sous-estimée,
et qu’ainsi la fréquence de cet évènement rapportée dans la littérature est probablement
inférieure à la réalité. Le corollaire à cette affirmation est que seuls les placentas non
402
infectés par le VIH-1, sauf exception, pourraient compléter adéquatement leur
développement, ce qui ainsi réduit artificiellement le taux de contamination
placentaire/fœtal documenté. Il faudrait tenter de vérifier cette hypothèse.
La cause de la plupart des avortements spontanés est la mort fœtale due à des anomalies
génétiques. Parmi les autres causes, on compte des facteurs hormonaux, des réponses
immunes, de sérieuses maladies systémiques maternelles et, de façon importante, les
infections (369). Dans le cas des femmes séropositives, on ne connaît pas les causes
directes du taux anormal d’avortements spontanés. Si l’on envisage que l’infection à VIH-1
puisse affecter directement le placenta et l’embryogenèse, on ne sait pas comment ceci
pourrait se produire (revue par : (153)). Deux éléments pouvent avoir un impact sur le bon
déroulement de la grossesse, soit l’environnement placentaire et le dérèglement des
fonctions des trophoblastes par l’infection à VIH-1. Premièrement, de façon générale, le
développement et le maintien de la grossesse sont régulés en partie par un équilibre entre
l’expression de cytokines de type 1 (Th1) et de type 2 (Th2). En effet, la présence de
cytokines Th2 inhibe le rejet fœtal, alors que les cytokines Th1, de même qu’une
production déficiente de LIF, d’IL-4 ou d’IL-10 par le placenta, sont associées à une
incidence récurrente d’avortements spontanés (510, 521). Or comme nous l’avons déjà
mentionné, l’expression d’IL-1, l’IL-6 et le TNF-α par les trophoblastes augmentent chez
les femmes enceintes séropositives (311), conditions prédisposant aux avortements
spontanés (542).
Le deuxième élément à considérer est le fait que l’infection des trophoblastes par le VIH-1
puisse entraîner des dysfonctions majeures des trophoblastes, résultant en un avortement
spontané. Nous entrevoyons deux possibilités à cet égard. D’abord, il est remarquable que
les trophoblastes internalisent de façon aussi efficiente les particules virales. Les virions se
retrouvent alors rapidement dans les endosomes intracellulaires. Or, il est reconnu que
l’activité endosomale des cellules épithéliales polarisées est vitale pour l’homéostasie
cellulaire (395). Est-ce que la présence soutenue de ces virions dans les endosomes pourrait
en quelque sorte monopoliser la machinerie endosomale et ainsi, nuire gravement aux
activités de la cellule? Pour répondre à cette question, il serait approprié de vérifier si le
403
devenir des macromolécules endogènes dans les trophoblastes est perturbé par l’endocytose
du VIH-1. Par exemple, nous pourrions analyser le taux de dégradation de marqueurs
connus (tels que le LDL), le recyclage de la transferrine, de même que la distribution
polarisée des protéines aux pôles apicaux et basolatéraux afin d’établir si la présence du
VIH-1 affecte ces fonctions cellulaires.
Le deuxième aspect relié aux dysfonctions des trophoblastes induites par le VIH-1 concerne
le type de trophoblastes visé par ce virus. Les études publiées sur la transmission verticale
du VIH-1 portent de façon exclusive sur le rôle des trophoblastes villeux. Quoique ces
études soient fort pertinentes, d’autres types de trophoblastes jouent un rôle vital dans
l’implantation et la placentation : les syncytiotrophoblastes dirigeant l’insertion du
blastocyste dans l’endomètre, de même que les cytotrophoblastes extravilleux (10, 11, 51).
Or, lors du développement placentaire, le syncytiotrophoblaste invasif et les cellules
extravilleuses remodèlent l’endomètre et certaines d’entre elles se transforment même en
cellules endovasculaires (10, 11, 51). Ces cellules interagissent donc activement avec des
cellules maternelles infectées, et de ce fait, nous croyons qu’elles constituent une cible
mésestimée de l’infection à VIH-1. Nous pensons que leur infection par ce virus pourrait
les rendre rapidement dysfonctionnelles, ce qui entraverait gravement les étapes
subséquentes du développement placentaire et, du coup, pourrait entraîner des avortements
spontanés. Ceci est d’autant plus probable si l’on envisage que l’infection de ces cellules
survient dans les étapes initiales de l’implantation. De façon intéressante, une équipe a
récemment développé une lignée de cellules immortalisées de cytotrophoblastes
extravilleux du premier trimestre de grossesse (173). Il serait approprié d’investiguer la
susceptibilité à l’infection de ces cellules et déterminer si leurs propriétés s’en trouvent
modulées. Par exemple, est-ce que leur profil d’expression d’intégrines de surface, de
molécules d’adhésion et/ou de facteurs solubles secrétés se trouve modulé par l’infection à
VIH-1?
