I. ADN polymérase Kappa et checkpoint de phase S

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Université Toulouse 3 Paul Sabatier (UT3 Paul Sabatier)
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Laura PIERINI
le lundi 28 septembre 2015
5JUSF
Etude des mécanismes moléculaires impliquant l'ADN polymérase Kappa dans
le checkpoint de phase S
²DPMF EPDUPSBMF et discipline ou spécialité ED BSB : Biotechnologies, Cancérologie
6OJUÏEFSFDIFSDIF
INSERM U1037, Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse
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Dr. Marie-Jeanne PILLAIRE
Dr. Jean-Sébastien HOFFMANN
Jury :
Rapporteurs:
Dr. Agnès CORDONNIER
Dr. Daniel FISHER
Dr. Kathrin MARHEINEKE
Président du jury:
Pr. Estelle ESPINOS-PARROU
La chute n’est pas un échec. L’échec est de rester là où l’on est tombé.
Socrate
Remerciements
Je commencerai par remercier chaleureusement les Dr. Agnès Cordonnier, Dr. Daniel
Fisher, Dr. Kathrin Marheinke, et le Pr. Estelle Espinos-Parrou pour m’avoir fait l’honneur
de participer à mon jury de thèse et d’avoir accepté d’évaluer mon travail.
Un grand merci aux sociétés Beopan, Kleiberit, Lafarge, Placoplatre, Polyprod, et Sika qui
ont financé ma thèse via un mécénat d’entreprise. Merci de m’avoir offert la possibilité de
continuer mes études. C’était la première fois que l’on voyait ce mode de financement à
Toulouse, et j’espère que ce ne sera pas la dernière.
Merci aux Dr. Florence Larminat et Dr. Patricia Kannouche, qui ont fait parties de mon
comité de thèse. Merci pour vos conseils, et vos idées qui m’ont permis d’avancer.
Je remercie Dr. Jean-Sébastien Hoffmann pour m’avoir accueillie dans l’équipe durant mon
année de Master 2, mais également pour mon doctorat que tu as co-encadré. Merci pour ta
disponibilité, et tom implication dans mon projet de recherche.
Je voudrais avoir une pensée pour le Pr. Christophe Cazaux. Il a été le premier à me parler
d’instabilité génétique, d’ADN polymérase spécialisée, ou de réparation. J’avais beaucoup
aimé ces cours, qui d’ailleurs m’ont donné envie de postuler en master 2 dans l’équipe. Un
grand merci pour tout. Il va beaucoup nous manquer.
Un merci tout particulier au Dr. Marie-Jeanne PILLAIRE, ma co-directrice de thèse. Merci
pour ton soutien indéfectible, ton engagement dans mon projet de recherche, et ta
confiance. Tu as toujours cru en moi, et tu m’as toujours poussé vers le haut. Merci pour ta
disponibilité pour parler d’un résultat, d’un protocole, du projet, mais aussi quand ça n’aller
pas pour moi. J’ai eu beaucoup de chance de t’avoir eu comme encadrante. Tu m’as
beaucoup appris !! Un très grand merci pour tout !
Merci au Dr. Marlène Dufresnes pour ces conseils sur les expériences d’ubiquitination, qui
m’ont permis de commencer vite ce projet.
Merci à l’ensemble de l’équipe, pour cette ambiance chaleureuse, et l’entraide qui règne
dans le labo. J’ai eu plaisir à travailler avec vous au cours de ces années.
Merci à Valérie, pour être toujours disponible pour discuter un résultat,un papier, un
protocole, ou donner un conseil avisé Merci à Rémy, toujours disponible pour donner des
idées ou un protocole. Un grand merci aux thésards de l’équipe, pour cette super ambiance,
cette entraide mutuelle, mais aussi pour tous ces apéros, et ces soirées ! Merci à Laure,
toujours là pour discuter, et pour m’avoir fait découvrir les meilleurs mojitos de Toulouse !
Bon courage pour la soutenance. Merci à Théo, toujours à l’affut des nouveaux papiers!!
Merci à Srdana, pour ta bonne humeur dans le bureau ! Un clin d’œil à Elodie, qui
commence, tout ira bien tu verras !
Merci à Marina, qui reprend le projet ! Merci pour ces derniers mois, ça m’a fait plaisir de
travailler avec toi !! Mène- le projet à bien et n’oublie pas de toujours avoir le power patate !
(Je t’en fais don !!!)
Merci également aux anciens de l’équipe Anne VF, Laure D, Anfina, Ivan, ça m’a fait plaisir
de vous revoir le jour J ! Merci à AnneSo anciennement membre de la dream team, pour ces
années de bureaux communs où régnaient une très bonne ambiance, et ça fait toujours
plaisir de te revoir quand tu reviens sur Toulouse.
Et enfin, un grand merci à tous pour mon calendrier 2016 !! Vous m’avez envoyé du rêve !
Un grand merci à mes copines, mes chéries, mes futures bridesmaids :
Axelle, Marie et Mélissa. Vous êtes tellement parfaites, géniales, je suis chanceuse d’avoir
des amies comme vous. Un gigantesque merci pour votre soutien sans faille, pour cette
amitié incroyable qui nous unit et qui, je l’espère, durera toujours (je nous vois bien raconter
nos exploits à nos petits-enfants), merci pour me comprendre aussi bien, être présentes
dans les moments importants quoi qu’il arrive, mais aussi pour toutes ces soirées
enflammées au Wallace, pour tous nos rires, fous-rires, pour vos réactions à l‘annonce du
mariage, pour cette complicité, pour tous nos souvenirs, et tous ceux qu’ils restent à venir
ensemble. Une année pleine d’émotion se profile, et j’ai hâte d’en partager les moindres
détails avec vous. Je vous aime !!!
Merci à Charly pour toutes ces années à avoir tenu parfaitement le rôle de lil’bro, et à me
chambrer sur le RCT (en attendant trois coupes d’Europe et un doublé). Tu pourras d’ailleurs
admirer le beau stade Mayol en juillet prochain.
Merci à Caroline et Renaud, pour toutes ces soirées du vendredi soir où on l’a toujours été
bien reçu, et où l’on pouvait se détendre après une semaine de dur labeur ! A très vite au
Havre !
Merci à Célia, Alex D, Alex B, Nicolas, Pauline, et tous ceux que j’oublie pour votre soutien,
et ces moments que l’on a partagés.
Un grand merci à ma famille, oncles, tantes, cousins, cousines. On dit souvent que ne choisit
pas sa famille, j’ai eu de la chance au tirage. Merci pour votre soutien, et pour votre
présence le jour J. Merci de tout cœur à mes mamies, vous êtes extraordinaires, et
tellement fortes. Vous êtes nos piliers, merci pour ce que vous m’avez donné, et appris.
Merci à ma belle-famille pour leur soutien et leur présence le jour de la soutenance, qui m’a
énormément touché !
Un ENORME merci à mes parents, pour votre confiance, vos encouragements, votre soutien
sans faille, pour croire, et de toujours prendre le temps de me conseiller. Vous vous êtes
toujours battus pour moi, et m’avez tout donné pour réussir Je vous en serai toujours
reconnaissante. Vous me manquez tous les jours ici. C’est tellement difficile pour moi de
partir de la maison à chaque fois. On sera toujours tous les trois envers et contre tout. Je
vous aime.
Et enfin, toi, toi mon tout mon toit, Thibault !
Avec toi j’irai au bout du monde, pour toi je ferai n’importe quoi ! Un très grand merci pour
tout ce que tu m’apportes au quotidien, pour être capable de me faire rire même si ça ne va
pas, pour ta patience au cours de ma thèse, pour ton soutien indéfectible, et surtout pour
croire en moi plus que moi-même. Notre rencontre improbable était écrite. Tu es ma bouée
de secours, mon roc, mon équilibre, mon destin. Un nouveau chapitre commence pour nous,
et j’ai vraiment hâte de découvrir ce qu’il nous réserve.
Comment finir ces remerciements, sans voir une pensée pour mes Grand-pères…
Table des matières
Liste des principales abréviations
Résumé
Summary
PARTIE I : INTRODUCTION GENERALE
CHAPITRE I : La réplication de l’ADN chez les eucaryotes supérieurs
I.
L’initiation de la réplication .............................................................................................. 11
A.
Mise en place des origines de réplication ................................................................................. 11
B.
Régulation des origines de réplication ...................................................................................... 14
II.
L’élongation de la réplication ........................................................................................... 19
A.
Les facteurs de la fourche de réplication ................................................................................. 20
B.
Les ADN polymérases réplicatives ............................................................................................. 22
III. La terminaison de la réplication........................................................................................ 24
CHAPITRE II: Le stress réplicatif: causes et conséquences
I.
Les causes du stress réplicatif ........................................................................................... 28
A.
La dérégulation des facteurs de la réplication .......................................................................... 28
B.
Interférence entre la réplication et la transcription ................................................................. 29
C.
La réplication des ADN non-B .................................................................................................... 30
D.
Les lésions de l’ADN................................................................................................................... 34
II.
Les conséquences du stress réplicatif ............................................................................... 35
CHAPITRE III: Les réponses cellulaires au stress réplicatif
I.
Activation du checkpoint de phase S ................................................................................ 41
A.
L’activation d’ATR aux fourches bloquées ................................................................................ 43
1.
Le complexe ATR/ATRIP/ADNsb ............................................................................................ 43
2.
L’hétérotrimère 9-1-1 et TopBP1 .......................................................................................... 44
B.
II.
Chk1 : effecteur du checkpoint de phase S ............................................................................... 46
1.
La localisation de Chk1 .......................................................................................................... 46
2.
Les fonctions de Chk1 ............................................................................................................ 48
3.
La régulation de Chk1 ............................................................................................................ 52
La tolérance des dommages ............................................................................................. 56
1
A.
Le contournement des lésions ou « Damage avoidance » ........................................................ 58
B.
La synthèse translésionnelle ..................................................................................................... 59
1.
Rôle de la mono-ubiquitination de PCNA dans la synthèse translésionelle......................... 59
2.
Les modèles de la synthèse translésionnelle ........................................................................ 63
3.
Le choix des ADN polymérases TLS ...................................................................................... 64
III. Les ADN polymérases translésionnelles ........................................................................... 65
A.
Généralités sur les ADN polymérases de la famille Y ................................................................ 65
B.
Rev1 ........................................................................................................................................... 66
C.
L’ADN polymérase Iota .............................................................................................................. 68
1.
Les domaines fonctionnels de pol Iota .................................................................................. 68
2.
Le rôle de pol Iota dans la gestion des dommages ............................................................... 69
D.
L’ADN polymérase Eta ............................................................................................................... 70
1.
Les domaines fonctionnels de pol Eta ................................................................................... 70
2.
Rôle de pol Eta dans le franchissement des dommages induits par les UV .......................... 70
3.
Rôle de pol Eta au niveau des sites fragiles communs .......................................................... 72
E.
L’ADN polymérase Zeta ............................................................................................................. 72
F.
Primpol ...................................................................................................................................... 73
CHAPITRE IV: L'ADN polymérase Kappa
I.
Structure et domaines fonctionnels de pol Kappa ........................................................... 76
II.
Les fonctions biologiques de pol Kappa ............................................................................ 79
A.
Réplication de l’ADN génomique .............................................................................................. 79
B.
Réplication de l’ADN endommagé et synthèse translésionnelle .............................................. 80
C.
Rôle dans la réparation de l’ADN endommagé ......................................................................... 82
1.
Pol Kappa et les dommages induits par les UV ..................................................................... 82
2.
La réparation des ICLs............................................................................................................ 83
3.
Rôle dans la recombinaison homologue ............................................................................... 83
III. Régulation de pol Kappa dans les cellules de mammifères .............................................. 84
A.
La régulation de la fonction de pol Kappa ................................................................................. 84
B. Dérégulation de l’expression de pol Kappa dans les cancers : conséquences sur la stabilité
génomique......................................................................................................................................... 85
PARTIE II: RESULTATS
I.
ADN polymérase Kappa et checkpoint de phase S ........................................................... 90
A.
Découverte de l’implication de pol Kappa dans le checkpoint de phase S ............................... 90
2
1.
Contexte et objectifs ............................................................................................................. 90
2. ARTICLE: “DNA polymerase κ-dependant DNA synthesis at stalled replication forks is
important pour chk1 activation.” Embo Journal, 2013 ................................................................. 91
3.
B.
Mécanismes moléculaires reliant pol Kappa au checkpoint de phase S ................................... 94
1.
Construction des mutants de pol Kappa ............................................................................... 94
2.
Analyse de la formation de foyers......................................................................................... 97
3.
Recrutement des mutants de pol Kappa à la chromatine ..................................................... 99
4.
Effet des mutants sur la signalisation du checkpoint de phase S........................................ 101
5.
Etude de l’interaction de pol Kappa avec des partenaires clés du checkpoint de phase S. 105
C.
II.
Conclusion ............................................................................................................................. 93
Conclusion sur le rôle pol Kappa dans le checkpoint de phase S ............................................ 110
Rôle de Pol Kappa dans la stabilisation de Chk1 en réponse à un stress réplicatif ........ 113
A.
Contexte et objectif ................................................................................................................. 113
B.
Pol Kappa est requise pour la stabilité de Chk1 après stress réplicatif ................................... 114
C.
USP7 : un nouveau régulateur de pol Kappa........................................................................... 116
1.
USP7 requis pour la stabilité de pol Kappa ......................................................................... 116
2.
Interaction entre Pol Kappa et USP7 ................................................................................... 118
3.
Pol Kappa régulée par ubiquitination.................................................................................. 120
4.
USP7 stabilise pol Kappa dans le noyau .............................................................................. 122
D.
Pol Kappa est importante pour stabiliser le complexe USP7/Chk1 ........................................ 124
E.
Conclusions sur la stabilisation de Chk1 en réponse à un stress réplicatif ............................. 126
III. Rôle potentiel de pol Kappa dans des régions hétérochromatiniennes ........................ 128
A.
Mise en évidence de l’interaction entre Pol Kappa et CENP-B .............................................. 128
B.
Généralités sur les centromères et CENP-B ............................................................................ 129
C.
Conclusion sur le rôle potentiel de Pol Kappa dans les régions d’hétérochromatine ............ 132
PARTIE III: CONCLUSION ET DISCUSSION GENERALE
I.
II.
Pourquoi pol Kappa est-elle importante pour la phosphorylation de Chk1 ? ................ 135
A.
La fonction polymérase de pol Kappa ..................................................................................... 135
B.
La stabilité protéique de Chk1 requiert pol Kappa.................................................................. 136
Comment pol Kappa est recrutée à la chromatine ? ...................................................... 139
III. Implication de pol Kappa dans des séquences particulières du génome ....................... 142
IV. Les conséquences cellulaires de l’absence de pol Kappa ............................................... 143
3
ANNEXES
Le domaine N-Clasp de pol kappa
I.
Réalisation et étude du mutant Δ-clasp68 ..................................................................... 149
II.
Etude du mutant pol Kappa Δ Clasp 68 .......................................................................... 150
III. Conclusion ....................................................................................................................... 152
Matériels et méthodes
I.
Culture cellulaire ............................................................................................................. 155
II.
Transfection de siARNs et plasmides .............................................................................. 155
III. Clonage pEGFP-C2 Kappa Δ clasp.................................................................................... 157
IV. Extraits protéiques totaux .............................................................................................. 157
V.
Extraits CSK ..................................................................................................................... 157
VI. Extrait protéiques nucléaire et immunoprécipitation .................................................... 158
VII. Proximity Ligation Assay ................................................................................................. 159
VIII. Fractionnement cellulaire ............................................................................................... 160
IX. Analyse des protéines par Western Blot ........................................................................ 161
X.
Ubiquitination de Pol Kappa ........................................................................................... 162
BIBLIOGRAPHIE
4
Liste des principales abréviations
8 oxoG : 8 oxoguanosine
9-1-1: Rad9-Rad1-Hus1
53BP1: p53 Binding Protein
ADN: Acide DesoxyriboNucléique
APC: Anaphase Promoting Complex
ARN: Acide RiboNucléique
ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated
ATR: ATM and Rad3 related
ATRIP: ATR Interacting Protein
BER: Base Excision Repair
BPDE: Benzo[a]Pyrène Diolepoxide
BRCA1: Breast Cancer 1
Cdc6: Cell division cycle 6
Cdk: Cyclin-dependant kinase
Cdt1: Chromatin licensing and DNA replication 1
Chk1: Checkpoint kinase 1
CRL4cdt2: Cullin 4-DDB1-CDT2
DDK: Dbf4-dependant promoting kinase
dNTP: Désoxyribonucléotide triphosphate
G4: G quadruplex
HU: Hydorxyurée
MCM: Mini Chromosomal Maintenance
Mono-ub: Mono-ubiquitinylé
5
NER: Nucleotide Excision Repair
NLS: Nuclear Localization Signal
ORC: Origin Recognition Complex
PCNA: Proliferating Cell Antigen
PIP: PCNA Interacting Protein
Pol: Polymérase
Pol TLS : Polymérase Translésionnelle
Pré-IC : Complexe de pré-initiation
Pré-RC: Complexe de pré-réplication
RFC : Replication Factor C
RPA : Replication Protein A
Ub : Ubiquitinylé
UBM : Ubiquitin-Binding Motif
UBZ: Ubiquitin-Binding Zinc finger
USP1: Ubiquitin Specific Peptidase 1
USP7: Ubiquitin specific Peptidase 7
UV: Ultra-Violet
TLS: Translésion
XP-V: Xeroderma pigmentosum variant
6
Résumé
La réplication de l’ADN est un évènement majeur pour la cellule car elle permet la duplication
fidèle du matériel génétique. Il s’agit d’une étape critique du cycle cellulaire, car les fourches de
réplication rencontrent fréquemment des barrières naturelles ou des lésions d’origine endogènes
(lésions oxydatives) ou exogènes (agents physiques ou chimiques), sources de cassures
chromosomiques et donc d’instabilité génétique. Une des réponses à ces fourches bloquées est
l’activation du point de contrôle (checkpoint) de la phase S du cycle cellulaire. Nous avons montré
que l’ADN polymérase Kappa (pol Kappa), polymérase dite translesionnelle en raison de ses capacités
à franchir des lésions sur l’ADN, s’avère être aussi un acteur du point de contrôle de phase S. En
effet, la déplétion de pol Kappa par ARN interférence dans différentes lignées cellulaires ou par
immunodépletion d’un extrait de Xénope, entraîne un défaut de phosphorylation de Chk1. Pol Kappa
est impliquée dans la synthèse de brins naissants d’ADN au niveau des fourches bloquées, ce qui
facilite le recrutement du complexe 9-1-1 composé des protéines Rad9, Rad1 et Hus1et permet alors,
une activation correcte du checkpoint de phase S.
Afin de décrypter le rôle de pol kappa, nous avons construit différents mutants et nous avons
analysé leur capacité à former des foyers, à être recrutés à la chromatine et à interagir avec
différents partenaires dans des conditions d’activation du point de contrôle de phase S. Nous avons
pu constater que le mutant du domaine d’interaction à PCNA était incapable de former des foyers.
Nous avons ensuite observé en condition de stress réplicatif, pol Kappa était recrutée à la chromatine
grâce à son domaine d’interaction à PCNA et par différentes approches biochimiques, nous avons
pu voir que pol kappa interagissait avec Rad9 et Chk1.
Nous avons également mis en évidence qu’en l’absence de pol kappa, le taux de Chk1 dans le
noyau diminuait, suggérant une régulation commune entre Chk1 et pol Kappa. En effet, nous avons
démontré que pol Kappa, comme Chk1, était régulée par l’ubiquitine hydrolase USP7. En effet,
l’interaction entre pol Kappa et USP7 est augmentée en condition de stress. Nous avons pu voir, qu’à
l’instar de Chk1, l’absence d’USP7 entrainait une baisse du niveau de pol kappa dans le noyau. Ainsi
nous proposons qu’en réponse à un stress réplicatif, pol Kappa et Chk1 soient stabilisés par un
processus de dé-ubiquitination par USP7, permettant leur recrutement à la chromatine et une
activation correcte du checkpoint de phase S.
Parallèlement à ces travaux, des publications récentes montrent une implication possible de
pol Kappa au niveau des séquences répétées. Nous avons pu mettre en évidence une interaction
entre pol Kappa et Cenpb, protéine centromérique reconnaissant une séquence de 17 paires de
bases dans l’ADN α-satellite. Ces résultats préliminaires suggèrent que le rôle de pol Kappa dans le
checkpoint de phase S concerne notamment les régions d’hétérochromatine.
L’ensemble des résultats obtenus montre l’importance de pol Kappa dans le maintien de la stabilité
génomique, par son rôle dans le checkpoint de phase S, et par son implication dans la régulation de
Chk1 en condition de stress réplicatif.
7
Summary
DNA replication is a major event for cells which allow the faithful duplication of genetic
material. It is a critical step of cell cycle, because replication forks encounters frequently naturals
barriers (non B-DNA structures), exogenous lesion (chemicals agents), or endogenous damage
(oxydatives lesions). These different barriers can be the source of chromosome breakage and genetic
instability. To overcome the stalled forks, cells have evolved two major mechanisms: the induction of
ATR replication checkpoint pathway and the recruitment of specialized DNA polymerase to perform
translesion synthesis. This two pathways are essential to maintain genomic stability.
Human DNA polymerase Kappa (pol Kappa), the most conserved specialized DNA
polymerase, is best known to participate to translesion synthesis. Recently, we have shown that pol
kappa has also a crucial role in the S-phase checkpoint activation. Indeed, pol Kappa is implicated in
the synthesis of short DNA intermediates at the stalled forks, facilitating the recruitment of 9-1-1
clamp, and is required for an optimal phosphorylation of Chk1, the main effector of the s-phase
checkpoint. Durant my PhD thesis, I explored the molecular mechanisms underlying this newly
identified role. We have constructed several pol kappa mutants, and we have observed that in the
PCNA binding domain is required to form foci in response to replication stress. We have also
evidenced the requirement of this domain for pol Kappa recruitment on chromatin. By different
experimental approaches, we have unveiled that pol Kappa, Rad9 and Chk1 form a complex.
The absence of pol Kappa leads to a decrease of the Chk1 protein level decreased in the
nucleus, suggesting a potential common regulation between pol Kappa and Chk1. Based on this
observation, we have studied how pol Kappa is regulated upon a replication stress. We found that
pol Kappa seems to be regulated by USP7, an ubiquitin hydrolase known to regulate Chk1. We have
demonstrated an interaction between pol Kappa and USP7, which is stimulated after replication
stress. Moreover, USP7 depletion leads to a decrease of pol Kappa level in the nucleus, suggesting
that de-ubiquination of pol Kappa could to be a prerequisite for its checkpoint function and its
stability.
Furthermore, recent publications have shown a potential implication of pol Kappa in the
replication of repeated sequences. Preliminary results revealed an interaction between pol Kappa
and Cenpb, a centromeric protein that recognizes and binds a 17 nucleotides sequence in the
centromeric α-satellite DNA. These data suggests an implication of Pol Kappa in the replication of
heterochromatin regions.
Taken together these data highlight an important role of Pol Kappa in managing the s-phase
checkpoint
response
through
the
regulation
of
Chk1
status
8
Partie I : Introduction générale
Partie I : Introduction générale
9
Partie I : Introduction générale
10
Partie I : Introduction générale
Chapitre I : La réplication de l’ADN chez
les eucaryotes supérieurs
Chaque cycle cellulaire est témoin de la division d’une cellule-mère en deux cellulesfilles. Cependant, avant cette division, la cellule-mère a besoin de dupliquer fidèlement son
matériel génétique. La machinerie de réplication nommée réplisome se compose d’un grand
nombre de protéines qui sont finement régulées et coordonnées afin d’assurer la duplication
fidèle et unique du génome, préambule obligatoire à la ségrégation des chromosomes. La
réplication s’initie aux origines de réplication, puis progresse de manière bi-directionnelle et
semi-conservative le long des chromosomes, cette étape d’élongation se termine lors de la
rencontre des fourches de réplication (LEHMAN et al., 1958 ; BESSMAN et al., 1958).
I.
L’initiation de la réplication
A.
Mise en place des origines de réplication
Parmi toutes les origines présentes dans le génome, entre 30 000 et 50 000 sont
activées de manière séquentielle au cours de la phase S du cycle cellulaire. L’activation des
origines de réplication permet l’ouverture de la double hélice d’ADN, afin d’en séparer les
deux brins, et permettre l’accès à la machinerie de réplication.
La mise en place des origines de réplication commence à la transition entre les
phases M et G1 du cycle cellulaire. L’hexamère ORC (Origin Recognition Complex 1-6) se lie
sur l’origine de réplication en début de G1, où il sert de plateforme pour le recrutement de
cdt1 (Chromatin licencing and DNA replication factor 1) et de cdc6 (cell division cycle gene
6). Ces deux protéines vont faciliter le chargement des hélicases MCM 2-7 (mini
chromosome maintenance) au niveau des origines de réplication (pour revue Leman et
Noguchi, 2013) (Maiorano, Moreau, et Méchali, 2000) (Remus et al., 2009). L’ensemble de
11
Partie I : Introduction générale
ces protéines forme alors le complexe de pré-RC (pré-Replication Complex) (fig 2). A cette
étape, l’origine de réplication est dite « licensed », ou prête à être activée.
A la transition G1/S, le complexe pré-RC est activé pour former le complexe pré-IC
(pre-Initiation Complex). Cette activation est due à l’action des kinases CDK (cycleDependant-Kinase) et DDK, appelé aussi, cdc7-Dbf4, (Dbf4-Dependant-kinase) (Nougarède
et al., 2000 ; Zou et Stillman, 2000). Elles vont faciliter le chargement de cdc45 et du
complexe GINS (composé de Sld5, Psf1, Psf2, Psf3) (Takayama et al., 2003).
12
Partie I : Introduction générale
13
Partie I : Introduction générale
MCM-cdc45-GINs forment alors le complexe CMG (Moyer, Lewis, et Botchan, 2006) ,
qui stimule l’activité de de l’hélicase MCM 2-7
(Ilves et al., 2009). Cdc45 permet le
recrutement des ADN polymérases α, δ, et ε. La protéine MCM 10 est aussi recrutée, elle
faciliterait l’ouverture la double hélice (Walter et Newport, 2000). A ce moment, l’origine est
dite activée ou « fired », l’ouverture et le déroulement de l’ADN commence alors.
B.
Régulation des origines de réplication
Comme la cellule se divise, l’information génétique qu’elle contient doit être
transmise à la génération suivante. Pour maintenir l’intégrité du génome, la réplication doit
être complète et non redondante à chaque cycle cellulaire. Pour cela, la cellule a mis en
place des mécanismes de régulation qui préviennent la re-réplication, c’est-à-dire la
réutilisation d’une origine déjà activée. En effet la re-réplication conduit à l’induction d’un
stress réplicatif et peut être vecteur d’instabilité génétique. Les protéines soumises à une
régulation stricte afin d’éviter la re-réplication sont : ORC, cdc6, et cdt1.
Après initiation de la réplication, la protéine Orc1 du complexe ORC est ubiquitinylée
sur la chromatine entrainant sa dégradation par le protéasome (Méndez et al., 2002).
Puisque la présence de toutes les protéines ORC est requise pour le recrutement des MCM,
la dégradation de Orc1 empêche donc l’origine de se réinitier.
Chez les eucaryotes supérieurs, l’essentiel de la régulation concerne cdt1 (Fig 3). En
effet, l’expression de cdc6 semble stable au cours du cycle cellulaire. Au cours de la phase S,
cdc6 est phosphorylée par cycline A/cdk2, la protégeant de la dégradation, elle est exportée
vers le cytoplasme par crm1 afin de limiter sa présence dans le noyau (Kalfalah et al., 2015).
14
Partie I : Introduction générale
La seule surexpression de cdt1 dans des cellules humaines entraine une reréplication. Cdt1 est phosphorylée par le complexe cycline A/cdk2 avant la formation du préIC (Fig 2), ce qui conduit à sa reconnaissance par l’E3 ubiquitine ligase SCFSKP2, et à sa
dégradation par le protéasome (pour revue (Blow et Dutta, 2005) . Il existe une autre voie de
dégradation de cdt1, dépendante de la réplication. Cdt1 possède un domaine d’interaction à
PCNA (facteur de processivité des polymérases réplicatives), ce qui entraine sa liaison à
15
Partie I : Introduction générale
PCNA pendant la réplication. Il est reconnu par l’E3 ubiquitine ligase Cul4-Ddb1ᶜᵈᵗ², ce qui
mène à sa dégradation par le protéasome (Nishitani et al., 2001) .
Cdt1 peut être inhibée par la protéine géminine, durant la phase S et G2. Elle protège
cdt1 de l’ubiquitination, et permet son accumulation en G2 et M sous forme inactive. En fin
de mitose, la géminine est dégradée sous l’impulsion d’APC (Anaphase Promoting Complex)
ce qui libère l’activité de cdt1 et permet le chargement des MCM. La géminine joue un rôle
majeur dans l’inhibition de la re-réplication (Fig 4). La déplétion d’Emi1, un inhibiteur de
l’activité du complexe APC/C durant la phase S et la phase G2, cause de la re-réplication.
L’activation d’APC aboutit à la dégradation de la géminine, de la cycline A, et de la cycline B1,
ce qui cause de la re-réplication dépendante de l’activation cdt1, et l’inactivation de
cdk2/cycline A, et cdk1/cycline B1 (Machida and Dutta, 2007).
La régulation par les CDK joue un rôle prépondérant dans la régulation des origines
de réplication. En effet, il a été montré chez S. pombe que l’inactivation de CDK1 ou de la
cycline mitotique cdc13 en G2 permettait une forte re-réplication de l’ADN durant un seul
16
Partie I : Introduction générale
cycle cellulaire (Broek et al., 1991; Hayles et al., 1994) . Ce qui indique que le re-chargement
de MCM2 a lieu en G2, quand l’activité CDK est inhibée. Il a également été montré chez S.
cerevisae que CDK1 était requis pour la transition du complexe pré-RC vers le complexe préIC (Dahmann et al., 1995). De plus, les CDKs promeuvent l’export nucléaire de cdt1 et MCM
2-7 durant la phase S, G2 et en mitose précoce, prévenant leur accès à l’ADN. L’inhibition de
tous ces contrôles aboutit à de la re-réplication (Blow et Dutta, 2005).
Les études menées sur les levures ont montré que l’initiation de la réplication prenait
place au niveau de séquences spécifiques. En effet, la réplication automone d’un plasmide a
été trouvée conduite par une séquence de 200 paires de bases (bp), chez S. cerevisiae. Cette
séquence est nommée ARS, « Automonously Replication Sequence ». Elle contient une
séquence consensus de 11 à 17 bp appelé ACS (ARS Consensus Sequence), qui sera par la
suite reconnue par ORC afin de former le pré-RC (pour revue (Renard-Guillet et al., 2014)).
Le positionnement des nucléosomes autour des origines semble être important. Les ACS se
trouvent dans des régions appauvries en nucléosomes (NDR Nucleosome depletion region)
(Berbenetz, Nislow, et Brown, 2010 ; Eaton et al., 2010), ce qui faciliterait la fixation du
complexe ORC, mais aussi influerait sur le bon repositionnement des nucléosomes
environnants.
Chez S. pombe, les origines de réplication sont riches en A/T. De façon cohérente,
l’homologue d’Orc4 chez S. pombe possède un motif « A-T
hook », requis pour la
reconnaissance des origines (Chuang et Kelly, 1999).
Chez les métazoaires, aucune séquence spécifique n’a été retrouvée. Cependant,
récemment, la présence de motifs riche en G, OGRE (Origine G-Rich Repeat Element), a été
reportée (Cayrou et al., 2011) en amont des origines de réplication. Il est proposé que ces
séquences OGREs forment des G-quaduplex. Les G-quadruplex se composent de plusieurs
plateaux comprenant 4 guanines reliés par des ponts hydrogènes. En effet, les G-quadruplex
ont été retrouvés largement associés aux origines de réplication chez l’homme (Besnard et
al., 2012). Des études à grande échelle ont montré un chevauchement entre les origines de
réplication et les ilôts CpG (Cadoret et al., 2008 ; Cayrou et al., 2011), dans des lignées
cellulaires humaines et murines. Ces résultats coïncident parfaitement avec la présence de
motifs OGREs au niveau des origines de réplication. La méthylation des ilôts CpG pourrait
17
Partie I : Introduction générale
avoir un rôle dans la régulation des origines de réplication. En effet, il apparait que les ratios
d’initiation de la réplication sont associés à la présence de méthylation sur les ilôts CpG, mais
ne sont pas compatibles avec les évènements de transcription (Martin et al., 2011), car La
méthylation des îlots CpG est connue pour être une marque répressive pour la transcription.
L’activation des origines de réplication est contrôlée par un programme temporel (le
timing de réplication), c’est-à-dire que les origines de réplication s’activent dans un ordre
établi. Le timing de réplication est mis en place en tout début de G1 au TDP (Timinig Decision
Point) (Dimitrova et Gilbert, 1999). Le timing de réplication est très conservé au cours de
l’évolution. Les études comparatives entre l’humain et les souris montrent une très grande
conservation du timing de réplication (Yaffe et al., 2010).
Les origines ne sont pas toutes activées à chaque cycle cellulaire. Une question se
pose alors : Comment sont choisies celles qui s’activent ? Les études penchent vers le
modèle « stochastique contrôlé » où la probabilité d’activation serait fonction du contexte
génomique (Raghuraman et Brewer, 2009). Ce modèle expliquerait pourquoi les origines
sont mises en place en G1, mais activées seulement en phase S. Par exemple, l’assemblage
de l’enveloppe nucléaire, incluant les lamines, aurait un impact sur le timing de réplication.
En effet, l’assemblage doit être complet pour le repositionnement des domaines
chromosomiques. Les facteurs recrutés sur des sites spécifiques de ces domaines créeraient
un microenvironnement qui modulerait la formation des pré-RC (Dimitrova et Gilbert,
1999). Des expériences in vitro chez le Xénope montrent qu’à l’échelle du simple réplicon ou
du cluster de réplication, le timing de réplication est aléatoire, car les séquences répliquées
précocement ne coïncident pas entre deux cycles cellulaires consécutifs. Néanmoins, le
timing de réplication de larges domaines n’est pas complètement stochastique puisque les
foyers de réplication coïncident entre deux phases S consécutives précoces (Labit et al.,
2008).
La protéine Rif1 (Rap Interacting Factor 1) a été découverte comme étant un
régulateur du timing de réplication chez S. pombe. Rif1 est capable de réguler positivement
ou négativement l’activation des origines, c’est-à-dire que sa présence ou son absence sur la
chromatine influe sur le moment où l’origine s’active. En effet, les domaines répliqués en
début de phase S peuvent être répliqués en fin de phase S, et inversement dans les mutants
18
Partie I : Introduction générale
déplétés en Rif1. Le site de liaison de Rif1 est distribué dans des régions intergéniques, le
long du génome de S. pombe. Ces régions sont proches d’origines activées tardivement en
phase S
(Hayano et al., 2012). Bien qu’étant un régulateur du timing de réplication,
l’absence de Rif1 n’entraîne pas de défaut de formation du pré-RC.
Récemment, mon équipe d’accueil a mis en évidence un nouveau régulateur du
timing de réplication, l’ADN polymérase Theta (pol θ), une ADN polymérase spécialisée de la
famille A. Pol θ est recrutée à la chromatine, en début de phase G1, où elle participe à la
formation du complexe pré-RC. De plus, elle interagit avec les protéines Orc2 et Orc4
appartenant au complexe ORC. Elle régule le recrutement des MCM, puisque son absence
entraîne une augmentation des MCM sur la chromatine. Pol θ et Rif1 ont un profil de
recrutement similaire sur la chromatine en G1. L’absence de pol θ n’entraîne pas de
diminution du niveau cellulaire de Rif1, ni de défaut de son recrutement à la chromatine. De
façon intéressante, l’absence de pol θ entraine une modification du timing de réplication
(Fernandez-Vidal et al., 2014) .
II.
L’élongation de la réplication
Après l’initiation aux origines de réplication, l’étape d’élongation débute. Les
hélicases chargées, au moment de la formation du complexe pré-RC, vont dérouler l’ADN, ce
qui permet aux polymérases réplicatives associées à leur facteur de processivité PCNA
d’accéder à la matrice d’ADN. Une hélicase supplémentaire, MCM8, vient s’ajouter afin de
faciliter la progression du réplisome, notamment en cas de perturbation de la réplication
(Lutzmann et al., 2012). Les ADN polymérases réplicatives sont capables de répliquer l’ADN
dans le sens 5’→3’. Sur le brin continu, la réplication sera directe, et sur le brin retardé, la
réplication se fait de façon discontinue, il y a génération de multiples fragments, les
fragments d’Okazaki (Okazaki et al., 1968)
19
Partie I : Introduction générale
A.
Les facteurs de la fourche de réplication
Après activation des origines de réplication, les ADN hélicases commencent à
dérouler l’ADN, ce qui génère de l’ADN simple brin (ADNsb), qui est recouvert par une
protéine affine pour l’ADN, RPA (Replication Protein A). RPA est composée de 3 sous-unités,
la sous unité 70kDa dans laquelle se trouve le site de liaison à l’ADN, la sous-unité 32kDa, et
la sous-unité 14kDa (Wold, 1997) .
Les ADN polymérases réplicatives ont besoin de nombreux facteurs afin de répliquer
l’ADN. En effet, la conformation des ADN polymérases réplicatives ne leur confère pas une
interaction stable avec l’ADN. Pour renforcer cette interaction, des pinces de glissements
20
Partie I : Introduction générale
(sliding clamp) ont été conservées au cours de l’évolution, et elles promeuvent la
processivité des ADN polymérases.
Figure 6 : Structure de PCNA
PCNA est un homotrimère. Chaque
monomère est représenté par une couleur.
Issue (Carrasco-Miranda et al., 2014)
Chez les eucaryotes, la pince de glissement PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)
est un homotrimère qui forme un anneau autour de l’ADN. Elle interagit en 3’ de l’amorce
d’ARN/ADN, et permet l’orientation des ADN polymérases. La stabilisation des ADN
polymérases par PCNA stimule significativement leur processivité (jusqu’à 1000 fois) (Prelich
et al., 1987). PCNA est donc un facteur essentiel de la réplication, mais aussi une plateforme
d’interaction commune dans de multiples processus (réparation de l’ADN, signalisation du
checkpoint).
PCNA doit être chargé au niveau des fourches de réplication. Sur le brin continu, il
n’est chargé qu’une seule fois au niveau de l’origine mais sur le brin retardé, PCNA est
constamment chargé et déchargé de la chromatine. Le chargement de PCNA est effectué par
le complexe RFC (Replication Factor C), qui inclut Rfc1, Rfc2, Rfc3, Rfc4 et Rfc5. RFC est
capable de reconnaitre en 3’, la jonction amorce/ADN et de recruter par hydrolyse de l’ATP,
PCNA au niveau de ces jonctions (pour revue Moldovan, Pfander, et Jentsch, 2007) .
PCNA
subit
de
nombreuses
modifications
post-traductionnelles
comme
l’ubiquitination, des phosphorylations, de sumoylations, ou des acétylations (pour revue
Moldovan, Pfander, et Jentsch, 2007)). PCNA possède 6 lysines dans ces régions N-terminale
et C-terminale qui peuvent être acétylées. L’acétylation de PCNA joue un rôle dans la
réplication de l’ADN, puisque PCNA acétylé présente une plus forte affinité pour pol δ
21
Partie I : Introduction générale
(Naryzhny et Lee, 2004). Il a été montré dans des cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian)
qu’il existait trois isoformes de PCNA avec différents statuts d’acétylation. PCNA peut être
également sumoylé sur la lysine K164, la même que pour l’ubiquination, durant la réplication
non perturbée. La sumoylation de PCNA est médiée par l’E2- enzyme de conjugaison Sumo
spécifique Ubc9 et l’E3 sumo ligase Siz1. La sumoylation de PCNA sur la lysine K164 est
retrouvée chez la levure, dans les cellules de poulet DT40, et dans les extraits de Xénope. Il
est montré que PCNA-sumo prévient la recombinaison et favorise la voie de tolérance des
dommages dépendante du complexe Rad6/Rad18 (Shaheen et al., 2010) . La sumoylation de
PCNA sur la lysine K164 est également retrouvé dans les cellules humaines, néanmoins sont
rôles est encore en débat. Il est proposé que PCNA-sumo prévienne la formation de cassures
doubles brins si la fourche est bloquée par une lésion, mais également en inhibant la
conversion de la fourche régressée en une cassure simple brin de l’ADN (Gali et al., 2012).
Les autres modifications post-traductionnelles de PCNA seront développées plus tard dans
l’introduction.
B.
Les ADN polymérases réplicatives
Dans les cellules humaines, il existe 15 ADN polymérases. Ces ADN polymérases sont
classées en famille en fonction de leur homologie de séquences (Tableau 1)
H. Sapiens
S. Cerevisae
S. Pombe
Lambda
Lambda
Lambda
Theta
Alpha
Alpha
Alpha
FamilleB
Delta
Delta
Delta
Epsilon
Epsilon
Epsilon
Zeta
Rev3
Rev3
Iota
Famille Y
Kappa
Kappa
Eta
Rad30
Eta
Rev1
Rev1
Rev1
Lambda
Lambda
Famille X
Beta
Mu
Pol 4
Sigma
Sigma
Sigma
Tdt
Tableau 1 : Familles des ADN polymérases classées en fonction de leur homologie de séquences ou
structures (Adapté (Burgers et al., 2001))
Famille A
22
Partie I : Introduction générale
Les ADN polymérases réplicatives, pol α, polδ, et pol ε, appartiennent à la famille B
des ADN polymérases et elles catalysent la réplication du génome nucléaire. Toutes ADN
polymérases connues adoptent une conformation similaire à une main, où chaque domaine
est important pour sa fonction, et représenté par (Fig 7)
(Steitz, 1998) :
-
La paume, où se trouve le domaine catalytique
-
Le pouce, interagit avec l’ADN et facilite sa processivité
-
Les doigts qui permettent un positionnement correct de la matrice et l’incorporation
des nucléotides (pour revue (Johansson et Dixon, 2013)).
Pol α, également appelé la primase, est chargée sur l’ADN durant la formation du pré-IC.
Elle est capable d’amorcer la réplication grâce à la synthèse d’une amorce ARN/ADN. Cette
enzyme est constituée de 4 sous-unités, dont les sous-unités p180 et p48 contenant
respectivement l’activité ADN polymérase et l’activité primase. A chaque départ de
réplication, elle est capable de synthétiser un fragment court d’ARN de 10bp, puis de
l’étendre en ajoutant environ 20 nucléotides, (Fig 5). Pol α va générer une seule amorce sur
le brin continu, et une amorce (environ tous les 1000bp) pour chaque fragment d’Okazaki,
sur le brin retardé (Maga et al., 2001 ; Hubscher, Maga, et Spadari, 2002).
