Thèse Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le
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N° d’ordre : 2007-ISAL-0116 Année 2007 Thèse Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. présentée devant L’Institut National des Sciences Appliquées de Lyon pour obtenir le grade de Docteur Ecole doctorale : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation Spécialité : Microbiologie par Thomas LAUTIER Soutenue publiquement le jeudi 20 décembre 2007 devant la Commission d’examen JURY Mr Carlos BLANCO, Professeur à l’Université de Rennes I, Rapporteur Mr Claude GUTIERREZ, Professeur à l’Université Toulouse III, Rapporteur Mr Hafid ABAIBOU, Responsable Senior R&D, Biomérieux, Examinateur Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA de Lyon, Examinateur Mme Marie-Andrée MANDRAND-BERTHELOT, Directeur de Recherche CNRS, Examinateur Mr William NASSER, Directeur de Recherche CNRS, Directeur de thèse 1 2 INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales 2007 SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE CHIMIE DE LYON http://sakura.cpe.fr/ED206 CHIMIE E.E.A. M. Jean Marc LANCELIN Université Claude Bernard Lyon 1 Bât CPE 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72.43 13 95 Fax : [email protected] M. Alain NICOLAS Ecole Centrale de Lyon Bâtiment H9 36 avenue Guy de Collongue 69134 ECULLY Tél : 04.72.18 60 97 Fax : 04 78 43 37 17 [email protected] Secrétariat : M.C. HAVGOUDOUKIAN M. Jean-Pierre FLANDROIS CNRS UMR 5558 Université Claude Bernard Lyon 1 Bât G. Mendel 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cédex Tél : 04.26 23 59 50 Fax 04 26 23 59 49 06 07 53 89 13 [email protected] M. Alain MILLE Université Claude Bernard Lyon 1 LIRIS - EDIIS Bâtiment Nautibus 43 bd du 11 novembre 1918 69622 VILLEURBANNE Cedex Tél : 04.72. 44 82 94 Fax 04 72 44 80 53 [email protected] - [email protected] M. Didier REVEL Hôpital Cardiologique de Lyon Bâtiment Central 28 Avenue Doyen Lépine 69500 BRON Tél : 04.72.35 72 32 Fax : [email protected] M. Jean Marc PELLETIER INSA de Lyon MATEIS Bâtiment Blaise Pascal 7 avenue Jean Capelle 69621 VILLEURBANNE Cédex Tél : 04.72.43 83 18 Fax 04 72 43 85 28 [email protected] M.Pascal KOIRAN Ecole Normale Supérieure de Lyon 46 allée d’Italie 69364 LYON Cédex 07 Tél : 04.72.72 84 81 Fax : 04 72 72 89 69 [email protected] Secrétariat : Fatine Latif - [email protected] M. Jean Louis GUYADER INSA de Lyon Laboratoire de Vibrations et Acoustique Bâtiment Antoine de Saint Exupéry 25 bis avenue Jean Capelle 69621 VILLEURBANNE Cedex Tél :04.72.18.71.70 Fax : 04 72 18 87 12 [email protected] Mme Claude-Isabelle BRELOT Université Lyon 2 86 rue Pasteur 69365 LYON Cedex 07 Tél : 04.78.69.72.76 Fax : 04.37.28.04.48 [email protected] M. Jean Marc LANCELIN Insa : R. GOURDON ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE http://www.insa-lyon.fr/eea M. Alain NICOLAS Insa : D. BARBIER [email protected] Secrétariat : M. LABOUNE AM. 64.43 – Fax : 64.54 EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2 E2M2 M. Jean-Pierre FLANDROIS INSA : H. CHARLES EDIIS INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE http://ediis.univ-lyon1.fr M. Alain MILLE Secrétariat : I. BUISSON INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE EDISS M. Didier REVEL Insa : M. LAGARDE MATERIAUX DE LYON M. Jean Marc PELLETIER Secrétariat : C. BERNAVON 83.85 MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE Math IF M. Pascal KOIRAN Insa : G. BAYADA MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE MEGA M. Jean Louis GUYADER Secrétariat : M. LABOUNE PM : 71.70 –Fax : 87.12 SCIENCES DES SOCIETES, DE L’ENVIRONNEMENT ET DU DROIT SSED Mme Claude-Isabelle BRELOT Insa : J.Y. TOUSSAINT 3 SOMMAIRE Remerciements _____________________________________________________________ 6 Liste des figures et tableaux___________________________________________________ 8 Abréviations ______________________________________________________________ 11 Résumé __________________________________________________________________ 14 Summary_________________________________________________________________ 15 INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ______________________________________ 16 I Les interactions hôte-pathogène ___________________________________________ 16 IA IB Définir un pathogène ____________________________________________________________ Les facteurs de virulence : acteurs moléculaires de la pathogénie __________________________ I.B.1 Les facteurs de virulence précoces _____________________________________________ I.B.1.1 La mobilité __________________________________________________________ I.B.1.2 L’adhérence _________________________________________________________ I.B.1.2.a Les adhésines ______________________________________________________ I.B.1.2.b Les lipopolysaccharides ______________________________________________ I.B.1.2.c Les exopolysaccharides_______________________________________________ I.B.1.2.d Les flagelles _______________________________________________________ I.B.1.3 Les harpines _________________________________________________________ I.B.2 Les facteurs de propagation __________________________________________________ I.B.2.1 Les enzymes dégradatives des bactéries pathogènes des animaux ________________ I.B.2.2 Les enzymes dégradatives des bactéries phytopathogènes ______________________ I.B.2.3 Les toxines __________________________________________________________ I.B.2.3.a Exotoxines_________________________________________________________ I.B.2.3.b Endotoxines _______________________________________________________ IC Résistance aux systèmes de défenses de l’hôte ________________________________________ I.C.1 Défenses des animaux ______________________________________________________ I.C.2 Réactions de défenses des plantes _____________________________________________ I.C.2.1 La réaction hypersensible, induite par le stress oxydant ________________________ I.C.2.2 Les systèmes de défenses contre le stress oxydant ____________________________ ID Conclusion sur les intéractions hôte-pathogène ________________________________________ II 16 19 21 21 24 24 25 27 27 27 28 28 29 30 30 31 32 32 32 32 35 37 Régulation de l’expression génique chez les procaryotes _______________________ 37 IIA Au niveau de l’initiation de la transcription ________________________________________ II.A.1 L’ARN polymérase est l’élément central de la transcription _________________________ II.A.1.1 L’enzyme core, la partie catalytique de l’ARN polymerase _____________________ II.A.1.2 La région promotrice : à la fois structurée et modulaire ________________________ II.A.1.3 Les étapes de l’initiation de la transcription _________________________________ II.A.2 La régulation de l’initiation de la transcription ___________________________________ II.A.2.1 Les acteurs __________________________________________________________ II.A.2.1.a Les facteurs sigma : acteurs de la reconnaissance des promoteurs _____________ II.A.2.1.a.i La sous-unité sigma (σ) __________________________________________ II.A.2.1.a.ii Les facteurs σ impliqués dans la transcription des gènes de virulence ______ II.A.2.1.a.iii Régulation de l’activité des facteurs sigma __________________________ II.A.2.1.b Les petits ligands ___________________________________________________ II.A.2.1.c Les facteurs de transcription __________________________________________ II.A.2.1.c.i Les activateurs _________________________________________________ II.A.2.1.c.ii Les répresseurs ________________________________________________ II.A.3 La chromatine bactérienne a une organisation dynamique___________________________ II.A.3.1 Les « Nucleoid Associated Proteins » (NAP) ________________________________ II.A.3.1.a