Sujet-ET1-2014-corrigé

BIO241 Examen Terminal 1ère session (19 mai 2014)
Documents et calculatrice non autorisés
Notation sur 80 points
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PARTIE A :
Question 1 : 18 pts
Dans la glycolyse, la réaction de phosphorylation du fructose-6-P (F6P) en
fructose-1-6-biphosphate (F16BP), catalysée par la phosphofructokinase (PFK), est
caractérisée par ΔG°' = -18 kJ.mol-1
1/ Ecrire la réaction. Vous préciserez les formules semi-développées du fructose 6P et
du fructose 1-6 BP en utilisant la représentation de Haworth.
fructose 6 P + ATP fructose 1-6 BP + ADP
2/ Quel est le nom complet correspondant à l'abréviation ΔG°' ? A quelles conditions
expérimentales correspondent les abréviations ' et ° ? Que représente cette ΔG°' ?
3pts
Variation d'énergie libre de Gibbs, standard apparente (=pH7)
conditions expérimentales standard apparente : P= 1 Bar ; T= 298K ; [chaque
réactant ]=1 M et pH=7.
La valeur absolue de cette variation représente la quantité de travail maximale
susceptible d'être fournie par une réaction spontanée, dans les conditions exp
standard apparente.
3/ Dans le cas où ΔG°' = -18 kJ.mol-1 , que pouvez-vous conclure ?
Dans les conditions standard apparentes, comme le signe de ΔG°' est négatif, la
réaction est spontanée = exergonique, et la quantité de travail susceptible d'être
fournie par cette réaction est de 18 kJ.mol-1
Cette réaction est issue du couplage entre deux réactions chimiques.
4/ Citer, en les explicitant, les conditions de couplage entre deux réactions chimiques.
C1 :Une réaction exergonique et une endergonique
C2 : quantité de travail fournie par l'exergonique > quantité de travail
nécessaire pour que l'endergonique ait lieu
C3 : simultanées
C4 : présence d'un élément de couplage = enzyme ici.
5/ Ecrire les réactions chimiques qui sont couplées pour donner la réaction catalysée
par la phosphofructokinase. Donner leurs ΔG°'.

exergonique ADP + Pi ΔG°' = - 30 kJ.mol-1 ATP + H2O
endergonique fructose 1-6 BP + H2O ΔG°' = 12 kJ.mol-1 fructose 6 P + Pi
ΔG°' (ender) = ΔG°' (totale) - ΔG°' (exer) = -18 - (-30) = 12 kJ.mol-1
In vitro, à 25°C et à pH7 et pour les concentrations en réactants suivantes [F6P] =
5.10-5 mol.L-1 ; [ATP] = 3.10-3 mol.L-1 ; [FBP] = 200.10-3 mol.L-1 ; [ADP] = 3.10-
3 mol.L-1 , la réaction a lieu dans le sens 2.
6/ Comment pourriez-vous prouver que la réaction dans les conditions précitées a
bien lieu dans le sens 2 ? Donner la relation dans ce cas.
en calculant ΔG' avec la relation suivante
ΔG' = ΔG'° + RT ln ([ADP] [F16BP])/([ATP][F6P])
si sens 2 alors ΔG' doit être positive dans ces conditions.
7/ Que proposez-vous de modifier comme condition expérimentale pour permettre à
la réaction d'avoir lieu dans le sens 1 ?
Selon les conditions de concentration en réactants, le ln peut être différent et faire
basculer le signe du ΔG'. Il faudrait par exemple diminuer les concentrations en
produit F16BP ou ADP. Ici [F16BP] très élevée facile à diminuer.
8/ Cette réaction est-elle réversible au sein de la glycolyse ? A la lumière des réponses
précédentes, proposer une explication.
Cette réaction est irréversible dans le sens 1 in vivo. La concentration en produit
F16BP ne peut pas être aussi élevée que dans ce cas, obtenu in vitro.
Donnée : ΔG°' (hydrolyse de l'ATP) = - 30 kJ.mol-1
Question 2 : 10 pts
L'étude enzymatique de la phosphofructokinase (réaction 1) s'effectue de
manière indirecte par dosage spectrophotométrique couplé en utilisant deux autres
réactions chimiques catalysées l'une par la pyruvate kinase, une autre réaction de la
glycolyse (réaction 2) et l'autre par la lactate déshydrogénase (réaction 3).
Dans ce système, la lactate déshydrogénase (LDH) permet le dosage du pyruvate
formé par la pyruvate kinase selon la réaction suivante :
réaction 3 :
pyruvate + NADH,H+ lactate + NAD+
LDH

1/ Justifier l'appellation « dosage spectrophotomètrique » en précisant quelle est la
molécule responsable de l'absorption du milieu réactionnel à 340 nm.
C'est le NADH,H+ qui absorbe de façon spécifique à 340 nm. On va suivre dans ce
dosage la disparition de NADH donc la baisse de l'absorbance.
L'ADP, produit de la réaction 1, est dosé par la pyruvate kinase lors de la réaction 2.
2/ Ecrire la réaction 2 catalysée par la pyruvate kinase (PK).
Phosphoénol pyruvate (PEP) + ADP pyruvate + ATP
3/ Quelle est la stœchiométrie du dosage ? Peut-on directement relier la quantité de
substrat consommé par la phosphofructokinase à l'absorbance du milieu réactionnel ?
Justifier.
Réaction 1 :
fructose 6 P + ATP fructose 1-6 BP + ADP
Réaction 2 :
Phosphoénol pyruvate (PEP) + ADP pyruvate + ATP
Réaction 3 :
pyruvate + NADH,H+ lactate + NAD+
La stœchiométrie du dosage est donc de 1. Une mole de fructose 6P consommée par
la PFK donne une mole de NAD+ et correspond donc à la disparition d'une mole de
NADH,H+
4/ Donner la composition du milieu réactionnel permettant de doser l'activité
enzymatique de la phosphofructokinase.
Fructose 6P ; ATP ; PEP ; NADH ; lactate déshydrogénase ; pyruvate kinase et
phosphofructokinase
Question 3 : 22 pts
L'étude cinétique de la phosphofructokinase est menée avec de faibles
concentrations en ATP (50 µM) pour garantir un comportement michaëlien vis à vis du
fructose 6P. En effet, pour des concentrations élevées en ATP, la PFK révèle son
caractère allostérique.
PK
PK
PFK-1
LDH

