Reconstruction Ancestrale des Acides Biliaires C24 chez les

RAPPORT DE STAGE
« Reconstruction Ancestrale des Acides Biliaires C24 chez
les Mammifères : Recherche d’Evolution Convergente et
Parallèle »
Présenté et soutenue par Duarte Layane
Marseille, avril 2014
Projet de stage de 7 semaines réalisé dans le cadre d’une
Première Année du Master BBSG (année universitaire
2013-2014), au sein de laboratoire d’Evolution Biologique
et Modélisation (l’EBM), sur le campus de Saint-Charles
d’Aix-Marseille Université, sous la supervision du Dr Pierre
Pontarotti, directeur de recherche au Centre National de la
Recherche Scientifique (CNRS).

Table des matières
Introduction ........................................................................................................................................................ 3
Matériel et méthodes........................................................................................................................................... 4
Classification taxonomique ............................................................................................................................ 4
Reconstruction de caractère ancestral des mammifères ................................................................................. 4
Reconstruction du caractère ancestral des vertébrés....................................................................................... 5
Recherche des orthologues et construction de la phylogénétique de BAAT chez vertébrés .......................... 5
Résultats ............................................................................................................................................................. 6
Analyse du caractère ancestral chez les mammifères ..................................................................................... 6
Analyse du caractère ancestral chez les vertébrés .......................................................................................... 6
Analyse des orthologues de BAAT ................................................................................................................ 7
Discussions ......................................................................................................................................................... 7
Conclusion .......................................................................................................................................................... 8
Références .......................................................................................................................................................... 8

Introduction
L'évolution peut être définie comme le
changement des caractères génétiques et
morphologiques des espèces au cours des
générations qui conduit à des changements
morphologiques, anatomiques, physiologiques,
fonctionnels et comportementaux des individus. Elle
est causée par des variations des caractères
héréditaires et aussi par divers mécanismes qui
modifient la fréquence de certains traits héréditaires
au sein de la population. La convergence
évolutive est le mécanisme qui explique la
présence de caractères analogues entre
des espèces soumises aux mêmes contraintes
environnementales qui ne les ont pas été hérité d’un
ancêtre commun. Elle résulte des adaptations
indépendantes des taxa soumis à la même pression
de sélection dans un même type d’environnement.
Dans ce travail, nous nous sommes
intéressés aux sels biliaires parce qu’il y a plusieurs
donnés décrits dans la littérature et il en existe
plusieurs types chez les organismes. Nous avons
cherché l’histoire évolutive du dernier sel biliaire
produit du métabolisme du cholestérol chez les
mammifères, les acides C24, afin de savoir quel type
d’évolution s’est passé avec ce caractère. En autre,
afin de savoir s’il existe des facteurs génétiques
associés à la synthèse de ce sel, nous avons cherché
des possibles gènes candidats à être impliqués à sa
synthèse.
Les alcools et acides biliaires,
collectivement appelés sels biliaires, sont des
molécules amphipatiques multifonctionnels
produites du métabolisme du cholestérol chez les
vertébrés (fig.1) – poissons, amphibiens, reptiles et
mammifères - et agnates. Ils sont sécrétés par le foie
dans l’intestin grêle et jouent un rôle pour faciliter la
dégradation et l’absorption des grasses. Ensuite, ils
vont au grand intestin pour aider l’absorption de
l’eau et ils reviennent au foie pour leurs
réutilisations. La voie métabolique du cholestérol
origine trois produits avec des structures standards
chacun qui servent de base pour des variantes. Il y a
plusieurs enzymes associées, dont quelques-unes
sont encore inconnues (annexe 1 fig. 1). Les
premiers dérivés sont les alcools C27 (avec 27
carbones) qui, après des oxydations, deviennent les
acides C27 et ceux, après d’autres modifications,
deviennent les acides C24 (24 carbones). Par rapport
aux étapes biochimies de synthèse des sels, celles qui
l’ont les acides C24 (les cholonéates – l’acide
chénodésoxycholique (C24H40O4) et l'acide cholique
(C24H40O5)) comme produit final ne sont connues
que chez les humains et les rongeurs. Cette partie de
la voie est complexe, il y a 16 enzymes et des
transporteurs d’intermédiaires entre plusieurs
organelles (Norlin et al 2007 ; Russel 2003).
Fig. 1 – Voie de synthèse des sels biliaires simplifiée.
Il est connu que les sels biliaires les plus
anciens évolutivement chez les vertébrés sont les
alcools C27 et que la capacité de libéré seulement
l’acide C24 a apparu et disparu de façon
indépendante plusieurs fois chez les vertébrés. Vu
que sa voie de synthèse est complexe et que la
convergence évolutive peut se passer en différents
niveaux, on croit donc que la capacité de ne libérer
que les acides C24 est un cas de convergence
évolutive au niveau physiologique et aussi
génétique. Entre les gènes qui participent à sa
synthèse (annexe 1 fig. 2 et 3), le gène BAAT (bile
acid Coenzyme A : amino acid N-acyltransferase
(glycine N-choloyltransferase)- ENSG00000136881
et CAG46716.1 – annexe 1 fig. 4 et 5), localisé au

