Sujet-ET1-2014-corrigé
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BIO241 Examen Terminal 1ère session (19 mai 2014) Documents et calculatrice non autorisés Notation sur 80 points ___________________________________________________________________________ PARTIE A : Question 1 : 18 pts Dans la glycolyse, la réaction de phosphorylation du fructose-6-P (F6P) en fructose-1-6-biphosphate (F16BP), catalysée par la phosphofructokinase (PFK), est caractérisée par ΔG°' = -18 kJ.mol-1 1/ Ecrire la réaction. Vous préciserez les formules semi-développées du fructose 6P et du fructose 1-6 BP en utilisant la représentation de Haworth. fructose 6 P + ATP fructose 1-6 BP + ADP 2/ Quel est le nom complet correspondant à l'abréviation ΔG°' ? A quelles conditions expérimentales correspondent les abréviations ' et ° ? Que représente cette ΔG°' ? 3pts Variation d'énergie libre de Gibbs, standard apparente (=pH7) conditions expérimentales standard apparente : P= 1 Bar ; T= 298K ; [chaque réactant ]=1 M et pH=7. La valeur absolue de cette variation représente la quantité de travail maximale susceptible d'être fournie par une réaction spontanée, dans les conditions exp standard apparente. 3/ Dans le cas où ΔG°' = -18 kJ.mol-1 , que pouvez-vous conclure ? Dans les conditions standard apparentes, comme le signe de ΔG°' est négatif, la réaction est spontanée = exergonique, et la quantité de travail susceptible d'être fournie par cette réaction est de 18 kJ.mol-1 Cette réaction est issue du couplage entre deux réactions chimiques. 4/ Citer, en les explicitant, les conditions de couplage entre deux réactions chimiques. C1 :Une réaction exergonique et une endergonique C2 : quantité de travail fournie par l'exergonique > quantité de travail nécessaire pour que l'endergonique ait lieu C3 : simultanées C4 : présence d'un élément de couplage = enzyme ici. 5/ Ecrire les réactions chimiques qui sont couplées pour donner la réaction catalysée par la phosphofructokinase. Donner leurs ΔG°'. exergonique ATP + H 2 O endergonique ADP + Pi ΔG°' = - 30 kJ.mol-1 fructose 1-6 BP + H 2 O fructose 6 P + Pi ΔG°' = 12 kJ.mol-1 ΔG°' (ender) = ΔG°' (totale) - ΔG°' (exer) = -18 - (-30) = 12 kJ.mol-1 In vitro, à 25°C et à pH7 et pour les concentrations en réactants suivantes [F6P] = 5.10-5 mol.L-1 ; [ATP] = 3.10-3 mol.L-1 ; [FBP] = 200.10-3 mol.L-1 ; [ADP] = 3.103 mol.L-1 , la réaction a lieu dans le sens 2. 6/ Comment pourriez-vous prouver que la réaction dans les conditions précitées a bien lieu dans le sens 2 ? Donner la relation dans ce cas. en calculant ΔG' avec la relation suivante ΔG' = ΔG'° + RT ln ([ADP] [F16BP])/([ATP][F6P]) si sens 2 alors ΔG' doit être positive dans ces conditions. 7/ Que proposez-vous de modifier comme condition expérimentale pour permettre à la réaction d'avoir lieu dans le sens 1 ? Selon les conditions de concentration en réactants, le ln peut être différent et faire basculer le signe du ΔG'. Il faudrait par exemple diminuer les concentrations en produit F16BP ou ADP. Ici [F16BP] très élevée facile à diminuer. 8/ Cette réaction est-elle réversible au sein de la glycolyse ? A la lumière des réponses précédentes, proposer une explication. Cette réaction est irréversible dans le sens 1 in vivo. La concentration en produit F16BP ne peut pas être aussi élevée que dans ce cas, obtenu in vitro. Donnée : ΔG°' (hydrolyse de l'ATP) = - 30 kJ.mol-1 Question 2 : 10 pts L'étude enzymatique de la phosphofructokinase (réaction 1) s'effectue de manière indirecte par dosage spectrophotométrique couplé en utilisant deux autres réactions chimiques catalysées l'une