Dans un premier temps, deux fractions (fraction 1 et fraction 2) de mélange
réactionnel de 980 µL chacune contenant tous les éléments nécessaires au dosage
enzymatique, sauf la PFK, sont préparées dans un tampon Tris de pH 7,4 et incubées
à 25°C.
La réaction est ensuite déclenchée par l'ajout de 20 µL de solution enzymatique diluée
au 1/600° dans la fraction 1, et par l'ajout de 20 µL de solution enzymatique diluée
au 1/160° dans la fraction 2. La réaction est alors suivie par spectrophotométrie à
340 nm dans une cuve de 1 cm.
Les résultats bruts obtenus sont ceux de la figure 1. Vous devrez rendre la figure 1
annotée avec votre copie.
1/ Donner un titre complet à cette figure.
Cinétique de disparition du NADH,H+ proportionnelle à celle du substrat F6P de la PFK,
en fonction du temps. Détermination des conditions de vitesse initiale et des V0
2/ Vous préciserez dans le cadre prévu les conditions expérimentales de mesure fixées
dans cette expérience. Pourquoi est-il important de les rappeler ?
Mesures effectuées à pH 7,4, T° 25°C, pour [F6P]0=0,2 mM et pour 20 µL d'enzyme à
1/800 (fraction 1) ou 1/160 (fraction 2)
dès qu'une de ces conditions est modifiée la V0 mesurée l'est aussi.
3/ Attribuer chacune des courbes aux fractions 1 ou 2.
fraction 1 = « droite »
fraction 2 = hyperbole
4/ Vous annoterez les 2 courbes pour mettre en évidence les résultats obtenus.
Tracé de chaque tangente à l'origine notée V0
5/ Sachant que l'on souhaite ensuite réaliser des mesures cinétiques pendant 2
minutes, justifier le choix de la dilution pour la solution de phosphofructokinase.
La durée des conditions de V0 dépend de la quantité d'enzyme. On choisira les
conditions de la fraction 1 pour arrêter la réaction à t=2min avec une bonne précision
de mesure de la V0
L'étude cinétique de la PFK peut alors être poursuivie à différentes concentrations en
fructose 6 phosphate.
Pour cela, des fractions de 980 µL du mélange réactionnel, chacune contenant tous les
éléments nécessaires au dosage enzymatique, sauf la PFK, et à différentes
concentrations en fructose 6 phosphate sont préparées dans un tampon Tris de pH 7,4
et incubées à 25°C.
La réaction est ensuite déclenchée par l'ajout de 20 µL de solution enzymatique diluée
au 1/600° et suivie par spectrophotométrie à 340 nm (ε NADH,H+ à 340nm = 6000 M-1.cm-
1) dans une cuve de 1 cm.
Une partie des résultats est compilée dans le tableau suivant.

N° du tube
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Mélange de
réaction (µL)
480 480 480 480 480 480 480 480 480
Solution de PFK
1/600° (µL)
- 20 20 20 20 20 20 20 20
Volume de
solution de F6P
ajoutée (µL)
500 500 500 500 500 500 500 500 500
[F6P] de la
solution ajoutée
(mM)
0,2 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
A340 nm à t=0 1,2 1,22 1,29 1,2 1,21 1,23 1,2 1,24 1,21
A340 nm à t=2 min 1,2 1,15 1,18 0,9 0,89 0,81 0,74 0,67 0,62
Dans le tube 1, 20 µL de tampon sont ajoutés à la place de l'enzyme.
Vous donnerez un exemple de calcul pour le tube 4 uniquement.
6/ Donner la définition du volume réactionnel.
C'est le volume dans lequel se passe la réaction. Il contient dans le tampon adéquat
les substrats et cosubstrats ainsi que l'enzyme.
7/ Donner la valeur du volume réactionnel dans cette expérience. Justifier.
Vréact = 980 µL + 20µL = 1 mL
8/ Calculer la concentration en fructose 6 phosphate à t=0 dans le tube 4.
500µL à 0,4 mM dans 1mL de Vréact : [F6P]0 = 0,2 mM
9/ Donner la définition de la vitesse initiale.
C'est la vitesse initiale de formation du produit ou de disparition du substrat. (ici les
mêmes)
V0 = ∆P/∆t = ∆S/∆t
10/ Calculer la vitesse initiale dans le tube 4 en mol.L-1.min-1.
∆A = 1,2-0,9 = 0,3 pour ∆t = 2 min
V0 = ∆S/∆t = (∆A340nm/ εNADH à 340nmxl) / ∆t = (0,3/6000 x1) / 2 = 0,25 10-4 M.min-1
L'analyse de l'ensemble des résultats du tableau donne une Vm de 200 µM.min-1 et un
Km de 0,15 mM.
11/ Comment feriez-vous, à partir des résultats expérimentaux, pour obtenir Km et Vm
avec précision ? Tracer l'allure de la courbe attendue en plaçant Vm et Km.
Je tracerais 1/V0 en fonction de 1/[F6P]0
1 / V
0