chromosome 9 104.122.699-104.145.801 chez
l’humain, réalise la deuxième partie de conjugaison
des acides C24 à glycine et taurine (la principale
forme trouvé) avant leurs excrétions dans les tubes
biliaires (annexe 1 – fig. 6). Il est aussi un des trois
gènes qui, quand défectueux, causent la maladie
hypercholanémie familiale (FHCA – concentration
élevée des acides biliaires dans le sérum). Comme
les différents niveaux d’évolution convergente
peuvent être observés au niveau phénotypique, cela
permet de découvrir l’évolution derrière un caractère
donné.
Matériel et méthodes
Le développement de ce travail s’est passé
en 3 parties. La première a été la classification
taxonomique des espèces de mammifères d’intérêt.
La deuxième a été la reconstruction du caractère
ancestral des acides C24 en utilisant l’ensemble de
logiciels Mesquite et le logiciel Seaview. Celui-ci est
une multiplateforme d’interface graphique pour
l’alignement multiple des séquences et pour la
phylogénie moléculaire. Celui-là c’est une interface
Java avec plusieurs logiciels développé pour
l’analyse comparative des caractères et qui permet
des études de biologie évolutive. Les 2 permettent de
construire des arbres phylogénétiques à partir du jeu
de donnés. La troisième partie a été la recherche des
orthologues du gène candidat BAAT à partir des
outils bioinformatiques traditionnels.
Classification taxonomique
Avant de reconstruire le caractère ancestral
des acides C24, il a fallu choisir les espèces à utiliser
pour cette étude. Nous avons utilisé comme base
l’article de Hofmann et al 2010, où la composition
des sels biliaires de 677 vertébrés a été déterminée.
Ils ont aussi défini 6 phénotypes différents selon les
profils des sels libérés chez les organismes (tableau
1). Nous avons choisi étudier l’évolution des sels
biliaires des mammifères, soit 173 espèces, et la
majorité entre eux ne libéraient que les acides C24
(phénotype 6). Nous avons ajouté à cette étude 52
espèces de mammifères, dont le phénotype était
inconnu, d’un travail parallèle du laboratoire afin
d’avoir un joue de donnés plus complet, ce qui a
donné un total de 225 espèces. En autre, pour
l’analyse phylogénétique du gène candidat, nous
avons utilisé 11 autres espèces de vertébrés (annexe
2 – tableau 2). Leurs classifications complète
(annexe 2 – tableau 1), ce qui comprend depuis la
classe jusqu’à l’espèce, a été faite à partir des
recherches sur NCBI Taxonomy, UniProt Taxonomy
entre autres outils bioinformatiques.
Tableau 1. Les phénotypes des espèces selon le profil de
sel biliaires libéré.
Phénotype
Sel biliaire libéré
1
alcools C27
2
alcools C27 + acides C27
3
alcools C27 + acides C24
4
acides C27
5
acides C27 + acides C24
6
acides C24
Reconstruction de caractère ancestral des
mammifères
La construction des arbres phylogénétiques
a été faite avec Mesquite (version 2.75 – build 564).
D’abord, pour le jeu de donnés, il faut construire une
matrice avec les 225 espèces et ensuite, il faut ajouter
les caractères qui seront analysés. Dans ce cas, nous
avons ajouté toutes les 6 phénotypes pour toutes les
225 espèces. Après, il faut choisir la méthode de
reconstruction du caractère ancestral. D’abord la
méthode de Parcimonie, une méthode par laquelle la
phylogénie la plus vraisemblable est celle qui
nécessite le plus petit nombre de changements
évolutifs, cela veut dire le minimum d'événements
évolutifs, a été utilisée pour la construction.
Pourtant, elle ne différencie pas l’absence ou la
manque d’information d’un caractère, il était
difficile de savoir si l’espèce n’avait pas le sel C24
ou s’il était inconnu. Nous avons dû donc refaire le