Les principales NAP impliquées dans la régulation de la virulence ____________ II.A.3.1.a.i H-NS_________________________________________________________ II.A.3.1.a.ii Fis __________________________________________________________ II.A.3.1.a.iii IHF _________________________________________________________ II.A.3.1.a.iv HU _________________________________________________________ 4 37 37 38 39 41 44 44 44 44 45 47 47 48 49 51 53 56 59 59 61 62 62 II.A.4 Dynamique de régulation ____________________________________________________ II.A.4.1 Un régulateur spécifique couplé à un régulateur général _______________________ II.A.4.2 Connexion entre régulateurs : réseau de régulation génétique ___________________ II.A.4.3 La régulation de la synthèse des facteurs de virulence est un processus complexe. ___ IIB Autres mécanismes de la régulation de la synthèse protéique chez les procaryotes __________ III 63 63 67 68 68 Erwinia chrysanthemi, une bactérie phytopathogène _________________________ 71 IIIA Taxonomie des Erwiniae_______________________________________________________ IIIB Distribution géographique______________________________________________________ IIIC Le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi __________________________________________ III.C.1 Un pouvoir pathogène multifactoriel _________________________________________ III.C.1.1 La paroi végétale et la pectine____________________________________________ III.C.1.2 Les pectinases, facteurs de virulence majeurs chez E. chrysanthemi ______________ III.C.1.2.a Les pectine estérases________________________________________________ III.C.1.2.b Les dépolymérases _________________________________________________ III.C.1.2.c Les endo-pectate lyases : déterminantes dans le pouvoir pathogène ___________ III.C.1.2.d Organisation génétique des pectinases __________________________________ IIID Régulation de la dégradation de la pectine chez Erwinia chrysanthemi ___________________ III.D.1 Inductions par les composés végétaux________________________________________ III.D.1.1 Le répresseur KdgR ___________________________________________________ III.D.1.2 Le régulateur Pir ______________________________________________________ III.D.2 La répression catabolique _________________________________________________ III.D.3 Régulation par diverses conditions physico-chimiques ___________________________ III.D.3.1 Osmolarité___________________________________________________________ III.D.3.2 Température _________________________________________________________ III.D.3.3 pH _________________________________________________________________ III.D.3.4 Carence en fer ________________________________________________________ III.D.3.5 Carence en oxygène et en azote __________________________________________ III.D.4 Les régulateurs répondant à des signaux encore inconnus_________________________ III.D.4.1 PecS _______________________________________________________________ III.D.4.2 PecT _______________________________________________________________ III.D.4.3 H-NS _______________________________________________________________ III.D.5 Régulation en fonction de la phase de croissance _______________________________ III.D.5.1 Sigma S _____________________________________________________________ III.D.5.2 Régulation par la densité cellulaire : le quorum sensing________________________ III.D.6 Modulation de l’expression des gènes de régulateurs : réseau______________________ 71 72 74 75 77 78 80 81 82 84 85 85 85 87 87 88 88 89 89 89 90 90 91 91 92 92 92 93 94 Objectifs de l’étude _________________________________________________________ 97 RESULTATS _____________________________________________________________ 98 I 1er ARTICLE: La protéine associée au nucléoïde Fis coordonne l’expression des principaux gènes de virulence de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. _____ 98 II 2eme ARTICLE : Intégration de deux signaux essentiels modulant la virulence au niveau des promoteurs des gènes pel d’Erwinia chrysanthemi : un rôle pour Fis dans la régulation par le phase de croissance. ____________________________________________ 132 III Résultats non publiés : intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. _ _____________________________________________________________________ 166 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ________________________________________ 174 Références bibliographiques ________________________________________________ 181 5 Remerciements Je remercie Monsieur Carlos Blanco et Monsieur Claude Gutierrez qui ont accepté avec cordialité d’être les rapporteurs de ce travail. J’exprime également tous mes remerciements à Madame Marie-Andrée Mandrand-Berthelot, Monsieur Hafid Abaibou et Monsieur Philippe Lejeune pour avoir accepté d’examiner ce travail. Je tiens à exprimer ma sincère reconnaissance à William Nasser pour son encadrement exemplaire durant cette thèse. Tu m’as donné une formation aussi bien scientifique qu’humaine d’une qualité remarquable. Je n’espérais pas acquérir un tel bagage pour la suite de la route. Bien sur je n’ai pas tout retenu mais peut être j’aurais appris, entre autre, à devenir un peu plus patient… Je tiens à remercier Nicole Hugouvieux-Cotte-Pattat pour m’avoir accueilli dans le laboratoire de Microbiologie, Adaptation et Pathogénie et pour avoir su être disponible pour toutes les questions liées à la vie dans le laboratoire. Mes remerciements vont également à Sylvie Reverchon, notamment pour répondre à certaines questions propres à la thématique « Régulation génique » de l’équipe « Erwinia ». Je remercie chaleureusement Vladimir Shevchik pour sa sympathie et pour nous avoir permis d’utiliser le mutant fliC d’Erwinia chrysanthemi avant publication. La saveur de ces quatre années aurait été bien différente sans la bonne humeur de Guy Condemine. Merci pour les multiples relectures des différents textes et articles, et pour avoir répondu à toutes les questions, aussi bien scientifiques que saugrenues. Je tiens également à remercier Agnès Rodrigue ainsi que Françoise Meier et Corinne Dorel pour les discussions au fil des repas. A mi-parcours de la thèse a eu lieu le comité de pilotage. J’en remercie les membres, Hans Geiselmann, Florence Wisniewski-Dyé, Marie-Andrée Mandrand-Berthelot et William Nasser, qui ont eu un effet significatif sur le bon déroulement de la fin de thèse. En particulier, je tiens à exprimer ma gratitude à Marie-Andrée Mandrand-Berthelot qui a suivi avec gentillesse ce travail. Mes remerciements amicaux vont à Georgi Muskhelishvili, Claudia Burau, Marcel Geertz, Michael Berger, Ramesh Mavathur et Sebastian Maurer de la Jacobs University of Bremen, Allemagne. Outre le matériel biologique fourni tel que la protéine Fis d’Escherichia coli, les discussions scientifiques et les compétences techniques acquises au cours de ce séjour, l’ambiance chaleureuse de l’équipe a fortement contribué au bon déroulement de cette expérience nordique. Ce séjour a été possible grâce aux participations financières de l’IFR41 "Ecologie Génétique Évolution" ainsi que de la Région Rhône-Alpes dans le cadre d’un projet Eurodoc. Je remercie les étudiants du laboratoire, qui, reprenant des phrases incontournables («c’est possible ça?»), ont été de bons collègues: Greg, Albert, Nasrin, Fred, Thierry (comment trouver un bon resto à Naples ?), Yann, Safia, Aleksandra, Claire, Nan, Zhengwei, Mathilde, Camille, Sophie et Camille qui a participé à ce travail. A mon tour de remercier Sandra Castang, l’amie du sud-ouest, pour nos pauses philosophiques. Je remercie également les étudiants du laboratoire d’écologie microbienne : Mickaël, Aymeric, Denis, Joël, Arnault, Hervé, Marina, Sandrine,… 6 Je remercie l’ensemble du personnel technique pour le