Polδ et polε sont composées de 4 sous-unités chacunes : p125, p66, p50, p12 pour
polδ, et p261, p59, p17, p12 pour polε. Les plus grosses sous-unités portent l’activité
catalytique et l’activité correctrice exonucléase 3’→5’ (Liu et al., 2000). Cette activité
exonucléase permet de corriger l’insertion d’un nucléotide mal apparié (McCulloch et
Kunkel, 2008). Pol δ réplique l’ADN sur le brin retardé (Nick McElhinny et al., 2007), tandis
23
Partie I : Introduction générale
que pol ε a été montré comme étant la polymérase participant à la synthèse du brin continu
(Pursell et al., 2007). Ces ADN polymérases sont très fidèles, grâce à leur site catalytique
discriminant et à leur activité exonucléase. Elles génèrent une substitution ou une
insertion/délétion pour 10 000 insertions correctes.
Polα ne possède pas d’activité correctrice exonucléase 3’→5’, ce qui explique sa plus
faible fidélité. Cependant, il est à noter que polδ pourrait participer à la correction des
erreurs de polα sur le brin retardé (Pavlov et al., 2006). L’activité exonucléase 3’→5’
apparait comme un garant de la stabilité génétique. Les polδ et polε ont un taux très faible
de mésappariement comparé aux taux obtenus avec ces mêmes polymérases mutées. Il est
intéressant de noter, que l’absence d’activité exonucléase augmente la probabilité de
développer un cancer. En effet, des études montrent que des souris ayant l’activité
exonucléase de polδ mutée ont une espérance de vie plus courte, et présentent une
mutagénèse spontanée augmentée, se traduisant par une probabilité élevée de développer
tous type de cancer (Goldsby et al., 2001). Chez l’homme, il a été montré que l’apparition de
cancers était corrélée avec des mutations dans l’activité exonucléase de polδ (Palles et al.,
2013) .
III. La terminaison de la réplication
Comme dit précédemment, la synthèse d’ADN par polδ sur le brin retardé génère des
fragments, dits les fragments d’Okazaki. Polδ réalise la synthèse d’ADN d’un fragment
d’Okazaki, jusqu’à l’amorce ARN/ADN du fragment précédent. Elle déplace la partie ARN, ce
qui entraîne la formation d’une extrémité battante. L’endonucléase FEN1 (Flap
EndoNuclease 1) entre alors en jeu (Fig 5), et clive l’amorce ARN du fragment d’Okazaki. La
ligase I (LigI) relie la brèche formée entre les deux brins de fragments d’ADN. Parfois, le
déplacement de l’amorce d’ARN par polδ est plus importante, la brèche formée entre les
deux fragments est plus importante, recouverte par RPA. La brèche sera clivée par Dna2, une
hélicase/endonucléase, générant une extrémité plus courte, avec laquelle FEN1 procédera
de façon identique à la première situation (pour revue Leman et Noguchi, 2013).
24
Partie I : Introduction générale
La terminaison de la réplication est établie, lorsque deux fourches de réplication se
rencontrent. Les réplisomes sont alors dissociés de la chromatine par des mécanismes
encore inconnus. Cependant, dans des extraits de Xénope, il a été montré que MCM-BP
(nouveau facteur de liaison au MCM) participerait au déchargement des MCM 2-7 en fin de
phase S (Nishiyama, Frappier, et Méchali, 2011).
Des études, réalisées dans des extraits de Xénope et de levure S. Cerevisae, montrent
que l’ubiquitination du complexe CMG est requise pour la terminaison de la réplication. Chez
le Xénope, il a pu être montré que la poly-ubiquitination de Mcm7 sur la lysine K48 de
l’ubiquitine, précédait le désassemblage de l’hélicase active de la chromatine durant la
terminaison de la réplication. Ce désassemblage requiert l’action des protéines
p97/VCP/cdc48, en effet, l’expression de la forme inactive de p97 prolonge l’association de
l’hélicase réplicative sur la chromatine, et l’accumulation de la forme ubiquitinylée de MCM7
sur la chromatine (Moreno et al., 2014) . Ce mécanisme est conservé, et retrouvé chez la
levure S.Cerevisae. Les auteurs ont pu mettre en évidence, in vivo, l’ubiquitination de MCM7
par l’ubiquitine ligase SCFdia2 mène au désassemblage du complexe CMG de façon
dépendante de cdc48/p97. En effet, cdc48 est requis pour séparer le complexe CMG
ubiquitinylé en 3 parties. Une fois séparé du complexe GINs et de cdc45, MCM2-7 est moins
stable et donc déchargé de l’ADN nouvellement répliqué (Maric et al., 2014) .
25
Partie I : Introduction générale
26
Partie I : Introduction générale
Chapitre II : Le stress réplicatif : causes
et conséquences
La réplication fidèle de l’ADN est un challenge pour les cellules. L’avancée des ADN
polymérases réplicatives peut être perturbée ou compromise par la dérégulation de facteurs
de la réplication, ou par la présence d’obstacles de diverses natures (Fig 8).
La définition du stress réplicatif
se réfère à la situation, qui engendre le
ralentissement ou l’arrêt de la réplication, et donc le ralentissement ou à l’arrêt des
fourches de réplication (Gelot, Magdalou, et Lopez, 2015 ; Zeman et Cimprich, 2014).
En conséquence, le stress réplicatif peut mener à des effondrements de fourches de
réplication, provoquant de l’instabilité génétique. Le stress réplicatif est d’ailleurs retrouvé
dans les étapes précoces de la tumorigénèse (Gorgoulis et al., 2005 ; Bartkova et al., 2005 ;
Burrell et al., 2013 ; Flach et al., 2014).
Cependant, ces perturbations de la réplication sont prises en charge par des voies de
signalisation, comme la voie ATR/Chk1 ou les voies de tolérance des dommages. Ces
mécanismes préviennent l’instabilité génétique. Nous détaillerons ces mécanismes de
réponses dans le chapitre III.
27
Partie I : Introduction générale
I.
Les causes du stress réplicatif
A.
La dérégulation des facteurs de la réplication
De nombreux facteurs sont nécessaires pour une réplication correcte et fidèle. La variation
du pool de nucléotides, des modifications des composants de la machine de réplication, ou
encore des histones sont des sources du stress réplicatif (Fig 8).
Le pool de dNTPs est un facteur limitant de la réplication. La ribonucléotide diphosphate
réductase (RNR) qui transforme les ribonucléotides en déoxyribonucléotides (dNTP), est la
cible d’une drogue, l’hydroxy-urée (HU). La modulation du pool de dNTPs altère la
dynamique de la réplication
(Anglana et al., 2003) en ralentissant des fourches de
réplication, et une diminution du taux d’activation des origines de réplication (Poli et al.,
2012 ; Wilhelm et al., 2014). Il a été proposé que le nombre de fourches de réplication
actives dépende de la quantité limitante de dNTPs pour chaque cycle cellulaire (Petermann
et al., 2010). Cependant, la surexpression de la RNR protège contre le stress réplicatif. Dans
des cellules sur-exprimant la RNR, après traitement provoquant des lésions sur l’ADN, le taux
de progression des fourches de réplication est identique à celui de cellules sauvages non
traitées (Poli et al., 2012). Il est intéressant de noter que la modulation du pool de
nucléotides est retrouvée dans les étapes précoces de la tumorigenèse (Bester et al., 2011 ;
Gad et al., 2014) .
Le mauvais assemblage du complexe pré-RC peut être une source de stress réplicatif.
En effet, la dérégulation des protéines, cdc6, cdt1, ORC, et MCM, peut entraîner une reréplication, et générer du stress réplicatif. Un excès d’activation des origines de réplication
peut également être une source de stress réplicatif, notamment, par la consommation
excessive de certains de ces facteurs, comme RPA. Le pool de RPA devient alors limitant, les
nouveaux ADN simples brins générés ne peuvent pas être protégés par RPA, ce qui provoque
des cassures de l’ADN ou des effondrements de fourches de réplication. Cependant, ce
phénomène peut être inversé par la surexpression de RPA (Toledo et al., 2013). La
dérégulation des complexes CDK/cyclines peuvent promouvoir le stress réplicatif. Le
complexe CDK2/cycline E est requis por la transition G1/S. La surexpression de la cycline E
induit du stress réplicatif en dérégulant la progression du cycle celluliare, mais aussi en
28
Partie I : Introduction générale
perturbant la réplication. En effet, la surexpression de la cycline E aboutit à une
augmentation des origines activées. Les fourches de réplication seront ralenties à cause
d’une diminution du pool de dNTPS. Ce ralentissement pourrait être à l’origine de collision
avec la machinerie de transcription (Jones et al., 2013).
La réplication de l’ADN requiert une grande quantité d’histones. Les nucléosomes parentaux
sont dissociés en aval de la réplication et restaurés sur les brins filles avec des nouvelles
histones synthétisées (Groth et al., 2007 ; Alabert et Groth, 2012). Il a été montré que le
défaut
d’assemblage
des
nucléosomes
nouvellement
synthétisés
entraînait
un
ralentissement des fourches de réplication et inhibait le déchargement de PCNA sur la
chromatine (Mejlvang et al., 2014), faisant des nucléosome un régulateur de la réplication
et de la stabilité génétique. La courte privation en nucléosomes ralentit les fourches de
réplication, mais n’active pas les voies de réponses aux barrières de fourches et répriment la
formation d’ADN simple brin, ce qui permettrait de donner du temps à l’assemblage des
nucléosomes de rattraper la réplication. Cependant, la suppression persistante des
nucléosomes, peut mener à un stress réplicatif.
B.
Interférence entre la réplication et la transcription
La transcription et la réplication sont deux mécanismes ayant pour matrice l’ADN.
Chez les bactéries, les gènes fortement transcrits sont majoritairement transcrits dans le
même sens que la réplication afin d’éviter les collisions entre les deux machineries. Chez les
eucaryotes, le nombre important d’origine de réplication compliquent ce phénomène. Bien
qu’il existe une ségrégation spatiale et temporelle de ces deux mécanismes (Wei et al.,
1998), il arrive que la réplication et la transcription interfèrent, ce qui cause un stress
réplicatif (Aguilera et García-Muse, 2013).
Il a été proposé que ce stress réplicatif puisse être dû à la présence d’hybride
ADN/ARN, que l’on appelle des R-loops. Le brin d’ARN naissant peut se rehybrider, de façon
inappropriée, avec le brin d’ADN matrice, générant un hybride ADN/ARN et un ADN simple
brin. Ce triple brin d’acide nucléique interfère avec la réplication et cause de l’instabilité
génétique (pour revue (Aguilera et García-Muse, 2012)).
29
Partie I : Introduction générale
Il existe des voies pour éviter la collision avec la machinerie de transcription et pour
résoudre les R-loops. La convergence de la réplication et la transcription entraîne des
contraintes topologiques de l’ADN, qui sont résolues par l’action des topoisomérases 1 et 2.
La RNAse H est capable de digérée la portion ARN d’un hybride ADN/ARN (Huertas et
Aguilera, 2003) et l’hélicase Senataxine est capable de dérouler un hybride ADN/ARN (Alzu
et al., 2012). La perturbation de ces systèmes augmente la probabilité de collision et de
formation des R-loops, ce qui induit un blocage des ADN polymérases réplicatives et, par
conséquent une augmentation de l’instabilité génétique.
Une autre voie de réponse aux R-loops a été mise à jour récemment. Il a été montré qu’un
facteur appartenant la famille de la senataxine, aquarius, était requis pour la résolution des
R-loops. En effet, l’extinction d’aquarius entraîne une augmentation des dommages à l’ADN,
ainsi qu’une augmentation des R-Loops. Il a, également été montré, que la résolution de ces
R-Loops étaient dépendante de la réparation par excision de nucléotides couplé à la
transcription. En effet, la déplétion de l’endonucléase XPG, appartenant la voie du TC-NER
(Transcription coupled- Nucleotide Excision Repair), entraîne une augmentation des R-Loops.
Bien que cette réponse semble indépendante du blocage des fourches de réplication, Il est
possible qu’elle agisse directement au niveau du R-Loop de façon coordonnée avec la
réplication (Sollier et al., 2014).
Des dysfonctionnements du mécanisme d’épissage de l’ARN peuvent aussi être à l’origine de
collision entre la machinerie de transcription et la machinerie de la réplication (Zeman et
Cimprich, 2014).
C.
La réplication des ADN non-B
Depuis la découverte de la structure de l’ADN par Watson et Crick en 1953, il a été
démontré qu’il existait au moins 10 conformations de l’ADN, la forme majoritaire, l’ADN-B et
des conformations alternatives, que l’on appelle les ADN-non B. Ces conformations ne sont
pas faîtes au hasard, mais sont dépendantes de la séquence d’ADN. Ces ADN-non B affectent
la réplication de l’ADN et par conséquent la stabilité du génome.
30
Partie I : Introduction générale
Les ADN-non B se forment au niveau de séquences répétées, comme les séquences
répétées inversées, les répétitions en miroir, ou au niveau des répétitions directes. Les
séquences répétées composent environ 50% du génome (Mirkin et Mirkin, 2007).
Les séquences inversées sont des séquences où les bases équidistantes du point de
symétrie sont complémentaires. Elles forment des structures comme les épingles à cheveux
sur un brin d’ADN lors de la réplication, ou un cruciforme sur les brins d’ADN
complémentaires (Fig 9). Les répétitions en miroir consistent en une répétition
d’homopurine sur un et homopyridine sur l’autre. Elles sont capables de former des triples
hélices ou triplex. Si le troisième brin vient d’une autre hélice d’ADN, la triple hélice est dite
intermoléculaire, et s’il vient de la même hélice d’ADN, la triple hélice est dite
intramoléculaire, ou ADN-H (Fig 9). Les répétitions directes sont des répétitions
ininterrompues du même motif. Il existe trois types de séquences répétées :
-
Les répétitions d’un motif composé de 1 et 10 nucléotides sont appelées
microsatellites
-
Les répétitions d’un motif composé de 10 et 60 nucléotides sont appelées
minisatellites
-
Au-delà de 60 nucléotides, ces séquences ont pour nom ADN satellite est sont
retrouvées au niveau des centromères et télomères.
En fonction des nucléotides qui composent la répétition, l’ADN adopte des conformations
différentes. Les séquences riches en G sont capables de former des G4-quadruplex (G4). Ils
sont composés de plusieurs plateaux parallèles reliés par des ponts hydrogène entre les
guanines (Fig 9) (Zhao et al., 2010 ; Boyer et al., 2013) . Il existe aussi des séquences riches
en AT, qui forme un ADN flexible.
31
Partie I : Introduction générale
Les fourches de réplication ont des difficultés à progresser au niveau de ces ADN-non B. Les
régions les plus probables où se forment ces structures sont les télomères, les gènes
ribosomiques, les sites d’initiation de la transcription, et les origines de réplication. Les
fourches de réplication sont bloquées au niveau des G4, et nécessitent l’intervention
32
Partie I : Introduction générale
d’hélicases spécialisées pour les dérouler. Si le G4 n’est pas déroulé, la réplication sera
arrêtée (Usdin et Woodford, 1995) , et entrainera de l’instabilité génétique. Par exemple,
Werner est une hélicase qui intervient dans la réplication des G4 ou niveau des télomères
(Opresko et al., 2004). L’absence de cette hélicase provoque une maladie, le syndrome de
Werner, caractérisée par un vieillissement précoce et une propension à développer des
cancers mésenchymateux.
Cependant, la réplication de ces séquences est un défi pour la cellule. En effet, l’efficacité de
de polymérisation des ADN polymérases réplicatives est fortement diminuée en présence de
répétitions que ce soit in vitro ou in vivo (Kroutil et al., 1996 ; Tran, Gordenin, et Resnick,
1999). La fidélité de polδ et de polε est largement diminuée lors de la réplication de
séquences répétées microsatellites di-nucléotiques (Abdulovic et al., 2011). Les séquences
répétées sont à l’origine de nombreuses maladies neurodégénératives, comme la maladie de
Huntington, ou la dystrophie mytonique, pour laquelle on constate une expansion de triplet
(Brook et al., 1992). L’instabilité des microsatellites est retrouvée également, dans des
maladies, comme le syndrome de Lynch. Les patients, atteints de ce syndrome, développent
une prédisposition à des cancers, suite à une mutation dans les gènes du MMR, qui
provoquent d’incontrôlables insertions/délétions au niveau des microsatellites (Woerner et
al., 2005).
Il existe dans le génome des séquences dites fragiles, on les appelle les sites fragiles. Il existe
les sites fragiles rares présents dans 5% de la population, et les sites fragiles communs (CFS)
présents chez tous les individus. Les CFS sont des séquences sujettes aux cassures et aux
réarrangements, à cause de la grande flexibilité de leur séquence riche en AT. Mais, leur
capacité à former des ADN structurés est encore inconnue (Debatisse et al., 2012). La
réplication au travers de ces séquences est très perturbée. Il y a deux aspects à prendre en
compte : l’appauvrissement en origines de réplication et la progression des fourches de
réplication. L’appauvrissement en origine oblige la fourche de réplication à parcourir une
distance plus grande, augmentant la probabilité de rencontrer des structures secondaires,
ou autres dommages sur l’ADN. Les CFS sont également des sites de pause des ADN
polymérases (Boyer et al., 2013).
33
Partie I : Introduction générale
D.
Les lésions de l’ADN
Une des causes principales du stress réplicatif est la persistance de lésions qui
bloquent l’avancée des ADN polymérases réplicatives.
Les lésions oxydatives sont dues à la production d’espèces réactives oxygénées (ROS).
La mitochondrie est la source majeure de ROS dûe à la consommation d’oxygène, dans la
chaine respiratoire. Les ROS peuvent également avoir d’autres sources endogènes, comme
les réactions inflammatoires, le métabolisme du péroxysome ou le métabolisme du
cytochrome p450 (pour revue Zhou, Shao, et Spitz, 2014). De façon exogène, les ROS
peuvent être produits par les radiations (Girard et al., 2008). Dans des conditions normales,
la production de ROS est contrebalancée par la production d’anti-oxydant. On parle de stress
oxydatif quand la balance oxydant/anti-oxydant est déréglée, au profit de la production de
ROS. Cette dérégulation entraîne l’oxydation de l’ADN, des dNTPS libres, de l’ARN, des
protéines et des lipides. L’oxydation des lipides, par exemple, forment des liaisons interbrins ce qui bloque l’avancée des polymérases réplicatives.
La protéine MTH1 est une protéine connue pour convertir les dNTPs oxydés en dNTPs
non oxydés. Elle est retrouvée surexprimée dans de nombreux cancers, ce qui contribue à la
survie des cellules cancéreuses, en leur permettant d’incorporer des dNTPs non oxydés. Il a
été montré que des inhibiteurs de MTH1 provoquaient un stress réplicatif, à cause de
l’incorporation de dNTPs oxydés durant la réplication. Les inhibiteurs de MTH1 ont été
utilisés pour induire des dommages à l’ADN et induire l’apoptose de cellules (Gad et al.,
2014).
Les radiations dues aux UV-B ont un rôle prépondérant dans le cancer de la peau. Ils
vont induire des photoproduits, les dimères de pyrimidines (TT, TC, CC ou CT), qui vont
bloquer l’avancée des fourches de réplication.
Les radiations ionisantes interagissent directement avec l’ADN et forment des
cassures simples ou doubles brins (Tableau 2). Cependant, ces radiations peuvent aussi avoir
un effet indirect, par l’ionisation des molécules d’eau, formant des radicaux libre oxygénés,
qui vont générer des cassures simple ou doubles brins sur l’ADN.
34
Partie I : Introduction générale
Des agents chimiques peuvent également induire des dommages sur l’ADN. Par
exemple, les hydrocarbures polycycliques comme le benzo[a]pyrène, présents dans la fumée
de cigarette, réagissent avec l’ADN et engendrent des adduits de grandes tailles sur des
guanines. Dans le cadre de traitement par chimiothérapie, le cisplatine est utilisé, et crée des
liaisons inter et intra-brin avec l’ADN (Tableau 2).
Origines de l’agent
Exemples
Type de dommages
Environnement
Radiations ionisantes
Cassures simple/double brin
UV
Ponts inter/intra-brins
Hydrocarbures polycycliques Adduits de grandes tailles
Chimiothérapie
(benzopyrène)
sur l’ADN
Cisplatine
Ponts inter/intra-brins
Mitomycine C
Mono-adduits,
ponts inter/intra-brins, et
cassures simple brins
Agents alkylants
cyclophosphamide
Mono-adduit, ponts interbrins
Tableau 2 : Exemple de dommages induits par des agents exogènes
II.
Les conséquences du stress réplicatif
Des perturbations durant la réplication de l’ADN engendre du stress réplicatif. La
première conséquence est l’activation du point de contrôle de phase S, qui va permettre la
stabilisation et le redémarrage des fourches de réplication. Parfois, la fourche de réplication
ne redémarre pas si les dommages persistent, ce qui a des conséquences sur les autres
phases du cycle cellulaire, notamment en mitose. En effet, des régions du génome
incomplètement répliquées peuvent se retrouver en mitose, conduire à la formation de
ponts anaphasiques et à des défauts de ségrégation des chromosomes (Fig 10). Il en existe
deux sortes de ponts anaphasiques: les ponts détectés par des intercalants de l’ADN comme
35
Partie I : Introduction générale
le DAPI, et les ponts détectés à l’aide de RPA, les ponts anaphasiques ultra-fins. Les ponts
anaphasiques ultra-fins sont retrouvés au niveau des sites fragiles communs, des
centromères et de télomères (Liu et al., 2014). D’ailleurs, l’induction de cassures par Mus81Eme1, ERCC1, et SLX4 au niveau des CFS prévient la formation de ponts anaphasiques ultrafins (Naim et al., 2013 ; Guervilly et al., 2015). Les protéines appartenant à la voie de
l’anémie de Fanconi participent à la résolution de ces ponts anaphasiques (Naim et Rosselli,
2009). La non résolution des ponts anaphasiques peut entraîner des cassures de l’ADN et la
formation de micro-noyaux en fin de mitose. Les micro-noyaux sont des corps
extranucléaires, résultant d’une ségrégation asymétrique des chromosomes enveloppés par
leur propre enveloppe nucléaire. L’augmentation du nombre de micro-noyaux est observée
quand les ponts anaphasiques ne sont pas résolus et ils peuvent persister durant plusieurs
cycles cellulaires. Il est proposé que les micro-noyaux soient à l’origine des chromothripsis,
un phénomène où des milliers de gènes sont réarrangés durant un cycle cellulaire et dans
une région donnée, il est retrouvé dans des cancers et des maladies congénitales.
Deux études récentes ont montré que les cassures issues de la non-résolution des
ponts anaphasiques sont transmises aux cellules filles, et sont séquestrées en G1 dans de
gros foyers contenant par la protéine 53BP1, un suppresseur de tumeur, et des protéines de
dommages à l’ADN comme γH2AX, ou des facteurs de la réparation, ce qui fait des foyers
53BP1 un témoin de l’instabilité génétique. Il est à noter que la quantité de foyers 53BP1
augmente après induction d’un stress réplicatif (Lukas et al., 2011 ; Harrigan et al., 2011)
L’instabilité chromosomique (CIN) est retrouvée dans certains cancers solides. Une étude
montre que les cancers CIN+ sont associés à la présence de cassures double brins (signalées
par la phosphorylation de l’histone H2AX), à l’augmentation des foyers 53BP1, et à
l’augmentation de ponts anaphasiques ultra-fins. Ils ont également montré que l’induction
de stress dans une lignée cellulaire issue de cancers CIN- entraînait la présence de ponts
ultra-fins, et de chromosomes dicentriques. Par des expériences d’hybridation génomique
comparative, ils ont pu voir que 80% des cancers CIN+ perdaient l’hétérozygotie du
chromosome 18q, qui code pour des gènes répresseurs de stress réplicatif (Burrell et al.,
2013), ce qui provoque l’apparition d’instabilité chromosomique dans les cancers. Ces
travaux mettent en évidence que le stress réplicatif est une cause des CIN.
36
Partie I : Introduction générale
Figure 10 : Le stress réplicatif et ses conséquences
Le stress réplicatif de nature endogène ou exogène peut mener à la persistance de
régions d’ADN mal répliquées ou mal décaténées, provoquant la formation de ponts
anaphasiques au moment de la ségrégation des chromosomes. Ces ponts ou les cassures
générées seront pris en charge par les foyers 53BP1, ou aboutiront à la formation de
micro-noyaux, ou à de l’aneuploïdie.
(Adapté de Gelot et al, 2015)
37
Partie I : Introduction générale
Les tissus pré-cancéreux, nommés tissus hyperplasiques et tissus dysplasiques, évoluent en
tissu cancéreux. Les stades pré-cancéreux se distinguent par une hyperprolifération des
cellules cancéreuses. Une accumulation de cassures doubles brins ont été trouvées dans ces
tissus précancéreux, signalées par la phosphorylation de H2AX, et par
l’activation de
protéines de réponses aux cassures doubles brins comme Chk2, ATM ou p53 (Gorgoulis et
al., 2005). La protéine p53 est retrouvée dérégulée dans un grand nombre de cancers. Cette
dérégulation permet aux cellules cancéreuses de contourner les voies de réponses aux
dommages à l’ADN, et ainsi continuer leur prolifération. Ces manifestations d’instabilité
génétique ont lieu dans des cellules hyperprolifératives, où le génome est dupliqué
intensément. Le modèle propose que la surexpression de la cycline E entraîne la génération
de stress réplicatif, et provoque des cassures doubles brins, entraînant, à son tour, une perte
d’hétérozygotie en sélectionnant la perte ou la mutation de p53, ou d’autres protéines
intervenant dans la réponse aux dommages (Fig 11) (Bartkova et al., 2005). Le stress
réplicatif serait donc antérieur à la perte ou la mutation de p53 dans les étapes précoces de
la cancérogénèse.
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont les cellules progénitrices des
cellules sanguines. Leur activité décline au cours du temps et la production du sang s’en
trouve perturbée. Les raisons pour lesquelles la fonction des CSH décline avec l’âge sont
encore inconnues. Cependant, les CSH humaines et murines accumulent du signal γH2AX
avec l’âge, suggérant que le déclin de l’activité pourrait être dû au stress réplicatif. Flach et
collaborateurs ont montré qu’effectivement les CSH âgées accumulaient γH2AX, sans que les
voies de réponses aux dommages à l’ADN ne soient altérées. Dans ces mêmes cellules, ils
ont observé une accumulation de RPA et d’ATRIP (protéine du point de contrôle de phase S
décrit dans la partie II), suggérant que le signal γH2AX pourrait venir d’un stress réplicatif. En
comparant l’expression des gènes entre les CSH âgées et les progéniteurs de macrophages,
ils ont observé une dérégulation négative de tous les gènes MCM, laissant penser que la
mise en place d’origines de réplication non fonctionnelles dans les CSH âgées génèrerait du
stress réplicatif. De façon intéressante, des CSH jeunes traitées pendant 36h avec de
l’aphidicoline, un inhibiteur des ADN polymérases réplicatives, et greffés sur des souris
montrent un défaut de reconstitution de moelle osseuse, et le nombre de cellules greffées
est significativement réduit au même niveau que les CSH âgées traitées ou non. Les CSH
38
Partie I : Introduction générale
jeunes ayant subies un stress réplicatif voient leur activité sérieusement impactée de façon
équivalente à des CSH âgées. Le stress réplicatif, dû au déficit de MCM, pourrait donc être le
moteur du déclin des CSH au cours du temps (Flach et al., 2014) .
39
Partie I : Introduction générale
40
Partie I : Introduction générale
Chapitre III : Les réponses cellulaires au
stress réplicatif
La réplication de l’ADN est une étape cruciale nécessitant une surveillance accrue.
Comme nous avons pu le voir, la réplication de l’ADN est fréquemment ralentie ou stoppée
par la présence de barrière de fourche, générant du stress réplicatif. La cellule a mis en place
des réponses à ces blocages de fourches. Parmi les différentes réponses, nous nous
concentrerons plus particulièrement, sur l’activation de la voie ATR/Chk1, ainsi que sur les
mécanismes de tolérance des dommages.
I.
Activation du checkpoint de phase S
Le stress réplicatif qui résulte d’un ralentissement ou d’un blocage des fourches de
réplication se traduit par l’apparition de longues séquences d’ADN simple brin (ADNsb) dû
par exemple au découplage entre les ADN polymérases de la fourche et le complexe hélicase
MCM. Il s’ensuit l’activation d’une voie de signalisation, la voie ATR/Chk1 (Checkpoint de
phase S), un garant de la stabilité génétique (Zhou et Elledge, 2000) (Fig 12). En effet, son
activation va permettre la stabilisation du réplisome, la réparation, et le redémarrage des
fourches bloquées (Nam et Cortez, 2011) . L’activation de la voie nécessite un enchainement
d’évènement complexe et fait intervenir un grand nombre de protéines. Son inactivation
entraîne un effondrement des fourches de réplication, la formation de cassures double brin
de l’ADN et de l’instabilité génétique qui favorise la progression tumorale.
41
Partie I : Introduction générale
Figure 12: L’activation de la voie ATR/Chk1
Le blocage de la fourche de réplication suite à une barrière de fourche endogène ou exogène,
aboutit à un découplage entre les hélicases et les polymérases, générant de l’ADNsb. Cet ADNsb
est recouvert par la protéine RPA. Il y a ensuite recrutement du complexe ATR/ATRIP à la
chromatine. Le complexe 9-1-1/ TopBP1 sont à leur tour chargés sur la fourche bloquée. Les
protéines Timeless, Tipin et Claspine sont aussi nécessaires pour la pleine activation d’ATR, qui
aboutit à la phosphorylation de Chk1. L’activation de la voie ATR/CHK1 va permettre notamment
la stabilisation de la fourche bloquée, l’arrêt du cycle cellulaire, et le redémarrage des fourches.
Adapté de (Ciccia et Elledge, 2010)
42
Partie I : Introduction générale
A.
L’activation d’ATR aux fourches bloquées
L’activation de la voie ATR/Chk1 passe par l’activation d’ATR (ATM et Rad3 related),
la kinase majeure de la voie. ATR est une kinase appartenant à la famille des phosphoinoside
3 Kinase (PI3K), et porte une activité sérine/thréonine kinase. Par son rôle durant la phase S,
ATR est une kinase essentielle, d’ailleurs les souris ATR « knock out » (KO) présente une
létalité embryonnaire (Brown et Baltimore, 2000). Il a été observé que des mutations
hétérozygotes ou hypomorphiques dans le gène d’ATR étaient à l’origine d’une maladie, le
syndrome de Seckel, caractérisé par un retard mental et une microcéphalie (O’Driscoll et al.,
2003). Un modèle de souris reproduisant ce syndrome (souris ATRˢ́ˢ) récapitule les
symptômes humains et les auteurs suggèrent que l’origine de ce phénotype serait due à un
stress réplicatif embryonnaire accru (Murga et al., 2009).
1.
Le complexe ATR/ATRIP/ADNsb
L’activation d’ATR dans le checkpoint de phase S passe par son recrutement sur
l’ADNsb, via son interaction avec son co-facteur ATRIP (ATR Interacting Protein) et RPA
(Costanzo et al., 2004 ; Zou, Liu, et Elledge, 2011). L’association entre ATR et ATRIP est
requise, mais n’est pas régulée. Il a été montré qu’ATRIP se lie avec l’ADNsb, et permet le
recrutement d’ATR au niveau des fourches bloquées (Ball, 2005). ATR et ATRIP co-localisent
avec les foyers de dommages de l’ADN. La déplétion de RPA par siARN empêche la formation
de ces foyers (Dart et al., 2004). Cependant, il a récemment été montré, dans extraits
d’œufs de Xénope, que le recrutement en excès de RPA est dispensable pour l’activation de
la voie ATR/Chk1, mais que la présence d’ADNsb est indispensable pour l’activation du
checkpoint de phase S (Recolin, Van der Laan, et Maiorano, 2012). Ces résultats sont
concomitants avec une étude réalisée dans des cellules humaines, où la déplétion de RPA
par siRNA n’a pas d’impact sur l’activation du checkpoint (Dodson, Shi, et Tibbetts, 2004).
De plus, l’expression dans les cellules d’un mutant d’ATRIP qui empêche l’interaction avec
RPA n’altère pas l’activation de la voie ATR/Chk1 (Ball, 2005). Ces observations suggèrent
qu’il existerait d’autres protéines de liaison à l’ADN encore méconnues, et qui permettraient
de protéger l’ADNsb.
43
Partie I : Introduction générale
Trois médiateurs additionnels interviennent dans la signalisation du checkpoint de
phase S, Timeless, son co-facteur Tipin (Timeless-Interacting Protein), et claspine (UnsalKaçmaz et al., 2005). Il a été montré que ce complexe est nécessaire pour la phosphorylation
de Chk1 par ATR, en réponse aux UV, et au traitement par l’Hydroxyurée (Yoshizawa-Sugata
et Masai, 2007 ; Unsal-Kaçmaz et al., 2007). Le complexe timeless/Tipin s’associe avec RPA,
via Tipin, ce qui permet la stabilisation de claspine, et la pleine phosphorylation de Chk1 par
ATR (Kemp et al., 2010).
2.
L’hétérotrimère 9-1-1 et TopBP1
L’interaction entre ATR, ATRIP et l’ADNsb est requise pour l’activation d’ATR, mais
elle n’est pas suffisante. Elle nécessite le recrutement indépendant du complexe 9-1-1,
composé des protéines Rad9-Hus1-Rad1. Cet hétérotrimère possède une structure
comparable à celle de PCNA. Il est chargé à la chromatine de la même manière que PCNA,
grâce à un complexe RFC alternatif où la plus large sous-unité RFC1 est remplacée par Rad17
(Ellison et Stillman, 2003 ; Bermudez et al., 2003). Une étude récente portant sur la queue Cterminale (C-tail) de Rad9 montre que sa délétion augmente le recrutement du 9-1-1 à la
chromatine, indépendamment de Rad17. De plus, ils mettent en évidence 15 acides aminés
requis pour l’interaction entre la C-tail de Rad9 et la structure du 9-1-1 (CRS Core Ring
Structure). Les auteurs de cette étude proposent que la C-Tail permette de masquer un site
intrinsèque de liaison à l’ADN (Takeishi et al., 2015)
L’activation d’ATR nécessite une synthèse d’ADN au niveau des fourches bloquées. En
effet, il avait été montré qu’une synthèse d’amorce d’ARN par pol Alpha était requise pour
une pleine activation du checkpoint de phase S (Michael, 2000). Plus récemment, par des
expériences de réplication in vitro dans des extrait d’œufs de Xénope après traitement avec
des faibles doses d’aphidicoline (drogue qui inhibe les ADN polymérases réplicatives mais
qui, à faible dose, les ralentit et permet d’activer le checkpoint sans induire de dommages),
une accumulation d’ADN naissants a été observé. Le complexe 9-1-1 se lie à l’ADN en 5’ de la
jonction ADN simple brin/ADN double brin (Ellison et Stillman, 2003). De plus, l’inhibition de
pol Delta entraine une diminution de cette synthèse et un défaut d’activation du checkpoint
(Van et al., 2010). Nous montrons dans la partie résultat que la polymérase spécialisée pol
Kappa est aussi requise pour la synthèse de brins naissants nécessaires au recrutement du
44
Partie I : Introduction générale
complexe 9-1-1 et donc à l’activation de Chk1 (Bétous et al., 2013). Ce papier sera discuté et
détaillé dans la partie « résultats ».
L’activation d’ATR nécessite le chargement de la protéine TopBP1 (Topoisomérase
Binding Protein I) (Hashimoto et al., 2006 ; Parrilla-Castellar et Karnitz, 2003). Cette protéine
interagit avec la C-Tail phosphorylée sur la sérine 387 de Rad9, qui crée un site de
reconnaissance pour les domaines BRCT (BRCA1 C Terminus) I et II de TopBP1 en N-terminal
(Delacroix et al., 2007). TopBP1 possède un domaine activateur d’ATR situé dans entre ces
domaines BRCT VI et VII en C-terminal, qui permet son interaction in vitro avec le complexe
ATRIP/ATR (Kumagai et al., 2005). La surexpression de ce domaine conduit à l’activation
d’ATR, et la fusion de ce domaine avec PCNA ou H2B s’affranchit de Rad17 ou du 9-1-1 pour
l’activation d’ATR (Delacroix et al., 2007). Le site de liaison de TopBP1 sur le complexe
ATR/ATRIP est porté par ATRIP et la mutation de ce site bloque l’activation du complexe.
L’activation du complexe ATR/ATRIP requiert un domaine porté par ATR, le domaine PRD
(PIKK Interacting Domain) dont la mutation n’affecte pas l’activité basale d’ATR, mais
prévient son activation par TopBP1, ce qui conduit à des défauts similaires à ceux induits par
la perte complète d’ATR (Mordes et al., 2008).
Récemment, une nouvelle protéine interagissant avec le 9-1-1 et TopBP1 a été mise à
jour. Dans des cellules U2OS (cellules ostéosarcomes humaines), les auteurs ont déplété des
protéines par siRNA et réalisé une étude à grande échelle basée sur la microscopie. Après
transfection des cellules, ils les ont traitées par irradiation (10Gy) et analysé l’entrée des
cellules mitose 18h après traitement. Grâce à cette étude, ils ont pu mettre en évidence une
nouvelle protéine RHINO (Rad9-Rad1 Hus1 Interacting Nuclear Orphan) (Cotta-Ramusino et
al., 2011). La déplétion de RHINO sensibilise les cellules aux traitements par irradiations,
camptothécine (drogue qui lie la topoisomérase I avec l’ADN se façon irréversible), et aux
MMS (Lindsey-Boltz et al., 2015). Une étude par spectrométrie de masse, confirmée ensuite
par immunoprécipitation montre une interaction entre RHINO et le complexe 9-1-1. La
relocalisation de RHINO sous forme de foyer après irradiation dépend de la présence du
complexe 9-1-1 (Cotta-Ramusino et al., 2011). Il a également été montré, par
immunoprécipitation l’interaction entre TopBP1 et RHINO sous stress réplicatif (CottaRamusino et al., 2011 ; Lindsey-Boltz et al., 2015). Cependant, l’absence de RHINO
n’empêche pas l’interaction entre TopBP1 et le complexe 9-1-1, les auteurs suggèrent que
45
Partie I : Introduction générale
RHINO n’est pas indispensable à l’activation du checkpoint, et qu’en son absence une autre
protéine puisse prendre sa place (Lindsey-Boltz et al., 2015).
B.
Chk1 : effecteur du checkpoint de phase S
Chk1, une sérine-thréonine kinase, est le principal effecteur du checkpoint de phase
S. Cette protéine régule la progression de la phase S en présence ou non de stress réplicatif,
via ces différentes fonctions, dans la régulation de l’initiation de la réplication, la tolérance
des lésions, la signalisation de l’apoptose, ou en mitose.
Tout comme ATR, sa délétion induit une létalité embryonnaire précoce (Liu et al.,
2000). Par ailleurs, les cellules épithéliales mammaires de souris hétérozygotes pour Chk1
passent en mitose avant que tout le génome ne soit répliqué et présentent une forte
instabilité génétique (Lam et al., 2004)
1.
La localisation de Chk1
Chk1 fait constamment la navette entre le cytoplasme et le noyau, même si elle est
majoritairement nucléaire. Le domaine C-terminal de Chk1 est requis pour son
import/export nucléaire. Deux motifs très conservés, CM1 et CM2, ont été montré comme
étant les motifs d’export nucléaire (NES : Nuclear Export Signal) et de localisation nucléaire
(NLS : Nuclear Localisation Sequence) respectivement. La mutation ponctuelle du domaine
CM1 entraîne une accumulation nucléaire de Chk1. L’export nucléaire de Chk1 serait
dépendant de crm1 (Chromosomal Maintenance 1), une protéine d’export nucléaire qui lie
les séquences NES riches en leucine (Wang et al., 2012) .
Il a également été montré que la phosphorylation de Chk1 sur la sérine 280
entrainait sa relocalisation dans le noyau. Cette phosphorylation, requise pour activation
efficace de Chk1 après irradiations par les UV, est réalisée par la kinase 90kDa ribosomale S6
kinase (p90RSK). L’accumulation de Chk1 dans le noyau précède son activation par ATR (Li et
al., 2012) .
46
Partie I : Introduction générale
Chk1 est phosphorylé par ATR sur les sérines 345 et 317. La phosphorylation de Chk1
sur la serine 345 est essentielle pour la signalisation du checkpoint de phase S. La
phosphorylation de la sérine 317 semble être un pré-requis pour la phosphorylation de la
serine 345. La phosphorylation de Chk1 par ATR rend compte de son activation (Walker et
al., 2009) . Cependant, ATR a peu d’affinité pour la protéine Chk1 seule. Après stress
réplicatif, la protéine claspine est phosphorylée dans le domaine de liaison à Chk1 par la
caséine kinase 1γ1, ce qui permet l’interaction entre claspine et Chk1. Cette association
promeut la phosphorylation de Chk1 par ATR, et par conséquent son activité. D’ailleurs
l’absence de claspine entraîne un défaut de phosphorylation de Chk1, et par conséquent un
checkpoint inactif (Mailand et al., 2006 ; Kumagai et Dunphy, 2000). 20% du pool de Chk1
total est lié à la chromatine mais la phosphorylation des sérines 317 et 345 par ATR entraîne
une dissociation entre Chk1 et la chromatine, son relargage dans le nucléoplasme où elle
s’auto-phosphoryle sur la serine 296, il s’ensuit alors la déphosphorylation des sérines 317 et
345. Cette phosphorylation sur la sérine 296 est reconnue par l’isoforme γ de la protéine 143-3, protéine participant à la voie de régulation de la progression du cycle cellulaire et au
checkpoint de dommages à l’ADN. Cette liaison entre Chk1 et γ14-3-3 est requise pour
l’inactivation de cdk2, ce qui permet l’arrêt du cycle cellulaire (Kasahara et al., 2010).
Il a également été montré que Chk1 pouvait être recruté au niveau des sites de
dommages grâce à sa PARylation (Poly(ADP)-ribosylation. Cette modification posttraductionnelle est catalysée par la famille des PARP. En effet, PARP1 est capable d’ajouter
une longue chaine de PAR à Chk1, qui sera recruté aux sites de dommages indépendamment
de claspine ou ATR (Min et al., 2013).
47
Partie I : Introduction générale
2.
