BIO241_ET2_corrigé_2011

BIO241 Examen terminal 2nde session (17 juin 2011)
Documents et calculatrices non autorisés
ATTENTION : Les parties A, B et C doivent être traitées sur des copies
séparées
6 pages
Notation sur 100
PartieA
Métabolismebactérien:coursdeMrY.Markowicz 20pts
Nousavonsvu,lorsdela1èresession,quelasoucheMR‐1delabactérieShewanellaoneidensisétait
capabled’utiliserlaN‐acétylglucosamine(NAG)oulelactatecommeuniquessourcesdecarbone,
d’énergieetd’électrons.
LecatabolismedelaNAG(parlavoied’Entner‐Doudoroff)
génère2moléculesd’ATPenamontdelaformationde
pyruvate,alorsquel’oxydationdulactateenpyruvaten’en
génèreaucune;danslesdeuxcas,lepyruvateestdécarboxylé
enacétyl‐coenzymeA,quipourraetentrerdanslecyclede
Krebs,etêtretransforméenacétylphosphate,quidonnera
alorsdel’ATPetdel’acétate.
Enanaérobie,labactérieestapparemmentcapablederespirerlefumarate,c’est‐à‐dired’utiliser
cettemoléculecommeaccepteurd’électronsauniveaudeseschaînesrespiratoires.

Figure1:CulturesdediversessouchesdeS.oneidensisdansunmilieuminimumdontonfaitvarier
lasourcedecarbone,enaérobieouenanaérobie.
(A)CroissanceenaérobiedelasouchesauvageMR‐1(●,rondsnoirs)etd’unmutantnepossédantpas
d’ATPase(,carrésnoirs)enanaérobie,avecdelaNAG40mMcommeuniquesourcedecarbone.
(B)CroissanceenaérobiedelasoucheMR‐1transforméeavecunplasmidesansinsert(●,rondsnoirs),
dumutantdépourvud’ATPasetransforméaveclemêmeplasmide(,carrésnoirs)etdecemême
mutanttransforméavecunplasmidedanslequelaétéinsérélegènedel’ATPasedeS.oneidensis(□,
carrésblancs),avecdelaNAG40mMcommeuniquesourcedecarbone.Unantibiotiqueaétéajouté
danslemilieudecultureafindes’assurerdelaprésenceduplasmide–porteurdugènede
résistanceàl’antibiotique–danslesbactéries.
(C)Croissanceenanaérobiedesmêmessouchesqu’en(A),maisavecdelaNAG10mMetdu
fumarate40mM(enl’absencedefumarate,iln’yapasdecroissancedesbactéries).
Lesdonnéesreprésententlesmoyennesdetroisexpériencesindépendantes(d’oùlesbarres
d’erreur).
1) Enanaérobie,quandlefumaratesertd’accepteurd’électrons,quelleestlamolécule
produitegrâceàlaréductiondufumarate?Quelleestlaparticularitédecetteréduction?
(1,5points)
Succinate.Ils’agitd’uneréactionducycledeKrebs«àl’envers».
2) Auvudesinformationsdonnéesdanslesujetd’examen,nommerlesdeuxmodesde
synthèsed’ATPexistantchezS.oneidensis,etdonnerunexemplepourchacund’eux.
(2points)
Phosphorylationauniveaudusubstrat:formationd’ATPvialatransformationde
l’acétylphosphateenacétate.
Phosphorylationoxydative:formationd’ATPparl’ATPasemembranaire,enlienaveclarespiration.
3) Expliquerlecomportementdumutantdépourvud’ATPaseenanaérobiedanslesexpériences
dontlesrésultatssontreportésdanslesFigures1Aet1C.Comptetenudecesrésultats
expérimentauxetdecequevoussavezquantaurôleetaumodedefonctionnementde
l’ATPasemembranaire,expliquerpourquoidetellesdifférencesdecroissance.Quelles
conclusionspouvez‐vousentirerquantàl’originedel’ATPnécessaireàlacroissance
bactérienneenanaérobieouenaérobie?(7points)

Enaérobie,lasouchesauvagepoussebeaucoupmieuxquelemutantdépourvud’ATPase
(Figure1A),doncl’ATPasemembranaireestnécessaire.
Parcontre,enanaérobie,alorsqu’ilyapourtantunautreaccepteurd’électronquel’oxygène,
lesdeuxsouchespoussentdelamêmefaçon,doncl’ATPasemembranairen’estpasnécessaire.
Onsaitquel’ATPasemembranairesertàfairerentrerdanslacellulelesprotonssortisvia
laréoxydationdescoenzymesréduits.Cetteentréedeprotonss’accompagnedelasynthèse
d’ATP. 
Onsaitégalementquelaproductiond’ATPestplusrentable,d’unpointdevue
énergétique,enaérobiequesilabactérieréduitunaccepteurd’électronalternatif.
Enanaérobie,l’essentieldelaproductiond’ATPnemetpasenjeul’ATPasemembranaire:
l’ATPestdoncessentiellementproduitparphosphorylationauniveaudusubstrat.
Onpeutcependantpenserque,enanaérobie,ilyaquandmêmeuneproductiond’ATPliéeà
laforceproton‐motrice,maisquecelle‐ciestmarginale(etquesasuppressionn’apasd’effet
visiblesurlacroissancecellulaire).
4) ExpliquerlepourquoidelamanipulationdontlesrésultatssontprésentésdanslaFigure1B,
etquelleinterprétationonpeuttirerdesrésultats.(1,5points)
Cetteexpérienceapourbutdevérifierquel’ATPasemembranaireestbienessentiellepour
unecroissanceoptimaleenaérobie.
Quandonapporteunecopiedugènecodantl’ATPasechezlemutantdépourvudel’enzyme,
celui‐ciretrouveunecroissancequasi‐normaleenaérobie.Cequiprouvel’importancedurôle
del’ATPase,etdoncdelaphosphorylationoxydative.
5) Quelle(s)différence(s)pouvez‐vousobserverentrelescourbesprésentéesdanslesFigures
1Aet1B?Auvudesprotocolesexpérimentauxmisenœuvre(souches,milieu),pourriez‐
vousproposeruneexplicationàcette(ces)différence(s)?(5points)
Ladifférencemajeureentrelesdeuxexpériencesconcernelacroissancedessouchessauvage
etmutante,beaucoupplusfaibleauvudesDOobtenuesenfindecroissance.
Or,lesseulesdifférencesobservéesdanslesprotocolessontlaprésenced’unplasmidedans
lesbactériesetd’antibiotiquedanslemilieudeculture.
Silesbactériespoussentmoinsbien,c’estqu’ellesutilisentunepartiedeleurénergiepour
autrechosequelacroissance.
Ilyadoncdeuxexplicationspossibles(etnoncontradictoires):
‐lecoûténergétiqueliéaufaitdeposséderunplasmide(réplication,réparationdeséventuels
dommagesàl’ADN)etd’enexprimerlesgènes;

