Effet du 5-aza-2`-désoxycytidine et de l`acide valproïque sur l

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UNIVERSITÉ DE NANTES
FACULTÉ DE PHARMACIE
ANNÉE 2008 N°61
THÈSE
pour le
DIPLÔME D’ÉTAT
DE DOCTEUR EN PHARMACIE
PAR
Thomas DAVID
Présentée et soutenue publiquement le 4 Décembre 2008
Effet du 5-aza-2’-désoxycytidine et de l’acide
valproïque sur l’expression d’antigènes
tumoraux dans le mésothéliome pleural malin
Président : M. Jacques AUBRY, Professeur d’Immunologie
Membres du jury : Mlle. Marianne LE PRIELLEC, Docteur en
Pharmacie
M. Stéphane BIRKLE, Maître de Conférences en
Immunologie

1
Sommaire
LISTE DES FIGURES ................................................................................................................................... 5
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................................................... 7
ABREVIATIONS ......................................................................................................................................... 8
Première partie : introduction générale ............................................................................................... 11
I. Le mésothéliome pleural malin .......................................................................................................... 12
I. 1. Définition et situation anatomique ........................................................................................... 12
I. 2. Données épidémiologiques ....................................................................................................... 13
I. 3. Facteurs étiologiques et mécanismes pathogéniques .............................................................. 14
I.3.1. Les fibres minérales .............................................................................................................. 14
I.3.2. Le virus SV40 ......................................................................................................................... 16
I.3.3. Autres facteurs étiologiques ................................................................................................. 17
I.3.4. Mécanismes moléculaires .................................................................................................... 18
I. 4. Etablissement du diagnostic ...................................................................................................... 20
I.4.1. Analyses immunocytochimiques .......................................................................................... 21
I.4.2. Analyses immunohistochimiques ......................................................................................... 21
I.4.3. Dosage de marqueurs solubles ............................................................................................. 23
I. 5. Modalités thérapeutiques ......................................................................................................... 26
I.5.1. La chirurgie ........................................................................................................................... 26
I.5.2. La chimiothérapie ................................................................................................................. 27
I.5.3. La radiothérapie .................................................................................................................... 28
II. L'immunité anti-tumorale ................................................................................................................. 28
II.1. Emergence d'une théorie : de l'immunosurveillance à l'immunoédition ................................. 28
II.2. Les effecteurs de la surveillance immunitaire anti-tumorale.................................................... 31
II.2.1. Les lymphocytes T cytotoxiques .......................................................................................... 31
II.2.2. Les cellules dendritiques ...................................................................................................... 35
II.2.3. Les autres cellules effectrices de l'immunité anti-tumorales .............................................. 46

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II.3. Les antigènes de tumeurs .......................................................................................................... 51
II.3.1. Les différentes techniques d'identification d'antigènes de tumeurs .................................. 51
II.3.2. Classification des antigènes ................................................................................................. 53
II.4. Les mécanismes d'échappement à la réponse antitumorale .................................................... 58
II.4.1. Phénomène de tolérance. ................................................................................................... 59
II.4.2. Influence des facteurs solubles sécrétés par les cellules tumorales. .................................. 60
II.4.3. Défaut d’activation des lymphocytes T ................................................................................ 60
II.4.4. Résistance à l’apoptose ....................................................................................................... 61
II.4.5. Lymphocytes T régulateurs. ................................................................................................. 61
II.4.6. Localisation des tumeurs. .................................................................................................... 62
III. Immunothérapie du mésothéliome ................................................................................................. 62
IV. Intérêt de l’utilisation de molécules hypométhylant l’ADN et d’inhibiteurs d’histone
désacétylase .......................................................................................................................................... 63
IV. 1. Rôle et mécanisme de la méthylation de l’ADN et de l’acétylation des histones .................. 63
IV.1.1. La méthylation de l’ADN ..................................................................................................... 63
IV.1 2. L’acétylation des histones .................................................................................................. 65
IV.2. Modifications épigénétiques et oncogenèse ........................................................................... 66
IV.3. Mécanisme d’action du 5-azacytidine, du 5-aza-2’-désoxycytidine et de l’acide valproïque . 66
IV.3.1. Le 5-aza-2’-désoxycytidine et du 5-azacytidine ................................................................. 66
IV.3.2. L’acide valproïque .............................................................................................................. 68
IV. 4. Méthylation de l’ADN, acétylation des histones et expression d’antigènes tumoraux. ......... 68
IV.4.1. Généralités ......................................................................................................................... 68
IV.4.2. Molécules hypométhylantes et expression des antigènes tumoraux ................................ 70
V. Choix des antigènes tumoraux étudiés ............................................................................................. 71
V.1. Les antigènes tumoraux de type testiculaire ........................................................................... 71
V.2. La mésothéline et la mucine-1 .................................................................................................. 72
VI. Objectif de l’étude ............................................................................................................................ 73
Deuxième partie : partie expérimentale ............................................................................................... 74