Les fonctions de Chk1
Figure 13 : Chk1 et la réplication de l’ADN
Chk1 inhibe les origines de réplication en empêchant le chargement de cdc45 sur la
chromatine. Après stress réplicatif, Chk1 prévient l’activation de cdk2, mais aussi
inactive cdc7. Chk1 empêche l’interaction entre topBP1 et treslin, ce qui aboutit au
non chargement du complex CMG au niveau des origines de réplication. Adapté de
(González Besteiro et Gottifredi, 2015).
a)
Régulation des origines de réplication
Après stress réplicatif, Chk1 a pour rôle de signaler l’arrêt des fourches à l’ensemble
du noyau. Pour cela, elle phosphoryle différents substrats (Blasius et al., 2011). Les cibles
clés de Chk1 sont les phosphatases cdc25 (A, B, et C) (Sanchez et al., 1997 (Fig13)). Leur
48
Partie I : Introduction générale
phosphorylation par Chk1 provoque leur inactivation et leur dégradation par le protéasome.
La phosphorylation de cdc25A par Chk1 entraîne son ubiquitination par SCFᵝᵀʳᶜᴾ
(Skip1/Cullin/Fbox proteinᵝᵀʳᶜᴾ), une E3 ubiquitine ligase, et par la suite, sa dégradation
(Mailand et al., 2006 ; Busino et al., 2003). La dégradation de cdc25A inhibe l’activité de la
cycline cdk2, ce qui arrête le cycle cellulaire, et empêche l’activation des origines de
réplication.
Comme expliqué dans la première partie de l’introduction, les origines de réplication
ne sont pas toutes activées au même moment, il est d’ailleurs dit que des origines
adjacentes ont tendance à s’initier en même temps, formant un « cluster » (un groupe). Ces
clusters sont entourés par des origines dormantes, qui restent normalement inactives, mais
peuvent être activées en cas de stress réplicatif, afin de compléter la réplication. Chez le
Xénope, après stress réplicatif, Chk1 est requis pour inhiber les origines de réplication en
dehors du cluster déjà activé. L’absence de Chk1 provoque une augmentation de la densité
de fourches, mais la distance entre les origines ne diminuent pas significativement, ce qui
veut dire qu’il n’y a pas de nouvelle activation d’origine à l’intérieur du cluster. La
surexpression de Chk1, lors de la réplication non perturbée, provoque une inhibition des
clusters d’origines de réplication. Le contrôle de l’activation des origines de requiert Chk1,
néanmoins la régulation de Chk1 doit être extrêmement fine (Platel et al., 2015). La sousexpression de Chk1, sans stress réplicatif, entraîne lui aussi une augmentation aberrante de
l’activation des origines de réplication, ce qui engendre du stress réplicatif, et des cassures
doubles brins (Syljuåsen, Sørensen, et Hansen, 2005).
L’inactivation de cdk2 empêche l’activation des origines de réplication, car cdk2 est
responsable du chargement de cdc45, facteur participant à la formation du pré-IC (Cf partie
I.A.1) pour le rendre actif. Il a été montré qu’à faible dose d’UV ou de benzo[a]pyrène
(BPDE), cdc45 n’est plus chargé sur la chromatine indépendamment de la dégradation de
cdc25A ou de l’inactivation de cdk2, mais toujours dépendante de Chk1. La régulation de
l’activation des origines de réplication par Chk1 pourrait passer par des voies alternatives,
quand la quantité de Chk1 phosphorylée n’est pas suffisante pour induire la dégradation de
cdc25A (Liu et al., 2006).
49
Partie I : Introduction générale
Récemment, il a été montré que la reconnaissance de cdc45 et de GINs au niveau des
MCM, dépendaient du chargement de TopBP1 et de sa protéine de liaison treslin. Chk1
phosphoryle treslin dans sa région C-terminale, ce qui inhibe le chargement de cdc45 au
niveau des origines de réplication et donc limite l’activation des origines. La dérégulation de
l’interaction treslin/Chk1 entraîne une augmentation des origines actives. Cette étude
montre que Chk1 durant la phase S non perturbée peut réguler l’activation des origines de
réplication, via son action sur Treslin (Guo et al., 2015).
b)
Rôle dans la tolérance des lésions à l’ADN
La tolérance des dommages peut être médiée par la synthèse translésionnelle. Elle
est effectuée par des ADN polymérases spécialisées dites translésionnelles. Certaines de ces
polymérases appartiennent à la famille Y des ADN polymérases (pol Kappa, pol Eta, pol Iota,
et Rev1) mais aussi l’ADN polymérase Zeta de la famille B est capable de réaliser la TLS, ce
mécanisme sera évoqué plus tard dans ce chapitre.
La monoubiquitination de PCNA est une voie de recrutement des polymérases
specialisées à la chromatine. La monubiquitination de PCNA dépend de l’activité E3 ligase de
Rad18. Le recrutement à la chromatine de Rad18 et de pol Eta, après traitement cisplatine
ou HU, est promu par ATR et Chk1. De plus, une étude a montré que l’absence de Chk1
entraînait un défaut d’ubiquitination de PCNA, après UV. En effet, Chk1 serait capable de
stabiliser claspine indépendamment d’ATR, ce qui permet à claspine de recruter Rad18 à la
chromatine, et permet la mono-ubiquitination de PCNA (Yang et al., 2008). Il a également
été montré que Chk1 est requis pour la phosphorylation d’APC/Cᶜᵈʰ¹, qui aboutit au
recrutement de Dbf4/cdc7, suivi du recrutement de Rad18 (Yamada, Watanabe, et Mistrik,
2013).
En 2012, une étude a montré que la déplétion de Chk1 dans les cellules affectait la
relocalisation de pol Eta en foyer après irradiations aux UV. Ils ont, également, observé un
ralentissement des fourches de réplication après UV en l’absence de Chk1, mais ce
ralentissement était indépendant de l’activité kinase de Chk1et de claspine. Par contre, le
mutant du domaine d’interaction à PCNA et le mutant qui ne peut pas être relargué dans le
50
Partie I : Introduction générale
nucléoplasme agissent comme des dominants négatifs, ce qui suggère que le domaine
d’interaction à PCNA, et le déchargement rapide de Chk1 de la chromatine sont nécessaires
pour la relocalisation de pol Eta après un traitement génotoxique. Pol Eta a été montré
comme étant requise pour agir au niveau des fourches bloquées pour la reprise de la
réplication, ce qui prévient l’activation du checkpoint de phase S après traitement à faible
dose d’UV. Cependant, en l’absence de pol Eta, après traitement à faibles d’UV, Chk1
devient essentielle pour la reprise de la réplication, grâce à des voies alternatives comme la
recombinaison homologue (Despras et al., 2010).
c)
Rôle en mitose et à la transition en G2/M
En réponse aux dommages de l’ADN, Chk1 est capable de phosphoryler la
phosphatase cdc25c. Cette phosphorylation aboutit à l'inactivation de cdc2 (Cdk1), ce qui
inhibe le passage en mitose (Sanchez et al., 1997 ; Furnari, Rhind, et Russell, 1997) . La
phosphorylation de cdc25c par Chk1 se fait sur la sérine 216, ce qui crée une attache pour la
protéine 14-3-3, protéine contrôlant le cycle cellulaire et le checkpoint en réponse aux
dommages de l’ADN. Cette liaison entre cdc25c et 14-3-3 entraîne l’export nucléaire de
cdc25c aboutissant à une inactivation de cdk1 (Kumagai et al., 1998 ; Kasahara et al., 2010) .
D’autre part, Chk1 peut phosphoryler et activer Wee1, kinase responsable de la
phosphorylation inhibitrice sur cdk1, et donc entrainer l’inhibition de la transition G2/M via
l’inactivation de cdk1 (O’Connell et al., 1997) . En 2009, une étude a montré un rétrocontrôle de Chk1 par cdk1. En effet, à la transition G2/M, Chk1 est phosphorylé par cdk1 sur
les sérines 30 et 280, permettant son export vers le cytoplasme, et la pleine activation de
cdk1/cycline B (Enomoto et al., 2009) .
En plus de son rôle dans la transition G2/M, Chk1 joue un rôle dans l’activation du
point de contrôle du fuseau mitotique (Spindle Checkpoint). Ce point de contrôle nécessite
le recrutement des protéines Mad, dont BubR1, un inhibiteur de l’initiation de l’anaphase.
BubR1 est localisé au niveau des kinétochores. Il a été observé que Chk1 se localise au
niveau des kinétochores, et que Chk1 est requis pour augmenter l’activité d’AuroraB,
responsable du recrutement de BubR1. En conséquence, les cellules déficientes en Chk1 ne
peuvent pas activer le point de contrôle du fuseau mitotique, ce qui entraîne de l’instabilité
chromosomique (Zachos et al., 2007) .
51
Partie I : Introduction générale
d)
Rôle dans la prévention des cassures doubles brins
Lorsque les fourches bloquées ne sont pas prises en charge, elles peuvent s’effondrer
et mener à des cassures doubles brins de l’ADN. Chk1 prévient la formation de cassures
doubles brins de l’ADN, en inhibant des nucléases dont Mus81 qui coupent l’ADN au niveau
des fourches bloquées (Forment et al., 2011) Cependant si la formation de cassures ne peut
pas être évitée, Chk1 promeut la réparation par recombinaison homologue.
En effet, Chk1 phosphoryle Rad51 et BRCA2, effecteurs de la voie, ce qui stimule le
recrutement de Rad51 aux sites de dommages (Sørensen, Hansen, et Dziegielewski, 2005)
3.
La régulation de Chk1
Après un stress réplicatif, une diminution de niveau de ChK1 est observée dans des
lignées cellulaires humaines, laissant penser qu’il existe une régulation post-traductionnelle
de Chk1. L’inhibition pharmacologique du protéasome par la drogue MG132 provoque une
accumulation de Chk1 dans des cellules normales, suggérant sa constante dégradation
(Zhang et al., 2005) . Dans cette même étude, il a été montré que Chk1 peut être régulé par
ubiquitination médiée par les cullines RING-E3 ligases (CRL) Cul1 et Cul4. Cette
ubiquitination pourrait être réalisée dans la région C-terminale « degron-like » de Chk1
(Zhang et al., 2005) et notamment sur la lysine 436 bien que d’autres lysines pourraient aussi
être impliquées dans ce processus (Zhang et al., 2009). Les facteurs FBX6 (F box protein X6)
et CDT2 permettent le recrutement de Chk1 au CRL1 et CRL4 respectivement (Zhang et al.,
2009). De façon intéressante, il a été montré que l’ubiquitination de Chk1 par le CRL1 prend
place dans le cytoplasme, alors que l’ubiquitination médiée par CRL4 a lieu dans le
nucléoplasme (Huh et Piwnica-Worms, 2013) .
52
Partie I : Introduction générale
Substrat
DDR
& checkpoint
Réparation
Expression des
gènes & mort
cellulaire
cdc25 A
site de
phosphorylation
Régulation du substrat
cdc25B
cdc25C
S76/123
T507
S230/563
S216
p53
14-3-3γ
Nek 11
Wee1
S20
S367
S273
S549
Tlk
Kap1
S695
S473
Chk1
S296
Dégradation
Liaison à 14-3-3
Réduction de l'activité
Localisation
cytoplasmique
Stabilisation
Stabilisation de p53
Phosphorylation cdc25A
Liaison à 14-3-3, CdKI
pY15
Assemblage chromatine
Liaison à
l'hétérochromatine
Autophosphorylation
AuroraB
S331
Activation Aurora B
Rad51
T309
A éclaircir
BLM
S646
Stabilisation
FancE
T346/S374
Dégradation
FancD2
S331
Mono-ubiquitination
Metnase
S495
Liaison à l'ADN
p73
H3
S473
T11
Trans-activation
recrutement GCN5
p53
S366/T387
Acétylation réduite
p65
T505
A éclaircir
p50
S329
ING1b
p57
S126
S19
Inhibition de la liaison à
l'ADN
Stabilisation
A éclaircir
p21
T140/S141
A éclaircir
Fonction
Arrêt phase S
Arrêt G2 & S
Arrêt G2/M
Arrêt G2/M
Arrêt G1/S ou G2/M
Arrêt G1/S par UV
Dégradation cdc25A
Arrêt G2/M
Checkpoint phase S
A éclaircir
Marqueur de
checkpoint
Attachement
kinétochores
Recombinaison
homologue
Réparation des
dommages
Réparation des
dommages
Réparation des
dommages
Réparation des
dommages
Transcription
Répression
transcription
Répression
transcription
Répression
transcription
Répression
transcription
CycB1 transcription
Prévenir la
différenciation
Prévenir la
différenciation
Tableau 3: Les cibles de Chk1
Tableau représentant les cibles de Chk1, leur site de phosphorylation, et la fonction de cette
(Zhang
et Hunter,
2014)médiée par son ubiquitination requiert la
Ilphosphorylation
est à noter que la
dégradation
de Chk1
53
Partie I : Introduction générale
Il est à noter que la dégradation de Chk1 médiée par son ubiquitination requiert la
phosphorylation de Chk1 par ATR sur la sérine 345 mais pas sur la sérine 317 (Zhang et al.,
2009 ; Huh et Piwnica-Worms, 2013). Il a été proposé que la phosphorylation de Chk1 sur la
sérine 345, lui permette de passer d’une conformation fermée, à une conformation ouverte,
libérant l’extrémité C-terminale nécessaire pour son ubiquitination. Par ailleurs, une
augmentation du taux de « turnover » de la protéine est observée avec un mutant
constitutivement ouvert de Chk1 (Huh et Piwnica-Worms, 2013) .
USP7, un régulateur de Chk1
Figure 14 : Les différents substrats d’USP7
USP7 possède différents substrats, qui appartiennent à plusieurs groupes fonctionnels.
INK4a n’est pas un substrat direct d’USP7, mais la stabilisation des protéines Mel18 et
BmI1 réprime la transcription d’INK4a.
Issue de (Nicholson et Suresh Kumar, 2011)
54
Partie I : Introduction générale
USP7 (Ubiquitine Specific-processing Protein7) est une ubiquitine hydrolase. Elle a
été découverte en association avec l’E3 ligase IPC0 du virus Herpès simplex (Everett et al.,
1997) . USP7 serait requis pour réguler l’auto-ubiquitination et la dégradation d’IPC0.
USP7 joue des rôles variés dans la cellule, comme dans la réponse immunitaire, ou
dans la localisation de tumeurs suppresseurs comme Foxo4 ou pTEN (Nicholson et Suresh
Kumar, 2011)
(Fig 14). Nous nous concentrerons sur son rôle dans la réponse aux
dommages à l’ADN. Le plus documenté dans la littérature traite de sa capacité à moduler
p53 directement ou indirectement. En 2002, une étude montre que p53 interagit avec USP7,
et qu’USP7 est requis pour la dé-ubiquitination de p53, aboutissant à sa stabilisation dans les
cellules (Li et al., 2002) . Une seconde étude rapporte qu’USP7 interagit et stabilise mdm2,
de façon indépendante de p53, aboutissant à la déstabilisation de p53 dans les cellules (Li et
al., 2004) . De façon intéressante, USP7 a été montré associée avec EBNA1, protéine du virus
Epstein-Barr. Cette interaction semble procurer un potentiel oncogénique. En effet, EBNA1
est en compétition avec p53 pour l’interaction avec USP7. Il a été montré qu’EBNA1 pouvait
séquestrer USP7, menant à la déstabilisation de p53 dans les cellules or la stabilisation de
p53 dans les cellules est très importante pour prévenir toute progression tumorale
(Holowaty et al., 2003) .
En réponse aux UV, USP7 est requis pour stabiliser Rad18, E3 ligase responsable de la
mono-ubiquitination de PCNA. USP7 interagit et stabilise Rad18 par sa dé-ubiquitination. Un
motif de liaison de Rad18 à PCNA a été mis en évidence. Des mutants de ce motif de liaison a
permis de mettre en évidence deux sérines (S192 et S194) nécessaires pour l’interaction
entre USP7 et Rad18 in vivo (Zlatanou et al., 2015) .
USP7 dé-ubiquitine claspine ce qui prévient sa dégradation et donc la stabilise. En
effet, la déplétion d’USP7 dans les cellules humaines entraîne une diminution du niveau de
claspine, et par conséquence à une diminution de Chk1 et un défaut d’activation du
checkpoint de phase S (Faustrup et al., 2009) .
Récemment, il a été montré qu’USP7 régulait Chk1 de façon indépendante de
claspine. Par des expériences de dé-ubiquitination in vitro, il a été observé qu’USP7 était
requis pour la dé-ubiquitination de Chk1, ce qui mène à sa stabilisation, et à l’activation du
checkpoint de phase S (Alonso-de Vega, Martín, et Smits, 2014 ; Zhang et al., 2014).
55
Partie I : Introduction générale
II.
La tolérance des dommages
Comme nous avons pu le voir dans le chapitre précédent, la réplication d l’ADN est
constamment soumise à des barrières de fourches. Malgré les mécanismes de réparation ou
de signalisation mis en place, il arrive que ces dommages échappent à ces voies, et bloquent
la réplication de l’ADN. La cellule a mis en place deux stratégies pour tolérer ces dommages,
poursuivre la réplication et réparer ultérieurement les dommages restants. Le premier
mécanisme est contournement des lésions ou « Damage Avoidance » (DA). Cette voie utilise
l’information de la chromatide sœur pour contourner la lésion, et assurer une réplication
fidèle. Peu de choses sont connues sur la partition des réponses entre ces deux mécanismes.
Le second mécanisme est appelé la synthèse translésionnelle ou TLS (TransLesion Synthesis)
(Fig 15). Elle est réalisée par des ADN polymérases spécialisées, qui répliquent au travers des
dommages de façon fidèle ou infidèle. Chez E.coli, les gènes de la TLS et du DA sont régulés
par la réponse SOS. Les gènes du DA étant transcrits plus précocement que les gènes de la
TLS, les auteurs avaient proposé que la voie de la TLS soit en secours pour le franchissement
des lésions, quand la voie fidèle du DA avait échoué (Sommer et al., 1998). Néanmoins, une
étude récente montre que la TLS a lieu avant le DA. Ce qui peut s’expliquer par le fait que la
voie TLS se met en place plus facilement que le DA (Naiman et al., 2014).
56
Partie I : Introduction générale
Figure 15. : Voies de tolérance des dommages
Des lésions sur l’ADN peuvent entraver la réplication fidèle de l’ADN, ce qui résulte à
un blocage de fourches de réplication. La synthèse translésionelle et le contournement
fidèle des lésions (recombinaison ou régression de fourches) se mettent alors en place.
Le régulateur clé est la modification post-traductionnelle de PCNA. Après stress
réplicatif, PCNA mono-ubiquitinylé sur la lysine K164 promeut la translésion, alors que
la poly-ubiquitination de PCNA promeut le contournement des lésions.
Issue de (Ghosal et Chen, 2013)
57
Partie I : Introduction générale
A.
Le contournement des lésions ou « Damage avoidance »
Le contournement des lésions a d’abord été observé chez la levure, puis identifié
chez l’humain. Chez la levure, la poly-ubiquitination sur la lysine K164 de PCNA est requise
pour activer la voie. Elle est réalisée par Ubc13/Mm2/Rad5 (Torres-Ramos, Prakash, et
Prakash, 2002). Chez l’humain, la poly-ubiquitination de PCNA est réalisée par UBC13 en
réponse à un traitement par les UV (Chiu et al., 2006).
Deux protéines ont été identifiées comme étant les homologues humains de Rad5, ce
sont les protéines SHPRH (SNF2 Histone Linker PHD Ring Helicase) et HLTF (Helicase Like
Transcription Factor). Elles appartiennent à la famille des protéines SWI/SNF2, et possèdent
un domaine RING en C-terminal, caractéristique des ubiquitines ligases, et des domaines
hélicases. Mais HLTF possède en plus un domaine HIRAN en N-terminal, qui servirait à sa
liaison au niveau des sites de dommages ou des fourches de réplication bloquées (pour
revue (Unk et al., 2010). SHPRH et HTLH peuvent former des complexes avec Rad6/Rad18,
et MSM2/UBC13 in vitro. In vivo, il a été montré que SHPRH et HLTF interagissait avec Rad18
et UBC13 (Motegi et al., 2006) . De plus, HLTF interagit avec PCNA (Unk et al., 2008). HLTF et
SHPRH promeuvent la poly-ubiquitination de PCNA sur la lysine K164, après monoubiquitination par le complexe Rad6/Rad18 (Motegi et al., 2008). Récemment, il a été
observé que l’interaction entre SHPRH et Rad18 est inhibée par la mono-ubiquitination de
Rad18. Après traitement au MMS (Methyl MethaneSulfonate), Rad18 est dé-ubiquitiné, ce
qui permet l’interaction entre Rad18 et SHPRH et favorise la voie de contournement des
lésions (Zeman et al., 2014).
Le mécanisme de contournement pourrait utiliser l’information de la chromatide
sœur nouvellement synthétisée comme matrice d’ADN. Ce mécanisme se rapprocherait de
la recombinaison homologue. Cependant, un autre mécanisme peut être mis en place, il
s’agit de la régression des fourches connue sous le nom de « fork reversal » ou « chicken
foot » dans lequel deux brins d’ADN néo-synthétisé s’apparient, ce qui permet le
franchissement de la lésion. En effet, le blocage de la synthèse du brin avancé ne bloque pas
nécessairement, la synthèse du brin retardé, et leur appariement permet au brin bloqué de
prendre l’autre brin néo-synthétisé comme modèle. La fourche régressée est ensuite
58
Partie I : Introduction générale
retournée, ce qui permet le franchissement des lésions et la reformation de la fourche
normale (Pagès et Fuchs, 2003). D’abord montré chez la levure puis chez l’homme, Rad5 et
HTLF, possèdent la capacité de régresser les fourches de réplication grâce à leur activité
hélicase (Blastyák et al., 2007) Blastyák et al., 2010 ; Achar, Balogh, et Haracska, 2011).
B.
La synthèse translésionnelle
La synthèse translésionnelle met en jeu des ADN polymérases spécialisées, dites ADN
polymérases translésionnelles (pol TLS), qui réalisent le franchissement des bases
endommagées de l’ADN en réalisant l’étape d’insertion c’est-à-dire l’incorporation de
nucléotides en face des bases endommagées et l’étape d’extension c’est-à-dire la poursuite
de la réplication sur quelques nucléotides au-delà des bases lésées. La synthèse
translésionnelle est potentiellement mutagène. Ce mécanisme de tolérance des dommages
est le plus utilisé par les cellules eucaryotes puisque par exemple après traitement aux UV, la
mono-ubiquitination de PCNA est plus abondante que la poly-ubiquitination (Chiu et al.,
2006) (Fig 16).
1.
Rôle de la
translésionelle
mono-ubiquitination de PCNA dans la synthèse
La mono-ubiquitination de PCNA sur la lysine K164 (PCNA-monoUb) favorise le
recrutement des pol TLS sur la chromatine lors du processus de synthèse translésionnelle
(Hoege et al., 2002 ; Stelter et Ulrich, 2003 ; Kannouche, Wing, et Lehmann, 2004 ;
Watanabe et al., 2004). Il a d’abord été montré chez la levure S. cerevisiae, que cette monoubiquitination était médiée par le complexe Rad6/Rad18, où Rad6 est l’enzyme E2 de
conjugaison de l’ubiquitine et Rad18 l’E3 ligase (Bailly et al., 1997), puis dans les cellules
humaines (Hoege et al., 2002). Lors de la réplication, la présence de dommages bloque
l’avancée des fourches de réplication, générant un découplage entre les ADN hélicases, qui
déroulent l’ADN et les ADN polymérase réplicatives bloquées au niveau du dommage. Cette
étape conduit à l’apparition d’ADNsb qui se couvre de protéines RPA (Zou et Elledge, 2003).
Cet évènement permet le recrutement du complexe Rad6/Rad18, via l’interaction de Rad18
59
Partie I : Introduction générale
Figure 16 : Mécanisme de synthèse translésionnelle chez les eucaryotes
Quand la fourche de réplication est bloquée par un dommage sur l’ADN, un découplage a lieu
entre les hélicases et les polymérases réplicatives générant de l’ADNsb recouvert par RPA.
Cette étape entraîne la mono-ubiquitination de PCNA par le complexe Rad6/Rad18. L’ADN
polymérase TLS (pol Kappa) est recrutée à la chromatine pour le franchissement du dommage.
La mono-ubiquitination de PCNA est réversée par USP1, ce qui permet l’échange de
polymérase et la reprise de la réplication.
(Adapté de Mailand, Gibbs-Seymour, et Bekker-Jensen, 2013)
60
Partie I : Introduction générale
avec RPA (Tsuji et al., 2008), et la mono-ubiquitination de PCNA sur la lysine K164 (Hoege et
al., 2002). PCNA-monoUb stimule le recrutement des ADN polymérases TLS au niveau de la
fourche (Kannouche, Wing, et Lehmann, 2004 ; Watanabe et al., 2004 ; Bienko et al., 2005 ;
Bi et al., 2006 ; Guo et al., 2008). En effet, il a été montré par différentes études l’existence
d’une interaction entre PCNA-monoUb et les ADN polymérases Eta et Kappa (Kannouche,
Wing, et Lehmann, 2004 ; Watanabe et al., 2004)(Guo et al., 2008), grâce à leur domaine
d’interaction à PCNA et leur domaine de liaison à l’ubiquitine (UBZ et/ou UBM) (Bienko et
al., 2005 ; Guo et al., 2008 ; Bienko et al., 2010 ; Brown, Niimi, et Lehmann, 2009 ; Bi et al.,
2006) (Figure 16).
PCNA peut être mono-ubiquitinylé en réponse à différents traitements génotoxiques
tels que les irradiations, les UV, le MMS, le BPDE, le cisplatine,les lésions oxydatives, mais
également l’hydroxy-urée, qui induit une diminution du pool de nucléotides (Bi et al., 2006 ;
Niimi et al., 2008 ; Zlatanou et al., 2011). Néanmoins, après irradiations ɣ ou traitements
induisant des cassures doubles brins (bléomycine ou camptothécine), PCNA n’est pas
retrouvé mono-ubiquitinylé, suggérant que la présence d’ADNsb est requise pour cette
modification post-traductionnelle de PCNA (Kannouche, Wing, et Lehmann, 2004 ; Niimi et
al., 2008).
Cependant, des études montrent que la mono-ubiquitination de PCNA pourrait ne
pas être essentielle à la synthèse translésionnelle. En effet, il a été montré que Rad18 n’était
pas nécessaire pour le franchissement in vitro des dimères de pyrimidines par pol Eta
(Schmutz et al., 2010). Il a été également été montré, in vitro, que la présence du mutant de
la lysine K164 affectait ni le recrutement, ni la relocalisation en foyer, ni l’activité TLS de pol
Eta (Nikolaishvili-Feinberg et al., 2008 ; Schmutz et al., 2010) (Sabbioneda et al., 2008).
Cependant le domaine UBZ de pol Eta est requis pour localisation (Bienko et al., 2005),
suggérant que pol Eta pourrait être recrutée à la fourche via des protéines ubiquinylées
autre que PCNA.
Hormis l’action de Rad18, il a été montré que la mono-ubiquination de PCNA sur la
lysine K164 pouvait être catalysée par une E3 ligase CRL4ᶜᵈᵀ² (Cullin4-DDB1-CDT2).
Cependant cette modification indépendante de Rad18 a lieu en absence de traitement
exogène et semble donc se produire au cours de la réplication génomique sans stress
61
Partie I : Introduction générale
réplicatif. Par contre en réponse à un stress réplicatif, CRL4ᶜᵈᵀ² auraient un rôle secondaire
par rapport à Rad18 puisque l’absence de CRL4ᶜᵈᵀ² n’induit pas de diminution de PCNAmonoUb (Terai et al., 2010). Il a, également, été montré in vitro que la mono-ubiquitination
de PCNA sur la lysine K164 pouvait être induite par le complexe RNF8-UbcH5, un complexe
E2-E3. Des cellules déplétées en RNF8 présentent une diminution de PCNA-monoUb suite à
un traitement aux UV, suggérant que cette voie puisse être une alternative à la voie
Rad6/Rad18 (Zhang et al., 2008).
L’E3 ligase CRL4ᶜᵈᵀ² est connue pour poly-ubiquitinée certains partenaires de PCNA
afin de les adresser au protéasome. Dans ce mécanisme, en phase S ou en cas de dommages
à l’ADN, PCNA serait une plateforme qui permettrait l’interaction entre les substrats de
CRL4ᶜᵈᵀ², qui portent un motif appelé « PIP Degron » et CRL4ᶜᵈᵀ². Ce motif possède quatre
résidus basiques qui confèrent une plus grande affinité pour PCNA (Mailand, Gibbs-Seymour,
et Bekker-Jensen, 2013). Récemment, il a été montré, après traitement aux UV, que CRL4ᶜᵈᵀ²
peut ubiquitinyler des régulateurs négatifs du recrutement des pol TLS comme p21 et
médier leur dégradation. Cette étape libère PCNA de certains partenaires qui peut alors
interagir avec pol Eta ou pol Kappa (Tsanov et al., 2014) .
La mono-ubiquitination de PCNA est antagonisée par USP1 (Ubiquitin Specific Protein
1), une ubiquitine hydrolase ce qui permet de limiter dans le temps l’existence de PCNA sous
sa forme mono-UB (Huang et al., 2006). Ainsi la mono-ubiquitination de PCNA est plus
importante dans les cellules déplétées pour USP1 que dans les cellules contrôles, induisant
le recrutement excessif des ADN polymérases TLS et l’apparition de mutations (Huang et al.,
2006). La formation de micro-noyaux suite au recrutement aberrant de pol Kappa durant la
réplication normale du génome a aussi été observée (Jones, Colnaghi, et Huang, 2012).
L’expression d’USP1 est dépendante du cycle cellulaire, sa transcription est faible en G1,
mais augmente en S (Nijman et al., 2005). Son niveau protéique est lui régulé par l’E3 ligase
APC/Cᶜᵈʰ¹, qui induit sa dégradation par le protéasome en G1 (Cotto-Rios et al., 2011).
Certains traitements génotoxiques comme les UV, induisent la dégradation d’USP1
favorisant la persistance de PCNA-Ub. Cependant le traitement par le MMS ou l’hydroxyurée n’induisent pas la dégradation d’USP1 bien que PCNA-Ub s'accumule (Huang et al.,
2006 ; Niimi et al., 2008). Ainsi l’action d’USP1 serait contrecarrée autrement que par sa
dégradation.
62
Partie I : Introduction générale
2.
Les modèles de la synthèse translésionnelle
A l’heure actuelle, il existe deux modèles pour expliquer la synthèse translésionnelle.
Le premier modèle suggère que la synthèse translésionnelle soit en fait une synthèse postréplicative « post-replicative gap filling », et le second propose que la synthèse
translésionnelle ait lieu directement à la fourche de réplication lors de la phase S, via un
changement de polymérase au niveau de la fourche de réplication « polymerase switch »
(Yang, Weinacht, et Zhuang, 2013).
a)
La synthèse translésionnelle post-réplicative
Dans ce modèle, lorsque la fourche de réplication rencontre un dommage, son
avancée est bloquée mais la réplication reprend en aval du dommage, laissant ainsi une zone
d’ADN non-répliqué endommagées. PCNA est mono-ubiquitinylé au niveau de la zone non
répliquée, permettant le recrutement des ADN pol TLS qui comblent la zone en en
franchissant le dommage.
Ce modèle est plausible, car, premièrement, il a été observé, chez la levure, la
présence de courtes zones d’ADNsb, qui persistent en G2 après irradiations aux UV (Lopes,
Foiani, et Sogo, 2006). Deuxièmement, dans les cellules eucaryotes supérieures, il a été
montré que la mono-ubiquitination de PCNA n’était pas nécessaire en phase S, après
traitement aux UV, néanmoins, en phase G2, Rad18 et la mono-ubiquitination de PCNA sont
requis pour la synthèse translésionnelle (Edmunds, Simpson, et Sale, 2008). Récemment, une
étude a montré que dans les cellules humaines ou murines, la TLS semblait être plus
importante en phase G2 par rapport à la phase S et, la fréquence de mutation est plus
élevée lors de la phase G2 (Diamant et al., 2012).
63
Partie I : Introduction générale
b)
Le changement ou « switch » de polymérase à la fourche
de réplication
Ce modèle repose sur le changement de polymérase au niveau de la fourche bloquée
et ceci via le facteur de processivité PCNA. Sa mono-ubiquitination permet le recrutement
des ADN pol TLS à la place des ADN pol réplicatives. Une fois recrutée, l’ADN pol TLS réplique
au travers du dommage, PCNA est ensuite dé-ubiquitinylé et la réplication reprend avec les
ADN polymérases réplicatives.
La première évidence d’un échange de polymérases a été mise à jour dans les cellules
humaines. Les auteurs ont utilisé un plasmide contenant un dimère de pyrimidines bloquant
les ADN polymérases réplicatives. Ils ont pu observer dans des cellules XPV (cellules de
patients atteints du syndrome de Xeroderma Pigmentosum Variant possédant pol Eta non
fonctionnelle), un arrêt de la réplication, qui est aboli après réintroduction de l’AN pol Eta
sauvage purifiée, suggérant un échange entre la polymérase réplicative et pol Eta (Masutani
et al., 2000). Cet échange entre pol Eta et pol Delta a ensuite été décrit in vitro, dans des
conditions qui miment le blocage des fourches de réplication (Zhuang et al., 2008). La monoubiquitination de PCNA par le complexe Rad6/Rad18 favorise le recrutement de pol Eta via
son domaine de liaison à l’ubiquitine et stimule l’échange après traitement aux UV
(Masuda, Piao, et Kamiya, 2010).
La protéine PIDP38 (Pol Delta Interacting Protein of 38kDa) a été trouvée comme
interagissant avec pol Delta et PCNA (Liu et al., 2003).
Des interactions entre PIDP38 et
Rev1, PDIP38 et Rev7 sous-unité de pol Zeta ont été observées. Cette protéine apparait
comme un régulateur de l’échange des polymérases au niveau des fourches bloquées
(Tissier et al., 2010).
3.
Le choix des ADN polymérases TLS
Le mécanisme responsable du recrutement de la polymérase TLS appropriée est
encore largement débattu. Peu d’études à ce jour, nous donne des éléments de réponses.
Cependant, il existe une sélection des polymérases TLS en fonction du dommage à franchir.
64
Partie I : Introduction générale
En effet, l’ADN polymérase Eta est requise pour le franchissement fidèle des dimères de
pyrimidines induits par les UV (Masutani et al., 2000) et l’ADN polymérase Kappa pour celui
des adduits polycycliques induits par le benzopyrène (Zhang et al., 2000). Néanmoins, il a
été observé que les ADN polymérases TLS étaient très dynamiques au niveau des fourches
bloquées. Leur temps de résidence sur la chromatine après UV est très faible, laissant penser
que toutes les polymérases pourraient essayer de franchir la lésion, et que seule celle
capable de l’exécuter serait sélectionnée (Sabbioneda et al., 2008).
III.
Les ADN polymérases translésionnelles
Au-delà des ADN polymérases réplicatives, il existe ADN polymérases dites
spécialisées, car restreintes à quelques processus particuliers. Parmi ces ADN polymérases
spécialisées, nous nous intéresserons seulement aux ADN polymérases de la famille Y (pol
Kappa, pol Eta, pol Iota, et Rev1), ainsi qu’à deux cas particuliers pol Zeta et primpol.
A.
Généralités sur les ADN polymérases de la famille Y
Les ADN polymérases de la famille Y possèdent des caractéristiques communes :

Elles sont capables de répliquer l’ADN au travers des dommages.

Elles sont mutagènes sur une séquence non endommagée. En effet, leur fréquence
de mutations est deux fois supérieure à celle des ADN polymérases réplicatives.

Elles ne possèdent pas d’activité d’exonucléase 3’→5’

Elles ont une faible processivité et sont distributives.
Les ADN polymérases spécialisées adoptent une conformation en forme de main droite
et elles se composent de quatre domaines (Fig 17) : la paume, où se trouve le domaine
catalytique, le pouce, qui facilite l’interaction avec l’ADN, les doigts, qui permettent le bon
positionnement sur l’ADN et l’insertion des nucléotides, et un domaine additionnel par
rapport aux pol réplicatives, nommé le petit doigt ou domaine d’association avec les
65
Partie I : Introduction générale
polymérases (PAD). Ce dernier leur confère un site actif plus ouvert et un contact
supplémentaire avec l’ADN. C’est grâce à ce PAD, que les ADN polymérases spécialisées
peuvent insérer des nucléotides en face de bases endommagées (Friedberg, 2005).
Petit doigt
Figure 17 : Structure des ADN polymérases
spécialisées de la famille Y
(Adapté de Friedberg, 2005)
B.
Rev1
La polymérase Rev1 est une protéine de 138 KDa codée par le gène REV1, situé sur le
chromosome 2q11.1-2. Rev1 incorpore préférentiellement des dCMP face à un G, un U, ou
un site absaique. De ce fait, elle est appelée la déoxycytidyl-transférase (d-CMP) (Flach et al.,
2014 ; Lin et al., 1999).
La perte de Rev1 entraine des arrêts de fourches fréquents durant la phase S et après
traitement aux UV (Edmunds, Simpson, et Sale, 2008). Dans cette même étude, il est montré
que les domaines fonctionnels spécifiques de Rev1, lui confère un rôle central dans le
processus de translésion.
En N-terminal, Rev1 possède un domaine BRCT (BRCA1 C-terminal), requis pour sa
localisation nucléaire et pour son interaction avec PCNA (Tissier et al., 2004 ; Ross, Simpson,
66
Partie I : Introduction générale
et Sale, 2005 ; Guo et al., 2006). Le domaine BRCT serait aussi requis pour la tolérance des
dommages (Jansen et al., 2005 ; Guo et al., 2006).
En C-terminal, Rev1 possède un domaine d’interaction avec les autres polymérases
de la famille Y, ainsi qu’avec la sous-unité Rev7 de pol Zeta (Guo et al., 2003 ; Ohashi et al.,
2004; Tissier et al., 2004). En plus de l’interaction avec les autres polymérases, le domaine Cterminal peut interagir avec PCNA (Ross, Simpson, et Sale, 2005). Il est à noter, également, la
présence de deux motifs de liaison à l’ubiquitine (UBM), qui permettent l’interaction entre
Rev1 et PCNA-monoUb, ce qui facilite son rôle dans la tolérance des dommages (Guo et al.,
2006).
De par sa liaison avec PCNA et PCNA-monoUb, ainsi que ses interactions avec les
polymérases translésionnelles, Rev1 serait une plateforme de recrutement des ADN
polymérases translésionnelles au niveau d’une zone endommagée (Lehmann, 2006).
Rev1 a un rôle essentiel dans la tolérance des dommages. En effet, après traitement
aux UV, les cellules murines déficientes en Rev1 affichent une hypersensibilité, une
diminution de la mutagénèse et un arrêt du cycle cellulaire en S et G2 (Jansen et al., 2005).
De même, la déplétion de Rev1 dans les cellules DT40 de poulet les rend hypersensibles au
traitement par les UV et par le cisplatine (Ross, Simpson, et Sale, 2005). Rev1 colocalise avec
pol Eta après irradiation aux UV. Ainsi Rev1 est requise pour la progression des fourches de
réplication en réponse aux traitements par des agents génotoxiques (Jansen et al., 2005;
Tissier et al., 2004).
Durant la réplication non perturbée, Rev1 co-localise avec PCNA, suggérant la
présence de Rev1 au niveau des fourches de réplication (Tissier et al., 2004). De plus, il a été
montré, chez la levure, que Rev1 prévient l’apparition de mutagénèse spontanée dont sont
sujettes les séquences microsatellites (Collins, Bhattacharyya, et Lahue, 2007). Une telle
implication est également retrouvée au niveau des structures G4. En effet, le domaine Cterminal serait requis pour la réplication complète des séquences prédites pour former ces
structures (Sarkies et al., 2010).
67
Partie I : Introduction générale
C.
L’ADN polymérase Iota
L’ADN polymérase Iota (Pol Iota) est une protéine de 80kDa codée par le gène POLI
positionné sur le chromosome 18q21.1 (McDonald et al., 1999) (Johnson et al., 1999) . Elle
est, à ce jour la moins bien caractérisée des ADN polymérases de la famille Y, et aucune
fonction biologique propre ne lui a été attribuée. Elle est retrouvée chez la souris et la
drosophile, mais est absente de la bactérie, de la levure et du nématode (Johnson et al.,
1999). Sa structure lui permet uniquement de faire des appariements de bases Hoogsteen
(Johnson et al., 2006 ; Nair et al., 2006). Pol Iota, en plus de son activité catalytique, possède
une activité dR-P lyase, c’est-à-dire qu’elle est capable de réparer les appariements G.U et
A.U (Bebenek et al., 2001) . Pol Iota est très mutagène lors de la réplication d’ADN non
endommagé, elle incorpore des bases non appropriées avec un taux d’erreurs moyen de
10⁻². Néanmoins, pol Iota affiche une spécificité de matrice car elle est relativement fidèle
lors de la réplication d’une matrice composée de purine (Tissier et al., 2000).
1.
Les domaines fonctionnels de pol Iota
Comme les autres polymérases de la famille Y, pol Iota possèdent des domaines structuraux
importants pour sa fonction.
 Elle possède un domaine catalytique en N-terminal
 Un domaine de liaison à pol Eta. L’interaction avec pol Eta permet sa relocalisation en
foyer de réplication (Kannouche et al., 2003)
 Un domaine d’interaction avec Rev1 en C-terminal (Tissier et al., 2004)
 Un domaine PIP (PCNA interacting Peptide) de liaison avec PCNA (Vidal et al., 2004)
 Deux domaines de liaison à l’ubiquitine (UBM Ubiquitin Binding Motif), nécessaires
pour l’interaction avec PCNA-monoUb ainsi que pour sa relocalisation en foyer après
traitement UV (Bienko et al., 2005)
 Pol Iota possède un domaine de localisation nucléaire, en plus de son domaine NLS
(Nuclear Localization Sequence) (Kannouche et al., 2003).
68
Partie I : Introduction générale
2.
Le rôle de pol Iota dans la gestion des dommages
Des études biochimiques ont montré que pol Iota étaient capable de répliquer au
travers de lésions comme les photoproduits [6,4], et les sites abasiques, néanmoins après
l’insertion de nucléotides, elle n’est pas capable d’étendre. Il est proposé que pol Iota réalise
l’étape d’insertion et, que pol Zeta prenne le relais pour l’étape d’extension (Johnson et al.,
2000) (Tissier, McDonald, et al., 2000) (Vaisman et al., 2003 ; Vaisman et al., 2006) .
Il existe des souris (lignée 129) possédant une mutation non-sens dans le gène POLI,
qui aboutit à la production d’une protéine pol Iota tronquée de seulement 26 acides aminés.