par la pyruvate kinase, une autre réaction de la glycolyse (réaction 2) et l'autre par la lactate déshydrogénase (réaction 3). Dans ce système, la lactate déshydrogénase (LDH) permet le dosage du pyruvate formé par la pyruvate kinase selon la réaction suivante : réaction 3 : + pyruvate + NADH,H LDH lactate + NAD+ 1/ Justifier l'appellation « dosage spectrophotomètrique » en précisant quelle est la molécule responsable de l'absorption du milieu réactionnel à 340 nm. C'est le NADH,H+ qui absorbe de façon spécifique à 340 nm. On va suivre dans ce dosage la disparition de NADH donc la baisse de l'absorbance. L'ADP, produit de la réaction 1, est dosé par la pyruvate kinase lors de la réaction 2. 2/ Ecrire la réaction 2 catalysée par la pyruvate kinase (PK). PK Phosphoénol pyruvate (PEP) + ADP pyruvate + ATP 3/ Quelle est la stœchiométrie du dosage ? Peut-on directement relier la quantité de substrat consommé par la phosphofructokinase à l'absorbance du milieu réactionnel ? Justifier. Réaction 1 : PFK-1 fructose 6 P + ATP fructose 1-6 BP + ADP Réaction 2 : PK Phosphoénol pyruvate (PEP) + ADP pyruvate + ATP Réaction 3 : + pyruvate + NADH,H LDH lactate + NAD+ La stœchiométrie du dosage est donc de 1. Une mole de fructose 6P consommée par la PFK donne une mole de NAD+ et correspond donc à la disparition d'une mole de NADH,H+ 4/ Donner la composition du milieu réactionnel permettant de doser l'activité enzymatique de la phosphofructokinase. Fructose 6P ; ATP ; PEP ; NADH ; lactate déshydrogénase ; pyruvate kinase et phosphofructokinase Question 3 : 22 pts L'étude cinétique de la phosphofructokinase est menée avec de faibles concentrations en ATP (50 µM) pour garantir un comportement michaëlien vis à vis du fructose 6P. En effet, pour des concentrations élevées en ATP, la PFK révèle son caractère allostérique. Dans un premier temps, deux fractions (fraction 1 et fraction 2) de mélange réactionnel de 980 µL chacune contenant tous les éléments nécessaires au dosage enzymatique, sauf la PFK, sont préparées dans un tampon Tris de pH 7,4 et incubées à 25°C. La réaction est ensuite déclenchée par l'ajout de 20 µL de solution enzymatique diluée au 1/600° dans la fraction 1, et par l'ajout de 20 µL de solution enzymatique diluée au 1/160° dans la fraction 2. La réaction est alors suivie par spectrophotométrie à 340 nm dans une cuve de 1 cm. Les résultats bruts obtenus sont ceux de la figure 1. Vous devrez rendre la figure 1 annotée avec votre copie. 1/ Donner un titre complet à cette figure. Cinétique de disparition du NADH,H+ proportionnelle à celle du substrat F6P de la PFK, en fonction du temps. Détermination des conditions de vitesse initiale et des V 0 2/ Vous préciserez dans le cadre prévu les conditions expérimentales de mesure fixées dans cette expérience. Pourquoi est-il important de les rappeler ? Mesures effectuées à pH 7,4, T° 25°C, pour [F6P] 0 =0,2 mM et pour 20 µL d'enzyme à 1/800 (fraction 1) ou 1/160 (fraction 2) dès qu'une de ces conditions est modifiée la V 0 mesurée l'est aussi. 3/ Attribuer chacune des courbes aux fractions 1 ou 2. fraction 1 = « droite » fraction 2 = hyperbole 4/ Vous annoterez les 2 courbes pour mettre en évidence les résultats obtenus. Tracé de chaque tangente à l'origine notée V 0 5/ Sachant que l'on souhaite ensuite réaliser des mesures cinétiques pendant 2 minutes, justifier le choix de la dilution pour la solution de phosphofructokinase. La durée des conditions de V 0 dépend de la quantité d'enzyme. On choisira les conditions de la fraction 1 pour arrêter la réaction à t=2min avec une bonne précision de mesure