‐lecoûténergétiqueliéàlanécessitépourlesbactériestransforméesdefabriquerl’enzyme
quipermettradeneutraliserl’antibiotiqueprésentdanslemilieudeculture.
6) S.oneidensisestparailleursconnuepoursacapacitéà«respirerlefer»,c’est‐à‐dire,en
anaérobie,àpouvoirutiliserl’unedesformesredoxduferentantqu’accepteurd’électrons.
Pourriez‐vousécrirelaréactiond’oxydo‐réductionenjeudanscetterespiration?S’agit‐ilde
lithotrophieoud’organotrophie(justifiervotreréponse)?(2points)
Fe3++e‐→Fe2+
Ils’agitd’organotrophie,carlesélectronssonttirésdelaNAGoudulactate.Ici,leminéralest
accepteurd’électrons,pasdonneur!
7) S.oneidensisétantcapablederespirerl’oxygène,lefumarateetlefer,commentla
qualifieriez‐vousquantàsoncomportementvis‐à‐visdel’oxygène?(1point)
Anaérobiefacultative:ellepréfèrel’oxygène,etl’utilisesystématiquementquandilest
présent,maispeutsedébrouillersans…
PARTIE B
Bioénergétique/Enzymologie:CoursdeMmeF.Cornillon (40pts)
Laphosphatasealcalinecatalysel'hydrolysedesestersphosphoriquesenmilieubasique.Onétudie
l'activitédecetteenzymepourl'hydrolyseduparanitrophénylphosphate(pNPP)enabsenceouen
présencedephosphateinorganiquePi.
Lecoefficientd'extinctionmolaire,déterminéà410nm,del’ionorthonitrophénateestégalà4000
M‐1.cm‐1.
Lesconditionsdutestsontlessuivantes:
Lemilieuréactionnel,comprenant1,4mLdetamponpH7,5et1,5mLdesubstratpNPP(MM=300
g.mol‐1)à3,6mg.mL‐1,estpréincubé5minutesà30°C.Laréactionestamorcéeparl'additionde100
µLd'unesolutionenzymatique.L'absorbanceestlueà410nmcontreuntémoinsansenzyme.
Les100µLdesolutionenzymatiqueutilisésdansletestproviennentdeladilutionau1/200ed'une
fractiontotalementpurifiéecontenant2mgdeprotéinesparmLdesolutionenzymatique.
1. Ecrirelaréactioncatalyséeparlaphosphatasealcaline.Lesformulessemi‐développées
nesontpasdemandées.
PNPP+H2O → pNP-OH + Pi
2. Donnerladéfinitiondumilieuréactionnel.Quelleestsavaleurnumérique?

Le milieu réactionnel est le milieu qui contient tous les éléments
chimiques nécessaires (réactifs) à la réaction catalysée par l'enzyme
étudiée (+ enzyme) en respectant les paramètres physicochimiques de
la réaction (T°, pH, P). vréactionnel = 3 mL
3. Sachantqueseull'ionparanitrophénateabsorbeà410nm,donnerl’alluredugraphe
obtenuexpérimentalementquidonnechacunedesvitessesinitiales,engrisédansle
tableauci‐dessous.Al'aided'untitreetd'uneannotationpertinents,mettreenvaleur
commentvousobtenezlavitesseinitiale.
DéterminationdelaVodelaPLP(0,1mLau1/200°),à30°C,pH7,5pourune
concentrationdepNPPde0,2mM
4. DonnerladéfinitiondeVmetKm.Quevouspermettent‐ilsd’étudier?
Vm vitesse initiale maximale, vitesse initiale obtenue à saturation de
l'enzyme, permet d'étudier le site catalytique de l'enzyme.
Km, constante de Michaëlis,reflète l'inverse de l'affinité de l'enzyme pour
son substrat, permet d'étudier le site de fixation du substrat sur
l'enzyme.
5. Apartirdesrésultatsdutableau,déterminerlaVmetleKmdela phosphatasealcaline
pourleparanitrophénylphosphate.Vousdisposezd’unefeuilledepapiermillimétréàla
findusujet.
Tracé du graphe : 1/Vo = f (1/[pNPP] ) en absence de Pi
intersection avec les ordonnées donne 1/Vm
intersection avec les abscisses donne -1/Km
Vm = 4 µM.min-1
Km = 0,25 mM
t
(i)
A 340 nm Vo