Les fibroblastes issus de ces souris ne présentent pas de différences de sensibilité aux UV par
rapport les fibroblastes sauvages. Cependant, la perte combinée de pol Iota et Pol Eta,
connue pour franchir efficacement les lésions dus aux UV, augmente la sensibilité aux UV, en
comparaison avec les cellules déficientes pour pol Eta (Dumstorf et al., 2006). Ces résultats
ont également été obtenus dans les cellules humaines (Gueranger et al., 2008). Pol Iota
aurait un rôle dans la tumorigénèse puisque son absence prédispose à un cancer. En effet,
suite à des irradiations par les UV, et la déplétion combinée de pol Iota et Eta accélère
l’apparition de cancers cutanés par rapport aux souris déficientes seulement pour pol Eta
(Ohkumo et al., 2006 ; Dumstorf et al., 2006).
Pol Iota aurait un rôle dans le franchissement des lésions oxydatives. En effet, une
étude biochimique a montré qu’in vitro, pol Iota était capable de répliquer au travers des
lésions 8-oxo-G (Vaisman et al., 2000). De plus, l’expression de pol Iota est induite par HIF1
(Hypoxia Inducible Factor 1). Les auteurs de cette étude proposent que pol Iota puisse être
requise lors de la réoxygénation des tissus hypoxiés, car ce phénomène s’accompagne de la
formation de ROS, ce qui génère un stress oxydatif (Ito et al., 2006). Une étude montre que
des fibroblastes humains déplétés pour pol Iota sont hypersensibles au traitement par H₂O₂,
un agent générant du stress oxydatif. Les auteurs de cette étude n’excluent pas que la TLS de
certaines lésions oxydatives soit catalysée par pol Iota, mais, ils favorisent l’hypothèse d’une
implication dans la voie de réparation par excision de bases (BER) puisque les cellules
déplétées en pol Iota, présentent un défaut de réparation par le BER. De plus, pol Iota
interagit avec XRCC1, protéine du BER (Petta et al., 2008) et son activité dRP-lyase serait
nécessaire pour son implication dans cette voie de réparation.
69
Partie I : Introduction générale
D.
L’ADN polymérase Eta
L’ADN polymérase Eta (pol Eta) est une protéine de 78kDa, codée par le gène POLH
positionné sur le chromosome 6p21.1. Elle a été identifiée comme étant l’homologue de
Rad30 chez la levure (Masutani et al., 1999). Pol Eta, comme les autres membres de la
famille Y, est infidèle et présente un taux d’erreur compris entre 10⁻² et 10⁻³ (Johnson et al.,
2000).
1.
Les domaines fonctionnels de pol Eta
Pol Eta possèdent des domaines biologiques importants pour sa fonction :
 Un domaine catalytique en N-terminal (Kannouche et al., 2001)
 Deux domaines d’interaction à Rev1 (Ohashi et al., 2004 ; Tissier et al., 2004)
 Un domaine de liaison à l’ubiquitine (UBZ Ubiquitine Binding Zinc Finger) en
N-terminal. Ce domaine est requis pour l’interaction avec PCNA-monoUb et,
pour la relocalisation de pol Eta en foyer (Bienko et al., 2005).
 Deux sites de liaison à PCNA (PIP). Un domaine PIP est situé en C-terminal et
l’autre se trouve en amont du domaine UBZ. Les deux domaines sont requis
pour la relocalisation de pol Eta en foyers (Haracska et al., 2001 ; Acharya et
al., 2008).
 Un domaine de localisation nucléaire NLS.
2.
Rôle de pol Eta dans le franchissement des dommages induits
par les UV
Pol Eta est la polymérase majeure pour le franchissement fidèle des adduits causés
par les UV, le CPD (Cyclobutane Pyrimidin Dimer). Il a été montré, in vitro, que pol Eta était
capable d’insérer deux déoxyadénosines en face de deux thymines liées des adduits CPD. Il
est à noter que pol Eta réalise seule l’étape d’insertion et d’extension (McDonald et al.,
1999 ; Johnson, Washington, Haracska, et al., 2000). Cette capacité est possible grâce à une
structure particulière, dite « attèle » qui en plus de son site actif élargi, lui permet de
70
Partie I : Introduction générale
prendre en charge les dimères de thymines. En effet une fois, le dimère répliqué, il est
toujours présent et induit une déformation de l’ADN, ce qui peut induire des décalages de
lecture sur le brin d’ADN néo-synthétisé. Pol Eta, grâce à son brin β, va permettre à l’ADN
néo-synthétisé de garder une conformation stable (Biertümpfel et al., 2010). Par contre, pol
Eta n’est pas capable de franchir les photoproduits [6,4], autres adduits produits par les UV.
Il est proposé que la tolérance de cette lésion repose sur l’action de pol Zeta (Szüts et al.,
2008).
Cette capacité à franchir les CPD de façon fidèle rend la déficience en pol Eta
particulièrement délétère chez l’homme et provoque le syndrome Xeroderma Pigmentosum
Variant (XP-V) (Masutani et al., 1999 ; Broughton et al., 2002 ; Yamada et al., 2000). Ce
syndrome est classé parmi les autres syndromes Xeroderma Pigmentosum (XP). Les patients
atteints de ces maladies ont des mutations dans des gènes codant pour des protéines
responsables de la gestion des dommages induits par les UV. Ils sont hypersensibles aux
rayonnements UV et ont une prédisposition aux cancers de la peau. Le syndrome XP-V
concerne 20% des syndromes XP. Il est montré que les extraits cellulaires des cellules
dérivant de patients XP-V présentent des défauts de réplication, après traitement aux UV,
résultants d’un défaut de synthèse translésionnelle (Broughton et al., 2002).
Récemment, il a été mis en évidence dans des cellules de patienst présentant un
phénotype XPV, un nouveau mutant de pol Eta nommé polη721. Ce mutant porte une
mutation faux sens dans son NLS, mais aussi dans le codant stop, allongeant la protéine de 8
acides aminés en C-terminal. Ce mutant est capable de franchir les lésions CPD, d’être
recruté à la chromatine après traitement par les UVs. Il interagit avec PCNA monoubiquitinylé, et se relocalise au niveau des lésions de l’ADN lorsqu’on le stabilise avec un
inhibiteur du protéasome. Il est sujet, cependant, à une dégradation excessive, cause du
phénotype XPV chez les patients. Sa dégradation par le protéasome est dépendante de sa
poly-ubiquitination. Les ubiquitines ligases CRL4-CDT2 et Pirh2 connues pour ubiquitinyler
Pol Eta ne sont pas requises pour cette poly-ubiquitination. Les 8 acides aminés
supplémentaires en C-terminal changent la conformation de la protéine, ce qui rend libre
d’accès la partie C-terminal pour l’ubiquitination (Ahmed-Seghir et al., 2015).
71
Partie I : Introduction générale
Les souris pol Eta -/- présentent un profil identique aux patients atteints XP-V, elles
sont viables et fertiles, montrant que pol Eta n’est pas une protéine essentielle. Néanmoins,
leurs fibroblastes sont hypersensibles aux irradiations par les UV.
3.
Rôle de pol Eta au niveau des sites fragiles communs
Mon équipe d’accueil a mis en évidence un nouveau rôle de pol Eta en dehors de sa
fonction de TLS. Par des expériences d’hybridation in situ, il a été observé que l’absence de
pol Eta dans les cellules entraînait une augmentation de l’instabilité d’un site fragile commun
en particulier, FRA7H des U2OS. Cette instabilité est augmentée lorsque les cellules sont
traitées par des faibles doses d’aphidicoline, qui induit, via l’inhibition des ADN polymérases
réplicatives, des blocages des fourches de réplication. Ils ont montré qu’en l’absence de pol
Eta, il y a une augmentation des aberrations chromosomiques, et que ce phénotype est
amplifié dans les cellules XP-V (Rey et al., 2009). Par des expériences d’immunoprécipitation
de chromatine, ils ont mis en évidence le recrutement de pol Eta au niveau des sites fragiles
communs. Les sites fragiles communs sont capables de former des ADN structurés (Voir
chapitre II), qui bloquent l’avancée des ADN polymérases réplicatives, mais pas des
hélicases. Pol Eta serait alors recrutée à la fourche pour répliquer au travers de ces
structures et permettre ainsi la reprise de la réplication. L’absence de pol Eta entraîne la
présence de zones d’ADN non répliquées qui sont transmises aux cellules filles et retrouvées
dans des foyers 53BP1 en G1 (Bergoglio et al., 2013).
E.
L’ADN polymérase Zeta
Pol Zeta appartient à la famille B des ADN polymérases comme les ADN polymérases
réplicatives Alpha, Delta, et Epsilon. Contrairement à Delta et Epsilon, pol Zeta ne possède
pas d’activité exonucléase 3’→5’, et n’est que très peu fidèle (Burgers et al., 2001 ;
McCulloch et Kunkel, 2008). Pol Zeta est hétérodimérique, composée du complexe Rev3,
portant l’activité catalytique, et Rev7, qui stimule l’activité catalytique de la polymérase
(Murakumo et al., 2000). Chez les eucaryotes, le gène REV3L code pour la protéine Rev3L
(Rev3 like) de 353KDa, il est positionné sur le chromosome 6q21. Rev3 porte son activité
72
Partie I : Introduction générale
polymérases en N-Terminal. Les souris déficientes pour Rev3 présente une létalité
embryonnaire à mi- gestation (Bemark et al., 2000). La protéine Rev7 de 28kDa est codée
par le gène REV7, positionné sur le chromosome 1p36. Rev7 est un membre de la famille
HORMA (Hop1, Rev7 and Mad2).elle interagit avec Rev3, mais aussi avec Rev1 (Hara et al.,
2010). Rev7 interagit aussi avec la protéine MAD2, entrant dans le point de contrôle associée
au fuseau mitotique (Murakumo et al., 2000).
Dans des cellules de mammifères, il a été montré que pol Zeta était impliquée dans le
franchissement de lésions dues aux UV, des sites abasiques, mais aussi des thymines glycols
(Shachar et al., 2009 ; Yoon et al., 2010).
Chez la levure, il a été montré que pol Zeta interagissait avec deux sous-unités de pol
Delta : pol 31 et pol 32 (Baranovskiy et al., 2012 ; Makarova, Stodola, et Burgers, 2012 ;
Johnson, Prakash, et Prakash, 2012). Chez l’humain, la purification du complex
Rev3/Rev7/PolD2/PolD 3 a permis de montrer que ces deux domaines supplémentaires
amplifiaient l’efficacité de pol Zeta lors de sa collaboration avec pol Eta pour la tolérance des
dommages induits par le cisplatine (Lee, Gregory, et Yang, 2014). Pol Zeta collabore aussi
avec pol Kappa pour le franchissement d’adduit BP-G. Pol Kappa réaliserait l’étape
d’insertion et pol Zeta réaliserait l’étape d’extension (Shachar et al., 2009).
F.
Primpol
Primpol a été identifiée en 2013. Elle est retrouvée dans le compartiment nucléaire et dans
le compartiment mitochondrial. Elle possède une activité primase ainsi qu’une activité
polymérase. Elle est la deuxième primase à être décrite. Elle est capable d’amorcer une
synthèse d’ADN avec des desoxyribonucléotides ou des ribonucléotides alors que pol alpha
n’utilisent que des ribonucléotides. Elle a la capacité de franchir les lésions induites par le
stress oxydatif (8-oxoG et sites abasique), mais également des lésions induites par les UV
(García-Gómez et al., 2013 ; Bianchi et al., 2013 ; Zafar et al., 2014) (Mourón et al., 2013). Il
est proposé que Primpol puisse intervenir au niveau des dommages, soit en franchissant les
dommages, soit en permettant la ré-initiation en aval de l’obstacle grâce à sa fonction
primase (Mourón et al., 2013; García-Gómez et al., 2013).
73
Partie I : Introduction générale
74
Partie I : Introduction générale
Chapitre IV : L’ADN polymérase Kappa
Pol Kappa a été identifiée chez l’homme et la souris, comme étant l’homologue de
l’ADN polymérase IV codé par le gène DinB chez E. coli (Gerlach et al., 1999 ; Ogi et al.,
1999 ; Johnson, Prakash, et Prakash, 2000). Bien que conservée des bactéries aux vertébrés,
pol Kappa est absente chez S. Cerevisiae et D. Melanogaster (Ohmori et al., 2001) . Pol
Kappa est une protéine de 99kDa codée par le gène POLK. Il est situé en position 5q13.1,
s’étend sur 87,5Kb, comporte 13 exons et 14 introns. Un ARN messager de 4074 nucléotides
est codé par le gène POLK (Gerlach et al., 1999). Pol Kappa est retrouvée dans la majorité
des tissus, mais présente une expression différentielle dans le cortex adrénalique (VelascoMiguel et al., 2003), et dans les testicules (Gerlach et al., 1999 ; Ogi et al., 1999 ; VelascoMiguel et al., 2003). Dans les testicules, il a été observé la présence d’une séquence 5’UTR
variante, qui comporte deux sites d’initiation de la transcription (Ogi et al., 2001).
La surexpression de pol Kappa dans des cellules murines provoque une augmentation
de la mutagénèse spontanée (Ogi et al., 1999). Cependant, les souris pol Kappa -/- ne
présentent pas de phénotype particulier, elles sont viables et fertiles. Pol Kappa n’apparait
donc pas comme une protéine essentielle (Schenten et al., 2002). Néanmoins, il est à noter,
que les lignées germinales mâles présentent un taux anormalement élevé de séquences
répétées (Burr et al., 2006), et que les cellules embryonnaires dérivées des souris pol Kappa
-/- présentent un phénotype mutateur (Stancel et al., 2009), conférant un rôle important
pour pol Kappa dans la stabilité du génome.
Afin de présenter pol Kappa, nous commencerons par présenter la structure et les
domaines fonctionnels de pol Kappa, puis nous détaillerons ses rôles biologiques, et enfin
nous verrons les conséquences de la dérégulation de pol Kappa dans les cellules de
mammifères.
75
Partie I : Introduction générale
I.
Structure et domaines fonctionnels de pol Kappa
Pol Kappa est composée de plusieurs domaines, qui sont indispensables pour lui
permettre d’assurer ses fonctions (Fig 18) :
Figure 18 : Domaines fonctionnels des ADN polymérases de la famille Y
Les ADN polymérases spécialisées sont composées d’une paume (en bleu), d’un doigt (en jaune),
d’un pouce (en orange) et d’un petit doigt appelé le domaine PAD (en violet). Les domaines
régulateurs sont détaillés en légendes. Le domaine N-clasp de pol Kappa est représenté par un
rectangle rouge. (Adapté de (Sale, Lehmann, et Woodgate, 2012)
N-Clasp
Le domaine N-Clasp est situé, comme son nom l’indique, dans la région N-terminale
de pol Kappa. Absent des procaryotes et des autres polymérases de la famille Y, il est
spécifique à pol Kappa, ce qui en fait un domaine très intéressant à étudier (Uljon et al.,
2004). Peu de choses sont connues sur ce domaine, si ce n’est qu’il confère une plus grande
76
Partie I : Introduction générale
stabilité de pol Kappa sur l’ADN, en l’encerclant (Lone et al., 2007). Sa délétion complète
entraîne une perte d’activité de pol Kappa (Uljon et al., 2004). Récemment, des variants
naturels du domaine N-clasp ont été mis à jour (L21F et I39T). Ces mutations nuisent à
l’efficacité de synthèse translesionnelle de pol Kappa (Song et al., 2014).
Le domaine catalytique
Il est situé en N-terminal (Gerlach et al., 1999 ; Ogi et al., 1999). Les acides aminés en
position 107, 198 et 199 sont requis pour la fonction polymérase. La séquence comprise
entre les acides aminés 19 et 526 code pour la partie minimale de l’enzyme active.
Le domaine PAD
Le domaine PAD (Polymerase-Associated Domain) est également appelé le petit doigt. Ce
domaine est requis pour la liaison de pol Kappa sur l’ADN. La liaison entre le domaine PAD et
le domaine catalytique semble être essentielle pour l’activité polymérase et la spécificité de
pol Kappa.
Le RIR
Le domaine d’interaction à Rev1 est situé dans la région C-terminale. Bien qu’il n’y ait
pas de séquence consensus de ce domaine, il a été mis en évidence que deux phénylalanines
(position 567 et 568) étaient requises pour l’interaction entre Rev1 et les polymérases de la
famille Y (Ohashi et al., 2009). L’interaction avec Rev1 permet le recrutement de pol Kappa
au site de TLS indépendamment de PCNA (Tissier et al., 2004)
Les domaines UBZ
Pol kappa possède deux domaines d’interaction à l’ubiquitine, les domaines UBZ
(Ubiquitin Binding Zinc Finger). Ils sont situés en C-terminal, et le seul partenaire connu à ce
jour est PCNA-mono ubquitinylé. La perte d’un des domaines empêche la relocalisation de
pol Kappa en foyer après irradiation UV (Guo et al., 2008). Dans cette étude, il est aussi été
montré que pol Kappa peut être ubiquitinylée, cependant, le rôle physiologique de cette
modification post-traductionnelle n’est pas encore établi (Guo et al., 2008).
77
Partie I : Introduction générale
Le domaine PIP2
Le domaine PIP contient une « PIP-box » c’est-à-dire un domaine d’interaction avec
PCNA. Ce domaine situé en extrême C-terminal, est retrouvé chez les autres polymérases de
la famille Y. Il est requis pour la relocalisation de pol Kappa aux foyers de réplication après
irradiation UV (Ogi, Kannouche, et Lehmann, 2005). PIP-box de pol kappa à la différence de
la PIP-box présente dans pol eta et à fortiori dans p21, ne permet pas des interactions très
fortes entre PCNA et pol Kappa c’est pourquoi l’immunoprécipitation de GFP-pol Kappa
n’entraine pas PCNA (Jones, Colnaghi, et Huang, 2012).
Le domaine PIP1
Il a récemment été mis en évidence, la présence du second domaine d’interaction à
PCNA (PIP1). Il est situé après le domaine catalytique. Chacun des deux domaines PIP peut
interagir avec PCNA. Néanmoins, la mutation PIP 1 de pol Kappa inhibe la réplication d’ADN
en présence de PCNA, RFC et RPA. La mutation du domaine PIP 1 ne serait alors pas
compensée par la présence du domaine PIP 2. Les auteurs en concluent que seul le domaine
PIP 1 serait requis pour l’interaction avec PCNA, alors que le PIP2 lui ne serait actif que dans
le cadre de la fonction TLS (Yoon et al., 2014).
Pol kappa possède aussi un domaine de localisation nucléaire (NLS) qui étendu au domaine
PIP2 est nommé le domaine RIR par analogie avec pol Eta (Bienko et al., 2010).
Comme les autres polymérases de la famille Y, pol Kappa ne possède pas d’activité 3’5’ exonucléase, ce qui fait d’elle une polymérase mutagène (Zhang et al., 2000). Elle
incorpore des nucléotides erronés à une fréquence comprise entre 10⁻⁴ et 10⁻³ (Johnson,
Prakash, et Prakash, 2000). Ses erreurs les plus fréquentes sont les substitutions de base
(T→G/C), et, les plus rares sont les délétions de base seulement 9,3% (Zhang et al., 2000). Sa
processivité est modérée, puisqu’elle s’associe et se dissocie tous les 1 à 25 nucléotides. Elle
reste, néanmoins, la polymérase la plus fidèle de sa famille (Ohashi et al., 2000).
78
Partie I : Introduction générale
II.
Les fonctions biologiques de pol Kappa
A.
Réplication de l’ADN génomique
Comme présenté dans le premier chapitre, les conformations non-B de l’ADN sont un
défi pour la réplication du génome. Ces structures rapidement formées bloquent l’avancée
des fourches de réplication. Les ADN polymérases Kappa et Eta (Bétous et al., 2009; Rey et
al., 2009 ; Bergoglio et al., 2013) ont émergée comme étant de nouveaux acteurs dans la
réplication de ces séquences. La déplétion de pol Kappa augmente la sensiblité des cellules à
la télomestatine, un ligand qui stabilise les structures G4. Cette hypersensiblité est correlée
avec la formation de foyers γH2AX dans les cellules, suggérant l’apparition de cassures sur
l’ADN (Bétous et al., 2009). Il a également été montré que pol Kappa était capable de
répliquer, in vitro, efficacement des séquences capables d’adopter des conformations
secondaires dans des sites fragiles communs (Walsh et al., 2012).
Une étude a montré que les souris pol Kappa-/- présentaient une augmentation des
séquences répétées dans les lignées germinales mâles (Burr et al., 2006), suggérant une
implication de pol Kappa dans la réplication de ces séquences. Par ailleurs, la fidélité des
ADN polymérases réplicatives est fortement réduite lors de la réplication de séquences
microsatellites (Abdulovic et al., 2011), ce qui renforce la possible implication de
polymérases spécialisées sur ces séquences. Par des expériences de réplication in vitro, il a
été montré que pol Kappa était capable de synthétiser au travers des microsatellites (Hile et
Eckert, 2008 ; Hile et al., 2012). Bien qu’étant une polymérase infidèle, pol Kappa réplique
plus fidèlement les séquences microsatellites que pol Delta (Baptiste et Eckert, 2012). Pol
Kappa permet, d’ailleurs de stabiliser les séquences microsatellites par deux moyens :
-
Elle réplique fidèlement les microsatellites. Elle permet donc le maintien sur toute la
longueur des séquences.
-
Pol Kappa insère préférentiellement des G ou des C, ce qui peut créer des erreurs.
Ces erreurs aboutissent à une interruption du microsatellite (Hile et Eckert, 2008),
créant deux microsatellites plus courts, dont la fréquence de mutation sont plus
faibles grâce à leur petite taille.
79
Partie I : Introduction générale
Par ailleurs, lors de la réplication des séquences répétées, il peut se produire un décalage
entre le brin néo-synthétisé et la matrice, Pol kappa est ensuite capable de réaligner le brin
décalé ce qui réduit le risque de délétion/insertion lors de la réplication de séquences
répétées (Mukherjee, Lahiri, et Pata, 2013).
B.
Réplication de l’ADN endommagé et synthèse
translésionnelle
Le rôle le plus documenté de pol Kappa dans la littérature est celui concernant la
synthèse translésionnelle. Pol kappa est spécifique des adduits encombrants sur les guanines
(Choi, Angel, et Guengerich, 2006). En effet, Pol Kappa est capable de réaliser seule l’étape
d’insertion de manière fidèle ainsi que l’étape d’extension lors du passage de la lésion.
D’ailleurs, la fonction cellulaire la plus décrite est son implication dans la tolérance fidèle des
dommages causés par le benzo[a]pyrène, un carcinogène présent dans la fumée de
cigarettes. Pol Kappa, in vitro et in vivo, est capable d’insérer un nucléotide en face d’une
base endommagée par le benzo[a]pyrène de façon fidèle (Zhang, Yuan, Xin, et al., 2000)
(Suzuki et al., 2002) (Avkin et al., 2004). De plus, les MEFs pol Kappa -/- présentent une
hypersensibilité au benzo[a]pyrène, et sont, d’ailleurs, incapables de progresser au cours de
la phase S après exposition à cet agent génotoxique (Bi et al., 2005) . Pol Kappa est capable
de se relocaliser en foyer après traitement au benzo[a]pyrène, mais cette relocalisation
nécessite la mono-ubiquination de PCNA par Rad 18 (Bi et al., 2006) .
Pol Kappa est aussi capable de passer une autre classe d’adduits encombrants, les
composés ostrogéniques. Il a été montré, in vitro, que pol Kappa peut catalyser l’insertion de
nucléotide face au 4-OH-equilenin, un composé ostrogénique oxydé (Suzuki et al., 2004) .
Ceci est en accord avec le fort niveau d’expression de pol Kappa dans les organes
reproducteurs, suggérant un rôle dans la translésion des adduits stéroïdes.
Pol Kappa protège contre les dommages liés aux stress oxydatifs puisqu’elle est
capable de franchir les lésions 8-oxoG et les thymines glycols de façon infidèle et fidèle
respectivement, prévenant ainsi l'accumulation de cassures de l'ADN (Zhang, Yuan, Wu, et
al., 2000) (Fischhaber et al., 2002 ; Yoon et al., 2010) . Pol Kappa est capable de franchir, in
80
Partie I : Introduction générale
vitro, les sites abasiques et les lésions dues à des guanines modifiées par le N-2acétylaminofluorène (Gerlach et al., 2000)
Pol Kappa participerait, également, à la translésion de bases alkylantes. En effet, les
MEFS pol Kappa -/- sont sensibles au traitement par l’agent alkylant le MMS (Méthyl
Méthane Sulfonate). Bien que cette sensibilité soit moins importante que celle engendrée
par la déplétion de Rev3, la double délétion de pol Kappa et Rev 3 augmente cette
sensibilité. Pol Kappa pourrait jouer un rôle de secours, en l’absence de Rev 3 (Takenaka et
al., 2006) .
Pol Kappa serait également capable de réaliser l’étape d’extension de
mésappariements, bien que pol zeta soit plus efficace (Washington et al., 2002). Cependant,
une coopération des deux polymérases serait possible. Pol Kappa réaliserait l’étape
d’insertion et pol Zeta l’étape d’extension (Ziv et al., 2009) . D’ailleurs, il a été montré que le
duo pol Kappa/ pol Zeta est capable de franchir les lésions induites par le cisplatine, in vivo,
alors que ces lésions sont bloquantes in vitro (Shachar et al., 2009).
81
Partie I : Introduction générale
C.
Rôle dans la réparation de l’ADN endommagé
Figure 19 : Différentes voies de réparation de l’ADN endommagé
Description des voies de réparation par excision de nucléotides (NER) et par recombinaison homologue
(HR). Les dommages induits par les UV sont réparés par le NER, tandis que les cassures doubles brins ou
les lésions interbrins sont réparées par la recombinaison homologue.
(Adapté de (Shaheen et al., 2011))
1.
Pol Kappa et les dommages induits par les UV
Pol Kappa est incapable de franchir les dimères de pyrimidines ou les photoproduits,
in vitro (Zhang, Yuan, Wu, et al., 2000 ; Johnson, Prakash, et Prakash, 2000). Pourtant, les
MEFs pol kappa -/- sont hypersensibles aux rayonnements UV (Schenten et al., 2002).
Lorsqu’on réintroduit la forme sauvage de pol Kappa dans les MEFS pol Kappa -/-, la
résistance aux UV est restaurée ce qui n’est pas le cas avec la forme catalytiquement inactive
82
Partie I : Introduction générale
suggérant que l’activité catalytique de pol Kappa est requise pour la résistance aux UV. Ce
phénotype serait dû à l’implication de pol Kappa dans la réparation par excision de
nucléotides (NER) (Fig 19), puisque pol Kappa interviendrait pour combler la brèche après
excision du nucléotide lésé (Ogi et Lehmann, 2006).
2.
La réparation des ICLs
Les liaisons inter-brins de l’ADN (DNA interstrand crosslink ICL) sont toxiques pour la
cellule. Elles interviennent de façon spontanée, ou sont induites par des drogues utilisées en
chimiothérapie. Elles peuvent être réparées pendant ou en dehors de la phase S. La
réparation des ICL durant la phase S est assurée par la polymérase Zeta (Räschle et al.,
2008), cependant pol Zeta n’est pas indispensable pour la réparation des ICL en dehors de la
phase S chez les vertébrés (Williams, Gottesman, et Gautier, 2012) . In vitro, pol kappa est
capable d’insérer un nucléotide face des lésions inter-brins entre deux guanines (Minko et
al., 2008), ce qui en fait un candidat potentiel pour la réparation des ICL indépendante de la
réplication (RIR). La déplétion de pol Kappa dans des extraits de Xénope entraîne un défaut
du RIR, qui est restauré lorsque les extraits sont complémentés par la forme sauvage de pol
Kappa. Pol Kappa serait nécessaire pour le RIR. Les domaines d’interaction à l’ubiquitine et le
domaine catalytique de pol Kappa sont requis pour cette fonction. En effet, leurs mutations
ne restaurent pas le défaut du RIR. De plus, les MEFS pol Kappa-/- sont sensibles aux drogues
induisant des ICLs (Williams, Gottesman, et Gautier, 2012). Ces résultats sont intéressants,
car ils montrent un rôle de pol Kappa en dehors de la phase S, mais surtout qu’il existe deux
voies distinctes de réparation des ICLs, une en phase S et l’autre en dehors de la phase S. Le
rôle de pol Kappa dans la réparation des ICLs en dehors de la phase S permettrait de cibler
les cellules non proliférantes en thérapie.
3.
Rôle dans la recombinaison homologue
Chez T. Cruzi, la seule voie de réparation des cassures doubles brins est la recombinaison
homologue. Les enzymes nécessaires pour réaliser le NHEJ sont absentes chez T. Cruzi. La
réparation des radiations ionisantes se fait en trois étapes :
-
Arrêt de la croissance et expression des protéines de recombinaison
-
Augmentation de l’activité de réparation de l’ADN
83
Partie I : Introduction générale
-
Inhibition des protéines de la réparation par recombinaison
Les parasites exprimant pol Kappa améliore le temps de récupération après exposition
aux radiations ionisantes. De plus, l’expression de pol Kappa dans les parasites leur confère
une résistance aux traitements à la zéomycine, drogue qui induit des cassures doubles brins
ce qui suggère un rôle, in vivo, de pol Kappa dans la recombinaison homologue chez T. Cruzi
(Fig 19). Il a également été montré, in vitro, que pol Kappa était capable de promouvoir
l’extension de D-loop. Les structures D-loop miment un intermédiaire de recombinaison,
dans lequel un brin invasif sert de matrice (Rajão et al., 2009).
III. Régulation de pol Kappa dans les cellules de
mammifères
A.
La régulation de la fonction de pol Kappa
Il existe, à ce jour, peu d’études concernant les modifications post-traductionnelles
de pol Kappa. En 2008, Guo et ses collaborateurs montraient que pol Kappa murine pouvait
être mono-ubiquitinylée, au niveau des domaines UBZ (Guo et al., 2008). Plus récemment,
une étude a mis en évidence une interaction entre le C-terminal de pol Kappa et une E3
ubiquitine ligase TRIP, renforçant l’idée que pol Kappa humaine pourrait être ubiquitinylée
(Wallace et al., 2014). Des analyses protéomiques à large échelle nous ont donné des
informations concernant les lysines pouvant être ubiquitinylées. Seules 4 lysines sont
retrouvées dans au moins deux études (K173, K461, K541, et K684) (pour revue (McIntyre et
Woodgate, 2015)).
En plus de l’ubiquitination, il a été montré chez C. elegans, que GEI-17, connu pour
sumoyler pol Eta et la protéger de la dégradation, peut aussi agir sur pol Kappa (Roerink et
al., 2012). Il est donc possible que pol Kappa soit sumoylée in vivo. D’ailleurs, il a été
récemment mis en évidence que 6 lysines de pol Kappa pouvait être sumoylées, dont 3
pourraient aussi être ubiquitinylées (Hendriks, D’Souza, et Yang, 2014).
84
Partie I : Introduction générale
Néanmoins, la fonction biologique de ces modifications post-traductionnelles de pol
Kappa reste inconnue mais on peut penser qu’elles seraient un moyen de réguler la
présence de pol Kappa au niveau des machineries de réplication.
Les modifications post-traductionnelles de pol Kappa ne sont pas le seul moyen de
réguler son recrutement à la chromatine puisque sa fonction dans la synthèse
translésionnelle requiert la mono-ubiquitination de PCNA (Guo et al., 2008) . En absence de
traitement génotoxique exogène, la déplétion d’USP1, une dé-ubiquitinase de PCNA,
entraîne une persistance de PCNA-monoubiquitinylé, et un recrutement aberrant de pol
Kappa au niveau de la réplication normale, ce qui génère de l’instabilité génétique mise en
évidence par la formation de micronoyaux (Jones, Colnaghi, et Huang, 2012).
B.
Dérégulation de l’expression de pol Kappa dans les
cancers : conséquences sur la stabilité génomique
Des études à large échelle sur des patients atteints de cancers différents ont montré
que l’expression des gènes des ADN polymérases translésionnelles était fréquemment
altérée. Pol Kappa est associée à des stades avancés et à une courte survie chez des patients
atteints de gliomes. Cette association a été identifiée comme indépendante du facteur
pronostic de la maladie (Wang et al., 2010). Pol Kappa est également retrouvée surexprimée
dans les tumeurs du poumon en comparaison aux tissus sains adjacents (Wang et al., 2004) .
Dans des lignées cancéreuses du poumon, la réintroduction de p53 réprime
l’expression de pol Kappa. Il a été montré que dans des MEFs p53 -/-, le niveau d’expression
de pol Kappa était augmenté (Wang et al., 2004) . De façon concomitante, le niveau des
transcrits de pol Kappa est augmenté dans des cellules RKO p53 -/- en comparaison, aux
cellules normales (Velasco-Miguel et al., 2003). Le suppresseur de tumeur p53 apparait
comme étant un régulateur de pol Kappa. De plus, pol Kappa apparait souvent surexprimée
dans les cancers du poumon à non petites cellules cellules (O-Wang et al., 2001 ; Wang et
al., 2004). Etant donné la capacité de pol Kappa à franchir les dommages provoqués par le
benzo[a]pyrène, présent dans les fumées de cigarette, les cellules surexprimant pol Kappa
pourraient être sélectionnées afin de tolérer des dommages. Mon équipe d’accueil a montré
85
Partie I : Introduction générale
que la surexpression de pol Kappa mène à une augmentation de la mutagénèse spontanée
dans les cellules MRC5 (Bergoglio et al., 2002), à une augmentation des cassures doubles
brins, caractérisées par une augmentation de foyers γH2AX, à une perte d’hétérozygotie, à
une augmentation de l’aneuploïdie, et qu’elle favorise la tumorigénèse chez la souris nude
(Bavoux et al., 2005). De plus, la surexpression de pol Kappa entraîne une perturbation du
programme de réplication sans que la voie ATR/Chk1 ne soit activée. Il est proposé que la
surexpression de pol Kappa entraine un stress chronique en dessous du seuil d’activation de
la voie ATR/Chk1 mais suffisant pour induire de l’instabilité génétique au cours des cycles
cellulaires successifs (Pillaire et al., 2007).
Une étude de mon équipe, montre que la région 5’ du gène POLK possède des sites
de liaison consensus à des facteurs de transcription SP1 et CREB. Une mutation dans le site
consensus de SP1 ou CREB engendre une diminution de l’activité du promoteur de pol
Kappa, tandis que l’expression ectopique de SP1 promeut la transcription de pol Kappa. De
façon intéressante, la sous-expression de Pol Kappa dans des biopsies de cancers
colorectaux est associée à la diminution de l’expression de CREB et SP1 (Lemée et al., 2007).
Pol kappa apparait sous-exprimée dans de nombreux cancers (Pillaire et al., 2010)
D’ailleurs, la sous-expression de pol Kappa dans les cellules entraine une augmentation de la
phosphorylation de l’histone γH2AX, signifiant une augmentation des cassures double brins
(Bétous et al., 2009). Les souris pol kappa -/- présente un phénotype mutateur de façon
spontanée (Stancel et al., 2010).
Etant donné les conséquences drastiques des modifications du taux intracellulaire de
pol Kappa, il semble que la régulation de cette enzyme, bien que méconnue, joue un rôle clé
pour dans le maintien la stabilité génomique.
86
Partie I : Introduction générale
Objectifs du travail de thèse
Comme nous avons pu le voir dans l’introduction, les fourches de réplication rencontrent
souvent des obstacles de nature endogène (ADN structuré, déplétion du pool de
nucléotides…), ou de nature exogène (lésions induites par les UV…), qui bloquent l’avancée
des ADN polymérases réplicatives. Ces arrêts de fourches doivent être pris en charge au sein
de la cellule afin d’éviter la formation de cassures doubles brins de l’ADN, vecteurs
d’aberrations chromosomiques et donc d’instabilité génétique. Afin de remédier à ces arrêts
de la réplication, la cellule met en place différentes voies de réponse:
Les voies de tolérance via la synthèse translésionnelle réalisée par des ADN polymérases
spécialisées ou la voie de contournement des lésions et l’activation du checkpoint de phase
S. Mes travaux s’intéressent à la connexion entre ces deux voies puisque nous avons mis en
évidence l’implication de pol Kappa, ADN polymérase spécialisée, dans l’activation du point
de contrôle de phase S. L’objectif de mon travail a été de comprendre le rôle joué par pol
Kappa dans cette voie de signalisation du stress réplicatif.
Ainsi ce travail se présente en trois grandes parties :
- La première partie traite de la découverte de l’implication de Pol Kappa dans le checkpoint
de phase S et de l’étude des mutants de pol Kappa.
- La deuxième partie aborde l’importance de pol Kappa dans la régulation de Chk1 et la corégulation du complexe Chk1/pol Kappa par l’ubiquitine hydrolase USP7.
-La troisième partie tente d’identifier les régions génomiques où pol Kappa pourraient
exercer sa fonction au sein du checkpoint de phase S et nous y verrons une possible
intervention de pol Kappa au niveau de régions d’hétérochromatine.
87
Partie I : Introduction générale
88
Partie II : Résultats
Partie II : Résultats
89
Partie II : Résultats
I.
ADN polymérase Kappa et checkpoint de phase S
A. Découverte de l’implication de pol Kappa dans le
checkpoint de phase S
1.
Contexte et objectifs
L’avancée des fourches de réplication peut être entravée par des barrières de
fourches, comme décrit dans l’introduction. Le blocage de la réplication, s’il n’est pas pris en
charge, génère du stress réplicatif, se traduisant par l’apparition de cassures de l’ADN et
des réarrangements chromosomiques. Une des réponses est le checkpoint de phase S via
l’activation de la voie ATR/Chk1. Une autre réponse aux fourches bloquées est l’activation de
voies de tolérance des dommages et Pol Kappa y participe par son activité de synthèse
translésionnelle (TLS). Pol Kappa appartient à la famille Y des ADN polymérases. Les souris
déficientes pour pol Kappa présentent un phénotype mutateur (Stance et al, 2009), et une
augmentation des répétitions en tandem (Burr et al, 2006). De plus, il a été montré que
l’orthologue de pol Kappa, DinB, chez S. pombe interagit avec Rad1 et Hus1, sous-unités du
complexe PCNA-like Rad9/Rad1/Hus1 requis durant le checkpoint de phase S (Kai et Wang
al, 2003). Ainsi ces données suggèrent que Pol Kappa puisse avoir un rôle en dehors de la
synthèse translesionnelle. Dans l’étude qui suit nous avons recherché quelles étaient les
conséquences de l’absence de pol kappa sur la stabilité génomique. Nous montrons une
implication de pol Kappa dans le checkpoint de phase S. Les cellules dépourvues de pol
Kappa présentent un défaut de phosphorylation de Chk1, et donc un checkpoint inactif. De
plus, grâce à des extraits d’œufs de Xénope immunodéplétés en pol kappa, nous montrons
que la synthèse d’ADN par pol Kappa au niveau des fourches bloquées est requise pour une
activation du checkpoint de phase S.
A mon arrivée en thèse, j’ai pris part à ces travaux, qui ont donné lieu à un article.
Par la suite, je me suis attachée à décrypter les mécanismes moléculaires impliqués dans
cette nouvelle fonction de pol Kappa au niveau du checkpoint de phase S.
90
Partie II : Résultats
2.
ARTICLE: “DNA polymerase κ-dependant DNA synthesis at
stalled replication forks is important pour chk1 activation.” Embo
Journal, 2013
91
Partie II : Résultats
92
The EMBO Journal (2013) 32, 2172–2185
www.embojournal.org
THE
EMBO
JOURNAL
DNA polymerase j-dependent DNA synthesis at
stalled replication forks is important for CHK1
activation
Rémy Bétous1,2,6,
Marie-Jeanne Pillaire1,2,6, Laura Pierini1,2,
Siem van der Laan3, Bénédicte Recolin3,7,
Emma Ohl-Séguy1,2, Caixia Guo4,
Naoko Niimi5, Petr Grúz5,
Takehiko Nohmi5, Errol Friedberg4,
Christophe Cazaux1,2,
Domenico Maiorano3,*
and Jean-Sébastien Hoffmann1,2,*
1
Equipe Labellisée La Ligue Contre le Cancer 2013, INSERM UMR 1037,
CNRS ERL 505294, CRCT (Cancer Research Center of Toulouse),
Toulouse, France, 2University of Toulouse; UPS, Toulouse, France,
3
Institut de Génétique Humaine (IGH), CNRS—UPR 1142, Montpellier
Cedex 5, France, 4Department of Pathology, The University of Texas
Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA and 5Division of Genetics
and Mutagenesis, National Institute of Health Sciences, Tokyo, Japan
Formation of primed single-stranded DNA at stalled
replication forks triggers activation of the replication checkpoint signalling cascade resulting in the ATR-mediated
phosphorylation of the Chk1 protein kinase, thus preventing
genomic instability. By using siRNA-mediated depletion in
human cells and immunodepletion and reconstitution
experiments in Xenopus egg extracts, we report that the
Y-family translesion (TLS) DNA polymerase kappa (Pol j)
contributes to the replication checkpoint response and is
required for recovery after replication stress. We found that
Pol j is implicated in the synthesis of short DNA intermediates at stalled forks, facilitating the recruitment of
the 9-1-1 checkpoint clamp. Furthermore, we show that
Pol j interacts with the Rad9 subunit of the 9-1-1 complex.
Finally, we show that this novel checkpoint function of
Pol j is required for the maintenance of genomic stability
and cell proliferation in unstressed human cells.
The EMBO Journal (2013) 32, 2172–2185. doi:10.1038/
emboj.2013.148; Published online 25 June 2013
Subject Categories: genome stability & dynamics
Keywords: DNA polymerase k; genetic instability; replication
checkpoint; replication stress
*Corresponding author. D Maiorano, Institut de Génétique Humaine
(IGH), CNRS—UPR 1142, 141 rue de la Cardonille, 34396 Montpellier
Cedex 5, France. Tel.: þ 33 4 34 35 99 73; Fax: þ 33 4 34 35 99 01;
E-mail: [email protected] or
J-S Hoffmann, Equipe Labellisée La Ligue Contre le Cancer 2013,
INSERM UMR 1037, CNRS ERL 505294, CRCT (Cancer Research Centre
06 Toulouse)Toulouse 31077, France.
Tel.: þ 33 5 61 17 59 75; Fax: þ 33 5 61 17 59 94; E-mail: [email protected]
6
These authors contributed equally to this work.
7
Present address: Department of Experimental Oncology, University
Medical Center Utrecht, Stratenum 2.241, Universiteitsweg 100, 3584 CG
Utrecht, The Netherlands.