de la V 0 L'étude cinétique de la PFK peut alors être poursuivie à différentes concentrations en fructose 6 phosphate. Pour cela, des fractions de 980 µL du mélange réactionnel, chacune contenant tous les éléments nécessaires au dosage enzymatique, sauf la PFK, et à différentes concentrations en fructose 6 phosphate sont préparées dans un tampon Tris de pH 7,4 et incubées à 25°C. La réaction est ensuite déclenchée par l'ajout de 20 µL de solution enzymatique diluée au 1/600° et suivie par spectrophotométrie à 340 nm (ε NADH,H+ à 340nm = 6000 M-1.cm1 ) dans une cuve de 1 cm. Une partie des résultats est compilée dans le tableau suivant. N° du tube Mélange de réaction (µL) Solution de PFK 1/600° (µL) Volume de solution de F6P ajoutée (µL) [F6P] de la solution ajoutée (mM) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 480 480 480 480 480 480 480 480 480 - 20 20 20 20 20 20 20 20 500 500 500 500 500 500 500 500 500 0,2 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 A 340 nm à t=0 1,2 1,22 1,29 1,2 1,21 1,23 1,2 1,24 1,21 A 340 nm à t=2 min 1,2 1,15 1,18 0,9 0,89 0,81 0,74 0,67 0,62 Dans le tube 1, 20 µL de tampon sont ajoutés à la place de l'enzyme. Vous donnerez un exemple de calcul pour le tube 4 uniquement. 6/ Donner la définition du volume réactionnel. C'est le volume dans lequel se passe la réaction. Il contient dans le tampon adéquat les substrats et cosubstrats ainsi que l'enzyme. 7/ Donner la valeur du volume réactionnel dans cette expérience. Justifier. Vréact = 980 µL + 20µL = 1 mL 8/ Calculer la concentration en fructose 6 phosphate à t=0 dans le tube 4. 500µL à 0,4 mM dans 1mL de Vréact : [F6P] 0 = 0,2 mM 9/ Donner la définition de la vitesse initiale. C'est la vitesse initiale de formation du produit ou de disparition du substrat. (ici les mêmes) V 0 = ∆P/∆t = ∆S/∆t 10/ Calculer la vitesse initiale dans le tube 4 en mol.L-1.min-1. ∆A = 1,2-0,9 = 0,3 pour ∆t = 2 min V 0 = ∆S/∆t = (∆A340nm/ ε NADH à 340nm xl) / ∆t = (0,3/6000 x1) / 2 = 0,25 10-4 M.min-1 L'analyse de l'ensemble des résultats du tableau donne une V m de 200 µM.min-1 et un K m de 0,15 mM. 11/ Comment feriez-vous, à partir des résultats expérimentaux, pour obtenir K m et V m avec précision ? Tracer l'allure de la courbe attendue en plaçant V m et K m. Je tracerais 1/V 0 en fonction de 1/[F6P] 0 1 / V0 1/ V 1 / [F6P]0 - 1 / KM 12/ Que signifie V m ? Donner sa définition. Que permet-elle d'étudier ? Vm est la vitesse initiale maximale. C'est la vitesse initiale à saturation de l'enzyme. Elle permet d'étudier les performances du site catalytique. 13/ Que signifie K m ? Donner sa définition. Que permet-elle d'étudier ? Km est la constante de Miachaëlis. C'est la concentration en substrat pour avoir Vm/2. Elle permet d'étudier les performances du site de fixation car elle représente l'inverse de l'affinité de l'enzyme pour son substrat. 14/ Donner la définition de l'activité expérimentales est-elle mesurée ? enzymatique. Dans quelles conditions AE (pHopt, T°optimale, [substrat]saturante, ramenée à 1mL d'enzyme non diluée) est le nombre de moles de substrat transformé par seconde. 15/ Calculer l'activité enzymatique de 1 mL de solution non diluée de PFK. AE (20µL à 1/600)= V m x v react AE (20µL Non diluée) = V m x v react x 600 AE (1mL Non diluée) = V m x v react x 600 x 50 = (200. 