support précieux fourni mais également pour leur bonne humeur et leurs conversations : Yvette Alfaro, Véronique Utzinger, Jean-Michel Prost, Sonia Diasparra, Christine Berger, Sandra Mebarki, Zagik Mouton-Kosem, Julie Frontier, Camille Villard et Julien Wawrzyniak. Je remercie avec toute ma sympathie Géraldine Effantin qui m’a fait sourire plus d’une fois. Je remercie amicalement Mickaël Boyer entre autre pour nous avoir facilité la normalisation des expériences de RT-PCR quantitative. De même, Francesca Damiola et Laurette Morlé m’ont aidé à débuter dans cette technique. Je suis redevable de Messieurs Falkow et Dorman pour m’avoir fait parvenir rapidement certains articles scientifiques utiles pour la rédaction de ce manuscrit. Ce travail a été facilité par la qualité des services administratifs de l’INSA, évitant ainsi une perte de temps dans le travail de recherche. Je tiens également à souligner le travail précieux effectué par l’Association Bernard Grégory, notamment à travers la formation « Nouveau Chapitre de la Thèse », qui prépare à l’après-thèse. Je remercie également Pauline Lautier pour m’avoir permis de rédiger ce manuscrit dans de bonnes conditions informatiques. Je tiens également à exprimer toute ma reconnaissance au professeur Paul Ritzenthaler de l’université de Toulouse, ainsi que son équipe, en particulier Pascal Lebourgeois, pour m’avoir guidé avec gentillesse et clairvoyance dans ce choix lyonnais. Je remercie l’ensemble de ma famille et belle famille, ainsi que Matthieu et Guillaume pour m’avoir soutenu dans tous les moments et pour me montrer qu’Erwinia n’est pas le seul être vivant. Enfin, Déborah, je t’exprime mon entière reconnaissance, tu es une des personnes ayant le plus contribué à la réussite de ce travail. Merci d’avoir accepté de quitter ton sudouest natal pour participer à mes côtés à cette expérience lyonnaise. 7 Liste des f igures et tableaux Figures et tableaux de la partie bibliographique : Figure 1 : L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues........ 16 Figure 2 : Classification des gènes impliqués dans la virulence. ................................................ 20 Figure 3 : Etapes du processus infectieux en fonction de la phase de croissance....................... 21 Figure 4 : Structure du flagelle bactérien. ................................................................................... 22 Figure 5 : La mobilité par l'actine utilisée par Shigella flexneri à l'intérieur des cellules épithéliales, nommée "rocket motility"........................................................................................ 23 Figure 6 : La structure du LPS. ................................................................................................... 26 Figure 7 : Réponse hypersensible élicitée par E. chrysanthemi sur feuille de tabac. ................. 33 Figure 8 : Production de composés oxygénés activés lors d’une interaction plante-pathogène compatible ou incompatible. ........................................................................................................ 34 Figure 9 : Structure de l’ARN polymérase et son interaction avec un promoteur. ..................... 39 Figure 10 : Eléments principaux du gène procaryote.................................................................. 39 Figure 11 : Les étapes de l’initiation de la transcription bactérienne. ........................................ 43 Figure 12 : Les différents types d’activateurs transcriptionnels. ................................................ 50 Figure 13 : Les différents types de répresseurs transcriptionnels. .............................................. 52 Figure 14 : Schéma illustrant l’effet de l’organisation spatiale du chromosome sur l’expression génique..................................................................................................................... 54 Figure 15 : Effet du niveau du surenroulement de l’ADN sur l’expression des gènes. .............. 55 Figure 16 : Concentrations cellulaires des protéines H-NS, Fis, HU et IHF au cours des différentes phases de la croissance bactérienne. .......................................................................... 59 Figure 17 : Mode d’action du répresseur H-NS et de l’activateur Fis en fonction de la température sur l’expression du gène virF chez les souches d’Escherichia coli entéroinvasives. ............................................................................................................................ 60 Figure 18 : Les mécanismes de régualtions mettant en jeu plusieurs facteurs de transcriptions.66 Figure 19 : Réseau de régulations entre les régulateurs globaux. ............................................... 67 Figure 20 : Régulation du niveau cellulaire de σS en fonction des stimuli extérieurs chez la bactérie Escherichia coli. ............................................................................................................. 70 Figure 21 : Distribution géographique d’Erwinia chrysanthemi. ............................................... 73 Figure 22 : Symptômes causés par E. chrysanthemi. .................................................................. 74 Figure 23 : La paroi végétale et la structure biochimique de la pectine...................................... 77 Figure 24 : La voie de dégradation et d’assimilation de la pectine............................................. 79 Figure 25 : Production de deux pectine méthyl-estérases et de deux pectine acétyl-estérases ches Erwinia chrysanthemi 3937. ............................................................................................... 80 Figure 26 : Production de dépolymérases chez Erwinia chrysanthemi 3937. ........................... 81 Figure 27 : Rôle des différentes pectinases dans le pouvoir pathogène d’Erwinia sur Saintpaulia. .................................................................................................................................. 83 Figure 28 : Organisation génétique des pectinases. .................................................................... 84 Figure 29 : Réseau de régulation contrôlant l’expression des gènes pel chez Erwinia chrysanthemi. ............................................................................................................................... 95 Tableau 1 : Fréquence d’apparition des nucléotides dans les éléments -35 et -10 du promoteur bactérien. ...................................................................................................................................... 41 Tableau 2 : facteurs sigma alternatifs impliqués dans la virulence............................................. 46 Tableau 3 : Les principales protéines associées au nucléoïde (NAP)......................................... 57 8 Figures et tableaux de la partie résultats : 1er article : Fig. 1. Behaviour of the E. chrysanthemi fis mutant.................................................................... 122 Fig. 2. The induction of pectate lyase activity is delayed in the supernatant of the fis mutant growth medium. ........................................................................................................................... 123 Fig. 3. Expression of the fliC, hrpN, prtC, sapA and cel5 genes in the parental strain and its fis derivative...................................................................................................................................... 124 Fig. 4. Band-shift assay for Fis binding on hrpN, fliC, cel5, sapA, prtC promoter regions. ....... 125 Fig. 5. Fis interacts with the cel5 downstream promoter regions and inhibits transcript elongation. .................................................................................................................................... 