Received: 21 November 2012; accepted: 4 June 2013; published
online 25 June 2013
2172 The EMBO Journal VOL 32 | NO 15 | 2013
Introduction
Common impediments to replication fork progression include
exogenous and endogenous DNA damage, natural structured
DNA, or tightly associated DNA–protein complexes that disturb
the progression of the replicative DNA polymerases a, d and e.
Failure to stabilize and restart stalled forks or prolonged arrest
of replication forks (replication stress) may result in fork
collapse, leading to chromosomal breakage and rearrangement.
Cells have evolved several mechanisms to deal with the constant challenge of replication stress. These include systems to
detect and repair damaged DNA, and replication checkpoints
that sense stalled replication forks in S phase to direct appropriate cellular responses (Nyberg et al, 2002; Ciccia and
Elledge, 2010). When these checkpoints are defective, cells
enter cell division with uncompleted DNA replication, and as
a consequence genetic instability is increased.
The ATR signalling pathway is crucial in regulating the
replication stress response to a large array of insults such as
DNA damaging agents and chemicals that cause replication
arrest (Melo and Toczyski, 2002; Cimprich and Cortez, 2008).
Many of these types of replication arrest cause functional
uncoupling of the MCM helicase and replicative DNA
polymerase activities at replication forks, resulting in
production of long stretches of RPA-coated single-stranded
DNA (ssDNA) (Byun et al, 2005; Cortez, 2005). In turn,
accumulation of the major ssDNA binding protein RPA onto
this substrate is thought to trigger the primary checkpoint
signalling (Zou et al, 2003), although more recent data
suggest that the role of RPA in this process may be indirect,
by allowing formation of replication forks and very likely by
stimulating DNA polymerase a (Pol a)-dependent synthesis
of replication intermediates that strongly contribute to
checkpoint activation (Van et al, 2010; Recolin et al, 2012
and see below). The ATR checkpoint pathway is known to
involve the independent translocation of multicomponent
protein complexes to damage sites followed by the
phosphorylation of the main ATR effector, the protein
kinase Chk1 (Zou et al, 2002; Cimprich and Cortez, 2008).
ATR activation requires its localization at stalled forks with
its partner ATRIP (ATR Interacting Protein) as well as the
heterotrimeric 9-1-1 complex and the ATR activator TopBP1,
which are recruited independently of ATR-ATRIP. TopBP1
interacts with both the 9-1-1 complex and ATR-ATRIP
complexes, and it plays a role in loading and/or stabilizing
the 9-1-1 complex on damaged chromatin (Delacroix et al,
2007; Mordes et al, 2008; Yan and Michael, 2009; Gong et al,
2010). An alternative RFC-containing Rad17 complex loads
the 9-1-1 complex to primers synthetized by DNA polymerase
alpha (Pol a) (Zou et al, 2002; Ellison and Stillman, 2003) and
the interaction between Rad9 and TopBP1 positions TopBP1
for ATR activation (Furuya et al, 2004; Delacroix et al, 2007).
In addition, the regulatory protein Claspin has been shown to
be required for ATR-dependent phosphorylation of Chk1
& 2013 European Molecular Biology Organization
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
(Liu et al, 2006). Previous studies have shown that DNA
synthesis also is required for checkpoint activation (Michael
et al, 2000; Lupardus et al, 2002). A recent study has shown
that continued synthesis and elongation of new DNA primers
on ssDNA templates represent an additional key step in
checkpoint activation (Van et al, 2010).
An important part of the cellular response to replication
arrest or stalling by DNA damage is the induction of DNA
damage tolerance pathways. The human Y-family DNA polymerases (Pol Z, Pol k, Pol i, and Rev1) participate in these
pathways by facilitating the replicative bypass of DNA
lesions. Y-family DNA polymerases promote damage
tolerance in part through their ability to insert nucleotides
opposite to DNA lesions that block the replicative DNA
polymerases, a process termed as translesion synthesis
(TLS) (Friedberg et al, 2002). Translesion polymerases may
function directly at the replication fork (Friedberg, 2005), or
may fill in postreplication gaps containing lesions that are left
behind by replication forks (Lopes et al, 2006; Callegari et al,
2010). Ubiquitylation of PCNA, which is dependent upon the
E2 ubiquitin-conjugating enzyme Rad6 and the E3 ubiquitin
ligase Rad18, facilitates these processes (Friedberg
et al, 2005). Pol k, an 870 amino-acid residue Y-family
polymerase related to DNA polymerase IV of Escherichia
coli, can replicate past several bulky adducts in DNA
in vitro, and cellular studies have shown a role for Pol k in
TLS past lesions such as benzo(a)pyrene-DNA adducts (Ogi
et al, 2002). However, Pol k differs from the three other
Y-family human DNA polymerases in that mice lacking Pol k
exhibit, besides a spontaneous mutator phenotype which
could be explained by defective TLS across endogenously
generated adducts (Stancel et al, 2009), increased tandem
repeat mutations (Burr et al, 2006) suggesting that Pol k
could have other roles in addition to TLS. An important, as
yet unsolved question is how TLS and replication checkpoint
activities are coordinated at stalled replication forks to
maintain genomic stability while ensuring the resumption
of DNA replication. In the yeast S. pombe, it was previously
observed that DinB, an orthologue of Pol k, and the Rad1 and
Hus1 components of the 9-1-1 complex interact, suggesting a
role for Pol k in checkpoint responses although the
significance of this interaction has not been further
explored (Kai and Wang, 2003). We have investigated
this issue in both Xenopus extracts and mammalian cells,
and provide evidence that Pol k has an additional TLSindependent function in replication checkpoint activation
when the replication fork progression is impeded by either
nucleotide starvation or upon inhibition of the replicative
polymerases. We show that Pol k fulfils this novel checkpoint
function by participating in DNA synthesis on ssDNA at
stalled replication forks. We also show that Pol k is
required in otherwise unstressed human cells for normal
S-phase progression, nuclear replication factory maturation
and the maintenance of genomic stability by preventing the
persistence of under-replicated regions in mitosis.
Results
Activation of the replication checkpoint is deficient
following Pol j depletion
Short-interfering (si) RNA-mediated Pol K gene silencing was
achieved in the human U2OS, MRC5 and HeLa cell lines, with
& 2013 European Molecular Biology Organization
substantial depletion of Pol k (80–90% depletion) by four
independent siRNAs or a pool of siRNAs (Figure 1A and B;
Supplementary Figure S1A and B). Significant RNAimediated depletion of Pol k was achieved without significantly altering the expression of other replicative or Y-family
TLS DNA polymerases (Supplementary Figure S1C). We
then assayed Chk1 phosphorylation on serine 345 in Pol
k-depleted human cells in response to nucleotide starvation
by Hydroxyurea (HU), a strong inducer of replication stress
widely used to investigate responses to DNA damageindependent replication fork arrest (Lopes et al, 2001;
Sogo et al, 2002). We observed a strong and reproducible
attenuation of Chk1 phosphorylation when Pol k was downregulated in several human cell lines (U20S, MRC5 and 293T
cells) treated with HU as compared with their counterparts
Pol k-proficient cells (Figure 1A and B; Supplementary Figure
S1D). As can be seen in Supplementary Figure S1E, the level
of neither ATR, ATRIP, Rad9, Hus1, Pol d nor TopBP1 was
affected following Pol k depletion, supporting that defective
Chk1 phosphorylation is not due to the downregulation of
these essential checkpoint factors. Importantly, expression
of wild-type Pol k in siRNA-mediated Pol k-depleted cells
significantly rescued defective Chk1 phosphorylation
(Figure 1C). Defective Chk1 phosphorylation was reproduced
in Pol k-knockout primary Murine Embryonic Fibroblast
(MEF) cells (Supplementary Figure S1F), and was not
observed upon knockdown of Pol Z, another Y-family translesion polymerase member (Figure 1D; Bergoglio et al, 2013),
demonstrating that this phenotype is Pol k specific.
Furthermore, while ectopic expression of wild-type Pol k
did not change the level of Chk1 phosphorylation after HU
(Supplementary Figure S1G), expression of catalytically inactive Pol k (DEAD Pol k) in which two critical active site
residues (D198A and E199A) in the catalytically active site
had been mutated (Gerlach et al, 2001) mimics the effect of
POL K gene silencing (Figure 1E), suggesting that Pol k
catalytic activity may be important for checkpoint activation.
We also found that Pol k is recruited to chromatin after HU
treatment, underlining a requirement of Pol k in the response
to fork stalling (Supplementary Figure S2A).
In order to obtain more insight in the molecular
mechanism by which Pol k promotes Chk1 phosphorylation,
we used extracts derived from activated Xenopus eggs naturally synchronized in S-phase. This system recapitulates
in vitro the regulated activation of the replication checkpoint
upon addition of demembranated sperm chromatin,
and is amenable to biochemical manipulation (Costanzo
and Gautier, 2004). We first generated Xenopus Pol k
(XPol k)-specific antibodies (see Materials and methods and
Supplementary Figure S3A) to deplete XPol k from egg
extracts (Figure 2A). We then assessed checkpoint activation
after stalling replication forks with either aphidicolin or UV
irradiation. Aphidicolin induces fork stalling like HU by
inhibiting the activity of replicative DNA polymerases,
while UV-induced lesions physically stall replicative DNA
polymerases and induce both strong replication fork uncoupling and Chk1 phosphorylation (Byun et al, 2005). We
observed a strong reduction in Chk1 phosphorylation upon
removal of XPol k, either after aphidicolin (Figure 2B) or UV
treatment (Supplementary Figure S3B), as observed in mammalian cells (Figure 1; Supplementary Figure S1D and S2B).
Addition of purified recombinant Pol k to egg extracts
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2173
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
Figure 1 Pol k is required for Chk1 phosphorylation after replication stress in human cells. (A, B) Western blot analysis of cell extracts from
Human U2OS and MRC5 untransfected (unt) or transfected with control luciferase siRNA (si-luc), Pol k siRNA (si-k1, si-k2, D-si-k), untreated
or treated with HU (2 mM, 3 h). Cell extracts were fractionated and soluble fractions were analysed with the indicated antibodies.
Quantification was performed by ImageJ software; means±s.d. were presented. (C) Western blot analysis of whole cell extracts prepared
from 293T cells treated with HU (2 mM, 3 h) transfected by si-RNA alone (si-luc or si-k3’UTR) or co-transfected by si-k30 UTR and a vector
expressing FLAG-tagged wild-type Pol k (k-WT). (D, E) Pol Z depletion with Pol Z siRNA (si-Z) or transfection with vector expressing
the FLAG-tagged catalytic inactive mutant of Pol k (Pol k-Dead) was performed in MRC5 cells untreated or treated with HU (2 mM, 3 h).
Source data for this figure is available on the online supplementary information page.
depleted of XPol k totally rescued defective Chk1 phosphorylation (Figure 2B), demonstrating that Pol k on its own
rather than co-immunodepleted proteins is responsible for
checkpoint activation, further demonstrating the specificity of
Pol k in this process. Since DNA synthesis is essential for
establishment of the S-phase checkpoint (Michael et al, 2000;
Lupardus et al, 2002; Recolin et al, 2012), we next verified
that DNA replication occurs upon removal of Xpol k
(Figure 2D), demonstrating that Xpol k is not required for
bulk chromosomal replication, and excluding an indirect
effect on replication forks formation.
2174 The EMBO Journal VOL 32 | NO 15 | 2013
We also obtained independent evidence that Xenopus Pol
k-immunodepleted extracts display a deficient ATR/Chk1
signalling pathway by monitoring replication of chromatin
containing UV blocking lesions which leads to DNA synthesis
slow down (Lupardus et al, 2002; Byun et al, 2005). As can be
seen in Figure 2C, the slow-down of DNA synthesis observed
upon UV irradiation of sperm chromatin in control extracts
(DMock) could be alleviated by addition of caffeine, an ATR/
ATM inhibitor. In contrast, extracts lacking XPol k (DXPol k)
displayed a high degree of UV-resistant DNA synthesis
that was not enhanced by addition of caffeine (Figure 2C),
& 2013 European Molecular Biology Organization
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
Figure 2 Pol k depletion from Xenopus egg extracts affects Chk1 phosphorylation. (A) Xenopus egg extracts were either mock depleted
(DMock) or depleted with an anti-XPol k-specific antibody (DXpol k) as described in Materials and methods. Egg supernatants after depletion
were analysed by western blotting with the indicated antibodies. (B) Analysis of Chk1P-S344 in mock-depleted or XPol k-depleted extracts
treated with ( þ ) or without ( ) aphidicolin (15 mM) and reconstituted with 25 ng of recombinant Pol k (R-Pol k) performed as in B. Chk1 was
used as the loading control. (C) Kinetics of DNA synthesis of mock-depleted (DMock; left panel) or XPol k-depleted (DXPol k; right panel) egg
extracts in both the presence ( þ ) or absence ( ) of UV irradiation (800 J/m2) and absence ( ) or presence of 5 mM caffeine. The extent of
DNA synthesis of both extracts is expressed as percent (%) of the input DNA added to egg extracts at time ¼ 0. Source data for this figure is
available on the online supplementary information page.
suggesting repression of the replication checkpoint. Chk1
phosphorylation after fork stalling is thought to suppress
origin initiation largely by inhibiting the activation of new
replication factories, thus reducing the number of active
factories (Maya-Mendoza et al, 2007). Hence, these results
may suggest that Pol k- immunodepleted extracts are not able
to regulate the suppression of origin firing after UV-induced
fork stalling and that Pol k is epistatic to ATR/Chk1.
Collectively, the results presented in Figures 1 and 2 show
that Pol k is required to promote Chk1 phosphorylation in
response to replication fork stalling and suggest that Pol k
catalytic activity may be implicated in this process.
Pol j is implicated in formation of small nascent DNA in
response to replication stress in Xenopus egg extracts
Next we characterized the defect in Chk1 phosphorylation
observed upon removal of Xpol k from egg extracts at the
molecular level, in order to determine at which step of the
checkpoint signalling pathway Xpol k is required. We first
investigated whether depletion of XPol k resulted in removal
of the main checkpoint sensors from egg extracts. As can be
seen in Figure 3A, neither ATR, TopBP1, RPA, the Rad9
subunit of the 9-1-1 complex nor Chk1 was co-depleted
by the XPol k antibody, further supporting that inhibition of
Chk1 phosphorylation is not due to quantitative removal of
these essential checkpoint factors, similarly to what observed
in human cells (Supplementary Figure S1E). DNA replication
inhibitors, such as aphidicolin, cause functional uncoupling
of the MCM helicase and replicative DNA polymerase activities at replication forks, resulting in the formation of long
stretches of RPA-bound ssDNA. We therefore verified whether
replication fork uncoupling occurs in the absence of Xpol k
by monitoring the recruitment of RPA to chromatin after
replicative stress. We observed that RPA recruitment was
unaffected after aphidicolin treatment in the absence
& 2013 European Molecular Biology Organization
of XPol k (Figure 3B) or upon stalling of replication forks by
UV irradiation (Supplementary Figure S3C), suggesting that
replication fork unwinding was not perturbed.
Recent work has demonstrated that short DNA products
accumulate on ssDNA templates in response to fork stalling
by aphidicolin and strongly contribute to checkpoint activation (Van et al, 2010). These DNA products are longer than
the size normally synthesized by Pol a, and a subset of them
are generated by Pol d, most probably on the lagging strand.
The leading strand replicative polymerase Pol e, in contrast,
does not appear to play a significant role in the synthesis of
these DNA products (Van et al, 2010). Since chromosomal
DNA synthesis is not inhibited upon depletion of XPol k from
Xenopus egg extracts (Figure 2D), we then determine whether
Pol k is involved in the generation of small nascent DNAs at
arrested forks by analysing replication intermediates formed
in Pol k-depleted extracts upon stalling forks with aphidicolin
as previously described (Van et al, 2010). To this end, we
monitored the incorporation of a radiolabelled nucleotide
precursor into low molecular weight DNA intermediates in
both control (DMock) and Pol k-depleted extracts (DXPolk in
the absence and presence of aphidicolin 40, 60 or 90 min after
chromatin template addition (Figure 3C; Supplementary
Figure S3D). Synthesis of 25–150 nt-long nascent DNAs
in response to aphidicolin treatment could be observed
in control extracts (DMock, Figure 3C; Supplementary
Figure S3D), confirming previous data (Van et al, 2010).
Strikingly, these short DNA products were greatly reduced
in Pol k-depleted extracts (DXPolk, Figure 3C; Supplementary
Figure S3D), suggesting that replication intermediates formed
in aphidicolin-treated egg extracts depend upon XPol k. This
finding is in agreement with the observation that, in contrast
to the three replicative DNA polymerases Pol d, Pol e and Pol
a, Pol k is not inhibited by aphidicolin (Gerlach et al, 2001).
Importantly, we verified that this phenotype was not due to
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2175
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
Figure 3 Pol k is required for the accumulation of small nascent DNA in response to replication stress in Xenopus egg extracts. (A) The
abundance of checkpoint factors in extracts Mock-depleted (DMock) or XPol k-depleted (DXPol k) was analysed by immunoblotting.
(B) Chromatin binding of RPA in egg extracts mock depleted or depleted with XPol k antibodies in the absence ( ) or presence ( þ ) of
aphidicolin. (C) Sperm chromatin was replicated in egg extracts mock depleted (DMock) or depleted with XPol k antibodies (DXPol k)
containing 15 mM aphidicolin (APH) and a-[P32]dCTP. At 40, 60 and 90 min, total DNA was purified as described (Van et al, 2010), replication
intermediates were fractionated by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and detected by autoradiography after exposure to a
PhosphoImager screen (Molecular Dynamics). Abundance of 25–150 nt long DNA intermediates was quantified by densitometric scanning and
analysed with ImageJ software. (D) Sperm chromatin was incubated in control (DMock) or XPol k (DXPol k)-depleted egg extracts in the
presence of aphidicolin (15 mM) for 60 min. Chromatin fractions were analysed by immunoblotting with the indicated antibodies. Western
blot signals were quantified with ImageJ software, normalized to histone H3 signals. (E) Analysis of XPol k chromatin binding.
Demembranated sperm nuclei (2000 nuclei/ml of egg extract) were incubated in egg extracts for 90 min in the presence ( þ ) or absence
( ) of 15 or 750 mM aphidicolin. Chromatin fractions were obtained as described in Materials and methods and analysed by immunoblotting
with the indicated antibodies. Source data for this figure is available on the online supplementary information page.
2176 The EMBO Journal VOL 32 | NO 15 | 2013
& 2013 European Molecular Biology Organization
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
removal of Pol d and Pol a from Pol k-depleted extracts
(Supplementary Figure S3E).
The presence of stable 50 ends of primer-template junctions
constitutes the likely binding sites for the 9-1-1 complex
(Ellison and Stillman, 2003). Thus, we reasoned that the
defect in synthesis of these replication intermediates in the
absence of XPol k might also affect the loading of the 9-1-1
complex onto chromatin. Therefore, we determined whether
Pol k depletion affects recruitment of the Rad9 subunit of the
9-1-1 complex to chromatin after aphidicolin treatment.
We found that recruitment of the Rad9 subunit of the 9-1-1
complex after aphidicolin treatment was strongly reduced in
the absence of Pol k (Figure 3D) and that addition of purified
recombinant Pol k to egg extracts depleted of XPol k restored
recruitment of Rad9 (Supplementary Figure S3F). We next
investigated the binding of Pol a, Pol d, Pol k, PCNA and
Rad9 onto chromatin during DNA replication in the absence
of aphidicolin, or in the presence of two concentrations of
aphidicolin, a low dose (15 mM) that does not inhibit Pol a and
a high dose (750 mM) that prevents the primer synthesis by
Pol a (Byun et al, 2005) (see Figure 3E). The data
clearly show that in the absence of aphidicolin, only the
replication factors Pol a, Pol d, and PCNA are loaded, as
expected. Similarly to what observed in mammalian cells
(Supplementary Figure S2A), in Xenopus egg extracts Pol k
is recruited to chromatin upon replication stress (15 mM aphidicolin) together with Rad9, further supporting the requirement of Pol k for the replication checkpoint upon replication
stress (Figure 3E). In contrast, in the presence of high doses of
aphidicolin only Pol a was chromatin bound while PCNA, Pol
d and Rad 9 were not (Figure 3E), as expected (Michael et al,
2000; Byun et al, 2005; Maiorano et al, 2005). In these
conditions, Pol k was not chromatin bound, suggesting that
similar to PCNA and Rad9, its recruitment is dependent on the
primer synthesis by Pol a upon replication stress. Finally, we
performed a series of immunoprecipitation experiments using
Pol d, Pol k or Rad9 antibodies (see Supplementary Figure S3G
and H). The data obtained clearly indicate that XPol k interacts
with XRad 9, but not with Pol d nor with Pol a. Collectively,
these results show that Pol k is implicated in the synthesis of
short DNA intermediates, which in turn may facilitate recruitment of the 9-1-1 complex at stalled forks and consequently
contribute to efficient activation of the replication checkpoint.
Pol j suppresses the formation of ssDNA induced by
replicative stress
Next, we monitored formation of ssDNA in S phase in human
cells after HU treatment and downregulation of Pol k. For this
purpose, ssDNA was detected by immunofluorescence in
PCNA-positive nuclei using a bromodeoxyuridine-based
assay. In this assay only BrdU contained in ssDNA is detected
by anti-BrdU antibody staining under non-denaturing conditions (Raderschall et al, 1999). As seen in Figure 4A and B,
around 70–80% of both control and Pol k-depleted S-phase
cells (PCNA positives) are ssDNA positive after treatment
with 2 mM HU for 3 h (R0). This observation indicates that in
mammalian cells Pol k depletion does not affect replication
fork uncoupling, consistent with what observed in Xenopus
egg extracts (Figure 3B). In addition, after HU treatment,
cells were released into fresh medium and the proportion
of ssDNA-positive cells 3 h after release was determined
(R3 in Figure 4A and B). Surprisingly, we found that
& 2013 European Molecular Biology Organization
Figure 4 Pol k suppresses formation of single-stranded DNA induced by replicative stress upon recovery from an HU block.
(A, B) Persistence of BrdU-positive cells in Pol k-deficient cells 3 h
after release from HU. Exponentially growing MRC5 cells were
transfected with the indicated si-RNA; 48 h later cells were treated
with 2 mM HU for 3 h and collected (R0) or released for 3 h in fresh
medium (R3). Detection of BrdU (green) and PCNA (red) was
performed in non-denaturating conditions. DNA was counterstained
with DAPI. IgG1/488 and -/555 were controls of immunodetections.
Examples of negative and positive cells for BrdU labelling at R0 and
R3 are shown in A; scale bar 10 mm. (B) At least 150 MRC5 were
randomly acquired with wide field microscopy and BrdU-positive
nuclei in PCNA-positive nuclei were quantified in three independent
experiments. Standard deviations were indicated by error bars and a
t-test was applied (*Po0.05). (C) Increased level of Ub-PCNA onto
chromatin after HU in Pol k-deficient cells. Extracts of MRC5
cells transfected with si-luc or si-k1 were fractionated. Soluble
and chromatin fractions were then subjected to immunoblotting
with the indicated antibodies. Actinin and MCM7 served as loading
controls for soluble and chromatin fractions, respectively. Source
data for this figure is available on the online supplementary
information page.
Pol k-depleted cells had a significantly higher proportion of
ssDNA-positive nuclei compared to control cells (Figure 4B),
suggesting that Pol k is important to suppress ssDNA during
the recovery from HU-mediated arrest.
To confirm this observation we used a second, independent
assay that consists in monitoring the monoubiquitylated form
of PCNA (Ub-PCNA). This post-translational modification is
generated in response to replication stress by the ubiquitin
E2–E3 complex composed of Rad6 and Rad18 and depends
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2177
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
upon replication fork uncoupling (Chang et al, 2006; Davies
et al, 2008). As shown in Figure 4C, higher amounts of
Ub-PCNA bound to chromatin were found in Pol k-depleted
cells compared to control cells, that persisted after recovery
from an HU block. Collectively, these results suggest that Pol
k is implicated in suppression of ssDNA after recovery from
replicative stress in human cells. Given that Pol k activity
promotes efficient phosphorylation of Chk1 after replicative
stress and that DNA synthesis on the unwound template is
required for checkpoint activation (Van et al, 2010), it is likely
that these two functional events may be mechanistically
linked (see Discussion).
Pol j depletion in unstressed cells perturbs replication
dynamics and affects genome stability
It has been reported that mice defective for the POL K gene
manifest a spontaneous genetic instability phenotype (Burr
et al, 2006; Stancel et al, 2009) but the mechanisms involved
in this phenotype remain thus far totally unknown. The novel
checkpoint function of Pol k might play a role in regulating
genomic stability under normal growth conditions. Indeed,
the replication checkpoint detects a variety of endogenous
replication-impeding events and responds by triggering
the ATR-mediated phosphorylation of Chk1 protein
kinase,
suppressing
replication-associated
genomic
instability (Petermann and Caldecott, 2006). We addressed
this issue by monitoring replication protein A (RPA) focus
formation in unstressed cells, which is indicative of
endogenous ssDNA accumulation due to fork stalling and/
or DNA damage. Pol k-deficient cells showed high levels of
RPA focus formation (Figure 5A, left panel) and a significant
increase in the number of RPA foci per nucleus (right panel)
as compared with control cells containing Pol k. Chromatin
fractionation followed by immunoblotting confirmed
recruitment of RPA to chromatin in otherwise unperturbed
Pol k-depleted cells by using two independent siRNAs
(Figure 5B) at levels comparable to what observed after UV
treatment, which served here as a positive control for replicative stress (lane UV). To verify that the additional recruitment of RPA is due to ssDNA accumulation at stalled forks
and not to firing of new replication origins, we checked the
recruitment of initiation factors such as Cdc45 and Pol a and
observed that they remained unchanged following Pol k
depletion (Supplementary Figure S4A). In order to determine
whether RPA recruitment depends upon Pol k catalytic
activity, we used a 30 UTR siRNA to deplete endogenous
Pol k, and then complemented Pol k-depleted cells with either
wild-type (catalytically active) or Dead (catalytically inactive)
Pol k. Complementing Pol k-depleted cells with wild-type,
and not with catalytically inactive Pol k suppressed the high
level of RPA recruitment to chromatin observed in Pol kdepleted cells (Figure 5C). Expression of Dead Pol k but not
wild-type Pol k, in the presence of endogenous Pol k, also
promoted high levels of RPA loading onto chromatin similar
to what seen in Pol k-depleted cells (Figure 5C). This result
suggests that the catalytically inactive Pol k might act in a
dominant-negative fashion in the presence of native Pol k.
In order to determine the status of the checkpoint in
unperturbed cells in the absence of Pol k, we monitored
Chk1 phosphorylation in Pol k-depleted cells. We found that
Chk1 phosphorylation was not significantly enhanced in the
absence of Pol k despite accumulation of RPA onto chromatin
2178 The EMBO Journal VOL 32 | NO 15 | 2013
(Figure 5B), suggesting that at least some of the spontaneous
stalled replication forks cannot trigger replication checkpoint
activation. These results collectively show that absence
of Pol k affects Chk1 phosphorylation even in unstressed
cells and leads to RPA focus formation, suggesting the presence of stalled, damaged forks and/or unwound DNA. We
observed a significant increase in g-H2AX focus formation in
Pol k-deficient cells relative to control cells, most noticeably
in S-phase cells (Supplementary Figure S4B). The increased
g-H2AX focus formation following Pol k depletion was still
observed in an NER-defective HeLa cell line (XPAKD cells)
(Biard et al, 2005; Supplementary Figure S4C), indicating that
phosphorylation of H2AX does not depend critically upon
the NER function of Pol k. Enhanced g-H2AX focus formation
was still observed in low (5%) oxygen conditions
(Supplementary Figure S4C), arguing that cellular oxidative
stress was unlikely to be the predominant stimulus for focus
formation.
Pol k depletion also affected replication factory dynamics
over the duration of S phase. Pol k-depleted cells contained
predominantly middle and late phase replication factories,
with fewer cells displaying early replication factory morphology compared to control cells (Figure 5D). Again, we
checked that the change in replication factory dynamics
was independent of endogenous oxidative stress (Figure 5D).
Together, these observations suggest that Pol k may
function at stalled forks also in unstressed cells. We thus
speculated that deficiency of Pol k in unstressed human cells
would result not only in under-replicated DNA or unresolved
replication intermediates in S phase, but also their persistence in mitosis in a checkpoint-blind manner. A recent study
shows that under-replicated regions persisting into mitosis
can be transmitted to daughter cells in 53BP1-shielded
nuclear bodies (Lukas et al, 2011). Therefore, we analysed
53BP1 nuclear body formation in G1 (Cyclin A negative)
nuclei from Pol k-depleted cells, and we compared it to mockdepleted cells (Figure 6). We found a significant increase in
the number of spontaneous 53BP1 nuclear bodies in G1 in the
absence of Pol k (Figure 6 A–C; Supplementary Figure S5B),
as hallmark of incomplete DNA replication during the previous cell cycle. These observations may explain why the
FACS profile of Pol k-depleted cells displays a mild elevated
fraction of cells in G2 and M phases (Figure 7A and B) which
could be slightly delayed, and a slower proliferation
than control cells (Figure 7C). Interestingly, increased
53BP1 nuclear body formation in G1 was also noticed
in Pol k-depleted cells after treatment with aphidicolin
(Figure 6 D–F; Supplementary Figure S5C). These experiments further support that Pol k is required to both prevent
incomplete replication intermediates and activate the replication checkpoint in the presence of endogenous or external
replication stress.
Discussion
DinB/ Pol k-like polymerases are found in all domains
of life and are among the most highly conserved of all the
TLS DNA polymerases (Waters et al, 2009). The ubiquity
of Pol k argues that this protein may contribute to additional
aspects of cell physiology in addition to its role in TLS
(Ogi et al, 2002; Avkin et al, 2004) and DNA repair
synthesis following the NER-mediated excision of
& 2013 European Molecular Biology Organization
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
Figure 5 Pol k depletion triggers perturbation of DNA replication program. (A) Increased RPA foci formation in nuclei from Pol k-depleted
cells. Left panel: MRC5 cells transfected with control siRNA (si-luc) or siRNAs targeting Pol k (si-k1) were randomly acquired (n4100 nuclei)
by confocal microscopy and quantification of RPA-positive nuclei was performed 48 h after transfection; DNA content was visualized by DAPI
staining. Right panel: cells transfected by the indicated siRNA were randomly acquired (n480 cells) with wide field microscopy and the
number of RPA foci per nucleus was automatically counted with ImageJ software; the distribution of the RPA foci per cell was presented and the
P-value determined with the non-parametric Mann–Whitney test was 0.011 (*). (B) RPA accumulation onto chromatin in Pol k-deficient cells.
Extracts of MRC5 cells transfected with control siRNA (si-luc) or siRNAs targeting Pol k (si-k1) were fractionated. Chromatin and soluble
fractions were then subjected to immunoblotting with the indicated antibodies. Extracts from the untransfected cells irradiated with UV
(50 J/m2) serves as positive control for RPA hyperloading and Chk1 phosphorylation; actin serves as loading control. (C) Catalytic activity of
Pol k is required for preventing RPA accumulation onto chromatin in unstressed cells: western blot with the specified antibodies of chromatin
cell extracts prepared from HeLa cells co-transfected by the indicated siRNA and empty vector ( ) or vectors expressing FLAG-tagged wildtype Pol k (Pol k-WT) or the FLAG-tagged catalytic inactive mutant of Pol k (Pol k-Dead). (D) Depletion of Pol k affects the spatial organization
of active replication foci. Left panel: images of early, middle and late replication PCNA foci in U2OS cells analysed by immunofluorescence;
scale bar: 10 mm. Right panel: quantification of MRC5 and HeLa cells with middle/late replication foci was performed (n4100 cells) for control
(si-luc) and Pol k-deficient cells (si-k1, si-k30 UTR) grown under 20 and 5% of oxygen. Source data for this figure is available on the online
supplementary information page.
exogenous DNA damage NER (Ogi and Lehmann, 2006;
Ogi et al, 2010). In this work, we have described a novel
and unexpected role for Pol k in response to replication
stress using two different experimental systems xenopus
and mammalian cultured cells. We have provided evidence
that Pol k is required for checkpoint activation after
replication fork stalling with DNA polymerase inhibitors,
such as hydroxyurea or aphidicolin, or in the presence of
UV-blocking lesions. These effects appear to be specific to
Pol k since (i) they were observed in Pol k / MEFs,
(ii) depletion of Pol k did not significantly affect expression
& 2013 European Molecular Biology Organization
of other TLS or replicative polymerases, (iii) cells depleted
for Pol Z, one of the closest relatives of Pol k, retained a
functional replication checkpoint, and (iv) the checkpoint
defect could be efficiently rescued by expression of wild-type
Pol k- in mammalian cells and by addition of a recombinant
form of Pol k in Xenopus egg extracts depleted for XPol k.
Our findings differ from a previously published report,
which showed that BPDE-induced phosphorylation of Chk1
is increased and persistent in Pol k-deficient MEF cells (Bi
et al, 2005). The MEF we used here (Schenten et al, 2002)
shows much higher UV sensitivity than the MEF used by Bi
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2179
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
et al (2005). Furthermore, we observed in our Pol k / MEFs a significant decreased level of Chk1 (Supplementary
Figure S1F), which was not observed in the MEFs from Bi and
2180 The EMBO Journal VOL 32 | NO 15 | 2013
colleagues. This strongly suggest that the discrepancy may be
due to differences in MEF cell types and further studies will
be required to clarify the issue.
& 2013 European Molecular Biology Organization
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
The decreased level of Chk1 that we observed in our Pol
k / MEFs may be explained by the chronic replication
stress induced by loss of Pol k. Indeed, the persistent absence
Figure 7 Analysis of cell-cycle progression and cell proliferation in
Pol k-deficient cells. (A) The percentage (%) of G2/M cells was
determined in HeLa or in HeLa XPAKD cells by flow cytometry
analysis on control (si-luc) and Pol k-deficient cells (si-k1 and
si-k2). Experiments were done three times and standard deviations
are indicated by error bars. P-values were calculated using Student’s
t-test (*Po0.05; **Po0.01). (B) Evaluation of the function of
the G2/M checkpoint: the relative mitotic index in Pol k-deficient
cells compared with control cells was measured by monitoring the
phosphorylated form of Histone H3 by flow cytometry analysis;
DNA content was determined after DNA labelling with propidium
iodide (PI). The percentage of H3P-positive cells was determined in
three independent experiments and standard deviations were indicated by error bars. P-values were calculated using Student’s t-test
(*Po0.05; ***Po0.001). (C) Doubling time calculated from
growth curve done during 96 h on control and Pol k-deficient
HeLa and MRC5 cells. Experiments were done three times in
triplicate and standard deviations are indicated by error bars.
P-values were calculated using Student’s t-test (*Po0.05;
**Po0.01; ***Po0.001).
of Pol k induces a mild but chronic replication stress,
triggering prolonged fork stalling that can collapse and generate DSB, which in turn can activate slightly but chronically
the DNA damage checkpoint, including the phosphorylation
of Chk1 which is here independent of Pol k. Since Chk1
activation by phosphorylation induces its degradation by the
proteasome degradation system (Zhang et al, 2009), this can
explain why Chk1 levels are reduced. Interestingly, it
has been recently reported that a chronic replication
stress by oncogenes triggers a fast decrease in Chk1 level
(Neelsen et al, 2013).
Activation of the replication checkpoint strongly depends
on the formation of primed ssDNA at stalled forks. Upon
replication stress, leading and lagging strand replication can
become disengaged at an unwound fork. On the lagging
strand, primers accumulate through recycling of Pol a and
are elongated by Pol d (Van et al, 2010). This process
generates several 50 ends primer-template junctions, as it is
the case for normal fork progression, facilitating the binding
of the 9-1-1 complex. The molecular determinants of
checkpoint activation on the leading strand must be
different since this strand is normally replicated in a highly
processive manner without interruption during replication. In
contrast to Pol d, Pol e seems to be involved at a lesser extent
in the primer elongation process at an unwound fork after
replication stress (Van et al, 2010), in agreement with the
need of a distributive synthesis. Here, we have uncovered
that Pol k contributes to formation of replication
intermediates at forks stalled with aphidicolin. Our results
suggest that Pol k may be directly involved in the elongation
of these short DNA products on the leading strand
and may be in competition with processive replicative DNA
polymerases in this process. A simple model that can be
proposed from our results is the following (see Figure 8):
upon induction of replication stress DNA primase-Pol a is
recruited to the leading strand to synthesize primers which
are elongated by Pol k in a distributive, rather than a
processive manner by a replicative polymerase. It cannot be
excluded that Pol k may also function on the lagging strand in
competition with DNA Pol d. This regulation may ensure
generation of multiple 50 ended primer-template junctions to
enable efficient replication checkpoint activation and is in
line with the observation that DNA synthesis at arrested forks
continues at a slow rate, leading to the formation of small
replication intermediates that contribute strongly to checkpoint activation (Van et al, 2010). We have presented also
evidence that in the absence of Pol k the DNA binding of the
Rad9 subunit of the 9-1-1 complex is affected after replication
stress. These observations suggest that Pol k-dependent DNA
synthesis is required for Rad9 binding. This interpretation is
consistent with the observation that in the absence of Pol k
short replication intermediates are poorly made, resulting in
much less 50 ends and consequently reduced recruitment of
the 9-1-1 complex. Generation of multiple short DNA
Figure 6 Increased 53BP1 nuclear bodies in G1 following Pol k depletion. Untransfected (unt) or transfected with control siRNA (si-luc) or
siRNAs targeting Pol k (si-k1, si-k2) were untreated (A–C) or treated with 0.2 mM of aphidicolin for 24 h (D–F). 53PB1 was detected by
immunofluorescence in G1 nuclei (cyclin A negative). Examples of positive nuclei for 53BP1 (red), Cyclin A (green) and DAPI (blue) staining
are shown in A and D; B and E are representative experiments showing the distribution of the number of 53BP1 foci per cell in control and Pol
k-deficient cells (n ¼ 100); Box, 25–75 percentile range; whiskers, minimum and maximum values. Mann–Whitney test was applied to compare
Pol k-deficient cells data set with the control cells (***Po0.001). In (C) and (F), 53BP1-positive nuclei were scored and classified in the
indicated categories based on the number of 53BP1 nuclear bodies. Experiments were done three times (n ¼ 100) and standard deviations are
indicated by error bars.
& 2013 European Molecular Biology Organization
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2181
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
Figure 8 A model for the checkpoint function of Pol k. Upon replication stress, new short RNA-DNA primers continue to be synthesized and
elongated on the unwound ssDNA downstream of a stalled replisome. On the lagging strand, primers accumulate through recycling of Pol a and
are elongated by Pol d with PCNA. On the leading strand, Pol a could be also recruited and elongation of the primers could be made by the
distributive Pol k in order to allow high levels of 5’ ends primer-template junctions. Accumulation of short nascent DNAs on both strands
results in multiple 50 ends of primer-template junctions facilitating the binding of the 9-1-1 complex and subsequently checkpoint activation.
intermediates by Pol k may also ensure that replication restart
occurs as we have observed that removal of Pol k from
human cells leads to persistence of ssDNA after recovery
from a block with HU.
It is well known that Pol k-deleted cells are sensitive to
UV radiation, although this polymerase does not support
replication bypass past thymine-thymine (To4T) dimers
or [6,4] pyrimidine-pyrimidone photoproducts (Okada et al,
2002; Schenten et al, 2002). These apparently contradictory
results are explained by the collaboration of Pol k with
the replicative DNA polymerases Pol d and Pol e during the
NER repair synthesis after the excision of UV damage
(Ogi et al, 2010). Our observation that depletion of Pol k
strongly affects Chk1 phosphorylation after UV irradiation
(see Supplementary Figure S2B) offers additional insight into
the role of Pol k in the response to UV damage.
Pol k has been previously considered to be involved in the
maintenance of genomic stability in the absence of external
stress. Mice defective for the POL K gene manifest spontaneous genetic instabilities including elevated frameshift mutations in the germline at tandem repeat minisatellite loci
(Burr et al, 2006; Stancel et al, 2009). Since the replication
checkpoint is known to suppress also genomic instability
by detecting and responding to a variety of endogenous
replication-impeding events (Petermann and Caldecott,
2006), minisatellite instability observed following Pol k
depletion is consistent with prolonged replication fork
pausing at these natural replication barriers, due to
2182 The EMBO Journal VOL 32 | NO 15 | 2013
defective replication checkpoint signalling, delayed
checkpoint recovery and replication restart with resulting
increased mutagenesis. These findings prompted us to
examine whether the novel checkpoint function of Pol k
might play a role in regulating genomic stability under
normal growth conditions. We found that in unperturbed
conditions Pol k-depleted cells have proliferative defects,
altered replication
factory
dynamics,
spontaneous
replication stress, and under-replicated regions which are
transmitted to daughter cells. Altogether, these observations
reveal a previously unrecognized role for Pol k during DNA
replication in unperturbed cells, which appears to depend
upon the catalytic activity of Pol k, as demonstrated by a
combination of depletion and complementation experiments,
and support its checkpoint function in the absence of external
stress, extending the role of this DNA polymerases outside
the TLS. Pol k is believed to be an error-prone enzyme,
which may generate mutations when it acts on undamaged
templates (Ohashi et al, 2000). Pol k may however have
higher fidelity in vivo, as suggested by recent work showing
that Pol k can perform accurate microsatellite DNA synthesis
(Hile et al, 2012).
In conclusion, the concept that TLS could be not the sole
function assigned to the Y-family DNA polymerases is now
emerging as we recently demonstrated that Pol Z is required
for the stability of common fragile sites during unperturbed
S phase (Rey et al, 2009; Bergoglio et al, 2013). Our work
provides new mechanistic insights into the roles of Pol k in
& 2013 European Molecular Biology Organization
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
responding to DNA replication fork stalling by endogenous
barriers or after external stress to ensure high cell viability
and genomic stability.
Materials and methods
Cell culture, cell lines, proteins and plasmids
HeLa, MRC5, and U2OS cells were cultured as described previously
(Betous et al, 2009; Rey et al, 2009). 293T cells were cultured in
DMEM/Glutamax with 10% SVF (Lonza) and 1X antibiotics
(GIBCO). When indicated, cells were cultured at 371C in a
humidified incubator in an atmosphere containing 5% O2 (Sanyo
incubator). The human Pol k coding sequence was cloned into the
pcDNA3.1Flag vector (Invitrogen). The catalytically inactive mutant
of human Pol k (Dead Pol k) was constructed by using Quick
Change (Stratagene) according to manufacturer’s instructions to
incorporate mutations (D198A and E199A). When indicated, cells
were treated with hydroxyurea, Bromodeoxyuridine (both from
Sigma) or UV irradiation (UVC light meter, Digit Instrument)
for doses and time indicated in the figure legends. Purified
full-length recombinant Pol k (RPol k) (98 kDa) used in rescue
experiments in Xenopus egg extracts was purchased from Enzymax
(Lexington, KY).