10-6 /60) x 10-3 x 600 x 50 =105 nkat.mL-1 numéro d'anonymat : Figure 1 : Conditions fixées : pH = 7,4 T° = 25°C [F6P]0 = 0,2 mM Fraction 1 20 µL de PFK à 1/600° Fraction 2 20 µL de PFK à 1/160° Fraction 1 Fraction 2 Titre : Cinétique de disparition du NADH,H+ proportionnelle à celle du substrat F6P de la PFK, en fonction du temps. Détermination des conditions de vitesse initiale et des V0 PARTIE B Question 1 : 10 pts La glycogénolyse s’effectue en deux étapes : (Glucose)n + Pi (Glucose)n-1 + Glucose-1-P Le Glucose-1-P est ensuite transformé en Glucose-6-P a- Quels sont les deux endroits où est stocké le glycogène dans l’organisme ? Foie et muscles b- donner le nom de l’enzyme qui catalyse la première étape. La glycogène phosphorylase c- Donner le devenir du Glc-6-P formé, selon l’endroit de stockage du glycogène Dans le foie, le Glc-6P sera transformé en glucose qui est libéré dans le sang (néoglucogenèse). Ce Glc va ensuite être distribué aux tissus consommateurs. Dans les muscles, le Glc-6P va être consommé dans la glycolyse (objectif produire de l’ATP) . d- Combien de moles d’ATP et de NADH,H+ obtient-on par la dégradation d’une mole de glucose (provenant de l’hydrolyse du glycogène) en pyruvate ? en lactate ? Justifier (brièvement) votre réponse. La seconde réaction de la glycogénolyse permet de générer du Glc6P qui entre directement dans la glycolyse au niveau de la 2ème réaction et on économise ainsi l’hydrolyse d’1 ATP (consommée dans la réaction 1). En pyruvate : 3 ATP et 2 NADH,H+ En lactate : 3 ATP et 0 NADH,H+ e- Donner les noms des deux hormones produites par le pancréas qui participent à l’homéostasie du glucose circulant et leur impact sur le métabolisme du glycogène Glucagon, hormone hyperglycémiante, stimule la glycogénolyse hépatique Insuline, hormone hypoglycémiante, inhibe la glycogénolyse hépatique et favorise la synthèse du glycogène Question 2 : 5 points On se propose de synthétiser de l’ATP radioactif marqué en position γ par du 32[P], isotope radioactif du phosphate. A cette fin, on dispose de phosphate de sodium marqué par du 32[P] et d’ADP non radioactif. Quelle(s) réaction(s) de la glycolyse choisiriez-vous pour obtenir de l’ATP radiomarqué ? Justifiez votre réponse en détaillant ces réactions (formules semi-développées, noms des enzymes, coenzymes nécessaires). Réactions 6 et 7 de la glycolyse Métabolisme microbien - Partie sur 15 points (20 à 30 minutes) Actinobacillus succinogenes est une bactérie qui a été isolée dans le rumen (flore qui colonise la panse des ruminants). Comme son nom le suggère, elle est capable de produire en anaérobie (une situation courante dans l’appareil digestif des ruminants) – et sécréter dans l’environnement – de grandes quantités d’acide succinique (ou succinate), une molécule qui peut servir de précurseur pour de nombreuses synthèses chimiques. Le succinate est surproduit via la réduction de l’oxaloacétate (fonctionnement « à l’envers » du cycle de Krebs). Pour cela, de l’oxaloacétate est produit grâce à la carboxylation du PEP ou du pyruvate, qui nécessite la présence en quantité importante de CO 2 (on dit d’ailleurs que cette bactérie est capnophile, c.à.d. qu’elle a besoin de grandes quantités de CO 2 pour vivre). pyruvate + CO 2 + ATP → oxaloacétate + ADP + Pi PEP + CO 2 + H 2 O → oxaloacétate + Pi Il faut noter qu’en présence d’oxygène, la bactérie ne produit que très peu de succinate (et n’utilise quasiment pas la carboxylation du PEP et du pyruvate). a) Au vu des informations fournies, comment pouvez-vous qualifier le comportement de cette bactérie vis-à-vis de l’oxygène (justifiez votre raisonnement) ? (1 point) b) Quelles conséquences la production de succinate telle qu’expliquée ci-dessus va-t-elle avoir pour métabolisme et la croissance de la bactérie (commencez par rappeler comment le cycle de Krebs passe d’une molécule à l’autre