126 Fig. 6. Comparison of virulence between E. chrysanthemi 3937 and its various derivatives on chicory leaves and potato tubers. ................................................................................................. 127 Fig. S1.The E. chrysanthemi fis operon. .................................................................................... 128 Fig. S2. Fis specifically interacts with its own regulatory regions and represses transcription initiation by σ70RNAP. ............................................................................................................... 129 Fig. S3. The fis operon and promoter region. .............................................................................. 130 Fig. S4. Growth phase-dependent induction of pectate lyase activity in the culture supernatants of Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). .......................................................... 131 Table 1. Bacterial strains, plasmids, phages and oligonucleotides used in this work. ................ 117-118 2ème article : Fig. 1. Time course induction of pectate lyase activity in the culture supernatants of Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis).......................................................................... 152 Fig. 2. Bacterial-number-dependent expression of pelA::uidA, pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). ................................... 153 Fig. 3. Quantification of the increase in pelD and pelE gene transcript accumulation in the fis background using real-time PCR analysis. .................................................................................. 154 Fig. 4. Band-shift assay for Fis-DNA binding. ........................................................................... 155 Fig. 5. DNase I footprinting of Fis, CRP, KdgR and RNAP binding at the pelB (A), pelD (B) and pelE (C) promoters. ............................................................................................................... 156-158 Fig. 6. Sequence of the pelB, pelD and pelE promoters. ............................................................ 159 Fig. 7. Fis and KdgR prevent transcription initiation at the pelD (A) and pelE (B) promoters. . 160 Fig. 8. Bacterial-number-dependent expression of pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in Erwinia chrysanthemi parental strain and its fis, kdgR and kdgR-fis derivatives. ....................... 161 Fig. 9. Bacterial-number-dependent expression of the Pel SA present both in the supernatants and in the cell pellets in Erwinia chrysanthemi parental strain A350 and its fis derivative A4374. .......................................................................................................................................... 162 Fig. S1. Time course expression of pelA::uidA, pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in Erwinia chrysanthemi strains A350 (ps) and A4374 (fis). .......................................................... 163 Fig. S2. Time course expression of pelB::uidA, pelD::uidA and pelE::uidA in Erwinia chrysanthemi parental strain and its fis, kdgR and kdgR-fis derivatives. ..................................... 164 Fig. S3. Time course expression of the Pel SA present both in the supernatants and in the cell pellets in Erwinia chrysanthemi parental strain A350 and its fis derivative A4374. .................. 165 Table 1. Bacterial strains, plasmids, phages and oligonucleotides used in this work. ................ 148-149 9 Résultats non publiés : Figure R1 : Comparaison par RT-PCR quantitative de l’expression des gènes crp, hns, kdgR, pir, pecT et pecS dans le mutant fis par rapport à la souche parentale à différents stades de la croissance et dans différents milieux de culture (LB ou LB+PGA). ........................................... 167 Figure R2 : Expression des fusions transcriptionnelles kdgR::uidA, crp::uidA et pecT::uidA en fonction de la densité cellulaire dans la souche parentale et dans le mutant fis...................... 168 Figure R3 : Intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. ................................ 169 Figure R4 : Expression de la fusion transcriptionnelle impliquant la région régulatrice du gène fis d’E chrysanthemi.. .......................................................................................................... 171 Figure R5 : Absence de fixation de Fis et de CRP sur la région promotrice du gène crp d’E. chrysanthemi. ............................................................................................................................... 172 Tableau R1 : Souches bactériennes, plasmides et oligonucléotides utilisés dans ce travail....... 173 Figure de la partie discussion perspectives : Figure D1 : Modèle du mécanisme d’action de Fis dans le contrôle de la production de différents types de facteurs de virulence au cours de la croissance bactérienne.......................... 176 Figure D2 : Extraits de surnageants de cultures de la souche parentale et du mutant fis d’E. chrysanthemi analysés sur gel de polyacrylamide. ..................................................................... 177 10 Abréviations A: ABC : Acyl-HSL : ADN : AMPc : Ap : ApR : ARN : ARNm : ATP : bp : BrET: C: C: CFU : Ci : Cm: CmR : CNRS : CP : CRP : CTD : Da : dATP : dCTP : °C : dI-dC : DKI : DKII : DL50 : DMI : DMM : DNA : DOx : DTT : EDTA : EHEC : EIEC : EPS : F: Fis : G: g: GA : GA2 : acide adénylique ATP binding cassette N-acylhomoserine lactone acide désoxyribonucléique adénosine monophosphate cyclique ampicilline ampicillin resistance acide ribonucléique ARN messager adénosine triphosphate paire de bases ethidium bromide acide cytidylique Fis-DNA complexe colony forming units curie chloramphenicol chloramphenicol resistance centre national de la recherche scientifique cell pellet cyclic AMP receptor protein domaine carboxyterminal dalton désoxy adénine tri-phosphate désoxy cytosine tri-phosphate degré Celsius désoxyinosine-désoxycytosine 5-céto-4-désoxyuronate 2,5-dicéto-3-désoxugluconate dose létale 50 dose minimale infectante dose minimale mortelle acide désoxyribonucléique densité optique à x nm dithiothréitol éthylene diamine tétra acetate Escherichia coli entérohémorragique Escherichia coli entéroinvasive exopolysaccharide de surface free DNA factor for inversion stimulation acide guanylique gramme galacturonate digalacturonate 11 GAn : H-NS : HR : HSL : HU : IHF : INSA : IPA : IPTG : kDa : KDG : Km : LB : LEE : LPS : M: MALDI-TOFF : mg : µg : MIC : ml : µl : min : mM : NADPH : NAP : ng : nm : NTD : OD : OEPP : ONP : 3-oxo-C6-HSL : PAGE : PCR : Pel : PGA : pH : pI : Pir : PNP : ppGpp : ps : PSB : pv. : QS : RNA : RNAP : rpm : oligogalacturonides saturés histone-like nucleoid structuring protein réponse hypersensible homosérine lactone heat-unstable nucleoid protein integration host factor institut national des sciences appliquées invasion plasmid antigens isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside kilodalton 2-céto-3-désoxygluconate kanamycine Luria Bertani locus of enterocyte effacement lipopolysaccharide molaire matrix assisted laser desorption ionization - time of flight milligramme microgramme minimal inhibitory concentration millilitre microlitre minute millimolaire nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduit protéines associées au nucléoïde nanogramme nanomolaire domaine aminoterminal optical density organisation européenne et méditerranéenne pour la protection des plantes orthonitrophénol N-(3-oxohexanoyl)-homosérine lactone électrophorèse en gel de polyacrylamide réaction de polymérisation en chaîne pectate lyase polygalacturonate potentiel hydrogène point isoélectrique plant-inducible regulator