Remarquons que les processus dont nous venons de faire état pourraient avoir lieu sans que
le VIH-1 ne soit nécessairement transmis au fœtus par les trophoblastes; le dérèglement
placentaire induit est suffisant en soi pour entraîner de fâcheuses conséquences pour le
404
fœtus. En sus de ces hypothèses, nous pouvons en formuler une dernière. Au tout début du
développement placentaire, nous sommes en présence d’un syncytiotrophoblaste invasif et
de quelques cytotrophoblastes. À ce stade, l’angiogenèse fœtale n’a pas débuté et les
trophoblastes sont donc en contact direct avec le blastocyste (10, 11, 51). Si l’on envisage
l’infection rapide des syncytiotrophoblastes par le VIH-1 durant l’implantation, celle-ci
pourrait rapidement se propager aux cytotrophoblastes voisins, puis aux cellules fœtales.
Une infection si précoce par le VIH-1 aurait sans nul doute des répercussions graves sur
l’embryogenèse.
1.11 Modèles expérimentaux de la transmission verticale
Nous avons abordé plusieurs volets de la transmission verticale du VIH-1 puisqu’il semble
qu’elle pourrait se produire selon plusieurs modalités. Un aspect-clé de l’étude de la
transmission verticale est le modèle expérimental employé. Dans cette thèse, nous avons
essentiellement utilisé la lignée de choriocarcinome JAR comme modèle d’étude des
évènements précoces du cycle réplicatif du VIH-1 dans les cytotrophoblastes. Deux raisons
majeures expliquent ce choix. D’abord ces cellules permettent de détecter de façon rapide
et reproductible l’infection par ce virus. Ensuite, elles forment une monocouche cellulaire
étanche et polarisée, condition essentielle à l’étude des propriétés de la barrière placentaire.
Toutefois, ce modèle expérimental comporte certaines limites. Il est en effet basé sur des
cellules transformées et, donc bien que les résultats que nous ayons obtenus soient
extrêmement significatifs, nous devrons maintenant établir que les mécanismes observés
prévalent dans un modèle plus physiologique. De plus, trois aspects de l’infection des
trophoblastes demeurent largement incompris. D’abord, si nous avons étudié l’infection du
VIH-1 dans un modèle s’apparentant aux cytotrophoblastes, nous ne connaissons pas la
susceptibilité à l’infection, ni le mécanisme d’infection des syncytiotropblastes. Ensuite,
nous n’avons pas déterminé si la permissivité des trophoblastes à ce virus est modulée en
fonction du stade du développement placentaire. Finalement, nous ne connaissons pas dans
quelle mesure la dégradation, l’infection, la transcytose et le recyclage des particules virales
internalisées ont lieu dans chacun des cas de figures énumérés. Il convient donc d’évaluer
405
ces évènements afin de préciser l’ensemble des paramètres régissant l’infection des
trophoblastes.
Quelles
sont
alors
les
possibilités
offertes ?
Les
cytotrophoblastes
et
les
syncytiotrophoblastes primaires comportent de sérieuses restrictions à leur utilisation, soit :
i) la perte de l’organisation tissulaire, ii) la fréquente contamination des préparations par
des macrophages et des fibroblastes, et iii) l’impossibilité de former une couche confluente,
continue et polarisée de cellules (181, 507). Certains auteurs ont alors eu recours à des
explants placentaires mais leur courte viabilité (24-48 h) en culture rend leur utilisation
limitée (181, 507). Récemment, un groupe a développé un protocole d’histoculture de
micro-explants de villosités chorioniques isolées de placenta précoce et à terme, qui est
basé essentiellement sur le modèle des échantillons d’amygdales (171). Il s’agit d’un
protocole fort pertinent pour l’étude de la transmission verticale du VIH-1 puisqu’il permet
d’investiguer l’infection des trophoblastes en tenant compte de l’intégrité tissulaire et du
stade de développement placentaire. De plus, le parcours du VIH-1 peut être
minutieusement suivi par microscopie afin d’établir comment le virus réussit à traverser la
barrière placentaire. Notons également que des équipes de recherche ont développé des
modèles d’étude de la transmission verticale basés sur l’infection des primates par le VIS
ou bien par des virus chimériques simiens/humains (125, 253). Considérant les résultats
spectaculaires qui ont pu être observés lors de la primo-infection des primates (320, 354),
de tels modèles pourraient s’avérer tout aussi informatifs pour la compréhension de la
transmission mère-enfant.