quand il fonctionne dans le bon sens) ? (4 points) c) La production de succinate est-elle d’après vous le résultat d’une respiration ou d’une fermentation (justifiez votre réponse) ? (1 point) Si A. succinogenes est capable d’utiliser différents sucres comme substrat, dans son environnement naturel, son sucre préférentiel est le cellobiose, qui lui sert à la fois de source de carbone, d’électrons et d’énergie. d) Au vu des informations en votre possession, indiquer, en justifiant vos réponses, les trois types trophiques de cette bactérie. (1,5 points) e) Sachant qu’A. succinogenes n’est apparemment pas capable d’utiliser la cellulose comme source de carbone, comment peut-elle se procurer du cellobiose dans son écosystème naturel (détaillez votre réponse) ? (1 point) L’utilisation de PEP exogène a été étudiée avec des cellules d’A. succinogenes préalablement cultivées avec du glucose ou du cellobiose comme seule source de carbone (la molécule est importée dans la cellule et intègre alors le métabolisme bactérien). Les cellules une fois lavées sont incubées dans un milieu réactionnel contenant – entre autres – du PEP 5 mM, du NADH 0,5 mM et 10 unités de lactacte déshydrogénase. L’enzyme catalyse la réaction suivante : + + pyruvate + NADH + H → lactate + NAD La réaction enzymatique est quantifiée par spectrophotométrie à 340 nm (longueur d’onde correspondant au NADH). Au début, rien ne se passe (bruit de fond), mais dès qu’on rajoute dans le milieu réactionnel une source de carbone qui peut être soit du glucose 15 mM, soit du cellobiose 15 mM, on observe la décroissance de la DO 340 nm . Et dans tous les cas, la vitesse d’oxydation du NADH est 10 fois supérieure quand les essais sont réalisés en présence de cellobiose. f) Quels enseignements pouvez-vous tirer de cette expérience ? g) Que va devenir le cellobiose une fois entré dans la cellule ? (5 points) (1,5 points) Réponses : Actinobacillus succinogenes est une bactérie qui a été isolée dans le rumen (flore qui colonise la panse des ruminants). Comme son nom le suggère, elle est capable de produire en anaérobie (une situation courante dans l’appareil digestif des ruminants) – et sécréter dans l’environnement – de grandes quantités d’acide succinique (ou succinate), une molécule qui peut servir de précurseur pour de nombreuses synthèses chimiques… a) Au vu des informations fournies, comment pouvez-vous qualifier le comportement de cette bactérie vis-à-vis de l’oxygène (justifiez votre raisonnement) ? (1 point) A. succinogenes peut croître aussi bien en présence d’oxygène qu’en absence d’oxygène. En présence d’oxygène, elle ne produit presque pas de succinate, alors qu’elle surproduit ce métabolite en anaérobie : elle change donc de métabolisme selon qu’il y ait ou non de l’oxygène dans le milieu. (0,5) Il s’agit donc d’une bactérie anaérobie facultative. (0,5) b) Quelles conséquences la production de succinate telle qu’expliquée ci-dessus va-t-elle avoir pour le métabolisme et la croissance de la bactérie (commencez par rappeler comment le cycle de Krebs passe d’une molécule à l’autre quand il fonctionne dans le bon sens) ? (4 points) Succinate + FAD → Fumarate + FADH 2 Fumarate + H 2 O → Malate + + Malate + NAD → Oxaloacétate + NADH + H (0,5) En tournant à l’envers pour produire du succinate à partir de l’oxaloacétate, il va y avoir non pas production mais consommation de coenzymes réduits. (0,5) Le détournement d’une partie des carbones (PEP, pyruvate) vers la synthèse d’oxaloacétate au lieu d’acétyl-coA va engendrer une baisse du flux de carbone dans le cycle de Krebs, et aura donc