paranitropnénol guanosine 3′,5′ bisphosphate parental strain poids sec bactérien pathovar quorum sensing acide ribonucléique RNA polymerase rotations par minute 12 RT-PCR : s: SA : SDS : Sm : SN : ssp. : STEC : T: TBS : Tris : U: UCBL : uGA2 : uGAn : UMR : UP : v/v : w/v : reverse transcriptase – polymerase chain reaction seconde specific activity sodium dodécyl sulfate streptomycine supernatant sous-espèce Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines acide thymidylique Tris Buffered Saline Tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane units université Claude Bernard Lyon 1 digalacturonate insaturé oligogalacturonides insaturés unité mixte de recherche upstream element volume to volume weight to volume 13 Résumé Rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la pourriture molle et qui engendre des pertes économiques importantes sur différentes plantes. Une colonisation efficace de l’hôte requiert l’action séquentielle de plusieurs facteurs de virulence. Certains de ces facteurs sont essentiellement requis dans les étapes précoces du processus infectieux tels que la harpine HrpN, le système de détoxification Sap ou les flagelles assurant la mobilité bactérienne. D’autres agissent par contre dans les étapes tardives du processus tels que les enzymes dégradatives. Parmi ces enzymes, les pectate lyases (Pels) jouent un rôle déterminant dans le pouvoir pathogène, en raison de leur capacité à reproduire le symptôme de pourriture molle. La synthèse des facteurs de virulence est finement régulée pour conduire une infection efficace. L’essentiel des travaux de cette thèse a consisté à caractériser le rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez E. chrysanthemi. Un mutant fis présente une synthèse diminuée des facteurs de virulence impliqués dans les étapes précoces de l’infection (flagelles, harpine et système de détoxification). De plus, l’induction de l’activité pectate lyase est retardée et augmente durant la phase stationnaire de croissance dans le mutant fis. Le contrôle exercé par Fis sur l’expression des gènes codant ces facteurs se fait par un mécanisme direct. In planta, le mutant fis présente une virulence atténuée qui serait le résultat de la modification du profil de synthèse des facteurs de virulence. Le mécanisme moléculaire de la régulation exercée par Fis a été étudié plus en détail sur les gènes pel dont l’expression est modulée par un grand nombre de régulateurs (8 sont déjà caractérisés). Une étude intégrative réalisée en adoptant une double approche in vivo et in vitro a montré que Fis réprime directement l’expression des gènes pel au niveau de l’initiation de la transcription. Dans certaines conditions, Fis agit de concert avec KdgR, un autre répresseur essentiel, pour verrouiller l’expression des gènes pel. L’ensemble de ces données met en évidence un rôle pivot de Fis dans la coordination de l’expression des principaux gènes de virulence d’E. chrysanthemi au cours du processus infectieux. MOTS-CLES : Bactérie phytopathogène / Fis / gènes de virulence / régulation de la transcription / Erwinia chrysanthemi. 14 S u m m a ry Role of the nucleoid associated protein Fis in the control of the virulence of the phytopathogenic bacteria Erwinia chrysanthemi. Erwinia chrysanthemi is a soft-rotting Gram-negative bacterium that attacks a wide range of plant species, including many crops of economical importance. Efficient host colonisation requires a sequential action of various virulence factors. Some of these factors are needed in the early steps of the infectious process: the harpin HrpN, the detoxification system Sap or the flagellum, responsible for bacterial motility. Others factors, such as degradative enzymes, act in advanced steps of the infection. Among these enzymes, the pectate lyases (Pels) play a key role in the pathogenicity since, purified, they can reproduce the soft-rot symptoms. Production of these virulence factors is tightly regulated to allow the correct development of the infectious process. The main aim of the investigations of this thesis was to evaluate the role of the nucleoid associated protein Fis in the control of the virulence in the phytopathogenic bacteria Erwinia chrysanthemi. A fis mutant shows a reduced synthesis of the virulence factors involved in the early steps of infection (flagellum, harpin and detoxification system). Moreover, induction of Pel activity is delayed and increased during the stationary growth phase in the fis mutant. Fis regulates the expression of the genes encoding these various factors by a direct mechanism. In planta, the fis mutant has a decreased virulence, which probably results from the modification of appropriate virulence factors synthesis. The molecular mechanism of the Fis action has been studied in more detail on the pel genes, which are regulated by at least eight other regulators. By using in vivo and in vitro integrative studies it appeared that Fis directly represses the pel gene expression at the transcription initiation step. In addition, Fis acts in concert with KdgR, the main repressor responding to the presence of pectin compounds, to shut down the pel gene transcription. Together, these data indicate that Fis plays a pivotal role in the coordination of the expression of the main virulence genes of E. chrysanthemi during pathogenesis. KEY WORDS : phytopathogenic bacteria / Fis / virulence genes / transcription regulation / Erwinia chrysanthemi 15 Introduction bibliographique INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE I Les interactions hôte-pathogène IA Définir un pathogène L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues : neutre (micro-organisme saprophyte), bénéfique pour les deux acteurs (symbiose) ou délétère pour l’un des deux (élimination du micro-organisme ou de l’hôte). (Figure 1). Figure 1 : L’interaction entre un micro-organisme et un hôte conduit à différentes issues (d’après Casadevall et Pirofski, 2000). Historiquement, la définition d’un micro-organisme pathogène, du grec παθογένεια «naissance de la douleur», est basée sur sa capacité à entraîner une maladie chez l’hôte. En 1870, Louis Pasteur identifie le premier microbe responsable d'une maladie infectieuse, la 16 Introduction bibliographique maladie des vers à soie et met fin à la théorie de la génération spontanée en publiant " La théorie des germes " en 1878. En 1882, le médecin allemand Robert Koch, pionnier avec Louis Pasteur de la bactériologie, isole le bacille Mycobacterium tuberculosis, responsable de la tuberculose. Combinée avec les travaux de Pasteur, cette découverte pose les principes de l'asepsie pour éviter la transmission des microbes d'un opéré à l'autre, et prône l'hygiène hospitalière pour éviter les transmissions d'infections entre malades contagieux. En 1883, au cours d'une expédition en Égypte, Koch isole la bactérie Vibrio cholerae, agent responsbale du choléra, avec l'aide de Gaffky et de Bernhard Fischer. Il prouve, peu après, le rôle de l'eau dans la transmission de la maladie. A la suite de ces travaux, Robert Koch établit en 1890 un postulat définissant les caractéristiques d’une bactérie pathogène : 1- Le micro-organisme doit être présent dans chaque cas de la maladie étudiée. 2- Il ne doit pas apparaître dans d’autres maladies ou dans des organismes sains. 