406
Section 2
Conclusion
L’infection des trophoblastes par le VIH-1 serait un moyen pour ce rétrovirus de traverser
la barrière placentaire et de contaminer le fœtus. Nous avons découvert que les étapes
précoces du cycle réplicatif du VIH-1 dans les trophoblastes sont intimement liées à
l’endocytose de ce virus. Les particules virales s’associent aux trophoblastes par des
interactions impliquant entre autres les HSPG. Les virions sont alors rapidement
endocytosés par un mécanisme peu commun, qui est indépendant de la clathrine, des
cavéoles, de la dynamine et de l’Arf6, mais qui nécessite que le cholestérol membranaire
soit libre. Si le VIH-1 est ensuite acheminé à des organelles différents de ceux contenant la
transferrine, c’est toutefois par l’action concertée du Rab5 et du Rab7 qu’il atteint
éventuellement les endosomes tardifs. Le transport des particules virales à ces organelles
est obligatoire pour l’infection des trophoblastes par le VIH-1. En effet, le virus y retrouve
probablement la machinerie cellulaire qui lui est nécessaire pour fusionner en l’absence de
la gp120 et de la gp41 et, ainsi, atteindre le cytoplasme. Nous pensons que cet évènement
s’apparente à la fusion rétrograde des vésicules intra-luminales avec la membrane des
endosomes.
Ces résultats constituent une importante avancée vers la compréhension de la transmission
in utero du VIH-1. De plus, l’infection des trophoblastes par ce rétrovirus présente un outil
biologique unique pour étudier le mécanisme associé à la fusion rétrograde des vésicules
intraluminales avec la membrane des endosomes. Trois questions majeures demeurent : i)
Quels sont les endosomes primaires où se retrouve initialement le VIH-1? ii) Comment se
fait le tri des particules virales vers les endosomes tardifs? iii) Comment le VIH-1 atteint-il
le cytoplasme une fois dans les endosomes? Les réponses à ces questions sont essentielles
si nous voulons éventuellement pouvoir agir sur les étapes précoces du cycle réplicatif de
ce rétrovirus pour prévenir la transmission verticale du VIH-1. Nous avons suggéré
quelques expérimentations pertinentes qui pourraient aider à répondre à ces questions.
Alors que notre compréhension de la pathogénèse virale se raffine, il est étonnant de
constater que la transmission du VIH-1 (aussi bien maternelle que par contacts sexuels) soit
beaucoup moins bien connue. La clé pour la résolution de cette énigme pourrait provenir
407
d’une meilleure compréhension de l’endocytose de ce virus. En effet, si l’on a longtemps
considéré qu’il s’agissait d’un évènement sans issue, l’internalisation des particules virales
semble en fait fort propice à la transmission menant à la primo-infection et/ou à la
dissémination virale. En effet, l’endocytose permet la capture et la dissémination des
particules virales par plusieurs types cellulaires dont les cellules dendritiques et les
macrophages. Ensuite, elle favorise la transcytose des virions par les muqueuses et les
cellules endothéliales. Finalement, elle est nécessaire à l’infection de certains types
cellulaires tels que les trophoblastes, les macrophages et les astrocytes. En s’appuyant sur
ce principe et à la lumière des données que nous avons observées, il nous semble impératif
d’étudier, non seulement dans les trophoblastes, mais également dans les muqueuses, les
cellules dendritiques et les macrophages, les mécanismes associés à l’endocytose virale. Si
nous parvenons à comprendre ces processus, nous pourrons par la suite développer des
stratégies favorisant la dégradation des particules virales internalisées au détriment de la
transmission/dissémination du virus. Cette stratégie a l’avantage de viser des étapes du
cycle viral qui précèdent l’implantation proprement dite de l’infection dans une cellule.
408
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