lui aussi pour effet une diminution de la production de coenzymes réduits (qui résultent de l’oxydation du pyruvate puis du citrate). (1,5) Du coup, la bactérie disposera d’une moindre quantité de coenzymes réduits, alors que chacun sait que c’est la réoxydation de ces coenzymes via l’utilisation d’une chaîne de transport membranaire qui est la principale source d’énergie pour la cellule. Du coup, les cellules vont disposer de moins d’énergie pour leur croissance. (1) Et comme la croissance est directement liée à la quantité d’énergie disponible, ces bactéries poussent nettement moins vite quand elles produisent du succinate ! (0,5) c) La production de succinate est-elle d’après vous le résultat d’une respiration ou d’une fermentation (justifiez votre réponse) ? (1 point) Le succinate est produit via la réduction de l’oxaloacétate par les enzymes (cytosoliques) du cycle de Krebs : ceci n’implique pas une chaîne de transport d’électrons membranaires. De plus, puisque le cycle de Krebs tourne pour partie à l’envers, il y aura moins de coenzymes réduits produits. (0,5) Il s’agit donc très probablement d’une fermentation. (0,5) d) Au vu des informations en votre possession, indiquer, en justifiant vos réponses, les trois types trophiques de cette bactérie. (1,5 points) La bactérie utilise le cellobiose comme source de carbone, d’électrons et d’énergie. Si elle utilise le CO 2 pour synthétiser de l’oxaloacétate, elle ne peut apparemment pas vivre uniquement avec du CO 2 . Par ailleurs, il n’est nulle part question de lumière ni de source d’électron inorganique. (0,75) La bactérie est donc chimio-hétérotrophe organotrophe. (0,75) e) Sachant qu’A. succinogenes n’est apparemment pas capable d’utiliser la cellulose comme source de carbone, comment peut-elle se procurer du cellobiose dans son écosystème naturel (détaillez votre réponse) ? (1 point) D’autres bactéries présentes dans le rumen sont capables de dégrader la cellulose pour produire du cellobiose. (0,5) Ces bactéries doivent pour cela synthétiser des enzymes (cellulases) qu’elles sécrètent dans le milieu. (0,5) f) Quels enseignements pouvez-vous tirer de cette expérience ? (5 points) En présence de cellobiose, on observe une forte décroissance de la quantité de NADH dans le milieu. Or, dans le milieu réactionnel, l’enzyme capable d’utiliser ce coenzyme est la LDH, qui utilise le NADH pour réduire le pyruvate. On peut déduire de cela que la bactérie a à sa disposition une quantité importante de pyruvate. (1) Mais il n’y a pas de pyruvate dans le milieu de culture. Par contre, ce métabolite peut être produit à partir du PEP. On en déduit donc qu’en présence de cellobiose, le PEP est converti en pyruvate, alors que ce n’est (presque) pas le cas en présence de glucose. (1) Or nous ne connaissons que deux moyens de produire du pyruvate à partir du PEP : la glycolyse (PEP + ADP → pyruvate + ATP) ; les transports de type PTS, qui permettent à un métabolite d’être importé moyennant phosphorylation grâce à un phosphate donné par le PEP (et transmis par plusieurs enzymes). (1) La glycolyse concernant les deux métabolites, la seule explication possible pour une production importante de PEP en présence de cellobiose uniquement est donc que ce sucre entre dans la cellule via un transport de type PTS. (2) g) Que va devenir le cellobiose une fois entré dans la cellule ? (1,5 points) Il sera hydrolysé pour donner une molécule de glucose et une molécule de glucose phosphorylée (probablement glucose-6-phoshate). (0,5) Ces deux métabolites intègreront alors glycolyse et voie des pentoses phosphates. (1)