Xenopus methods
Egg extracts preparation, immunodepletion, immunoprecipitation
and replication assay. Xenopus sperm chromatin and egg extracts
(LSS) were prepared as previously described (Murray, 1991). For
immunodepletion experiments, XPol k antibodies were covalently
coupled to recombinant Protein A beads (GE Healthcare) and
complete depletion of Pol k was achieved by incubating one
volume of egg extract with 40% of antibodies (Vol/Vol) for 40 min
twice at 41C on a rotating wheel. Sperm chromatin (2000 nuclei/ml
of egg extract) was added to egg extracts and incubated at room
temperature for the indicated time. For immunoprecipitation, egg
extracts were supplemented with cycloheximide and diluted
10-fold in ice-cold Xb buffer in the presence of proteases
inhibitors (see next paragraph). Antibodies (10 mg each) were
added and incubated at 41C on a rotating wheel for 1 h. Then,
20 ml of Protein A sepharose beads was added and incubation was
prolonged for 1 h. ProteinA beads-immunocomplexes were
collected by low speed centrifugation at 41C and washed several
times in Xb as above. Bound proteins were eluted with Laemmli
buffer. For replication assays, radiolabelled DNA samples were
prepared by addition of a-[32P]dCTP (3000 mCi/mmole, Perkin
Elmer) to the extract supplemented with demembranated sperm
chromatin, cycloheximide (250 mg/ml) and an energy regeneration
system (1 mM ATP, 2 mM MgCl2, 10 mM creatine kinase, and 10 mM
creatine phosphate). Reactions were performed with or without
aphidicolin or caffeine (both from Sigma), stopped by addition of
stop buffer (0.5% SDS, 20 mM EDTA, pH 8.0, and 500 mg/ml
proteinase K) and analysed by denaturing polyacrylamide gel
electrophoresis as described (Van et al, 2010).
Chromatin isolation from egg extracts. Egg extracts supplemented
with demembranated sperm nuclei were diluted 10-fold with
ice-cold Xb buffer (10 mM Hepes pH 7.7; 100 mM KCl; 50 mM
sucrose; 2 mM MgCl2, 5 mM leupeptine, aprotinin and pepstatin)
and centrifuged at 1500 g in a Sorvall centrifuge at 4 1C for 5 min to
sediment nuclei. Nuclei were washed once in ice-cold Xb and
detergent extracted with 0.1% NP-40 for 5 min on ice. Chromatin
(pellet) and soluble nucleosolic (supernatant) fractions were
obtained by centrifugation at 6000 g for 5 min at 41C in a microfuge.
siRNAs, transfection, chromatin fractionation, western
blotting and quantification
To knock down the POL K gene, cells were transfected with two
independent siRNA (Betous et al, 2009) or Pol k siRNA Smart Pool
(Dharmacon) directed either the coding sequence (D-sik) or the
3’UTR region (si-k30 UTR). For control, siRNA against luciferase
(Elbashir et al, 2001) was used. For siRNA transfection
experiments, 1 1.5 105 cells were seeded 24 h before
transfection with 100–300 nM siRNA using lipofectamine 2000
(Invitrogen). For vectors transfections, 2 mg of DNA was transfected
& 2013 European Molecular Biology Organization
with JetPrime reagent (Polyplus-Ozyme). Chromatin fractionation
was performed as in Zou et al (2002) with the following
modifications: solution A (10 mM PIPES pH 7, 300 mM sucrose,
3 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.1%, Triton
X-100, 0.5 mg/ml Pepstatine and 1X to 3X HaltTM protease/
hosphatase inhibitors; Thermo Scientific) was used. Cells were
left on ice during 5 min then spun 3 min at 7500 r.p.m. at 41C.
Pellets were incubated in solution A for 5 min on ice, spun again,
and resuspended in solution A (Chromatin fraction). The
supernatants from the two extraction steps were pooled (soluble
fraction). Chromatin fractions were sonicated. Whole cell extracts
were performed as previously described (Betous et al, 2009). Blots
were detected by ECL Western Blotting Substrate (Pierce) or ECL
Plus Western blot detecting system (GE Healthcare). Where
indicated, western blots were quantitated using ImageJ software.
Immunofluorescence
For BrdU, PCNA, RPA immunodetection: cells were washed in CSK
buffer (10 mM PIPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 300 mM Sucrose, 3 mM
MgCl2, 1X HaltTM protease/phosphatase inhibitors; Thermo
Scientific) and pre-extracted in CSK-0.5% Triton X-100 for 2 min,
rinsed in CSK buffer and PBS, fixed in 2% paraformaldehyde for
20 min. Coverslips were blocked in PBS containing 5% BSA and 0.1%
Triton for 15 min. Antibodies were diluted in PBS containing 1% BSA
and 0.1% Triton. Incubation times were 90 min for primary. Nuclei
were counterstained wit 40 ,60 -diamino-2-phenyl-lindole (DAPI).
Coverslips were mounted in Vectashield Hard Set (Vectors
Laboratory). BrdU (Becton Dickinson, 1:100), PCNA (Abcam,
1:800), RPA (Calbiochem, 1:200), For g-H2AX immunodetections:
cells were fixed in 3.2% paraformaldehyde, 2% sucrose for 15 min,
permeabilized for 4 min in Triton buffer (0.5% Triton X-100 in 20 mM
HEPES pH 7.4, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM sucrose). g-H2AX
(Millipore, 1:500) incubations were performed as previously described. For 53BP1 and Cyclin A immunodetections: cells were fixed
in 4% paraformaldehyde for 20 min, permeabilized for 5 min in
0.25% Triton X-100/1X PBS, incubated for 20 min in 5% goat serum
and 2 h with primary antibodies, 53BP1 (Abcam, 1:300), CyclinA
(Santa Cruz, 1:150), Mouse IgG1 (Southern Biotech, 1:150) and
Rabbit IgG (Cell Signaling, 1:300). Secondary antibodies were incubated 30 min at room temperature, anti-mouse Alexa-fluor 488 and
anti-rabbit Alexa-fluor 555 (Molecular Probes, 1:1200).
Microscope image acquisition
Images acquisition of multiple random fields were carried out on a
wide field Leica DMLA microscope equipped with 63 oil immersion objective (PLAPO 1.4 Leica) using a Cool-Snap HQ CCD
camera (Photometrics, Roper Scientific) driven by PM capture
Pro6.0 or Metamorph software. Images were assembled
with Adobe photoshop and Illustrator. When indicated in the figure
legends, images of RPA were acquired using the 100 NA 1.4
objective of a SP2 confocal microscope (Leica microsytems) using
laser lines 488 and 633 nm for excitation of Alexa Fluor 488
and ToPro3 dyes.
Cell-cycle analysis and measurement by flow cytometry
In all, 100 000 cells were seeded 48 h prior to harvesting. Cells were
washed in PBS once and 300 ml of Propidium Iodide solution
(25 mg/ml Propidium Iodide (Sigma), 0.1% C6H5O7Na3, 2H2O,
10% RNAse A (Sigma), 0.1% Triton X-100) was added 30 min
prior to FACS analysis (FACScan, Becton Dickinson). Results were
analysed by using Modfit software. Analysis g-H2AX and H3P by
flow cytometry were performed as described (Betous et al, 2009),
H3P (Cell Signaling, 1:75).
Supplementary data
Supplementary data are available at The EMBO Journal Online
(http://www.embojournal.org).
Acknowledgements
We thank Renaud Poincloux and Franc¸oise Viala (IPBS, CNRS
Toulouse) for their technical contributions. We thank S Waga
(Japan Women’s University) for anti Xpol d antibodies. This work
was supported by La Ligue contre le cancer (Equipe Labellisée 2013
to JSH; PhD grant for RB), 2 INCa Grants (CHECKPOL-2007
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2183
Pol j regulates the replication checkpoint
R Bétous et al
and YPOL-2010 to JSH), 1 ARC grant (3156 to DM), and FRM (FRM
Equipes to DM).
Author contributions: RB, MJP, DM and JSH designed the experiments. RB, MJP, LP, SVdL and EOS performed the experiments in
human cells. BR, MJP and DM performed the experiments in
Xenopus extracts. NN, PG and TN performed the production of
the human Pol Kappa antibodies. RB, MJP, CG, EF, CC, DM and JSH
analysed the data and contributed to the manuscript preparation.
DM and JSH supervised the project and wrote the manuscript.
Conflict of interest
The authors declare that they have no conflict of interest.
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The EMBO Journal is published by Nature
Publishing Group on behalf of the European
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under a Creative Commons Attribution 3.0 Unported
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commons.org/licenses/by/3.0/.
The EMBO Journal
VOL 32 | NO 15 | 2013 2185
1
Supplemental material: additional Materials and Methods and 5 supplemental
figures
Additional Materials and Methods
Pol  -/- MEF
The embryonic fibroblasts (MEF) used in this study were generated from
homozygous mutant Pol -deficient mice described in (Schenten et al, 2002)
Preparation of polyclonal anti-rabbit IgG antibody of human Pol 
The human POL K gene (GenBank accession number XM_003930.2), was amplified
by polymerase chain reaction (PCR) from human testis large insert cDNA library
(CLONTECH). The amplified fragments were digested with NcoI and BamHI and the
resulting fragment was ligated into similarly digested vector pYG8582, which is the
same as pET-16b (Novagen) but has the translational DB enhancer. The resulting
plasmid pYG8583 codes for an N-terminal 10xHisTagged full-length Pol . To
construct the C-terminally truncated Pol  expression vector, a synthetic linker was
ligated between the XbaI and BamHI sites of pYG8582. This construct was then
digested with XbaI and AvrII, and the digested plasmid was ligated with the XbaI
fragment of pYG8583 carrying the N-terminal portion of the Pol  coding sequence.
The resulting construct overexpressing C-terminally truncated 10xHis Tagged Pol 1559
has been named pYG8591. To express the truncated 10xHis Tagged Pol 1-559
plasmid pYG8591 was transformed into E. coli Rosetta competent cells (Novagen)
and the expression was induced by adding IPTG. Cells were harvested and
resuspended in BugBuster lysis buffer (Novagen) and soluble proteins were collected
by centrifugation. To purify recombinant Pol , the protein was bound to BD TALON
2
Superflow resin (BD Biosciences) and eluted according to the manual provided by
BD Biosciences. The eluted proteins were further purified by gel filtration, followed by
ion exchange chromatography (HiTrap Heparin HP, GE healthcare) using the FPLC
system (AKTAexplorer 10s, GE healthcare). The polyclonal anti-rabbit IgG antibody
of Pol  was obtained by injection of the purified protein to rabbits (Takara, Japan).
Antibodies for Immunoblotting
Experiments with Xenopus extracts. Anti-Xpol  antibodies were produced against
full-length Xenopus Pol  made in bacteria as 6His-tag recombinant protein as
previously described (Yagi et al, 2005) at the external facility Proteogenix
(Strasbourg, France). Inclusion bodies were isolated and the protein purified on a
nickel column followed by step dialysis renaturation and injection into rabbits. AntiRPA antibodies were produced as described (Recolin et al, 2012). Anti-MCM3
antibodies have been previously described (Coue et al, 1998). Histone H3 and DNA
polymerase  (p180) antibodies were purchased from Abcam (ab1791 and ab31777
respectively). Anti-hChk1 P-S345 antibody was from Cell Signaling (2341, recognizes
P-S344 in Xenopus), anti-hChk1 antibody from Santa Cruz (sc-8408). Anti-RAD9 and
ATR antibodies were described in (Recolin et al, 2012). XTopBP1 antibodies were
produced as previously described (Parrilla-Castellar & Karnitz, 2003). Anti-PCNA
antibody used to detect XPCNA was from Sigma (clone PC10). ORC2 antibody was
produced against 6His-tagged bacterial recombinant proteins (a gift of Marcel
Méchali, IGHG-CNRS Montpellier). Anti pol  antibodies were previously described
(Van, et al., 2010). Hybridization of antibodies to nitrocellulose membranes was
performed using a SNAPi.d. system (Millipore) and detection was performed by
Enhanced Chemio Luminescence (Luminata Crescendo reagent, Millipore).
3
Experiments with mammalian samples. Rabbit polyclonal antibodies: Actin (Sigma,
1:30000); MCM7 (Santa Cruz, WB, 1:1000), phospho-Chk1-Ser345 (Cell signaling,
1:1000), Pol  (Abcam, 1:1000), Pol α (Abcam, 1:1000). Rat antibody: CDC45 (a kind
gift from Heinz-Peter Nasheuer, Galway-Ireland; 1:50). Mouse monoclonal
antibodies: Actinin (Chemicon, 1:2000); Chk1 (Santa Cruz, WB, 1:1000); MCM2
(Abcam, 1:3000); RPA-34 (Calbiochem, 1:1000); Tubulin-alpha (Sigma, 1:50000);
ORC4 (1:1000); PCNA (Abcam, 1:1000). Secondary antibodies: HRP conjugated
anti-rabbit and HRP conjugated anti-mouse (Jackson Immuno Research, 1:20000).
HRP conjugated anti-rat (1:5000).
Additional antibodies (supplemental Figures)
Rabbit polyclonal antibodies: ATR (Cell signaling, 1:1000); ATRIP (Cell signaling,
1:1000); Hus1 and Rad9A (kind gift from Pr U Hubscher, University of Zurich). Mouse
monoclonal antibodies: Pol δ (Santa Cruz, 1:250).
Supplemental figures
Supplemental Figure S1: Validation of the specificity of Pol  depletion in
human cells (A,B) Western blot analysis of whole cell extracts prepared from Hela
and MRC5 cells, untransfected (unt), transfected with control luciferase siRNA (siluc), Pol  individual siRNA (si-1 and si-2) or with two independent Pol  siRNA
pools (Dharmacon) (D-si- and si-3’UTR). Actin, actinin or Orc 4 were used as
loading controls. (C) mRNA expression of several replicative and specialized DNA
polymerases was analysed by quantitative real time PCR in MRC5 cells transfected
with control luciferase siRNA (si-luc), or Pol  individual siRNAs (si-1 and si-2).
4
Data are mean +/- SD from at least three independent experiments. The p-value
determined with a t-test *** p<0.0001. Only the Pol  expression is significantly
decreased after si-RNA transfection. (D) Western blot analysis of whole cell extracts
prepared from 293T untreated or treated with HU (2 mM, 3h), transfected with control
luciferase siRNA (si-luc) or Pol  individual siRNA (si-1). Quantification of
Pchk1/Chk1 is the mean +/- SD of two independent experiments. Actin is used as a
loading control. (E) Western blot analysis of whole cell extracts prepared from MRC5
and Hela untreated cells transfected with control luciferase siRNA (si-luc) or Pol 
siRNAs (si-1 and si-3’UTR) and analysed by immunoblotting with the indicated
antibodies. Tubulin α and actinin are used as a loading control. (F) Whole cell
extracts from control and Pol  -/- MEF, untreated or treated with HU (1 mM, 1h)
were prepared and analyzed by Western blot with the indicated antibodies.
Quantification of the ratio P-CHk1/Chk1 in treated vs untreated cells is presented. (G)
Western blot analysis of whole cell extracts prepared from MRC5 untreated or treated
with HU (2 mM, 3h), transfected with empty vector (-) or vectors expressing FLAGtagged wild-type Pol  (Pol -WT) respectively. Actinin is used as a loading control.
Supplemental Figure S2: Additional experiments confirming the phenotype of
Pol -depleted cells (A) The level of Pol  on chromatin was analyzed by Western
blotting in 293T cells, untreated or treated with 2 mM HU 3h; Tubulin α and Histone
H3 were used as loading controls for chromatin and soluble fractions respectively.
(B) MRC5 cells transfected with the indicated siRNAs were mock-irradiated or
irradiated with 50 J/m2, then cell extracts were fractionated, and soluble fractions
were analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies.
5
Supplemental Figure S3: Functional characterization of Xpol  (A) Western blot
of pre-immune (PI) or immune serum (XPol ) of rabbits immunized with recombinant
Xenopus Pol k protein. The Xenopus Pol  serum recognizes a specific polypeptide
at the expected size of 100 kDa. (B, upper panel) Egg supernatants mock-depleted
or depleted with the XPol  antibodies were reconstituted with sperm chromatin
(2000 nuclei/µl) in the absence (-) or presence (+) of aphidicolin (15µM) or after UV
irradiation (800 J/m2) and incubated at room temperature for 90 minutes. Isolation of
nuclei and preparation of chromatin and nuclear soluble fractions were performed as
described in Materials and Methods. Proteins fractions were then analysed by
western blot with the indicated antibodies; (B, lower panel) Analysis of Chk1
phosphorylation in Mock-depleted extracts (ΔMock) with (+) or without (-) UV
irradiation (800 J/m2) or aphidicolin (15 µM). (C) Replication fork uncoupling occurs
normally after incubation of UV-irradiated sperm chromatin in Xenopous egg extracts.
Mock (- UV) or UV-irradiated (+ UV) sperm chromatin was incubated in Xenopus egg
extracts Mock-depleted (∆Mock) or depleted with Xpolk antibodies (∆Xpolk) for 90
minutes. Chromatin fractions were obtained as described in Materials and Methods
and analyzed by western blot with the indicated antibodies. (D) Sperm chromatin was
replicated in egg extracts mock-depleted (ΔMock) or depleted with XPol  antibodies
(ΔXPol ) containing or not 15 µM aphidicolin (APH) and α-[P32]dCTP.
At 40
minutes, total DNA was purified as described (Van et al, 2010), replication
intermediates were fractionated by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis
and detected by autoradiography after exposure to a PhosphoImager screen
(Molecular Dynamics). Abundance of 25-150 nt long DNA intermediates was
quantified by densitometric scanning and analysed with ImageJ software. (E) The
abundance of Pol  and Pol  in extracts Mock-depleted (ΔMock) or XPol -depleted
6
(ΔXPol ) was analysed by immunoblotting. (F) Addition of purified recombinant Pol 
to egg extracts depleted of XPol  totally restored recruitment of Rad9 onto chromatin
after aphidicolin. Sperm chromatin was incubated in XPol  (ΔXPol ) depleted egg
extracts in the presence of aphidicolin (15 µM) for 60 min. Chromatin fractions were
isolated after 90 minutes incubation and analysed by immunoblotting with the
indicated antibodies. (G) Xpolk interacts with XRad9. Xenopus egg extracts were
immunoprecipitated with XPol  or Rad9 antibodies and analysed by western blot
using anti-Rad9 or XPol  antibodies. (H) Xpolk does not interact with Pol  nor Pol
. Immunoprecipitation (IP) from egg extracts with the indicated antibodies was
performed as described in materials and methods. Immunoprecipitates were blotted
with antibodies against Xpol , XRad9, Xpol  or Xpol .
Supplemental Figure S4: Increased spontaneous DNA damage following Pol 
depletion.
(A) Additional recruitment of RPA is due to ssDNA accumulation at stalled forks and
not to firing of new replication origins in Pol –deficient cells. Extracts of MRC5 cells
transfected with control siRNA (si-luc) or siRNAs targeting Pol  (si-1, si-2) were
fractionated. Chromatin fractions were then subjected to immunoblotting with the
indicated antibodies. Extracts from the untransfected cells treated with HU (2mM 3h)
served as positive control for RPA hyperloading; MCM7 served as loading control for
chromatin fraction. (B) Evaluation of endogenous DNA damage in S-phase: γ-H2AX
foci formation (green) in the indicated cell lines was analysed by immunofluorescence
in PCNA-positive nuclei (red) of control and Pol -deficient cells 48h after transfection
with the indicated si-RNA. DNA content was visualised by DAPI coloration (blue). At
least 100 cells were counted for each condition; scale bar 10µm. (C) Quantification of
7
γ-H2AX-positive cells by Flow cytometry analysis and by immunofluorescence for
HeLa wild-type and XPAKD cell lines transfected with the indicated siRNAs under low
(5%) or high (20%) oxygen conditions. The numbers of cells analysed were more
than 300.
Supplemental Figure S5: addition experimental evidence showing that 53BP1
nuclear bodies in G1 are increased following Pol  depletion.
(A) IgG/555 and IgG1/488 were controls of immuno-detection. Rabbit IgG and mouse
IgG1 were used instead of 53BP1 and CycA antibodies respectively. Secondary
antibodies and immuno-detection protocols are mentioned in material and methods.
(B and C) Distribution of the number of 53BP1 foci per nucleus in cells untransfected
(unt), transfected with control luciferase siRNA (si-Luc) or Pol  individual siRNA (si1 and si-2). Two independent experiments (EXP2 and EXP3) performed without
treatment (untreated) or after 0.2 µM aphidicolin for 24h were showed (n=100 for
each condition). Box, 25-75 percentile range; whiskers, minimum and maximum
values. Mann-Whitney test was applied to compare Pol -deficient cells data set with
control cells.
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Actinin
100
Relative expression of mRNA
C
D
si-luc
si-κ2
si-κ1
2
1,6
HU
293T
***
***
1,2
kDa
98
42
c
-lu
si
c
-lu
si
kDa
Pol κ
98
P-Chk1
0,8
Chk1
55
0,4
Actin
42
0
1
0.5
0
si
-lu
si c
-κ
1
Pol κ
Pol κ
Orc 4
PChk1/Chk1 arbitrary units
42
MRC5
kDa
98
si
-κ
1
Actin
HeLa
si
-κ
1
Pol κ
kDa
98
B
si
-lu
c
si
-κ
3’
UT
R
HeLa
un
t
si
-lu
c
si
-κ
1
si
-κ
2
si
-lu
D- c
si
-κ
A
si
-lu
c
si
-κ
3’
UT
R
Bétous_Supplementary Fig 1
HU
Pol δ
Pol α
Pol θ
Pol η
Pol ι
Pol κ
Rev1
E
κ/-
W
T
κ/-
100
Pol κ
98
Chk1
55
Actinin
100
Flag-Pol κ
Pol κ
Chk1
55
Actin
42
PChk1/Chk1 HU vs unt
(fold increase) :
2.24
1.08
HU
-
si-κ3’UTR
si-κ1
si-luc
si-κ3’UTR
si-κ1
si-luc
HeLa
Pol δ
kDa
125
Rad9A
55
Hus1
31
Tubulin α
50
κ-WT
-
MRC5
kDa
P-Chk1
kDa
Hus1
G
HU
MEF
W
T
F
si-κ3’UTR
50
si-κ1
Tubulin α
si-luc
ATRIP
82
MRC5
HeLa
si-κ3’UTR
kDa
250
si-κ1
si-κ1
ATR
si-luc
MRC5
si-κ3’UTR
HeLa
si-luc
si-κ3’UTR
si-κ1
si-luc
MRC5
HU kDa
98
P-Chk1
Chk1
55
Actinin
100
Bétous_Supplementary Fig 2
A
Soluble
HU
-
+
Chr
-
+
kDa
Pol κ
98
Tubilin α
50
Histone H3
17
Pol κ
si
-κ
2
si
-κ
1
si
-lu
c
un
t
B
kDa
98
P-Chk1
Chk1
55
Actin
42
Bétous_Supplementary Fig 3
A
kDa
PI XPol κ
∆Mock
B
-
150
100
75
∆XPol κ
-
APH
UV
∆ XPol κ
- + kDa
∆Mock
C
APH kDa
UV
-
+
P-Chk1
55
RPA
34
MCM3
100
Histone
H3
16
50
∆Mock
37
UV
25
-
APH
-
+
+
kDa
P-Chk1
Chk1
APH
E
k
oc
∆M
XPol κ
200 nt
150
100
∆XPol κ
F
Depletion
R-Pol κ
lκ
+
∆Mock
∆XPol κ
∆Mock
∆XPol κ
-
∆X
Po
D
55
kDa
100
XPol δ -p125
125
XPol δ -p66
66
-
+
kDa
XRad9
55
Histone
H3
16
75
XPol α
180
50
G
Mock
Rad9
Mock
XPol κ kDa
XPol κ
100
XRad9
55
6
∆XPol κ
IP
H
4
Ex
2
150
100 75
50
25
Size of the replication products (nt)
after aphidicolin
IP
kDa
Ex
M
oc
k
XP
ol
κ
∆Mock
M
oc
k
XP
ol
κ
XP
ol
δ
Intensity (arbitrary units)
25
IP
IP
kDa
XPol κ
100
XPol κ
100
XPol δ-p125
125
XPol α
180
XPol δ-p66
66
12
65
RPA
34
MCM7
90
20% O2
**
**
XPA
8
4
0
γ-H2AX
12
HeLa
8
4
0
si
-lu
c
s
si i-κ
-κ
3’ 1
UT
R
CDC45
B
γ-H2AX - PCNA double
positive cells (%)
166
si
-lu
c
s
si i-κ
-κ
3’ 1
UT
R
Pol α
γ-H2AX - PCNA double
positive cells (%)
Chromatin
si
-lu
c
si
-κ
1
si
-κ
2
A
si
-lu
c
s
si i-κ
-κ
3’ 1
UT
R
16
un
si t
-lu
c
si
-κ
1
si
-κ
si 2
-lu
c
si
-κ
2
% of γ-H2AX positive cells
Bétous_Supplementary Fig 4
HU kDa
PCNA
Dapi
Neg.
C
5% O2
Pos.
20
MRC5
10
0
Bétous_Supplementary Fig 5
A
DAPI
IgG/555
B
DAPI
IgG1/488
Untreated
***
***
40
***
30
20
10
0
unt
si- κ1
si-luc
***
***
Number of 53BP1
foci per cell
Number of 53BP1
foci per cell
***
***
40
***
30
20
10
0
si- κ2
unt
si- κ1
si-luc
EXP 2
si- κ2
EXP 3
0.2µM Aphidicolin
C
***
***
***
35
30
25
20
15
10
5
0
***
unt
**
***
si-luc
Number of 53BP1
foci per cell
Number of 53BP1
foci per cell
***
si- κ1
EXP 2
si- κ2
***
50
40
30
20
10
0
unt
si-luc
si- κ1
EXP 3
si- κ2
Partie II : Résultats
3.
Conclusion
Pol Kappa, polymérase spécialisée connue pour son rôle dans la translésion, joue un
nouveau rôle dans le checkpoint de phase S. L’absence de pol Kappa entraîne un défaut de
phosphorylation de Chk1, kinase effectrice du checkpoint après induction de stress réplicatif,
et la complémentation avec la forme ectopique WT de pol kappa restaure la
phosphorylation de Chk1.
En 2010, il a été montré que l’extension d’amorce au niveau des fourches était
requise pour une activation optimale du checkpoint de phase S (Van et al., 2010) . Nous
avons pu mettre en évidence, par des essais de réplication in vitro chez le Xénope, que pol
kappa était nécessaire pour la synthèse d’ADN au niveau des fourches bloquées. En effet,
dans des extraits d’œufs de Xénope immunodéplétés en pol Kappa, nous avons pu voir que
la synthèse des ADN naissants était largement retardée. Cette synthèse d’ADN qui est
nécessaire pour la pleine activation de Chk1, est aussi nécessaire pour le recrutement du
clamp 9-1-1 au niveau des fourches bloquées.
Nous avons pu également voir que l’absence de pol kappa avait des conséquences
sur la réplication génomique en absence de traitement exogène. En effet, l’absence de pol
Kappa entraîne une accumulation de RPA à la chromatine, signe que l’absence de pol Kappa
mène à une augmentation de la présence d’ADN simple brin dans les cellules. D’ailleurs
l’absence de pol kappa entraine une augmentation des foyers γH2AX, marqueur de cassures
doubles brins. Ces résultats pourraient traduire une accumulation de fourches bloquées non
résolues, marquées par l’augmentation de RPA, susceptibles de s’effondrer et générer des
cassures, marqués par γH2AX. De plus, la présence d’ADN mal répliqué s’illustre par la
formation de foyers 53BP1 en G1 qui caractérisent la transmission de dommages aux cellules
filles. Les foyers 53BP1 en G1 ont été observés dans nos expériences suite à la déplétion de
pol Kappa et leur fréquence est augmentée après un stress réplicatif induit par des faibles
doses d’aphidicoline.
Non seulement ces travaux identifient un nouvel acteur du checkpoint de phase S
mais ils proposent aussi un rôle pour pol Kappa dans la réplication du génome en absence de
traitement génotoxique.
93
Partie II : Résultats
L’ensemble des résultats montrent que pol Kappa est un garant de la stabilité
génétique, par son rôle dans la translésion, mais aussi par son rôle dans le checkpoint de
phase S, et dans la réplication normale de l’ADN.
B.
Mécanismes moléculaires reliant pol Kappa au checkpoint
de phase S
L’implication de pol Kappa au niveau du checkpoint de phase S a ouvert de nouveaux
champs d’investigation. Notamment, décrypter le rôle au niveau moléculaire de pol Kappa
dans ce mécanisme, connaître les mécanismes de son recrutement, identifier ses
partenaires, et identifier les domaines chromosomiques impliqués.
Pour répondre à ces nombreuses questions, nous avons dans un premier temps synthétisé
des mutants de pol Kappa en fusion avec la GFP (Fig. 1A), et étudié leur capacité à former
des foyers. La formation de foyer est un témoin de l’accumulation de la protéine après stress
réplicatif. De plus, il a été montré que ces foyers colocalisaient avec les foyers PCNA,
marqueurs de la phase S du cycle cellulaire. Cette étude est un indicateur de la présence de
la polymérase aux fourches de réplication après stress réplicatif. Nous avons également
analysé par western blot, le recrutement à la chromatine des mutants après stress réplicatif.
Nous avons aussi regardé l’impact des mutants de pol Kappa sur les protéines participant
dans la voie ATR/Chk1.
1.
Construction des mutants de pol Kappa
La majorité des publications sur des formes mutées de pol Kappa implique des
délétions de domaines entiers, ou partiels. Afin de choisir les mutations ponctuelles à
réaliser, je me suis inspirée des publications caractérisant la pol Kappa de souris, ou de
xénope, mais aussi de mutants ponctuels de pol Eta, qui a une structure proche de celle de
pol kappa. La séquence du domaine d’interaction à PCNA de pol Kappa est K-H-T-L-D-I-F-F-K.
La leucine et les deux phénylalanines sont les acides aminés ayant le plus d’affinité avec
PCNA (Hishiki et al, 2009, Williams et al, 2012), ce sont eux que nous avons choisi de muter
94
Partie II : Résultats
Le domaine d’interaction à Rev 1 possède une séquence consensus X-F-F-Y-Y-Y-Y. Les deux
phénylalanines sont les acides aminés nécessaires pour l’interaction (Ohashi et al, 2009,
Williams et al, 2012). Nous avons choisi de les muter en alanine. Pour les domaines
d’interaction à l’ubiquitine UBZ, nous suivi les conseils du Dr Emmanuelle Desprat (Equipe du
Dr P. Kannouche, Institut Gustave Roussy, Paris) en mutant deux acides aminés, une cystéine
et un acide aspartique, par domaine.
Afin de vérifier la stabilité des mutants étaient exprimés dans les cellules humaines, nous
avons transfecté les différents vecteurs et analysé les protéines par western blots et
immunofluorescence. Les résultats de la première partie ont été obtenus après
surexpression des différents mutants de pol Kappa.
Les résultats du western blot (Fig 1B) montrent que les mutants sont exprimés dans les
cellules. L’analyse par microscopie à fluorescence a permis de quantifier le nombre de
cellules positives pour la GFP dans chaque condition, après stress réplicatif ou non. Les
résultats indiquent que 30 à 40 % des cellules sont positives et que le traitement par
l’hydroxyurée ne modifie pas ces pourcentages. Il est aussi important de noter que les
différentes mutations n’interfèrent pas avec l’expression et/ou la stabilité des protéines
ectopiques puisque des pourcentages de cellules GFP positives sont comparables entre les
conditions (Fig 1C).
95
Partie II : Résultats
96
Partie II : Résultats
2.
Analyse de la formation de foyers
97
Partie II : Résultats
Pour caractériser ces mutants, nous avons regardé leur capacité à former des foyers
après traitement à l’hydroxyurée (HU). Nous avons décidé d’utiliser cette technique comme
première approche, car il a été montré par mon équipe d’accueil, que 80% des cellules
présentaient des foyers pol Kappa après HU. De plus, ils ont également montré qu’après
induction de stress réplicatif les foyers pol Kappa colocalisaient avec PCNA, marqueur de la
phase S, indiquant que la formation des foyers de pol Kappa aurait lieu durant la phase S
(Bergoglio et al., 2002).
En absence de traitement, 15% des cellules transfectées par pol Kappa WT forme des
foyers de façon spontanée (Fig 2). Ce résultat est en accord avec ceux précédemment
obtenus dans l’équipe (Bergoglio et al, 2002). Les mutants Rev1, UBZ1, UBZ2 présentent le
même pourcentage de cellules présentant des foyers que pol Kappa WT, suggérant un
comportement similaire à la protéine WT. Environ 45% des cellules présentent des foyers
avec le mutant inactif de pol Kappa (Dead) En revanche, pol Kappa muté dans son domaine
d’interaction à PCNA (PIP) abolit la formation spontanée de foyers (Fig 2A).
En condition de traitement, pol Kappa WT forme des foyers à hauteur de 60%. Le
pourcentage de cellules avec des foyers pour les mutants des domaines Rev1, UBZ1, et UBZ2
augmente par rapport à la situation sans traitement mais, restent néanmoins légèrement
inférieurs à celui obtenu avec la forme WT, cela suggère que les mutations affectent peu la
relocalisation de pol Kappa en foyers. Après traitement, le pourcentage de cellules
présentant des foyers avec le mutant catalytique inactif augmente peu (environ 55%).
Cependant, la formation de foyers est toujours abolit en présence de pol Kappa PIP (Fig 2B ).
En conclusion, les domaines Rev1, UBZ1, et UBZ2 ne semblent pas être essentiels
pour la formation de foyers après stress réplicatif. Il n’est pas exclu que la formation des
foyers dépendent des domaines UBZ. Nous n’avons analysé que les simples mutants UBZ, le
double mutant (UBZ1+UBZ2) pourrait avoir un effet plus drastique sur la formation des
foyers. Le domaine catalytique n’est pas important pour la formation des foyers, mais pol
Kappa catalytiquement inactive de pol Kappa forme de manière constitutive, en absence ou
en présence de HU, des foyers. Par contre, les mutations du domaine C-ter d’interaction à
PCNA (PIP2) abolit toute formation de foyers spontanément ou après stress réplicatif. Ces
98
Partie II : Résultats
résultats montrent que le domaine PIP2 est celui requis pour la formation de foyers après
stress de la réplication.
3.
Recrutement des mutants de pol Kappa à la chromatine
Nous avons regardé le recrutement à la chromatine des mutants de pol Kappa, en
portant une attention particulière aux mutants Dead et PIP. Bien que la formation de foyers,
et le recrutement à la chromatine soient deux phénomènes distincts, il est intéressant de
voir s’ils sont corrélés.
Pour cela, nous avons transfecté les mutants dans des cellules 293T, et traités ou non
avec HU. Nous avons ensuite réalisé deux types de fractionnement cellulaires différents. Le
premier, que l’on nomme fractionnement CSK, a permis de séparer la fraction soluble (le
cytoplasme et les protéines soluble du noyau) de la fraction insoluble (les protéines
présentent sur la chromatine). La figure 3A représente l’analyse des protéines de la fraction
insoluble. Pol Kappa WT est accumulée sur la chromatine après stress réplicatif. De façon
similaire, le mutant Dead de pol Kappa et le mutant du domaine Rev1 sont aussi recrutés au
niveau de la chromatine, suggérant que les domaines catalytique et Rev1 ne sont pas
essentiels au recrutement de pol Kappa après stress réplicatif. Inversement, le mutant du
domaine d’interaction à PCNA n’est pas accumulé sur la chromatine comme les autres
mutants. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus en immunofluorescence sur la
formation des foyers.
99
Partie II : Résultats
Pour confirmer ce résultat, les lysats de cellules transfectées ont été fractionnés
selon la méthode de Mendez et Stillman, qui permet de séparer les protéines en une fraction
cytoplasmique, une fraction nucléoplasmique (protéines solubles du noyau), et une fraction
enrichie en protéines chromatiniennes. Ce fractionnement donne des informations sur la
localisation de la protéine d’intérêt, et notamment sur leur localisation nucléaire. Pour cette
expérience, nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux mutants Dead et PIP. En
l’absence de traitement, pol Kappa WT, dead, PIP2 sont accumulés dans la fraction nucléaire
soluble, et une partie du mutant Dead est recruté à la chromatine, ce qui est cohérent avec
la capacité du mutant Dead à former des foyers spontanément (fig 3B). Après traitement,
pol Kappa WT est recrutée à la chromatine. Par contre, le mutant PIP2 reste dans la fraction
100
Partie II : Résultats
nucléaire soluble et ne semble pas être recruté à la chromatine (Fig 3B) confirmant le
résultat obtenu avec le premier fractionnement (Fig 3A). Ce résultat engendre deux
hypothèses, soit pol Kappa PIP n’est pas recrutée à la chromatine, soit la mutation du
domaine PIP altère la stabilité de pol Kappa sur l’ADN, et diminue son temps de résidence
sur la chromatine.
Le domaine d’interaction à PCNA semble être un domaine clé dans le recrutement de
pol Kappa à la chromatine. Il est d’ailleurs aussi nécessaire au recrutement de pol Kappa lors
du processus de synthèse translesionnelle (Ogi, Kannouche, et Lehmann, 2005). Pour assurer
la synthèse translésionnelle, pol Kappa est recrutée via son domaine PIP mais aussi grâce à
l’interaction forte entre les domaines UBZ et PCNA-monoUb. Il sera intéressant de vérifier si
le double mutant UBZ présente, comme le mutant PIP2, un défaut de recrutement aux
niveaux de fourches bloquées. Le
mutant du domaine catalytique de pol Kappa est
intéressant, car il est recruté à la chromatine et forme des foyers en l’absence de traitement.
On peut alors se poser la question sur son temps de résidence à la chromatine, pol Kappa
dead pourrait avoir une mobilité réduite et un temps de résidence plus long sur la
chromatine. Il a d’ailleurs été montré, par des expériences de FRAP (Fluorescence Recovery
After Photobleaching) réalisées sur pol Eta Dead que la forme inactive de pol Eta est moins
mobile à l’intérieur des foyers que la forme sauvage (Sabbioneda et al., 2008).
4.
Effet des mutants sur la signalisation du checkpoint de phase S
Puisque pol Kappa PIP n’est pas recrutée ou maintenue à la chromatine comme la
forme sauvage, elle doit donc être dans l’incapacité de jouer son rôle au niveau du
checkpoint de phase S. On s’attend donc à une signalisation défectueuse du checkpoint
lorsque les cellules expriment le mutant PIP2 de pol Kappa.
101
Partie II : Résultats
102
Partie II : Résultats
Nous avons transfecté des cellules 293T avec les différents mutants, traités ou non
par HU. Les protéines des fractions cytoplasmiques, nucléoplasmiques, et enrichies en
chromatine ont été analysées par western blot après fractionnement. L’induction d’un stress
réplicatif, conduit au recrutement à la chromatine des protéines RPA et Hus1, appartenant à
la voie ATR/Chk1. En présence de la forme WT, des mutants dead et Rev1 nous retrouvons
ces protéines recrutées à la chromatine (Fig 4A). RPA, témoin de la présence de simple brin,
est recruté au même niveau que les autres mutants pour pol Kappa PIP, cependant le
recrutement de Hus1 est diminué en présence du mutant PIP (Fig 4A). La protéine ϒH2AX qui
est un marqueur des cassures doubles brins est recrutée après stress réplicatif, en présence
de la forme sauvage et des mutants PIP et Rev1, mais elle est accumulée avec la forme Dead
de pol Kappa (Fig 4A). De plus, l’expression de la forme Dead de pol Kappa entraîne un
défaut de phosphorylation de Chk1 après stress réplicatif (Betous, Pillaire et al, 2013 et
figure 4B). Ces résultats suggèrent que lorsque pol Kappa est incapable d’assurer son rôle au
niveau du checkpoint de phase S, il y a une accumulation de fourches de réplications
bloquées non résolues, menant à un effondrement des fourches de réplication et à des
cassures doubles brins.
En présence du mutant PIP, on constate une diminution de Hus1 à la chromatine
malgré la présence de la forme endogène de pol Kappa (Fig 4A), ce qui a pour conséquence
un défaut de phosphorylation de chk1 après stress réplicatif (Fig 4B). Il est d’ailleurs
intéressant de noter que ce résultat est en accord avec celui obtenu avec les extraits de
Xénope, où l’absence de pol Kappa entrainait un défaut du recrutement de Rad9, sous-unité
du complexe 9-1-1, et par conséquence un défaut d’activation du checkpoint. Néanmoins,
ces résultats sont à prendre avec prudence à cause de la présence de la forme endogène de
pol Kappa. Le mutant PIP pourrait agir en dominant négatif, en retenant le complexe 9-1-1
dans le nucléoplasme.
Sachant que l’interaction entre Pol Kappa avec la forme mono-ubiquitinylé de PCNA
est nécessaire pour le recrutement de Pol kappa en réponse à des génotoxiques, nous avons
analysé le statut de PCNA dans des cellules transfectées avec le mutant pol kappa-PIP. Nous
observons que l’expression du mutant PIP entraînait une diminution de PCNA-Ub que ce soit
103
Partie II : Résultats
dans la fraction soluble ou dans la fraction insoluble (Fig 5C). Cette diminution de la forme
mono-Ub de PCNA n’est pas observée dans les extraits Pol Kappa WT ou Pol Kappa dead
mais semble donc spécifique de la mutation du domaine PIP. La mono-ubiquitination de
PCNA est médiée par le complexe E3-ligase Rad6/Rad18, et sa dé-ubiquitination est faîte par
l’ubiquitine hydrolase USP1. En réponse aux UV, USP1 est dégradée pour promouvoir la
mono-ubiquitination de PCNA et la translésion. La question s’est posée de savoir si pol
Kappa PIP avait une influence sur USP1, ou sur le complexe E3-ubiquitine ligase Rad6/Rad18.
Les premiers résultats ne montrent pas de variation du niveau d’USP1 en absence de pol
Kappa mais ces expériences doivent être reproduites. Concernant Rad18, nous n’avons pas
eu de résultats clairs, ceci sera d’ailleurs discuté dans la partie III.
En conclusion, la fonction catalytique de pol Kappa serait importante pour la
résolution des fourches bloquées, en effet son absence aboutit à une accumulation de ces
fourches jusqu’à leur effondrement. Le domaine d’interaction à PCNA (PIP2) est important
pour le recrutement de pol Kappa au niveau des fourches bloquées, pour le recrutement
du clamp 9-1-1 après stress réplicatif et pour la mono-ubiquitination de PCNA. Toutefois,
ces résultats sont à reproduire après la déplétion de la forme endogène de pol Kappa.