3- Après avoir été isolé de l’hôte et cultivé en milieu pur, le micro-organisme doit induire à nouveau la maladie. Toutefois, ce postulat fait apparaître certaines limites. En effet, l’agent pathogène doit pouvoir être cultivé en milieu synthétique, ce qui en exclue les bactéries non cultivables ou les virus. Il ne prend pas en compte le portail d’entrée dans l’hôte, la niche écologique du microorganisme ou la notion de dose infectieuse (Isenberg, 1988). Sur ce dernier point, de nombreuses études ultérieures quantifient le pouvoir pathogène suivant trois données : la Dose Minimale Mortelle (DMM), la Dose Létale 50 (DL50) et la Dose Minimale Infectante (DMI). - La DMM est la dose la plus faible qui tue dans un délai déterminé par un groupe expérimental. - La DL50 est la dose où le nombre d'agents pathogènes est capable de tuer 50% des hôtes d'un groupe expérimental en un temps donné. - La DMI est la dose minimale d'agents pathogènes donnée permettant la contamination et le développement de la maladie. Des progrès spectaculaires ont été réalisés dans les domaines de la microbiologie, de l'immunologie, de la biologie moléculaire, dans l'amélioration des techniques de diagnostic, en épidémiologie. Ces nouvelles avancées ont permis d’affiner le postulat de Koch et mettent 17 Introduction bibliographique en évidence que la définition d’un pathogène est en perpétuel changement et s’adapte aux résultats apportés par les nouveaux outils de la biologie. En 1988, en accord avec ces nouvelles données, Stanley Falkow définit une version moléculaire des trois postulats de Koch : 1- Le phénotype ou la propriété étudiée doit être associé à des membres pathogènes d’un genre ou des souches pathogènes d’une espèce. 2- Isolé par des méthodes moléculaires, l’inactivation spécifique du ou des gènes associés avec le trait de virulence étudié doit conduire à une perte de fonction dans le pathogène qui peut se traduire par une baisse significative du pouvoir pathogène. 3- Le remplacement allélique du gène muté par le gène sauvage doit conduire à la restauration du pouvoir pathogène. Cette nouvelle définition permet d’affiner la compréhension des mécanismes mis en jeu par le pathogène, notamment en recherchant les gènes impliqués dans le pouvoir pathogène. Toutefois, cette définition reste centrée sur le micro-organisme et ne prend en compte que les micro-organismes provoquant une infection sévère. Ainsi en sont exclus les agents possédant un pouvoir pathogène relativement limité comme les pathogènes opportunistes. Casadevall et Pirofski propose en 1999 de définir un pathogène par les dégâts générés chez l’hôte par le pathogène mais aussi par les réactions de défenses de l’hôte. Dans la plupart des interactions entre un pathogène et son hôte, il y a un continuum entre les dommages causés par le pathogène et ceux causés par l’hôte. Ceci conduit à la maladie seulement quand la nature des dommages modifie les fonctions normales de l’hôte. De ce fait, la maladie est une issue complexe qui survient à cause des dommages provoqués par le pathogène (par exemple les pathogènes induisant la nécrose des cellules) et/ou à cause des dommages induits par l’hôte (par exemple une réponse immunitaire aberrante). Ainsi, Streptococcus pneumoniae s’établit dans les tissus pulmonaires sans induire une nécrose des cellules de l’hôte, mais cela peut conduire à une intense réaction inflammatoire. De même, Staphylococcus aureus induit une nécrose des tissus et stimule la réponse inflammatoire de l’hôte. Au contraire, Mycobacterium tuberculosis provoque une forte réponse immunitaire de l’hôte qui entraîne une sévère inflammation aboutissant à des dommages dans les tissus de l’hôte. Définir un micro-organisme pathogène en terme de dommages induits chez l’hôte permet d’inclure de nombreux paramètres qui affectent la relation hôte-pathogène. De ce point de vue, la pathogénie est la cause du pathogène mais est modulée par la résistance de l’hôte (Casadevall et Pirofski, 2000). 18 Introduction bibliographique L’ensemble de ces données met en évidence la difficulté de trouver une définition interdisciplinaire d’un pathogène. Dans ce travail, un pathogène est considéré comme un micro-organisme dont la survie dépend de sa capacité à se multiplier et à persister sur ou dans d’autres espèces en franchissant ou en détruisant la barrière cellulaire de l’hôte qui empêche normalement le passage d’autres micro-organismes. IB Les facteurs de virulence : acteurs moléculaires de la pathogénie La mise en place d’un processus infectieux, régie par différentes étapes clefs, permet parfois au micro-organisme de réussir à infecter son hôte. Il doit pouvoir survivre dans l’hôte, s’y multiplier et y causer des dommages. Pour ce faire, il doit être compétitif vis à vis des bactéries commensales, neutraliser les mécanismes de défense de l’hôte et y assurer sa propagation. Une partie de ces propriétés est conférée par les facteurs de virulence. Définir les gènes codant ces facteurs reste un problème délicat (Figure 2) (Wassenaar et Gaastra, 2001). Dans ce travail, le terme de gène de virulence sera utilisé pour les gènes codant des facteurs indispensables à la colonisation de l’hôte par le pathogène. 19 Introduction bibliographique Les gènes de virulence vrais codent des facteurs ou des enzymes produisant des facteurs qui sont: -impliqués dans les interactions avec l’hôte -directement responsables des dommages au cours de l’infection -absent dans les souches avirulentes Gènes de virulence vrais Les gènes associés à la virulence codent des facteurs ou des enzymes synthétisant des produits qui: -régulent l’expression des gènes de virulence -ou activent les facteurs de virulence par modification conformationnelle ou sécrétion -ou sont requis pour l’activité des facteurs de virulence vrais Gènes associés à la virulence Gènes de survie au cours de l’infection Gènes restants Les gènes de survie au cours de l’infection codent des facteurs ou des enzymes produisant des facteurs qui: -permettent la colonisation de l’hôte -ou permettent d’échapper au système immunitaire de l’hôte -ou permettent la survie intracellulaire -ou utilisent des facteurs de l’hôte pour survivre Figure 2: Classification des gènes impliqués dans la virulence (Lautier et Nasser, 2005 adapté de Wassenaar et Gaastra, 2001). Le nombre de gènes de virulence et de gènes associés à la virulence est représenté par des cercles concentriques. La limite entre les cercles n’est pas toujours bien établie. L’infection peut être considérée comme un processus où le passage à l’étape suivante est globalement régi par la phase de croissance (Figure 3). La première étape du processus infectieux consiste généralement à l’adhésion du pathogène à l’hôte et débute durant la phase de latence, qui est un temps d’adaptation à ce nouvel environnement. En conditions favorables, la croissance bactérienne devient exponentielle, conduisant au deuxième niveau de 20 Introduction bibliographique l’infection appelé phase de multiplication. Lorsqu’elles sont en quantité suffisamment importante pour arriver à conduire une attaque brusque et forte des cellules de l’hôte, les bactéries synthétisent massivement leurs facteurs de propagation permettant une invasion de l’hôte. Cette étape a lieu généralement lorsque le pathogène est en phase exponentielle avancée ou en phase stationnaire de croissance, durant laquelle la bactérie est plus résistante à un environnement défavorable. Processus infectieux Facteurs de virulence adhésion multiplication précoces invasion tardifs Densité cellulaire Phase de latence Phase exponentielle Croissance Phase stationnaire Figure 3: Etapes du processus infectieux en fonction de la phase de croissance (Lautier et Nasser, 2005). I.B.1 Les facteurs de virulence précoces Ils interviennent au début du processus infectieux et permettent aux micro-organismes de rejoindre la zone cible de l’hôte, de s’y établir pour s’y multiplier. I.B.1.1 La mobilité La mobilité est supposée être une très ancienne caractéristique des bactéries. Elle est intimement liée au chimiotactisme, la capacité de s’orienter dans certains gradients chimiques. La combinaison de la mobilité et du chimiotactisme permet aux bactéries de détecter et rejoindre leurs niches écologiques préférées. 