caractère ancestral à partir de la méthode de
Vraisemblance, une méthode d’estimation
paramétrique permettant de donner un estimateur
d’un paramètre d’une loi de probabilité inconnue
dont on observe des réalisations indépendantes, en
utilisant le modèle Mk1 avec 3 états du caractère
« acide C24 », soit présence, absence ou inconnu.
Par rapport à la topologie d’arbre, nous
avons fait 24 arbres modèles des tous les 225
mammifères deux fois, d’abord par la méthode de
parcimonie et après, par la méthode de
vraisemblance, parce qu’il y avait plusieurs
topologies différents d’arbres phylogénétiques des
mammifères (annexe 3 – partie 1) dans la littérature.
De plus, vu qu’il y avait des espèces dont leurs
phénotypes étaient inconnu, il était difficile à
interpréter les arbres, nous avons donc fait aussi les
mêmes 24 arbres avec seulement les espèces dont le
phénotype était connu, un total de 162 individus
(annexe 3 – partie 2).
Reconstruction du caractère ancestral des vertébrés
Hofmann et al 2010 ont montré que chez les
vertébrés et aussi chez les agnates le phénotype 1 est
le caractère ancestral, mais chez les mammifères, le
phénotype 6 est prédominant. Afin de savoir quand
le phénotype 6 a apparu chez les vertébrés et mieux
comprendre son histoire évolutive, nous avons
reconstruit le caractère ancestral « acides C24 » avec
Mesquite, comme décrit avant, en utilisant la
méthode de Vraisemblance. Cette fois, nous avons
dû faire seulement 4 topologies différentes des 61
espèces de vertébrés séquencés (annexe 3 – partie 3)
qui faisaient partie du tableau de 225 espèces. En
autre, nous avons refaire les 4 arbres avec les espèces
dont le phénotype était connu – soit un total de 28
espèces – afin de faciliter l’analyse des arbres
(annexe 3 – partie 4).
Recherche des orthologues et construction de la
phylogénétique de BAAT chez vertébrés
Une fois le gène candidat choisi, nous avons
cherché des orthologues entre les espèces de
vertébrés séquencées sur la base de données
Ensembl. Nous avons fait un BLAST de la séquence
de la protéine humaine et comme résultat, la
recherche a trouvé 61 vertébrés qui ont été utilisées
pour faire la reconstruction du caractère ancestral
« acides C24 » par Mesquite selon le gène BAAT.
Entre eux, 28 espèces avaient le phénotype connu
(elles faisaient partie des jeux de donnés de
Hofmann et al 2010) et afin d’obtenir des résultats
plus significatifs, la reconstruction a été faite aussi
uniquement avec elles. Afin de comparer le résultat
de la recherche sur Ensembl, une recherche des
orthologues de BAAT et un BLAST de la protéine
humaine ont été faits aussi sur la base de données
NCBI et les mêmes 61 espèces ont été trouvées. La
séquence au format FASTA des 28 espèces dont le
phénotype était connu a été prise ainsi que celle de
deux urochordés, Ciona intestinalis et C. savignyi,
afin les utiliser comme groupe externe pour la
construction de la phylogénie (annexe 4 – partie 1).
Afin d’identifier les espèces après l’alignement, la
première lettre qui identifie le genre et les deux
premières lettres de l’espèce de leurs noms
scientifiques ont été utilisés pour faire une
identification avant chaque séquence, par exemple :
l’identifiant de l’espèce Homo sapiens est « Hsa ».
Les séquences ont été alignées par le logiciel
Seaview 4.5.0 et les régions conservées ont été
sélectionnées pour la construction de la phylogénie
de BAAT (annexe 4 – partie 2). Les séquences de
Petromyzon marinus, Tarsius syrichta et
Microcebus murinus, n’ont pas été alignées parce
qu’elles étaient trop petites (ne sont pas présentes
dans l’annexe 4), ce qui a donné un total de 27
séquences alignées. La construction de l’arbre
phylogénétique du gène BAAT a été faite aussi par