104
Partie II : Résultats
5.
Etude de l’interaction de pol Kappa avec des partenaires clés
du checkpoint de phase S
a)
Identification de nouveaux partenaires de Pol Kappa dans
les celllules humaines
105
Partie II : Résultats
Afin de mieux comprendre le rôle de pol kappa dans le checkpoint de phase S, nous
nous sommes attachés à mettre à jour des partenaires dans cette nouvelle fonction. Peu
d’informations sont connues à ce jour. Des interactions avec le clamp 9-1-1 ont été
démontrées chez S. pombe (Kai, et 2003) et chez le Xénope (Bétous, Pillaire, et al, 2013),
mais jamais dans les cellules humaines.
Par des expériences d’immunoprécipitation, nous avons trouvé des partenaires de
pol Kappa. La difficulté dans la recherche de partenaires de pol Kappa vient du fait qu’il n’y a
pas d’anticorps anti-pol kappa assez performants pour immunoprécipiter la forme
endogène, il nous fallait donc passer par une expression ectopique. Nous avons surexprimé
pol Kappa dans des cellules 293T, traitées par HU et lysées pour préparer un extrait
nucléaire avec lequel nous avons réalisé l’immunoprécipitation. Les résultats montrent que
pol kappa est bien immunoprécipitée et que les protéines Rad 9 et Chk1 sont coimmunoprécipitées (Fig 5A). Ainsi nous montrons pour la première fois que Pol Kappa
interagit avec Rad9 et Chk1 dans les cellules humaines.
Pour confirmer ces résultats, nous voulions nous affranchir de l’étape de
surexpression et travailler avec les protéines endogènes. Nous nous sommes donc penchés
sur la technique de « Proximity Ligation Assay » (PLA). Après incubation avec les anticorps
primaires dirigés contre les partenaires potentiels, les anticorps secondaires couplés à des
sondes d’ADN sont ajoutés sur les cellules fixées. Si les protéines sont suffisamment proches
(maximum de détection 40nm), les sondes d’ADN seront liées, ce qui permettra une
amplification avec des dNTPs marqués via RCA (Rolling Circle Amplification), et cette
amplification sera détectée par microscopie à fluorescence (Fig 6).
106
Partie II : Résultats
Nous avons réalisé des expériences de PLA avec des cellules MRC5-SV ensemencées
sur lamelles de verres, traitées ou non par HU (Fig 5B). Le nombre de cellules présentant des
foyers est quantifié (environ 150 noyaux/condition n=3). Le couple pol Kappa/ PCNA a été
utilisé comme contrôle positif d’interaction car l’interaction entre pol Kappa et PCNA a déjà
été démontrée (Guo et al., 2008). Nous observons une interaction entre Pol Kappa et PCNA
par la méthode du PLA. Et cette interaction est stimulée par le traitement par l’hydroxyurée.
Le PLA a donc été étendu à l’étude de l’interaction entre Pol Kappa et les partenaires
nouvellement par immunoprécipitation. Les résultats du PLA confirment ceux de l’IP, mais
en plus nous montrent que les interactions entre pol Kappa-Rad9 et pol Kappa-Chk1 sont
stimulées par HU. En effet, le pourcentage de cellules présentant des foyers passe de 15% à
45% (Fig 5B). Nous avons réalisé les mêmes expériences de PLA avec une polymérase
spécialisée de la famille Y, l’ADN polymérase Eta (pol Eta), pour évaluer si ces interactions
sont spécifiques de pol Kappa. Nous avons analysé dans les mêmes conditions les couples
pol Eta/PCNA, pol Eta/Rad9, et pol eta/Chk1 (Fig 7). Comme attendu, après stress réplicatif,
107
Partie II : Résultats
pol Eta et PCNA interagissent, par contre Pol Eta n’interagit ni avec Rad9, ni avec Chk1,
confirmant ainsi la spécifité d’interaction entre pol Kappa/Rad9 et pol Kappa/Chk1.
108
Partie II : Résultats
En conclusion, la forme endogène de pol Kappa interagit avec les formes endogènes
de PCNA, Chk1 et Rad9. Ces interactions sont stimulées après stress réplicatif.
b)
Effet des mutants de pol Kappa sur l’interaction avec
Rad9 et Chk1
Nous avons réalisé des expériences d’immunoprécipitation avec les mutants pol
Kappa-Dead et pol-Kappa PIP. Nous avons suivi le même opératoire qu’avec la forme WT de
pol Kappa. De manière intéressante, nous pouvons voir que pol Kappa Dead ne semble pas
interagir avec Rad9 et Chk1 après stress réplicatif alors que la forme PIP mutée interagit
avec Rad9 et Chk1 (Fig 8A). L’interaction avec Chk1 semble, d’ailleurs, être stimulée après
stress réplicatif (Fig 8B). Ces interactions entre pol Kappa PIP –Rad9, et pol Kappa PIP-Chk1
semble suggérer l’existence d’un complexe pré-formé entre pol Kappa et ses partenaires. En
effet, l’IP est réalisée sur des extraits nucléaires, incluant les protéines solubles et insolubles,
et pol Kappa PIP est moins recrutée, on peut penser que les interactions prennent place
préférentiellement dans le nucléoplasme. Il est à noter que cette hypothèse est confortée
par l’analyse de l’IP du mutant Dead de pol Kappa. En condition non traité, il y a une
interaction entre pol Kappa dead et Chk1, mais après traitement HU, l’interaction est
fortement diminuée. L’interaction entre Chk1 et pol Kappa semble être plus forte, quand pol
Kappa est dans le nucléoplasme. Pour confirmer cette hypothèse, il faudra réaliser des
immunoprécipitations sur la fraction nucléaire soluble et la fraction nucléaire insoluble.
En conclusion, il existerait un complexe libre 9-1-1-pol Kappa-Chk1 formé
dans le
nucléoplasme, ce qui confirme le résultat obtenu avec Hus1 (Fig 4A)
109
Partie II : Résultats
C. Conclusion sur le rôle pol Kappa dans le checkpoint de phase S
La connaissance du checkpoint de phase S n’impliquait pas de polymérase spécialisée
au niveau de cette étape cruciale dans la réponse aux fourches bloquées or nos travaux
démontrent l’implication d’une polymérase spécialisée, Pol Kappa.
Après induction d’un stress réplicatif par l’hydroxyurée, les polymérases réplicatives
sont bloquées tandis que les hélicases continuent de dérouler l’ADN laissant l’ADN sous
forme simple brin recouvert par la protéine RPA. Ce qui permet le recrutement des
protéines appartenant à la voie ATR/Chk1.
L’ensemble des résultats montre un rôle important de pol Kappa au niveau du
checkpoint de phase S. L’absence de pol Kappa entraîne un défaut de phosphorylation de
Chk1, qui se traduit par un défaut d’activation du checkpoint de phase S. Par des expériences
d’immunodéplétion dans les extraits d’œufs de Xénope, il a été montré que pol Kappa était
requis pour la synthèse de brins d’ADN naissants au niveau des fourches bloquées, ce qui
permet une signalisation correcte du checkpoint de phase S. De plus, l’expression de la
forme Dead de pol Kappa conduit à un défaut de phosphorylation de Chk1. Ces expériences
démontrent l’importance du domaine catalytique de pol Kappa dans cette nouvelle fonction.
110
Partie II : Résultats
L’expression du mutant dead provoque une relocalisation de pol Kappa en foyers de façon
spontanée et son accumulation sur la chromatine en l’absence de stress. De façon
intéressante, il a été montré par des expériences de FRAP (Fluorescent Recovery after
Photobleaching), que la forme inactive de pol Eta avait un temps de résidence plus long en
foyer (Sabbioneda et al., 2008) . Les structures de pol Eta et pol Kappa étant similaires, la
formation de foyers spontanés de pol Kappa Dead pourrait s’expliquer de la même manière.
Il serait intéressant de faire des expériences de FRAP afin de confirmer cette hypothèse. De
plus, pol Kappa Dead semble interagir avec Chk1, cependant cette interaction est diminuée
après HU. Il serait intéressant de réaliser des PLA avec le mutant afin de confirmer ce
résultat.
Les nouvelles expériences réalisées par la suite approfondissent le mécanisme de
recrutement. Les études sur les mutants nous montrent l’importance du domaine PIP pour le
recrutement au niveau des fourches bloquées, et sur le recrutement à la chromatine du
clamp 9-1-1. Nous avons vu que pol Kappa PIP et Rad9 interagissent. Bien que le domaine
PIP ne semble pas requis pour cette interaction, il est important pour le recrutement à la
chromatine du complexe pol Kappa/9-1-1. Nous montrons aussi une interaction entre pol
Kappa PIP et Chk1. On peut donc imaginer, qu’après stress réplicatif, un complexe se forme
entre pol Kappa /chk1/9-1-1, et que ce complexe est recruté à la chromatine via le PIP
domaine de pol Kappa.
Récemment, un nouveau domaine PIP (PIP1) a été mis à jour dans pol Kappa. La
mutation de ce domaine abolit l’interaction avec PCNA, contrairement à la mutation du
domaine PIP2. Nous venons de réaliser des mutants de ce domaine, mais aussi des doubles
mutants (PIP1+PIP2). A ce jour, nous n’avons pas encore de résultats avec ces mutants. Il
sera intéressant d’étudier si les domaines PIP sont redondants et si la mutation des deux
domaines amplifie le phénotype observé avec les mutant PIP2.
Nous sommes actuellement en train de réaliser des doubles mutants UBZ. En effet,
les simples mutants UBZ ne montrent pas de phénotype fort. On voit une légère diminution
des cellules présentant des foyers après stress réplicatif. La mutation d’un domaine UBZ
pourrait être compensée par le domaine encore fonctionnel. L’étude du double mutant est
intéressante, car les domaines UBZ ont été montrés comme étant requis pour la translésion.
111
Partie II : Résultats
Nous allons regarder si la mutation des deux domaines affecte le recrutement de pol Kappa
à la chromatine, dans un contexte de fourches bloquées, mais aussi, par des expériences d’IP
et PLA, nous allons étudier ses partenaires.
L’ensemble de ces études nous permettrait d’approfondir le rôle de pol Kappa dans le
checkpoint de phase S, mais aussi d’établir un modèle de recrutement au niveau des
fourches bloquées.
112
Partie II : Résultats
Rôle de Pol Kappa dans la stabilisation de Chk1 en
réponse à un stress réplicatif
II.
A.
Contexte et objectif
Après induction de stress réplicatif, nous avons pu voir que l’absence de pol Kappa
entraine un défaut d’activation de Chk1, se traduisant par un checkpoint de phase S inactif
(Bétous et al., 2013). Nous avons alors voulu comprendre en quoi la présence de pol Kappa
était importante pour la phosphorylation de Chk1.
Dans un premier temps, nous avons démontré que l’activité catalytique de pol Kappa
était importante, en effet, la synthèse d’ADN au niveau des fourches bloquées est requise
pour la pleine activation du checkpoint de phase S. Mis à part l’implication du domaine
catalytique de pol Kappa, nous nous sommes intéressés aux différentes raisons qui
pourraient aboutir à un défaut de phosphorylation de Chk1 en l’absence de pol Kappa,
comme un défaut de son recrutement à la chromatine. Sa régulation post-traductionnelle
défectueuse Chk1, ou à son instabilité.
Les résultats obtenus dans la partie I montrent une interaction entre pol Kappa et
Chk1. Cette interaction est forte en présence du mutant PIP2 de pol Kappa qui n’est pas
recruté à la chromatine après stress réplicatif, suggérant que cette interaction a lieu dans le
nucléoplasme. En plus de son activité catalytique, le rôle de pol Kappa en réponse au stress
réplicatif pourrait s’exercer au travers de son interaction avec Chk1. La partie II des résultats
adresse cette question.
113
Partie II : Résultats
A.
Pol Kappa est requise pour la stabilité de Chk1 après stress
réplicatif
114
Partie II : Résultats
Le taux intracellulaire de Chk1 a été évalué dans des cellules embryonnaires de souris
(MEFs) primaires KO pour pol Kappa. Nous voyons que l’absence de pol Kappa entraîne une
diminution du niveau global de Chk1 (Fig 9A), indépendamment du traitement. Ce résultat
est en accord avec le résultat publié avec des cellules MEFs pol Kappa KO (Bétous et al.,
2013) . Pour confirmer cette observation dans les cellules humaines, nous avons cotransfecté des cellules 293T avec le siARN ciblant pol Kappa dans sa partie 3’UTR, avec le
vecteur exprimant la GFP seule ou le vecteur exprimant pol Kappa WT, puis induit un stress
réplicatif par traitement avec HU. Nous avons ensuite réalisé un fractionnement cellulaire,
puis analysé par western blot les différentes fractions cytoplasmique, nucléaire soluble et
enrichie en protéines chromatiniennes. Le niveau de Chk1 reste inchangé dans la fraction
cytoplasmique en l’absence de pol Kappa. Néanmoins, dans les fractions nucléaires (FNI et
FNS), nous pouvons voir que l’absence de pol Kappa entraîne une diminution du niveau
global de Chk1 (Fig 9B). La complémentation de pol Kappa WT dans les cellules déplétées en
pol Kappa endogène restaure le niveau de Chk1 dans le noyau (Fig 9C).
En conclusion, pol Kappa régule directement ou indirectement le niveau protéique
intra-nucléaire de Chk1.
115
Partie II : Résultats
B.
USP7 : un nouveau régulateur de pol Kappa
1.
USP7 requis pour la stabilité de pol Kappa
Des publications récentes mettent en évidence une régulation des protéines
impliquées dans la voie ATR/Chk1 via un processus d’ubiquitination/dé-ubiquitination. Une
ubiquitine hydrolase, USP7, semble d’ailleurs avoir un rôle privilégié dans la réponse au
stress réplicatif. En effet, le rôle le plus connu de cette HAUSP est la régulation de p53. En
condition normale, p53 est ubiquitinylé par l’E3 ligase, MDM2 (Mouse Double Minute 2
homologue), induisant sa dégradation, ce qui permet de garder un niveau bas de p53. Après
stress réplicatif, USP7 est capable de dé-ubiquitinylé p53 et de le stabiliser. USP7 semble
avoir un rôle important dans la réponse au stress réplicatif. D’ailleurs, il a été montré
qu’USP7 était capable de stabiliser Chk1 par dé-ubiquitination. L’absence d’USP7 entraîne
une diminution du niveau de Chk1 dans la cellule, et un défaut de signalisation du
checkpoint.
Pour explorer si pol Kappa pouvait aussi être régulée par cette voie, nous avons
réalisé des expériences de déplétion d’USP7 par ARN interférence dans des cellules MRC5-SV
et 293T. Nous avons d’abord validé les siARNs ciblant USP7 (Fig 10A). Puis nous avons
transfecté des cellules MRC5-SV (Fig 10B) et 293T (Fig 10C), traitées ou non à l’hydroxyurée,
et analysé par western blot le niveau de pol Kappa endogène. De façon intéressante, nous
avons pu constater que l’absence d’USP7 entraîne une diminution du niveau de pol kappa, et
116
Partie II : Résultats
Figure 10 : USP7 régule pol Kappa
A- Afin de valider l’extinction d’USP7, les cellules 293T ont été transfectées avec des siARN ciblant
USP7 (siUSP7_pool correspond à un mix des 3 siARN siUSP_1; siUSP7_2; siUSP_3). Les cellules ont été
lysées et analysées par western blot.
B- Des cellules MRC-SV ont été transfectées avec des siARNs ciblant pol Kappa (si-K5 et si-K qui est un
pool de siARN ciblant la partie non codante), Chk1, et USP7 (si-USP7_2). Les cellules ont été traitées
par l’hydroxyurée 0,5mM, 30min.
C- Comme précédemment, des cellules MRC5-SV sont transfectées avec des siARN ciblant la
luciférase (si-CT), ou USP7 (si-USP7_2), traitées ou non par l’hydroxyurée 0.5mM, 30min, lysées afin
d’otenir un extrait total, et analysées par western blot.
D- Un proximity ligation assay a été réalisé sur des MRC5-SV transfectées par les siARNs ciblant la
luciférase (siLuc), pol Kappa (si-K5 et si-K3’ qui est un pool de siARN ciblant la partie non codante), et
USP7 (siUSP_2). Pol Kappa a été detectée directement après couplage des anticorps primaires avec
les sondes d’ADN. La quantification representée correspond au nombre de foci par cellules (n=1).
117
Partie II : Résultats
que cette diminution est accentuée après HU (Fig 10C). Par ailleurs dans les deux
expériences montrées, nous retrouvons comme attendu une diminution de Chk1. Nous
avons confirmé ce résultat par PLA. En effet, le PLA permet aussi une meilleure détection
d’une protéine endogène. Nous avons directement couplés les sondes ADN aux anticorps
primaires, ce qui nous permet de détecter directement la protéine endogène. Le nombre de foyers
pol Kappa par cellule est quantifié dans les cellules. On obtient un résultat similaire à l’analyse
par western blot, l’absence d’USP7 entraîne une diminution du niveau de pol Kappa dans la
cellule.
2. Interaction entre Pol Kappa et USP7
Suite à ces résultats, nous avons cherché s’il existait une interaction entre pol Kappa
et USP7. Dans un premier temps nous avons réalisé une immunoprécipitation à partir
d’extraits nucléaires. Nous avons co-transfecté des cellules 293T avec le siARN ciblant la
luciférase ou le siARN ciblant USP7, puis avec le vecteur pEGFP-vide ou le vecteur pEGFP-Pol
Kappa WT, et traitées ou non les cellules par HU (0,5mM 30min). Par la suite, nous avons
réalisé les immnunoprécipitations. Nous pouvons voir qu’USP7 est précipité avec pol Kappa
(Fig 11A) dans la condition siARN contrôle (siCT).
Pour confirmer ce résultat, nous avons fait des expériences de PLA dans des cellules MRC5SV traitées ou non avec HU (0,5mM, 30min). Afin de contrôler la spécificité de l’interaction
entre pol Kappa et USP7 en PLA, nous avons reproduit la même expérience mais en
transfectant des cellules MRC5SV avec un siARN ciblant la luciférase et un siARN ciblant pol
Kappa, puis les cellules ont été traitées par l’hydroxyurée. Comme attendu avec le siARN
contrôle, nous retrouvons un pourcentage de cellules présentant de foyers identique à celui
précédemment. En condition siARN ciblant pol Kappa, le pourcentage est fortement
diminué, montrant la spécificité de l’interaction entre pol Kappa et USP7 (Fig 11B). Les
résultats confirment l’interaction entre pol kappa et USP7 observé par IP et indiquent qu’elle
est stimulée après stress réplicatif (20% en condition non traité à 80% après stress réplicatif)
(Fig 12C).
Pris ensemble, ces résultats suggèrent que pol Kappa est un partenaire d’USP7 et peut être
un de ces nouveaux substrats.
118
Partie II : Résultats
119
Partie II : Résultats
3.
Pol Kappa régulée par ubiquitination
a)
Pol kappa est ubiquitinylé
En 2008, une étude menée chez la souris (Guo, et al 2008) montrait que les domaines
UBZ étaient requis pour l’interaction entre pol Kappa et l’ubiquitine, mais aussi que pol
Kappa pouvait être ubiquitinylée sur ces mêmes domaines UBZ. Bien que la structure des
protéines humaines et murines soient très proches, il nous a fallu démontrer que pol Kappa
humain pouvait être elle aussi ubiquitinylée après HU.
120
Partie II : Résultats
Pour cela, nous avons co-transfecté des cellules 293T avec des vecteurs exprimant
l’ubiquitine taguée avec HA, et des vecteurs exprimant pol Kappa tagué avec la GFP ou le
vecteur codant simplement la GFP, puis nous avons induit ou non un stress réplicatif. Pour
détecter l’ubiquitination de pol Kappa, nous avons réalisé une immunoprécipitation en
utilisant le tag GFP, et révélé les protéines avec l’anticorps contre le tag HA de l’ubiquitine.
Les résultats montrent un smear autour de 130kDa (Taille de pol kappa-GFP) qui pourrait
correspondre à pol Kappa ubiquitinylée, ou à l’ubiquitination des partenaires de pol Kappa
(Fig 12). Afin de confirmer la spécificité de l’ubiquitination de pol Kappa, nous pourrions
réaliser ces IP dans des conditions dénaturantes, ce qui rompt les interactions entre les
protéines. Nous pourrions également immunoprécipiter l’ubiquitine, et faire une seconde IP
contre le tag GFP de pol Kappa.
Le résultat de l’IP semble montrer une légère différence entre les conditions traitées
et non traitées. Néanmoins, ce résultat est préliminaire, il faudra confirmer ce résultat en
réalisant les expériences en présence d’un inhibiteur du protéasome afin de visualiser les
formes poly-Ub de pol kappa.
b)
USP7 dé-ubiquitine pol Kappa ?
Après avoir montré que pol Kappa est ubiquitinée, nous voulions savoir si USP7 est
l’enzyme requise pour sa dé-ubiquitination. Pour cela, nous avons éteint ou non par ARN
interférence USP7 dans nos cellules 293T, puis surexprimé pol Kappa tagué GFP et HAubiquitine, et induit un stress réplicatif par HU. Nous avons réalisé un immunoprécipitation
de pol Kappa et analysé par western blot son ubiquitination. Comme obtenu précédemment
(Fig 12), nous retrouvons l’ubiquitination de pol Kappa. Cependant, en l’absence d’USP7, on
observe une forte diminution de HA, suggérant une diminution de pol Kappa ubiquitinylé
(Fig 13).
Ce résultat surprenant peut s’expliquer par le fait que l’absence d’USP7 entraine une
accumulation de pol Kappa poly-ubiquitinylée
entraînant sa dégradation rapide. Des
expériences complémentaires sont en cours afin de tester cette hypothèse. Nous faisons les
expériences en présence d’un inhibiteur du protéasome, afin de voir s’il y a effectivement
une accumulation de formes poly-ubiquitinylées de pol Kappa. Mais la confirmation directe
121
Partie II : Résultats
serait de réaliser la même expérience mais en surexprimant USP7. La forme ectopique
d’USP7 devrait annihiler l’ubiquitination de pol Kappa.
4. USP7 stabilise pol Kappa dans le noyau
Après stress réplicatif, Pol Kappa est recrutée aux fourches bloquées. USP7 est un
partenaire de pol Kappa, et il pourrait réguler son ubiquitination. Nous avons recherché si
USP7 régulait le recrutement de pol Kappa à la chromatine. Nous avons déplété pol Kappa,
USP7 et Chk1, par des expériences d’ARN interférence dans les cellules que nous avons
ensuite traitées ou non par HU. Un fractionnement cellulaire a été réalisé, et les protéines
des fractions cytoplasmiques, fractions nucléoplasmiques, et enrichies en protéines
chromatiniennes ont été analysées par western blot (Fig 14).
122
Partie II : Résultats
En l’absence de traitement, pol Kappa se situe majoritairement dans la fraction
cytoplasmique Pol kappa n’est pas détéctée dans le noyau, ce qui est surement dû à un
niveau très faible de l’enzyme. Après traitement, il y a une augmentation du niveau de pol
Kappa dans le noyau et elle est recrutée à la chromatine. Contrairement à pol Kappa, USP7
est présent dans la fraction nucléaire en l’absence de traitement, mais comme pol Kappa,
son niveau est augmenté après HU (Fig 14).
En l’absence d’USP7, on constate que le niveau de pol Kappa dans le cytoplasme est
inchangé, mais que son niveau nucléaire est fortement diminué, et en conséquence son
recrutement à la chromatine est fortement affecté après stress réplicatif. Donc USP7 semble
important pour la stabilité de pol Kappa dans le noyau, et en conséquence, pour son
recrutement à la chromatine après stress réplicatif.
Si USP7 est absent, pol Kappa est déstabilisée et n’est pas recrutée à la chromatine.
En effet, bien que les expériences sur l’ubiquitination de pol Kappa soient incomplètes, la
diminution des formes ubiquitinylées de pol Kappa en l’absence d’USP7 et sans MG132,
nous laisse croire que pol Kappa est dé-ubiquitinylé par USP7. Nous pourrions alors émettre
l’hypothèse, qu’après stress réplicatif, pol Kappa et USP7 sont dirigés dans le noyau, USP7
dé-ubiqutine pol Kappa qui est ensuite recruté aux fourches bloquées.
En conclusion, l’ensemble des résultats suggèrent qu’USP7 stabilise pol Kappa via
sa dé-ubiquitination, mais devrons être confirmés.
123
Partie II : Résultats
C. Pol Kappa est importante pour stabiliser le complexe USP7/Chk1
Fort des résultats obtenus, nous avons cherché à comprendre pourquoi la déplétion
de pol Kappa entraînait une diminution du niveau de Chk1. Le lien entre pol Kappa, Chk1 et
USP7 nous laisse supposer que l’absence de pol Kappa pourrait conduire à un défaut de déubiquitination de Chk1 par USP7, et donc à une dégradation de Chk1.
124
Partie II : Résultats
Pour tester cette hypothèse, nous avons déplété pol Kappa dans des cellules MRC5SV par ARN interférence, et induit un stress réplicatif. Nous avons réalisé sur ces cellules un
PLA entre USP7/Chk1, et regardé l’effet de l’absence de pol Kappa sur la proximité de ces
deux protéines. Dans des conditions contrôles (Fig 15), on retrouve, comme attendu, une
interaction entre Chk1 et USP7 (environ 85% des cellules présentent des foyers). Cependant,
en l’absence de pol Kappa, on constate une forte diminution du nombre de cellules
présentant des foyers (environ 30%), suggérant une déstabilisation du couple USP7/Chk1.
Pol Kappa semble donc être nécessaire pour la stabilité de l’interaction entre USP7
et Chk1. Or, comme l’absence de pol Kappa n’entraîne pas de diminution d’USP7,
contrairement à Chk1, pol Kappa pourrait permettre l’interaction entre les deux protéines,
favorisant la dé-ubiquitination de Chk1 par USP7.
125
Partie II : Résultats
D. Conclusions sur la stabilisation de Chk1 en réponse à un stress
réplicatif
Lors d’un stress réplicatif, la cellule met en place différents mécanismes afin de
résoudre les arrêts de fourches de réplication. Une des réponses est l’activation du
checkpoint de phase S. Nous savons maintenant que pol Kappa intervient dans ce checkpoint
de phase S, en synthétisant des fragments d’ADN au niveau des fourches bloquées, ce qui
permet l’activation du checkpoint. En approfondissant, nous avons pu voir que pol Kappa
était recrutée au niveau des fourches bloquées par son domaine d’interaction à PCNA, de
plus nous avons montré une interaction avec Rad9 et Chk1, acteur majeur du checkpoint.
Cependant, au cours des expériences, nous avons observé, dans les MEFs primaires
pol Kappa-/- une diminution du niveau de Chk1, suggérant une régulation entre pol Kappa et
Chk1. En suivant cette piste, nous avons pu voir que le taux de pol Kappa, de manière
similaire à celui de Chk1, était diminué en l’absence de la dé-ubiquitine hydrolase USP7. De
plus, nous pouvons penser que le recrutement de pol Kappa à la chromatine serait
dépendant de sa dé-ubiquitination par USP7. Des expériences complémentaires (test de déubiquitantion de pol Kappa) seront réalisées pour permettre de valider cette hypothèse.
Nous avons pu aussi montrer que l’absence de pol Kappa entraînait une diminution de
l’interaction entre USP7 et Chk1, ce qui expliquerait qu’en absence de pol Kappa le niveau de
Chk1 soit diminué. Pol Kappa serait le lien entre USP7 et Chk1, qui aboutirait à la
stabilisation de Chk1 après dé-ubiquitination.
L’ensemble des résultats nous a permis de proposer un modèle. Au cours d’un stress
réplicatif menant à un arrêt des fourches de réplication, ub-pol Kappa, ub-Chk1 et USP7 sont
importés dans le noyau. Pol kappa ubiquitinylée s’associe avec Chk1 lui aussi ubiquitinylé et
permet le rapprochement avec USP7. Une fois ce complexe associé, USP7 dé-ubiquitine pol
Kappa et Chk1, les stabilise, et ce qui permet leur recrutement à la chromatine (Fig 16).
126
Partie II : Résultats
127
Partie II : Résultats
III. Rôle potentiel de pol Kappa dans des régions
hétérochromatiniennes
Nous montrons au cours des chapitres précédents un rôle majeur de pol Kappa dans
le checkpoint de phase S or cette polymérase n’est pas essentielle chez la souris puisque les
souris pol Kappa knock out (KO) sont viables et fertiles. La stabilité génomique de ces souris
est affectée puisque une augmentation de la fréquence de mutation et une instabilité de
certaines séquences répétées ont été décrites en absence de pol Kappa. De plus, comme
décrit en introduction (Chapitre IV.II.A), différentes études in vitro suggèrent un rôle pour
pol Kappa lors de la réplication de séquences répétées.
Nous avons ainsi émis l’hypothèse que pol Kappa aurait un rôle au niveau de zones
de séquences répétées. Pour cela, nous avons étudié la co-localisation entre pol Kappa et
une protéine centromérique CENPB.
A.
Mise en évidence de l’interaction entre Pol Kappa
et CENP-B
Afin de voir si pol Kappa avait potentiellement un rôle au niveau des centromères,
nous avons réalisé des expériences de PLA, en utilisant le couple pol Kappa/CENP-B. Nous
avons, pour cela, traitées des cellules MRC5-SV par l’hydroxy-urée. Nous avons choisi de
regarder, dans un premier temps, l’interaction après traitement, parce que pol kappa est
recrutée à la chromatine et qu’il est capable de former des foyers. Nous avons pu voir, sur
deux expériences, que pol Kappa et CENPB interagissaient après stress réplicatif (Fig 21).
Environ 55% des cellules présentent des foyers après HU. On peut constater que ces foyers
ont une localisation péri-nucléaire ou péri-nucléolaire.
128
Partie II : Résultats
B.
Généralités sur les centromères et CENP-B
Les centromères sont des structures présentes sur les chromosomes visibles durant la
métaphase lorsque les chromosomes sont condensés. Ils sont le point de liaison entre les
deux chromatides sœurs, mais aussi le point d’attachement des microtubules.
Chez l’humain, l’ADN centromérique est composé d’ADN α-satellite (Manuelidis,
1978) , qui comporte un motif monomérique répété de 171bp (Vissel et Choo, 1987) Ces
monomères sont organisés en complexe répété d’ordre supérieur (HOR), qui s’étend sur des
régions variant entre 0,3 à 4 mégabases. Les HORs possèdent 90% d’homologie entre eux,
alors que les monomères les composant présentent une homologie de seulement de 50%
(Aldrup-Macdonald et Sullivan, 2014) (Fig 20).
129
Partie II : Résultats
La conservation des HORs dans les centromères suggèrent qu’ils sont requis pour leur
fonctionnalité. Cependant, la découverte de centromères dicentriques contenant de l’ADN
α-satellite et la découverte de néocentromères ne possédant pas d’ADN α-satellite (Voullaire
et al., 1993) ont mis à mal cette affirmation. Il est maintenant admis, que la fonction et
l’identité du centromère est régulé par épigénétique, et par des structures chromatiniennes
spécialisées et conservées chez les eucaryotes.
Une des marques épigénétiques la plus conservée est le variant histone H3, connu
sous le nom de CENP-A chez l’homme. Il va permettre la formation d’un nucléosome
différent des nucléosomes traditionnels. Les nucléosomes formés sont composés de CENP-A,
H2A, H2B et H4, chacune présente en double exemplaire afin de former un octamère
(Tashiwana et al, 2011). Le nucléosome centromérique possède un core plus rigide,
cependant il enroule l’ADN de façon moins étroite que les nucléosomes conventionnels
(Hasson et al., 2013) . La chromatine centromérique est flanquée de part et d’autre
d’hétérochromatine dite péricentromérique. Dans cette hétérochromatine, on retrouve des
histones H3 triméthylé sur la lysine 9 (H3K9me3) liées par la protéine hétérochromatine 1
130
Partie II : Résultats
(HP1) (Minc, Courvalin, et Buendia, 2000 ; Nakayama et al., 2001 ; Yamagishi et al., 2008) .
On note aussi la présence du variant d’histone H2AZ, qui contribue à la structure 3D du
centromère (Greaves et al., 2007).
La fonction essentielle du centromère est la formation du kinétochore, une
superstructure capable de lier les chromosomes métaphasiques aux microtubules. Les
nucléosomes formés par le variant d’histone CENP-A seront la plateforme à laquelle les
protéines formant le kinétochore s’amarrent.
Il existe une maladie auto-immune liée aux centromères, le CREST. Elle tient son nom
des symptômes qu’elle confère, et qui ressemble à ceux d’une sclérose (Calcifications sous
cutanées, syndrome de Raynaud, anomalies Œsophagiennes, Sclérodactylie, Télangiectasie).
Les patients produisent des auto-anticorps contre les centromères (Moroi et al., 1980) . Lors
de l’étude des antigènes des sérums des patients, les protéines CENP-A, CENP-B, et CENP-C
ont été mises à jour (Earnshaw et Rothfield, 1985) . CENP-C fait partie du complexe
nucléosome variant et, est requis pour l’assemblage du kinétochore. Nous nous sommes
plus intéressés à CENP-B, car cette protéine est capable de lier une séquence de 17bp dans
l’ADN α-satellite (Earnshaw et Rothfield, 1985 ; Muro et al., 1992).
CENP-B est une protéine de 80kDa, connue pour lier par son extrémité aminoterminal à un motif de 17bp présent dans l’ADN α-satellite, et elle est capable de se
dimériser par sa région carboxy-terminale (Earnshaw et Rothfield, 1985 ; Pluta et al., 1992 ;
Yoda et al., 1992 ; Muro et al., 1992.). Les souris CENP-B KO sont viables et ne présentent
pas de phénotypes particuliers (Hudson et al, 1998, Fowler et al, 2000), surement dû au fait
qu’il existe des homologues fonctionnels de CENP-B (Toth et al., 1995 ; Smit et Riggs, 1996).
En clinique, CENP-B a été montré comme un bio-marqueur potentiel dans les cancers du
poumon à petites cellules (SCLC) (Briasoulis et al., 2008)
Des expériences de reconstitution de nucléosomes avec CENP-B montrent que CENPB pourrait moduler la formation des nucléosomes à proximité des boites CENP-Box (Tanaka
et al., 2002). Par ailleurs, il a été observé que le domaine N-terminal de CENP-B est requis
pour l’assemblage de novo de CENP-A sur l’ADNα-satellite (Tanaka, Kurumizaka, et
Yokoyama, 2005). Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine montrent que
CENP-B forment un complexe stable avec CENP-A sur l’ADN α-satellite (Fujita et al., 2015).
131
Partie II : Résultats
CENP-B est aussi nécessaire par conséquence pour la formation du kinétochore. CENP-B
reste un acteur majeur des centromères, et joue un rôle clé dans l’assemblage des
nucléosomes.
C.
Conclusion sur le rôle potentiel de Pol Kappa dans les régions
d’hétérochromatine
Mon équipe d’accueil a ouvert un champ d’investigation sur des rôles nouveaux des
ADN polymérases spécialisées, notamment en montrant que pol Theta modulait le timinig
de réplication, mais aussi en montrant que pol Eta était requise pour la réplication des sites
fragiles communs (Fernandez-Vidal et al., 2014 ; Bergoglio et al., 2013 ; Rey et al., 2009).
Nous proposons ici que pol Kappa soit une polymérase impliquée dans la maintenance des
régions hétérochromatiniennes et plus particulièrement les centromères, peut être grâce à
sa fonction dans le checkpoint de phase S.
Nous avons pu mettre en évidence une interaction entre CENP-B, protéine
importante des centromères, et pol Kappa. Ce résultat, bien que très préliminaire est
intéressant, car il pourrait mettre en évidence un rôle de pol Kappa dans la réplication nonperturbée. En effet, l’ADN centromérique se compose de répétitions, et les ADN
polymérases réplicatives sont montrées pour être moins fidèles sur des séquences répétées
(Abdulovic et al., 2011). Pol Kappa pourrait, à l’instar de pol Eta au niveau des sites fragiles,
venir en secours des ADN polymérases réplicatives afin de franchir cette zone de répétition.
132
Partie II : Résultats
133
Partie III : Conclusion et discussion générale
Partie III : Conclusion et discussion
générale
134
Partie III : Conclusion et discussion générale
Conclusion et discussion générale
Au cours de ma thèse, nous avons pu mettre en évidence un nouveau de rôle de pol
Kappa dans les cellules de mammifères. En effet, nous avons vu qu’en l’absence de pol
Kappa, après induction de stress réplicatif, il y avait une diminution de l’activation du
checkpoint de phase S, générant de l’instabilité génétique. Mon travail de thèse s’est articulé
autour des trois axes : la mise en évidence du rôle de pol Kappa dans le checkpoint de phase
S et l’étude des domaines fonctionnels, l’implication de pol Kappa dans la stabilité de chk1,
et enfin le rôle potentiel de pol Kappa au niveau des régions d’hétérochromatine.
IV. Pourquoi pol Kappa est-elle importante pour la
phosphorylation de Chk1 ?
C.
La fonction polymérase de pol Kappa
En 2013, nous avons mis à jour un nouveau de rôle de pol Kappa au niveau du
checkpoint de phase S. Nous avons pu voir que pol Kappa était requise pour synthétiser des
ADN naissants au niveau des fourches de réplication bloquées. Cette synthèse est nécessaire
pour le recrutement du complexe 9-1-1 aux fourches bloquées. Nous supposons que Pol
kappa intervient sur le brin direct puisque pol Delta est assignée au brin retardé. La place
des pol Kappa et Delta est prépondérante au regard de pol epsilon dont l'implication est
minoritaire (Bétous et al., 2013 ; Van et al., 2010). Afin de vérifier si d’autres polymérases
spécialisées étaient impliquées, nous avons déplété pol Eta dans les cellules. Nous avons pu
voir que la déplétion de pol Eta n’affectait pas l’activation du checkpoint de phase S, et que
pol Eta n’interagissait pas avec des protéines impliquées dans la signalisation du checkpoint.
Ces résultats excluent une intervention de pol Eta dans cette réponse cellulaire. Cependant,
nous n’avons pas testé si les autres polymérases de la famille Y, ni même pol Zeta, qui
collabore pourtant avec pol Kappa pour le franchissement de dommage, pouvaient
135
Partie III : Conclusion et discussion générale
participer. Ainsi la question de la collaboration entre les ADN polymérases dans le
checkpoint de phase S reste ouverte.
D.
La stabilité protéique de Chk1 requiert pol Kappa
En l’absence de pol Kappa, dans des MEFs primaires, il a été observé une diminution
du niveau de Chk1 quelque soit le traitement utilisé, ce résultat a d’ailleurs été confirmé
dans les MEFs immortalisés. Ces résultats ont été, également, observé dans des cellules
humaines après traitement à l’hydroxyurée. Après stress réplicatif, il est connu que Chk1 est
accumulée dans le noyau, afin de jouer son rôle dans l’activation du checkpoint de phase S.
Cependant, l’absence de pol Kappa conduit à une diminution du niveau de Chk1 seulement
dans le noyau, après stress réplicatif. Le niveau cytoplasmique de chk1 n’est pas impacté par
l’absence de pol Kappa. De plus, nous avons observé une interaction entre pol Kappa et Chk1
dans le noyau, et plus précisément dans le nucléoplasme, laissant penser à une régulation
commune entre pol Kappa et Chk1. Nos résultats conduisent à l’hypothèse que l’absence de
pol kappa déstabilise Chk1 dans le noyau.
Le niveau protéique de Chk1 est régulé par l’ubiquitination. En C-terminal, Chk1
possède une séquence « degron like » qui pourrait être la cible par deux cullines E3 Ringligases CRL1 et CRL4. L’ubiquitination de Chk1 conduit à sa dégradation nucléoplasmique via
CRL4, tandis que CRL1 ubiquitinerait Chk1 dans le cytoplasme (Zhang et al., 2005 ; Zhang et
al., 2009). Récemment, il a été mis en évidence une ubiquitine hydrolase USP7 capable de
dé-ubiquitiner Chk1 et, de le stabiliser. L’absence d’USP7 conduit à une diminution du niveau
de Chk1 dans les cellules (Alonso-de Vega, Martín, et Smits, 2014) mais le mécanisme exact
de cette régulation n’est pas connu. USP7 pourrait agir sur Chk1 ubiquitinylé par CRL4 après
la phosphorylation par ATR ou, nous pouvons imaginer que l’ubiquitination par CRL1
pourrait médier le transport de Chk1 dans le noyau, et une fois dans le noyau USP7 pourrait
agir et stabiliser Chk1.
Nous avons mis à jour une interaction entre USP7 et Pol Kappa. La déplétion d’USP7
dans nos cellules aboutit à la diminution du niveau de pol Kappa dans le noyau. Nous nous
136
Partie III : Conclusion et discussion générale
sommes alors posés la question du lien entre pol Kappa et USP7. Pol Kappa pourrait être
régulé par USP7, via une dé-ubiquitination.
Il existe différents type d’ubiquitination (Fig 20). Notamment, la poly-ubiquination sur
la lysine K48 de l’ubiquitine entraîne la dégradation de la protéine par le protéasome, alors
que la poly-ubiquitination sur la lysine K63 joue plutôt un rôle dans la tolérance des
dommages à l’ADN ou dans la signalisation. La mono-ubiquitination joue un rôle dans la
réparation de l’ADN ainsi que dans l’expression des gènes (Sadowski and Sarcevic, 2010;
Sadowski et al., 2012). Il serait intéressant de savoir de quel type d’ubiquitination est doté
137
Partie III : Conclusion et discussion générale
pol Kappa pour son rôle dans le checkpoint de phase S. La poly-ubiquitination sur la lysine
K48 est sans doute requise pour maintenir un niveau stable de pol Kappa dans la cellule,
mais aussi peut être pour son déchargement après qu’elle ait joué son rôle aux fourches
bloquées. Cependant, elle pourrait être différente de l’ubiquitination permettant
l’implication de pol Kappa dans le checkpoint après stress réplicatif. Nous possédons des
mutants des lysines K48 ou K63 de l’ubiquitine (donnés par Dr Marlène Dufresnes, équipe Dr
Pierre Cordelier). Nous pourrions transfecter nos cellules avec ces différents mutants, et voir
l’effet sur l’ubiquitination de pol Kappa, sa stabilité, et son recrutement au niveau des
fourches bloquées. De plus, Il a été montré que pol Kappa pouvait être ubiquitinylée (Guo et
al., 2008), bien que nous ne connaissions pas les rôles physiologiques de cette
ubiquitination.