3
MATERIEL ET METHODES ...................................................................................................................... 75
I. Patients ............................................................................................................................................... 75
II. Lignées cellulaires .............................................................................................................................. 75
III.Traitement des cellules ..................................................................................................................... 75
III.1. Préparation des solutions-mères ............................................................................................. 75
III.2. Comparaison de l’efficacité du 5-azacytidine et du 5-aza-2’-désoxycytidine sur l’induction
de l’expression d’antigènes tumoraux ............................................................................................. 75
III.3. Choix du mode de traitement .................................................................................................. 76
III.4. Test effet-dose du 5-aza-2’-désoxycytidine et de l’acide valproïque ...................................... 76
IV. Extraction des ARN totaux ............................................................................................................... 77
V. Traitement à la DNase et transcription inverse (RT) ......................................................................... 77
VI. Réaction d’amplification génique (PCR) ........................................................................................... 78
VII. PCR en temps-réel ........................................................................................................................... 79
VIII. Etude de la persistance d’expression des gènes induits par le traitement au 5-azaCdR ............... 80
IX. Fixation de l’anticorps anti-NY-ESO-1 .............................................................................................. 80
X. Activation de la réponse immunitaire. .............................................................................................. 80
X.I. Etude de la réponse immunitaire après traitement des cellules avec 5-azaCdR ou VPA .......... 80
X.II. Traitement des cellules avec 5-azaCdR et VPA ......................................................................... 81
RESULTATS ............................................................................................................................................. 82
I. Vérification de l’intégrité des ARN ..................................................................................................... 82
II. Comparaison de l’efficacité du 5-azaCR et du 5-azaCdR sur l’induction de l’expression
d’antigènes tumoraux (CTA et antigènes de différenciation) ............................................................... 82
III. Choix du mode de traitement .......................................................................................................... 83
IV. Test effet-dose du 5-azaCdR et de l’acide valproïque ..................................................................... 84
IV.1. Etude de la viabilité cellulaire .................................................................................................. 84
IV.2. Etude de la prolifération cellulaire........................................................................................... 85
IV.2.1. Effets du 5-azaCdR .............................................................................................................. 85
IV.2.2. Effets du VPA ...................................................................................................................... 86

4
V. PCR quantitative en temps réel......................................................................................................... 86
V.1. Mise au point de la qPCR .......................................................................................................... 86
V.2. Induction de l’expression du transcrit NY-ESO-1 ...................................................................... 87
VI. Induction de l’expression de différents antigènes de tumeur par le 5-azaCdR et le VPA. .............. 90
VII. Etude de la persistance d’expression des gènes induits par le traitement au 5-azaCdR ................ 91
VIII. Fixation de l’anticorps anti-NY-ESO-1 ............................................................................................ 91
IX. Activation de la réponse immunitaire .............................................................................................. 92
IX.1. Traitement des cellules avec 5-azaCdR ou VPA ....................................................................... 92
IX.2. Traitement des cellules avec combinaison de 5-azaCdR et de VPA ......................................... 94
DISCUSSION ........................................................................................................................................... 97
PERSPECTIVES ...................................................................................................................................... 102
CONCLUSION ....................................................................................................................................... 103
BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................................... 104