L’ubiquitination de pol Kappa pourrait être médiée par une E3 ligase TRIP (TNF
receptor associated factor interacting protein). En effet, cette enzyme promeut
l’ubiquitination de pol Eta, mais interagit aussi avec pol Kappa en C-terminal (Wallace et al.,
2014).
Il est intéressant de noter, qu’une étude en 2010, a démontré l’importance de
l’ubiquitination de pol Eta sur trois lysines situées dans son NLS. La mono-ubiquitination de
ces trois lysines conduirait à une forme repliée de pol Eta, où ces mono-ubiquitinations
seraient reconnues par son domaine de liaison à l’ubiquitine. Après induction de stress
réplicatif, il y aurait dé-ubiquitination de pol Eta, ce qui lui rendrait une conformation active,
et pourrait interagir avec PCNA-monoUb pour réaliser sa fonction dans la TLS. De façon
intéressante, ces trois lysines ont été retrouvées dans le NLS de pol Kappa, suggérant une
régulation similaire de pol Kappa (Bienko et al., 2010). La dé-ubiquitination par USP7 la
stabiliserait et lui rendrait sa forme active. Pol Kappa pourrait alors jouer son rôle dans le
checkpoint de phase S. La mutation dirigée de ces trois lysines pourra nous en dire plus sur la
régulation de pol Kappa.
Nous avons observé une diminution de pol Kappa dans le noyau après stress réplicatif
en l’absence d’USP7. Nous pourrions penser qu’USP7 régule la translocation de pol Kappa
dans le noyau, à l’instar de pol Beta par USP47. Lorsque la réplication n’est pas perturbée,
pol Beta nouvellement synthétisée peut être soit envoyé directement vers le noyau ou être
138
Partie III : Conclusion et discussion générale
ubiquitinylée et dégradée, ce qui permet de garder un niveau stable de pol Beta dans les
cellules. Mais lorsqu’un dommage sur l’ADN est détecté, pol Beta est dé-ubiquitiné par
USP47, ce qui permet sa translocation dans le noyau, et sa fonction dans le BER (Parsons et
al., 2011). Bien que nos expériences favorisent une interaction dans le noyau entre pol
Kappa et USP7, nous ne pouvons pas exclure qu’USP7 régule aussi la translocation de cette
enzyme.
Nous avons vu qu’USP7 semblait réguler indépendamment pol Kappa et Chk1,
laissant penser qu’il existe un complexe entre ces trois protéines après stress réplicatif.
L’absence de pol Kappa entraîne une diminution de Chk1 dans le noyau. Nous proposons
que la diminution du taux de Chk1 en absence de Pol Kappa soit due à la diminution de
l’interaction entre USP7 et Chk1, qui laisserait Chk1 ubiquitinylé et le conduirait vers la
dégradation. Ceci implique qu’en l’absence de pol Kappa nous devrions voir apparaitre une
poly-ubiquitination de Chk1, synonyme de son adressage au protéasome, hypothèse que
nous allons tester. Néanmoins, il est intéressant de confirmer la présence d’un complexe
pré-formé entre ces trois protéines, après stress réplicatif, qui permet leur stabilisation, et
leur recrutement aux fourches bloquées afin, d’y jouer leur rôle respectif.
USP7 a également été montré comme stabilisateur de Claspine. Chk1 et Claspine sont
connues pour interagir, et s’auto-stabiliser. Dans mon équipe, il a été montré une interaction
entre pol Kappa et Claspine chez le Xénope et dans les cellules humaines (données non
publiées). Il serait intéressant de faire de nouvelles expériences pour savoir qu’elle est la
place de la claspine dans ce partenariat USP7-Chk1-pol Kappa.
V.
Comment pol Kappa est recrutée à la chromatine ?
Afin de préciser les mécanismes de recrutement de pol Kappa aux fourches bloquées,
nous avons réalisé des mutants des domaines fonctionnels de pol Kappa. Durant la TLS, les
domaines fonctionnels de pol Kappa tiennent un rôle prépondérant. En effet, il a été montré
que son domaine d’interaction avec Rev1 est requis pour son recrutement indépendamment
de PCNA (Tissier et al., 2004). De plus, il a également été montré que les domaines de liaison
à l’ubiquitine sont requis pour sa relocalisation en foyer, mais aussi pour interaction avec
PCNA-monoUb (Guo et al., 2008). Cependant, bien que le domaine d’interaction à PCNA soit
139
Partie III : Conclusion et discussion générale
requis pour la relocalisation de pol Kappa en foyer après traitement UV, il ne permet pas
d’interaction forte entre pol Kappa et PCNA, laissant penser que la liaison à PCNA-monoUb
passerait plutôt par ses domaines de liaison à l’ubiquitine (Ogi, Kannouche, et Lehmann,
2005 ; Jones, Colnaghi, et Huang, 2012).
La mutation du domaine Rev1 n’a pas eu d’impact sur le recrutement de pol Kappa à
la chromatine après un stress réplicatif. Contrairement à la TLS, Rev1 ne serait pas requis
pour le recrutement et la relocalisation de pol Kappa aux fourches bloquées après induction
de stress réplicatif. Ce résultat sous-entend que le mécanisme de recrutement pourrait être
totalement différent de celui de la translésion.
L’expression de la forme inactive de pol Kappa montre que son recrutement à la
chromatine ne nécessite pas son activité catalytique, cependant, l’expression de ce mutant
provoque un recrutement constitutif de pol Kappa durant la réplication non-perturbée. Nous
pensons que pol Kappa resterait « bloquée » à la chromatine sans pouvoir être déchargée, à
l’instar de pol Eta Dead, qui a un temps de résidence plus long à la chromatine (Sabbioneda
et al., 2008). Nous avons également montré que l’expression du mutant Dead de pol Kappa
dans les cellules aboutit à un défaut d’activation du checkpoint de phase S, il agirait comme
un dominant négatif.
De façon surprenante, nous n’avons pas constaté d’impact des mutants des
domaines UBZ, alors que leur interaction avec PCNA-monoUb est forte. Toutefois, nous
n’avons analysé que les simples mutants, nous construisons actuellement les doubles
mutants, afin de conclure sur l’importance des domaines UBZ. Mais nous pensons, que le
recrutement de pol Kappa ne nécessiterait pas forcément les domaines UBZ. En effet, Okada
et ses collaborateurs ont montré que pol Kappa pouvait agir indépendamment de PCNAmonoUb (Okada et al., 2002). Ce qui a été confirmé par des résultats récents qui montrent
que l’interaction entre Pol Kappa et PCNA-monoUb varie en fonction du type de traitement
(Wit et al., 2015). Par ailleurs, on peut penser que si les domaines UBZ prévalaient comme
durant la TLS, pol Kappa aurait été recrutée après expression du mutant PIP, qui porte des
UBZ fonctionnels.
Le mutant d’interaction avec PCNA situé en C-terminal de pol Kappa est intéressant.
Son expression dans les cellules provoque un défaut de relocalisation de pol Kappa en foyer,
140
Partie III : Conclusion et discussion générale
aisnsi qu’un défaut de recrutement de pol Kappa à la chromatine après stress réplicatif.
L’expression du mutant PIP aboutit, également, à un défaut de recrutement du 9-1-1, et à
une absence de phosphorylation de Chk1. Ces résultats sont intéressants, car ils sont
cohérents avec les résultats précédemment obtenus. En effet, nous avons montré que la
synthèse d’ADN effectuée par pol Kappa était requise pour le recrutement du 9-1-1 (Bétous
et al., 2013). Les résultats obtenus au cours de ma thèse montrent aussi une
immunoprécipitation de Rad 9 avec le mutant PIP alors qu’il n’est pas recruté à la
chromatine. Je pense que Pol Kappa et Rad9 pourraient interagir dans le nucléoplasme,
après la stabilisation de pol Kappa par USP7 et, le clamp 9-1-1 et pol Kappa serait recruté en
même temps sur la chromatine via l’interaction entre le domaine PIP de pol Kappa et PCNA.
De façon intéressante, nous avons pu observer, que l’expression du mutant PIP de
pol Kappa conduit à un défaut d’ubiquitination de PCNA. Nous avons d’abord pensé à une
sur-activation d’USP1, enzyme qui dé-ubiquitine PCNA, cependant le niveau d’USP1 est
stable. Concernant Rad18, nous n’avons jamais eu de réponse claire. Très récemment, une
étude a mis en évidence un rôle d’USP7 dans la stabilisation de Rad18. Finalement, est-ce
que Rad18 n’appartiendrait pas au complexe composé d’USP7-pol Kappa-Chk1? Ce mutant
PIP n’est pas recruté sur la chromatine, si Rad18 appartient au complexe, il ne serait alors
pas recrutée, ce qui aboutirait à un défaut d’activation de mono-ubiquitination de PCNA.
Récemment, il a été mise à jour une seconde PIP box présente dans la structure de
pol Kappa, en amont des domaines UBZ. Elle serait requise elle aussi pour son interaction
avec PCNA (Yoon et al., 2014). Nous commençons actuellement, les expériences avec le
double mutant PIP, et le simple mutant de ce nouveau domaine. Il serait intéressant de voir,
si ces domaines sont redondants, ou s’ils ont chacun une fonction bien définie. On pourrait
penser que l’un œuvre pour la fonction au niveau de la TLS, tandis que l’autre aurait plutôt
dans la réponse du checkpoint de phase S.
Pol Kappa pourrait être un lien entre le recrutement du complexe 9-1-1 d’une part et
du recrutement de Chk1 d’autre part. L’hypothèse est qu’après stress réplicatif, il y a une
accumulation de Chk1, USP7 et pol Kappa dans le noyau. Ils interagissent tous les trois, et
possiblement avec Rad18 et claspine. USP7 dé-ubiquitine ses partenaires, ce qui conduit à
141
Partie III : Conclusion et discussion générale
leur stabilisation. Pol Kappa interagit avec le complexe 9-1-1. Pol Kappa/9-1-1 et Chk1 sont
recrutés à la chromatine, via le domaine PIP de pol Kappa.
VI. Implication de pol Kappa dans des séquences
particulières du génome
De manière intéressante, nous avons pu voir que pol Kappa interagissait avec CENPB,
une protéine présente au niveau des centromères. Les régions centromériques sont
composées de zones d’ADN répétées, l’ADN α-satellite. Pol kappa, comme décrit dans
l’introduction (Chapitre IV.II.A) jouerait un rôle au niveau de séquences répétées. Elle serait
d’ailleurs plus fidèle que les ADN polymérases réplicatives.
Bien que je n’aie pas eu le temps d’explorer plus cette voie, il serait intéressant de
poursuivre l’analyse par une étude plus approfondie de la localisation de pol Kappa. En codétectant pol Kappa et les centromères (anti-CREST), en immnunofluoresence, nous serions
capable de voir s’ils co-localisent. Pour localiser pol Kappa aux centromères, nous pourrions
détecter pol Kappa en immunofluorescence, combiné à une détection des centromères par
hybridation in situ. Il serait d’ailleurs intéressant de continuer les expériences de PLA, entre
pol Kappa et CENP-B, pol Kappa et CENP-A, mais aussi avec HP1, qui est présent sur l’ADN
centromérique.
Des études récentes ont montré une implication de la protéine de pré-RC, Orc2, dans
la stabilité des centromères (Prasanth et al, 2004, Prasanth et al, 2010). En effet, il a été
montré qu’Orc2 colocalise avec la protéine HP1, mais est aussi retrouvé au niveau des
centromères. La déplétion d’Orc2 par ARN interférence entraîne une compaction anormale
de l’ADN α-satellite, ainsi que des mitoses anormales dues à des défauts de condensation
des chromosomes, une perte d’alignement des chromosomes métaphasiques et un fuseau
mitotique défectueux. Des données non publiées de l’équipe montrent, à l’instar d’Orc2,
une mauvaise condensation des chromosomes en l’absence de pol Kappa. Nous pourrions
regarder s’il existe un lien entre pol Kappa et Orc2. En effet, par des expériences de colocalisations en immunofluorescence ou par du PLA, nous pourrions voir s’il existe une
142
Partie III : Conclusion et discussion générale
interaction entre ces deux protéines, et combiner ces expériences à une détection des
centromères en hybridation in situ. Nous pourrions aussi observer l’effet de la déplétion de
pol Kappa sur Orc2 et, sur la condensation des centromères.
Il serait, d’ailleurs, intéressant d’étudier la fonctionnalité de pol Kappa au niveau des
centromères. Nous savons que pol Kappa réplique plus efficacement les séquences répétées,
en plus de son rôle dans le checkpoint de phase S, pol kappa pourrait être nécessaire pour
du redémarrage de fourches bloquées, ou pour le remplissage de « gap » lors de la
réplication de l’ADN centromérique. Nous pourrions penser que son domaine N-Clasp aurait
de l’importance pour ce rôle. Ce domaine est décrit comme conférant une meilleure
stabilité à pol Kappa sur l’ADN, ce qui lui permettrait d’assurer la réplication de ces régions
particulières du génome. Pol Kappa aurait, en plus de son rôle dans la TLS et le checkpoint de
phase S, un rôle dans la réplication normale en aidant les polymérases réplicatives à
répliquer des séquences répétées, ce qui ferait de pol Kappa un acteur crucial de la stabilité
des centromères.
La déplétion de pol Kappa, sans stress réplicatif, entraîne de l’instabilité génomique.
Son absence conduit une augmentation des foyers 53BP1 en G1, synonyme de présence
d’ADN sous-répliqué, mais aussi à une accumulation de foyers γH2AX, synonyme des
cassures de l’ADN. Ce rôle potentiel de pol Kappa dans la réplication de l’ADN centromérique
non endommagée permettrait d’expliquer ces observations.
VII. Les conséquences cellulaires de l’absence de pol Kappa
Les conséquences de l’absence de pol Kappa vont au-delà de son rôle dans la
translésion. Il est vrai que les souris pol Kappa-/- ne présentent pas de phénotype particulier,
cependant les fibroblastes embryonnaires issus de ces souris présentent un phénotype
mutateur (Schenten et al., 2002 ; Stancel et al., 2010).
Nous avons mis en évidence une nouvelle implication de pol kappa dans la stabilité
de Chk1. Nous pouvons nous interroger sur des conséquences de l’absence de pol Kappa sur
les différentes fonctions de Chk1. Une fois activée ChK1 a la capacité de réguler le cycle
cellulaire via des arrêts en G1 et G2. Chk1 régule notamment l’activation des origines de
143
Partie III : Conclusion et discussion générale
réplication. Des résultats préliminaires obtenus dans l’équipe montrent que l’absence de pol
Kappa se traduit par une dynamique de réplication modifiée. Des expériences de peignage
moléculaire de l’ADN indiquent des tracks de réplication plus long en absence de pol Kappa.
S’agit-il d’une vitesse de réplication augmentée ou d’une activation d’origines très proches
les unes des autres ? Nous n’avons pas à ce jour la réponse mais sachant que Chk1 régule
négativement l’activation des origines, la diminution de son taux devrait être en faveur
d’une augmentation de la densité d’origines.
Une des fonctions de Chk1 est d’arrêter le cycle cellulaire via la phosphorylation des
protéines cdc25, ce qui laisse le temps à la cellule de réparer le dommage. Cependant, à
cause de sa déstabilisation, le cycle cellulaire ne serait plus arrêté, de ce fait des zones
d’ADN endommagées passeraient en mitose, générant de l’instabilité chromosomique.
D’ailleurs, nous montrons que l’absence de pol Kappa augmentait le nombre de foyers
53BP1) (Bétous et al, 2013). De par son rôle dans la stabilisation de chk1, mais aussi par sa
potentielle implication dans des zones particulières du génome l’absence de pol Kappa
conduit à une réplication non maitrisée, ce qui génère du stress réplicatif.
De manière générale, il est connu que les ADN polymérases spécialisées ont un rôle
majeur dans le maintien de la stabilité génétique, grâce à leur rôle dans la gestion des
dommages de l’ADN. Toutefois, elles sont mutagènes, et notamment sur une matrice d’ADN
non endommagé. Leur expression doit être finement régulée, afin que leur accès aux
fourches de réplication ne soit restreint qu’à leur fonction. La modulation de l’expression des
polymérases spécialisées réduit la fidélité de la machinerie de réplication et conduit à une
accumulation de mutations, qui sera à l’origine du processus tumoral (Hoffmann et Cazaux,
2010) (Tableau 3). Nous avons pu voir en introduction que Les souris pol Kappa -/présentent une instabilité des séquences répétées dans les séquences dans les lignées
germinales males (Burr et al., 2006). Et plus récemment, pol Kappa a été montré comme
étant requise pour la réplication des séquences microsatellites (Abdulovic et al., 2011 ; Hile
et Eckert, 2008)
144
Partie III : Conclusion et discussion générale
ADN polymérases
Polβ
Polλ
Surexpression
Utérus, prostate, ovaire,
estomac, sein, colon,
rectum
Estomac, rectum,
prostate
Polθ
Colon, estomac, poumon,
peau, sein
Polι
Prostate, estomac,
rectum,
sein
Rectum, poumon
Polκ
Sous-expression
Rein
Colon, rein, poumon,
estomac
Colon, poumon, estomac,
sein
Polη
Poumon, estomac, colon
Polζ
Poumon, estomac, colon
Tableau 3 : Les dérégulations des ADN polymérases spécialisées dans les différents
cancers. (Adapté de (Hoffmann et Cazaux, 2010)
145
Partie III : Conclusion et discussion générale
De façon intéressante, il a été montré par mon équipe d’accueil que l’expression de
pol Kappa est diminuée dans les tumeurs colorectales, par rapport au tissu sain adjacent
(Lemée et al., 2007 ; Pillaire et al., 2010) (Tableau 3).
La longueur, la variation des
microsatellites ou leur instabilité sont associées avec 10 à 15% des cancers endométriaux,
colorectaux, ou gastriques, et sont utilisées comme outils de diagnostic pour le Syndrome de
Lynch, maladie génétique qui touche les gènes impliqués dans le mécanisme de réparation
des mésappariements (MMR) lors de la réplication de l’ADN. Cependant, il existe des cas où
les gènes du MMR ne sont pas la cause de l’instabilité des séquences microsatellites. Pol
Kappa pourrait être à l’origine de cette instabilité? Il serait intéressant de pouvoir inhiber
l’expression de pol Kappa durant plusieurs cycles cellulaires, et analyser la stabilité des
séquences répétées. Toutes ces évidences nous laissent penser que pol kappa pourrait être
un nouveau marqueur de la stabilité des microsatellites dans les cancers. Il est à noter que
pol Zeta a aussi une implication dans les séquences répétées, elle préviendrait les décalages
de cadres de lecture (Northam et al., 2010). Pol Kappa et pol Zeta collaborent pour le
franchissement de certains dommages durant la TLS. Nous pourrions penser, qu’il y ait une
collaboration entre ces deux polymérases pour la stabilité des séquences répétées.
L’extinction de deux polymérases dans les cellules pendant plusieurs cycles cellulaires
pourrait conduire à une instabilité des séquences microsatellites plus importantes, que dans
les cellules déplétées pour une seule polymérase.
De manière générale, l’approfondissement de l’étude de ces polymérases
spécialisées nous permettrait de mieux appréhender la réplication non perturbée, et la
réponse aux dommages de l’ADN. Ces études seraient un atout pour le développement de
nouveaux traitements ou de nouveaux marqueurs prédictifs.
146
Partie III : Conclusion et discussion générale
147
Annexes
Annexes
148
Annexes
Le Domaine N-Clasp de pol Kappa
Pol Kappa possède un domaine absent des autres polymérases de la famille Y, le
domaine N-clasp. Très peu de choses sont connues à l’heure actuelle sur ce domaine. On sait
qu’il est important pour la stabilité de pol Kappa sur la chromatine. Il formerait un crochet
Elle est réalisée par des ADN polymérases spécialisées, qui répliquent au travers des
dommages de façon fidèle ou infidèle. Le second mécanisme est appelé la synthèse
translesionnelle ou TLS (TransLesion Synthesis). (Fig 15)de l’ADN conférant la stabilité à pol
Kappa sur l’ADN.
Ainsi, nous nous demandons si le domaine N-clasp de pol Kappa pourrait donner à
cette enzyme une « spécificité d’intervention » c’est-à-dire si sa fonction dans le checkpoint
de phase S pourrait se dérouler dans des régions spécifiques du génome et notamment dans
des régions riches en séquences répétées.
VIII. Réalisation et étude du mutant Δ-clasp68
Une étude structurale avait pour but d’étudier le rôle du domaine N-clasp dans la
translésion des adduits aromatiques (Lone et al., 2007 ) . Grâce à cette étude, nous avons pu
réaliser un mutant de délétion partiel du domaine N-clasp. Nous avons choisi de déléter les
68 premiers acides aminés composant ce domaine, ce qui confère une activité réduite de pol
Kappa mais stable. En effet, la déletion totale du domaine (72 acides aminés) entrainait une
déstabilisation totale de pol Kappa, ce qui n’est pas intéressant car ce mutant aurait été
inactif.
149
Annexes
Nous avons fait synthétiser des amorces de part et d’autre du domaine à déléter.
Ainsi après amplification par PCR, les 68 premiers acides aminés de Pol Kappa sont exclus de
la construction générant la forme pol Kappa Δ-clasp68. Les
clones obtenus ont été
séquencés (Fig 18).
IX.
Etude du mutant pol Kappa Δ Clasp 68
Comme pour les autres mutants, nous avons étudié la capacité du mutant N-clasp à
former des foyers. Nous avons transfecté des cellules 293T avec pol Kappa WT, qui nous sert
de contrôle et pol Kappa Δ clasp, traités ou non par HU (2mM 2h). L’analyse par microscopie
à fluorescence montre que comme pol Kappa WT, le mutant Δ clasp68 forme peu de foyers
de façon spontanée. Après traitement par HU, il y a une augmentation du nombre de
cellules présentant des foyers (Fig 19A). Il est intéressant de noter la localisation des foyers,
car avec la forme WT de la protéine, les foyers sont répartis dans l’ensemble du noyau mais
avec le mutant Δ clasp 68, les foyers semblent être périnucléaires ou périnucléolaires.
L’analyse par western blot montre que Δ clasp 68 est exprimé dans les cellules humaines,
toutefois il semble être moins exprimé que les mutants dead ou PIP (Fig 19B).
La localisation particulière des foyers pourraient aussi suggérer une implication de pol Kappa
au niveau de l’hétérochromatine. Afin de confirmer cette possible implication, il serait
intéressant de réaliser des colocalisations entre pol Kappa et HP1 (Heterochromatin Protein
1), protéine présente au niveau de l’hétérochromatine. Nous avons pour cela étudié
150
Annexes
151
Annexes
l’implication de pol Kappa au niveau des centromères, contenus dans des régions
d’hétérochromatine.
X.
Conclusion
Pol Kappa possède un domaine en N-terminal, nommé N-clasp, qui est absent des
autres polymérases de la famille Y. Nous avons partiellement délété ce domaine, afin
d’étudier sa fonction et nous avons observé une localisation particulière de ce mutant. En
effet, la relocalisation en foyer de pol Kappa après un stress réplicatif présente des foyers
répartis dans l’ensemble du noyau tandis qu’avec le mutant N-Clasp, nous observons une
localisation périnucléaire et périnucléolaire. Ces localisations nous font penser à une
possible implication de pol Kappa au niveau des régions d’hétérochromatine.
Afin de
confirmer cette possible implication, il serait intéressant de réaliser des colocalisations entre
pol Kappa et HP1 (Heterochromatin Protein 1), protéine présente au niveau de
l’hétérochromatine. Les résultats de western blot nous montrent que le mutant semble être
moins bien exprimé. Le domaine N-Clasp est important pour la stabilité de pol kappa, sa
délétion partielle entraîne peut être un défaut de stabilité de la protéine. Il serait intéressant
de vérifier cette hypothèse en regardant la demi-vie du mutant par des cinétiques après
traitement avec la cycloheximide, drogue qui bloque la biosynthèse des protéines, mais aussi
en regardant si l’accumulation de Δ clasp 68 est plus précoce que la forme sauvage après
inhibition du protéasome. Etant un domaine propre à pol Kappa, il doit sûrement avoir un
rôle clé dans les fonctions propres à pol Kappa. De plus, dans une étude publiée récemment
des variants naturels de domaine N-clasp de pol Kappa ont été mis à jour (L21F et I39T), ces
mutations affectent l’activité translésionnelle de pol Kappa (Song et al., 2014) et nous
testons si elles affectent sa fonction dans le checkpoint de phase S.
152
Annexes
153
Matériels et Méthodes
Matériels et Méthodes
154
Matériels et Méthodes
I.
Culture cellulaire
Les lignées cellulaires HEK 293T, cellules humaines embryonnaires de reins
transformées par l’antigène T du virus SV40, et MRC5-SV, fibroblastes humains de poumons
transformés par l’antigène T de SV40, (American Type Culture Collection) ont été cultivées,
respectivement, en DMEM avec Glutamax I, High-glucose, sodium pyruvate (Gibco, Life
Technologies) supplémenté avec 10% de Serum de Veau Foetal (Gibco, Life Technologies), et
α-MEM, Glutamax I, high-glucose, sodium pyruvate (Gibco, Life Technologies) supplémenté
avec 10% de Sérum de Veau Foetal (Gibco, Life Technologies). Les cellules embryonnaires de
souris primaires (MEF donnée par le Dr. C. Guo) ont été cultivées avec du milieu DMEM avec
Glutamax I, High-glucose, sodium pyruvate (Gibco, life technologies) complémenté avec 10%
de sérum de veau Fœtal (Gibco, Life technologies). Les cellules sont cultivées à 37°C et à 5%
CO₂. Les cellules sont collectées suite à l’incubation en présence de trypsine/EDTA 0,25%
(Life Technologies) pendant 3min à 37°C.
II.
Transfection de siARNs et plasmides
Les transfections de plasmides sont réalisées avec du PolyEthylenImine (PEI
[Polysciences]). Elles nécessitent 4µg de plasmides, que l’on dilue dans 100µL de milieu OptiMEM (Gibco, Life Technologies). On ajoute à cette dilution 24µL de PEI. Après 15min
d’incubation à température ambiante, on ajoute goutte-à-goutte 124µL du mix final aux
cellules. Les transfections de siRNAs ont été réalisées avec Avalanche MRC5 (EZ Biosystem)
à une concentration finale de 45nM. Les cellules sont récupérées 48h après transfection de
siARNs ou plasmides, et sont traitées ou non avec de l’hydroxyurée (Sigma) aux doses et
temps indiqués dans les légendes des figures. (Une étiquette GFP est en fusion avec le Nterminale de pol Kappa dans les vecteurs pEGFP-C2)
155
Matériels et Méthodes
Les plasmides utilisés :
Nom des vecteurs
Acides aminés mutés
pEGFP-C2 Vide
pEGFP-C2 Kappa WT
pEGFP-C2 Kappa Dead
D198A, E199A
pEGFP-C2 Kappa PIP1
F532A, L533A
pEGFP-C2 Kappa PIP 2
L864A, F867A, F868A
pEGFP-C2 Kappa PIP 1+2 F532A, L533A, L864A, F867A,
F868A
pEGFP-C2 Kappa UBZ1
C623A, D643A
pEGFP-C2 Kappa UBZ2
C778A, D798A
pEGFP-C2 Kappa Rev1
F566A, F567A
pEGFP-C2 Kappa Δ clasp
Délétion des 68 premiers acides
aminés
HA-ubiquitine
.Les siARNs utilisés :
Nom du siARN
fournisseur
Séquence
si-Luciférase
Sigma
5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'
si-Kappa 2
Sigma
5'-CCCAGUUAAUCAACCCAAA- 3'
si-Kappa 5
Sigma
5'-CCAAUAGACAAGCUGUGAU-3'
si-k3’
Dharmacon
5'-GCUUAAUAGUAGUUAGCUU-3'
On target plus
5'-CUGUCUUGCCUUAGGUUUA-3'
5'-GUAAGGGCUCUCAAAGAUU-3'
5'-ACUCCAGCCUGAAGAGCGA-3'
si-Chk1-A
5'-GAAGCAGUCGCAGUGAAGA-3'
siChk1-B
5'-CUGAAGAAGCAGUCGCAGU-3'
Si-USP7_1
5’-GGAACCUUUCAGUUCACU -3’
156
Matériels et Méthodes
si-USP7_2
5'-CCCAAAUUAUUCCGCGGCAAA-3'
Si-USP7_3
5’-ACCCUUGGACAAUAUUCCU-3’
III. Clonage pEGFP-C2 Kappa Δ clasp
Le plasmide peGFP-C2 (Invitrogen) portant le cDNA de Pol κ a été préalablement construit
par Clarisse Bavoux, doctorante dans l’équipe Instabilité Génétique et Cancer de 2001 à
2006. Pour la génération du mutant peGFP-Kappa Δ clasp, nous avons déléter les 68
premiers acides aminés en N-terminal. Pour cela, le vecteur peGFP-Kappa WT est amplifié
intégralement par PCR (30 cycles d’élongation de 20 minutes en utilisant la Pfu (Promega) et
une température d’hybridation des amorces de 65°C), en utilisant deux amorces en position
inverse contenant
le domaine désiré. Après la PCR, les fragments obtenus sont
phosphorylés par la T4 polynucléoatide Kinase (Thermo Scientific), puis reliés grâce à la T4
Ligase (Thermo Scientific).
 Nclasp68 : 5’-TTATCAAGCTTAGAAAATATGATGCAACAAAAAGCT-3’
 Reverse primer : 5’- TTAGGATCCTTACTTAAAAAATATATCAAG-3’
IV.
Extraits protéiques totaux
Les cellules sont reprises dans un tampon de lyse (50mM Tris-HCl pH 7,5, 250mM
NaCl, 1mM EDTA, 0 ,1% Triton X100, Halt protease et
phopshatase inhibiteur [life
Technologies] 1X), et incubées pendant 30min sur glace. Après une centrifugation à 15000g
pendant 20 min, le surnageant est récupéré et les protéines sont dosées par la méthode
Bradford [Biorad]. On y ajoute le tampon Laemli, le mix final est bouilli 3min à 95°C.
V.
Extraits CSK
Les cellules sont récupérées à la trypsine, lavées une fois au PBS (Gibco) et
centrifugées 5 minutes à 1000 rpm à 4°C. Les cellules sont re-suspendues dans du tampon
157
Matériels et Méthodes
CSK (10mM Pipes pH6.8, 300mM sucrose, 3mM MgCl2, 1mM EDTA, 0.% triton, 0.5µg/µL
Pepstatin A, 1X Halt protease et phopshatase inhibiteur [life Technologies]) à raison de
200µL pour 3 millions de cellules. Les cellules sont ensuite incubées 5 minutes sur glace puis
centrifugées 3 minutes à 7500rpm à 4°C, le surnageant est récupéré, les culots sont repris
dans le tampon, et l’opération est répétée une seconde fois. Les extraits insolubles sont
soniqués pendant 30s (1s ON, 1s, OFF) avec une amplitude de 25% (Sonics Vibra Cells
processor). Après dosage des protéines par la méthode Bradford (Biorad), le tampon Laemli
est ajouté aux différentes fractions, et les extraits sont bouillis pendant 3min à 95°C.
VI.
Extrait protéiques nucléaire et immunoprécipitation
100 millions de cellules 293T transfectées par différents vecteurs pEGFP-C2 sont
resuspendues avec un tampon hypotonique (10mM Hepes pH 7.9, 1,5mM MgCl₂, 10mM KCl,
0,5mM DTT, 0,2mM PMSF), et incubées 10min sur glace. Elles sont ensuite transférées dans
un dounce homogenizer type B. Les cellules sont centrifugées 15min, 400rpm à 4°C, le
surnageant est l’extrait cytoplasmique, et le culot est composé des noyaux des cellules. Le
culot est repris dans un tampon à faible teneur en sel (20mM Hepes pH 7.9, 25% Glycérol,
1,5mM MgCl₂, 0,02M KCl, 0,2mM EDTA, 0,5mM DTT, 0,2mM PMSF). Sous agitation, un
tampon fort en sel est ajouté goutte à goutte aux noyaux (20mM Hepes pH 7.9, 25%
Glycérol, 1,5mM MgCl₂, 1,2M KCl, 0,2mM EDTA, 0,5mM DTT, 0,2mM PMSF). Les noyaux sont
incubés 30min sur glace et sous agitation puis centrifugés 30min à 14500 rpm à 4°C. Le
surnageant est l’extrait nucléaire. Afin de réduire la concentration en sel, l’extrait nucléaire
est dialysé (20mM Hepes pH 7.9, 25% Glycérol, 1,5mM MgCl₂, 100mM KCl, 0,2mM EDTA,
0,5mM DTT, 0,2mM PMSF). Après centrifugation pour éliminer les débris restants, l’extrait
nucléaire est prêt pour l’immunoprécipitation (IP).
L’immunoprécipitation (IP) est réalisée grâce aux billes magnétiques GFP-trap
(Chromotek) selon les recommandations du fabriquant. Le rapport 20µL de billes pour 10
millions de cellules est utilisé. La benzonase (Millipore) est ajoutée à l’extrait nucléaire au
moment de l’incubation avec les billes pendant 1h à 4°C. Une centrifugation permet de
158
Matériels et Méthodes
séparer les protéines immunoprécipitées (associées aux billes) des autres protéines (fraction
nommés « flow through »). Les billes sont ensuites reprises dans 50µL de tampon Laemli 2X,
bouillies 10min à 95°C. Du tampon laemli est ajouté à la fraction « flow through » et les
protéines sont déposées sur gel SDS-PAGE.
VII. Proximity Ligation Assay
Les cellules MRC5-SV sont ensemencées sur des lamelles de verre 22x22mm, à raison de
300 000 cellules par lamelles. 24h après, les cellules sont traitées ou non par l’hydroxyurée.
Les cellules sont fixées selon trois méthodes différentes :
-
Les cellules sont fixées avec le paraformaldéhyde 4% durant 12 min sur glace. Après
trois lavages, les cellules sont perméabilisées avec du PBS/Triton X100 0.25%
pendant 7min sur glace. Afin de saturer les sites non spécifiques, on ajoute du
PBS/BSA 5% pendant 15 min à température ambiante.
-
Les cellules sont pré-extraites avec un tampon CSK/Triton X100 0,5% (PIPES pH…
10mM, NaCl 100mM, sucrose 300mM, MgCl₂ 3mM, Halt protease inhibiteur [Life
technologies] 1X, Triton X100 0,5%) pendant 2 min sur glace. Les cellules sont ensuite
fixées comme précédemment avec du paraformaldéhyde 4% pendant 12min sur
glace, et après trois lavages au PBS 1X, on ajoute la solution de blocage PBS/BSA 5%
15min à température ambiante.
-
Les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde 4% pendant 12 min sur glace.
Après, trois lavages au PBS 1X, on ajoute du méthanol 100% froid sur les cellules
pendant 5min sur glace. Après trois lavages au PBS 1X, les cellules sont
perméabilisées au PBS/Triton X100 0,25% pendant 7 min sur glace, et les cellules
sont mises en saturation avec du PBS/BSA 5% 15min à température ambiante.
Après trois lavages au PBS 1X, les cellules sont ensuite saturées avec le tampon
« Blocking solution » (Sigma-Duolink) à 37°C pendant 30min. Les cellules sont incubées avec
159
Matériels et Méthodes
les anticorps primaires pendant 1h30 à température ambiante. puis avec les anticorps
secondaires couplés à des sondes d’ADN (PLA probes Mouse minus et PLA probes Rabbit
Plus [Sigma-Duolink]), à 37°C pendant 1h. Si les protéines ciblées sont proches, les sondes
s’hybrident et leur ligation permet leur amplification par Rolling Cercle Amplification (RCA).
Ainsi la ligation s’effectue à 37°C pendant 30min (Ligase et tampon [Sigma-Duolink]) et
l’amplification à 37°C pendant 1h40 (polymérase et tampon contenant des dNTPs
fluorescents [Sigma-Duolink]). Les cellules sont ensuite colorées avec une solution de Dapi
(1/10000) et montées au milieu de montage Dako. Les anticorps primaires anti-pol Kappa
16A7 ont été couplés aux sonde d’ADN selon les recommandations du fournisseur (Kit
Probemaker Sigma).
Les anticorps primaires utilisés :
Anticorps
Fournisseur
Dilution
Anti-Kappa
Biotem clone 16A7
1/800
Anti-Rad9
Bethyl Laboratories
1/250
Anti-Chk1
Bethyl Laboratories
1/300
Anti-PCNA
Abcam
1/800
Anti-USP7
Bethyl Laboratories
1/500
Anti-Chk1
Santa Cruz
1/250
Anti-RPA
Calbiochem
1/200
Anti-CenpB
Abcam
1/300
VIII. Fractionnement cellulaire
Le fractionnement cellulaire est réalisé comme décrit dans (Mendez, J. & Stillman, B
Moll Cell Biol 2000). Les cellules sont lysées dans le Tampon A 10mM (Hepes pH 7,9, 10mM
KCl, 1,5mM MgCl₂, 0,34M sucrose, 10%, Glycérol, 1mM dithiothreitol (DTT), Halt protease et
phosphatase inhibiteur 1X [Life Technologies]) complémenté avec du triton X100 0,1%
pendant 5 min sur glace. Après une centrifugation (1500g, 5min, 4°C), le surnageant
récupéré est clarifié par centrifugation (18000g, 15min, 4°C), pour obtenir la fraction
160
Matériels et Méthodes
cytoplasmique. Le culot est lavé une fois dans le tampon A et incubé dans le tampon B (EDTA
3 mM, EGTA 0.2 mM, DTT 1 mM, Halt protéase et phosphatase inhibiteur [Life Technologies]
1X) pendant 30 min sur glace. Après centrifugation (1700g, 5min, 4°C), le surnageant
récupéré constitue la fraction nucléaire soluble. Le culot est lavé une fois avec le tampon B
et repris dans le tampon A, puis il est soniqué pendant 30s (1s ON, 1s, OFF) avec une
amplitude de 25% (Sonics Vibra Cells processor). Cette fraction représente la fraction
enrichie en chromatine. Après dosage des protéines par la méthode Bradford (Biorad), le
tampon Laemli est ajouté aux différentes fractions, et les extraits sont bouillis pendant 3min
à 95°C.
IX.
Analyse des protéines par Western Blot
Les protéines sont déposés sur gels précoulés NuPAGE Novex 3-8% Tris-Acétate, ou
sur gels blot bis-tris 4-12% (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant, et
transférées sur des membranes de polyvinilydene difluoride (GE Healthcare) dans le tampon
de transfert (20% Ethanol, 10% tampon Tris-gly (Euromedex)) pendant 1h à 300mA. Les
membranes sont saturées dans un tampon TBS-tween 0,1% supplémenté avec 5% de lait
pendant 1h. Les membranes sont incubées avec l’anticorps primaires dilués dans un tampon
TBS-Tween 0,1%/1% lait sur la nuit. Après trois lavages dans un tampon TBS-Tween 0,1%, les
membranes sont incubées avec l’anticorps secondaire couplé à la HRP dilué dans le tampon
TBS-Tween 0,1%. Après trois lavages avec le tampon TBS-Tween 0,1%, les membranes sont
révélées avec l’ECL (Pierce), ou ECL quantum (Diagomix).
Les anticorps utilisés :
Anticorps
Fournisseur
Dilution
Anti-Kappa
Japon donné par Dr. T Nohmi
1/2000
Anti-Kappa 975
Bethyl Laboratories
1/1000
Anti-Rad9
Bethyl Laboratories
1/1000
Anti-PCNA
Santa Cruz
1/1000
Anti-USP7
Bethyl Laboratories
1/1000
Anti-PCHk1 Ser345
Cell signaling
1/1000
161
Matériels et Méthodes
Anti-Chk1
Santa Cruz
1/1000
Anti-RPA
Calbiochem
1/1000
Anti-Hus 1
donné par Pr U Hubscher Zurich
1/1000
Anti-ϒH2AX
Millipore
1/1000
Anti-H3
Santa Cruz
1/1000
Anti-Orc4
Santa Cruz
1/1000
Anti-GFP
Abcam
1/5000
Anti-HA
Cell signaling
1/1000
Anti-USP1
Bethyl Laboratories
1/1000
Anti-βtubuline
Sigma-Aldrich
1/50000
Anti-actinin
Millipore
1/1000
Anti-Rabbit HRP
Life technologies
1/10000
Anti-Mouse HRP
Jackson Immuno Research
1/10000
X.
Ubiquitination de Pol Kappa
Les cellules 293T sont transfectées avec les couples de plasmides pEGFP-C2 Vide/HA-
Ubiquitine ou pEGFP-KappaWT/HA-Ubiquitine par le protocole PEI. On transfecte 2µg de
vecteur pEGFP-Kappa ou empty, et 5µg de plasmide HA-ubiquitine afin de déplacer la
balance vers l’ubiquitine taguée plutôt que l’ubiquitine endogène. 48h après, les cellules
sont traitées ou non par l’Hydroxyurée (Sigma) 0,5mM 30min. Les cellules récupérées sont
lysées afin d’obtenir un extrait nucléaire. Les cellules sont reprises dans un tampon
hypotonique (20mM Hepes pH 7,9, 1 ,5mM MgCl₂,10mM KCl, 0,5mM DTT, Halt protease et
phosphatase inhibiteur [Life Technologies] 1X). Après centrifugation (2500g, 3min 4°C), les
culots sont repris avec le même tampon et incubés sur glace pendant 10min. La suspension
cellulaire est transférée dans un dounce homogenizer de type B. Après centrifugation
(3300g, 6min, 4°C), le surnageant récupéré est la fraction cyoplasmique. Le culot est repris
dans un tampon fort en sel (20mM Hepes pH 7,9, 25% glycérol, 1,5mM MgCl₂, 350mM NaCl,
0,5mM DTT, Halt protease et phosphatase inhibiteur [Life Technologies] 1X), puis incubé sur
glace pendant 30 min sous agitation. Après centrifugation (18000g, 10min, 4°C), le
162
Matériels et Méthodes
surnageant est repris dans un tampon ne contenant pas de sel (20mM Hepes pH 7,9, 20%
glycérol, 0,1% Tween 20 [Sigma],
Halt protease et phosphatase inhibiteur [Life
Technologies] 1X), puis centrifugé (18000g, 5min, 4°C). Le surnageant récupéré constitue
l’extrait nucléaire.
Une immunoprécipitation par GFP-Trap est réalisée, comme décrit précédemment,
sur l’extrait nucléaire, auquel est ajouté 1U benzonase (Millipore) durant la durée de l’IP.
60µL de billes sont utilisées pour 30 millions de cellules, et sont reprises, à la fin, dans du
tampon Laemli 2X et bouillies à 95°C pendant 10min, puis déposés sur gel NuPAGE Novex 38% (Invitrogen). L’ubiquitination est mise en évidence par western blot.
163
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