21 Introduction bibliographique Le mode de locomotion le plus connu met en jeu un organe rotatif spécialisé, le flagelle (Figure 4). Il est constitué de trois parties (Aizawa et al., 2000 ; Macnab, 1999): - Le filament flagellaire : c'est la plus longue et la plus évidente, elle s'étend depuis la surface cellulaire : c'est cette partie qui est mise en évidence lors de colorations et observation en microscopie optique. C'est un cylindre creux et rigide constitué de nombreux monomères d'une seule protéine : la flagelline. Il existe cependant des flagelles complexes, composés de plusieurs protéines distinctes. Ces monomères semblent dans tous les cas emprunter le canal central pour être finalement assemblés à l'extrémité distale. - Le crochet : d'un diamètre supérieur au filament, il est situé au niveau de la surface cellulaire. Il fait la liaison entre le corps basal et le filament flagellaire. Son rôle est de transmettre le mouvement du corps basal au filament. - Le corps basal : il est enfoui dans la cellule et sa structure diffère des bactéries Gram négatives et Gram positives. On peut le définir comme une tige centrale insérée dans un système d'anneaux, l’ensemble étant inséré dans la membrane plasmique et la paroi. Cette partie du flagelle est reliée à une cascade de transduction du signal répondant au chimiotactisme. Figure 4 : Structure du flagelle bactérien. Dans le cas des bactéries pathogènes, la nécessité d’organes de mobilité varie selon le mode de colonisation du micro-organisme : - comme précédemment indiqué, la mobilité est nécessaire dans les phases précoces de l’infection : elle permet à la bactérie de rejoindre sa niche écologique pour y adhérer. Ainsi, 22 Introduction bibliographique les Escherichia coli pathogènes STEC doivent être mobiles pour rejoindre les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale de l’homme. Une fois leur cible atteinte, elles perdent leur mobilité en créant des attachements intimes avec les cellules intestinales. - la mobilité est nécessaire pour établir et maintenir l’infection. C’est le cas de Legionella pneumophila qui colonise les macrophages humains (Dietrich et al., 2001). Une fois dans le macrophage, la bactérie perd sa mobilité jusqu’à ce que la cellule hôte lyse. A ce stade, la synthèse des flagelles est de nouveau activée pour permettre d’infecter une autre cellule. Un exemple original est la mobilité par l'actine utilisée par Shigella flexneri à l'intérieur des cellules épithéliales, nommée "rocket motility" (Figure 5). Après la pénétration dans l’hôte, la bactérie se libère de la vacuole phagocytaire et induit ensuite la formation de filaments d'actine qui la propulseront vers une cellule adjacente. La formation de filaments d'actine requiert la participation de protéines bactériennes comme IcsA et le recrutement de la vinculine et de l'actine (éléments du cytosquelette de la cellule eucaryote); la vinculine se lie à IcsA et initie la polymérisation de l'actine. Figure 5 : La mobilité par l'actine utilisée par Shigella flexneri à l'intérieur des cellules épithéliales, nommée "rocket motility". A. Représentation de l’invasion des cellules épithéliales par la bactérie. B. Schématisation de la polymérisation de l’actine au niveau de la bactérie. Chez les bactéries phytopathogènes, l’implication de la mobilité dans le pouvoir pathogène a été relativement bien étudiée chez Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie produit des flagelles disposés de façon circulaire à une extrémité de la cellule en forme de bacille. Trois gènes, flaA, flaB et flaC sont impliqués dans la synthèse des flagelles (Chesnokova et al., 1997), déterminants dans le pouvoir pathogène de cette bactérie. Dans le 23 Introduction bibliographique cas de la bactérie phytopathogène Erwinia carotovora, des mutants non mobiles présentent une virulence atténuée (Mulholand et al., 1993 ; Pirhonen et al., 1991). Ces souches sont mutées au niveau des gènes mop codant des protéines homologues aux protéines d’assemblage et de sécrétion des flagelles chez Salmonella, Bacillus, Shigella, Yersinia et Pseudomonas. L’apport en trans de ces gènes sauvages restaure à la fois la mobilité bactérienne et la virulence. L’existence de flagelles permettrait à la bactérie de se déplacer dans le sol à la recherche d’une plante hôte et d’y pénétrer par des ouvertures naturelles ou des blessures. Ainsi, les flagelles auraient un rôle non négligeable dans le pouvoir pathogène des Erwinia. I.B.1.2 L’adhérence Adhérer à l’hôte est indispensable pour le micro-organisme afin de s’y implanter (Finlay et Falkow, 1997). La charge électrostatique négative présente à la surface du microorganisme et des cellules de l’hôte provoque une répulsion électrostatique, qui empêche la formation de liaisons faibles ou aspécifiques. De ce fait, l’adhésion bactérienne requiert des interactions fortes et hautement spécifiques entre un ligand moléculaire situé sur la surface du pathogène et le récepteur correspondant présent sur la surface de la cellule hôte. La nature de ces facteurs conditionnent la spécificité (espèces cibles plus ou moins nombreuses) et le tropisme (tissus cibles plus ou moins nombreux). I.B.1.2.a Les adhésines Les adhésines bactériennes sont les structures principales d’adhésion du pathogène à d'autres cellules. Le terme adhésine définit un ligand produit par le micro-organisme qui se lie spécifiquement à un récepteur de la cellule hôte (Nougayrède et al., 2003). Pour être qualifié d’adhésine, le produit microbien doit remplir certains critères. La molécule purifiée doit se lier de façon stable et saturable à la cellule hôte (ou aux produits extracellulaires). La spécificité est déterminée en montrant qu’un excès de ligand non marqué inhibe la fixation de ligands marqués. Le caractère saturant de la fixation montre qu’il existe un nombre fini de récepteurs qui lient le ligand. La constance de liaison pour cette interaction doit se situer dans une gamme biologique plausible. Les bactéries utilisent comme adhésine une grande variété de structures de surface. La plupart des pili des bactéries gram négatif fonctionne comme des 24 Introduction bibliographique adhésines, mais dans beaucoup de cas, c'est une sous unité protéique mineure à l’extrémité des fimbriae qui est l'adhésine réelle. Chez les bactéries gram positives, une protéine ou un polysaccharide de surface sert d'adhésine spécifique. Les Escherichia coli entéropathogéniques ou entérohémoragiques sont des pathogènes humains responsables d’un taux de morbidité et de mortalité élevé chez les enfants des pays en voie de développement. Ces pathogènes extracellulaires adhèrent aux cellules de l’épithélium intestinal de l’hôte, induisant la formation d’un piédestal riche en actine (Kenny et al., 2002). La formation de ce piédestal requiert l’intimine, une adhésine dont le gène est porté sur le chromosome bactérien (Jerse et al., 1990 ; Donnenberg et al., 1993). Dans ce couple adhésine-récepteur, le récepteur, nommé Tir, a la particularité d’être une molécule bactérienne. Tir est une protéine effectrice du système de sécrétion de type III, qui une fois transloquée dans le cytosol, s’insère dans la membrane de la cellule eucaryote pour remplir son rôle de récepteur (Kenny et al., 1997). Cet exemple met en évidence le caractère déterminant de la spécificité adhésine-récepteur. Pour les bactéries phytopathogènes, les mécanismes impliquant des adhésines sont moins bien connus. Toutefois, dans le cas de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, l’adhésion aux tissus végétaux nécessite principalement une adhésine calcium dépendante (Smit et al., 1992) ainsi qu’un ensemble de protéines codées par les gènes du locus att (attachement) (Matthysse et al., 1996, 1998, 2000). Un autre exemple concerne la bactérie Erwinia chrysanthemi EC16, qui provoque une nécrose chez différentes plantes hôtes. Elle possède un gène hecA codant une adhésine de 3850 acides aminés appartenant à la famille des hémagglutinine filamenteuse de Bordetella pertussis (Rojas et al., 2002). Les auteurs ont montré qu’une souche mutée dans le gène hecA présente une virulence atténuée sur des plantules de Nicotiana clevelandii, infectées sans blessures. De plus, les Erwinae produisent des pili qui leur permettraient d’adhérer à la surface des cellules végétales. En effet, l’addition d’anticorps anti-piline inhibe la fixation des bactéries sur les racines des plantes (Haahtela et al., 1985). I.B.1.2.b Les lipopolysaccharides Les lipopolysaccharides (LPS) sont des complexes macromoléculaires présents de manière constitutive dans la membrane externe de toutes les bactéries à Gram négatif. Sur le 25 Introduction bibliographique plan structural, les LPS sont constitués d'un lipide A et d'une partie polysaccharidique débordant de la membrane externe (Figure 6). Figure 6 : La structure du LPS. Le lipide A est doué de propriétés toxiques et il correspond à l'endotoxine des bactéries à Gram négatif. La fraction polysaccharidique constitue l'antigène O et est responsable de la spécificité antigénique O permettant de décrire des sérovars au sein d'une même espèce bactérienne. Les lipopolysaccharides (LPS) jouent également un rôle dans l’adhérence, notamment chez Agrobacterium tumefaciens (Reuhs et al., 1997). D’autres études mettent en évidence le rôle du LPS dans l’adhérence de Vibrio cholerae. En effet, un mutant dans le gène rfp, essentiel pour la synthèse des LPS, présente une colonisation de l’hôte mille fois plus faible par rapport à la souche parentale (Merrell et al., 2002). Chez Erwinia carotovora subsp. atroseptica, un mutant altéré dans la synthèse de LPS présente une virulence diminuée (Toth et al., 1999). Il est proposé que ces composés de la surface membranaire pourraient être impliqués dans les phénomènes de reconnaissance entre la plante et la bactérie. 26 Introduction bibliographique I.B.1.2.c Les exopolysaccharides Les exopolysaccharides (EPS) forment une capsule mucoïde protectrice autour de la cellule bactérienne. La production de ces EPS est souvent liée à la virulence de différents pathogènes (Agrobacterium, Erwinia, Pseudomonas,…). Au cours de l’infection, ces EPS, grâce à leurs propriétés anioniques et hydrophiles, fournissent un avantage sélectif à la bactérie qui les produit (Sutherland, 1988). En effet, ils permettent de maintenir une forte hydratation de la zone colonisée et/ou de séquestrer les molécules toxiques en général chargées positivement. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, ils interviennent dans la pathogénèse, en obstruant probablement les vaisseaux du xylème. L’étude de l’infection de plants de Saintpaulia par des mutants d’E. chrysanthemi ne synthétisant pas d’EPS a montré que le développement des symptômes était retardé et que le stade de macération systémique n’était jamais atteint (Condemine et al., 1999). I.B.1.2.d Les flagelles Outre leurs rôles dans la mobilité, les flagelles peuvent également servir d’appendices adhésifs au début de la phase de colonisation de l’hôte. Dans ce cas, ils perdent leur fonction de mobilité puisqu’ils deviennent attachés (Josenhans et Suerbaum, 2002). La structure classique du filament flagellaire est composé de deux protéines : FliC, constituant majoritaire, et FliD, constituant la coiffe du flagelle dans la partie distale. Ainsi, il a été mis en évidence le rôle de FliD dans l’adhésion de Pseudomonas aeruginosa lors de trachéites (Arora et al., 1998). Les flagelles apparaissent donc comme une structure assurant la mobilité de la bactérie mais également comme acteurs des premières étapes de l’adhésion. I.B.1.3 Les harpines Les harpines sont des protéines thermostables sécrétées dans le milieu extérieur par les bactéries phytopathogènes. Le mode d’action des harpines reste à clarifier, toutefois, il a été montré que la présence de harpine perturbe les échanges ioniques des cellules végétales avec le milieu extérieur (El-Maarouf et al., 2001 ; Popham et al., 1995) et provoque l’inhibition rapide de la synthèse d’ATP (Xie et Chen, 2000). Celà conduit à une alcalinisation du milieu intercellulaire initialement acide, modification bénéfique à la bactérie pathogène (Hoyos et 27 Introduction bibliographique al., 1996 ; Popham et al., 1995). Il a également été observé une inhibition des pompes à protons ATP dépendantes, entraînant une dépolarisation de la membrane (Pike et al., 1998). Les mécanismes conduisant ensuite à la mort de la cellule eucaryote reste inconnus. Cependant, la harpine HrpZ de Pseudomonas syringae ssp phaseolicola forme in vitro un pore dans une bicouche lipidique, permettant le passage sélectif de cations (Lee et al., 2001). Ce pore pourrait favoriser l’invasion du pathogène en provoquant une sortie de nutriments dans le milieu intercellulaire et en facilitant l’entrée de facteurs de virulence à l’intérieur de la cellule végétale. I.B.2 Les facteurs de propagation Pour réussir à infecter son hôte, le pathogène doit passer la barrière extérieure de la cellule eucaryote (Herron et al., 2000). Dans le cas des cellules végétales, cette barrière est essentiellement composée de polysaccharides alors que pour les cellules animales, elle est constituée de lipides. Une fois que le micro-organisme pathogène a rejoint la partie de l’hôte propice à une infection, et lorsque les conditions environnementales sont favorables, il va produire les facteurs de propagation. Ces derniers permettent la multiplication et la colonisation de l’hôte. Il existe un grand de nombre facteurs de virulence, impliqués dans la colonisation de l'hôte. I.B.2.1 Les enzymes dégradatives des bactéries pathogènes des animaux Les bactéries pathogènes sont capables de produire un certain nombre d'enzymes extracellulaires permettant d’envahir les tissus de l’hôte : - les hyaluronidases sont des enzymes qui favorisent la dissémination des bactéries dans les tissus en dégradant l'acide hyaluronique du tissu conjonctif; - les fibrinolysines dissolvent les caillots de fibrine que l'hôte constitue souvent pour contenir localement les micro-organismes invasifs et empêcher leur dissémination; - les protéases, les nucléases et les lipases sont toutes des enzymes qui augmentent l'invasivité bactérienne en dégradant des protéines, des acides nucléiques ou des lipides; - les hémolysines sont des protéines toxiques extracellulaires capables d'attaquer les membranes de différentes cellules, dont celles des globules rouges, et de provoquer par là leur lyse; 28 Introduction bibliographique - les leucocidines sont capables de lyser les polynucléaires, ce qui entraîne l'affaiblissement de la résistance de l'hôte. L’arsenal enzymatique bactérien serait donc déterminant dans l’adaptation du pathogène à l’hôte au cours du processus infectieux. Ainsi, Pseudomonas aeruginosa produit une batterie d’enzyme dégradative comme les élastases LasA et LasB qui dégradent l'élastine, un composant de tissu pulmonaire. Ces deux enzymes inactivent aussi de nombreuses protéines telles que les immunoglobulines (IgA et IgG) (Heck et al., 1990). I.B.2.2 Les enzymes dégradatives des bactéries phytopathogènes L’obstacle essentiel pour les bactéries phytopathogènes est la paroi des cellules végétales, dite paroi pectocellulosique. Elle est constituée de deux matrices de polysaccharides : le réseau de pectine et le réseau de cellulose-hémicellulose : La cellulose est constituée de monomères de glucose liés entre eux par des liaisons β 1-4, conduisant à des polymères linéaires. Ces polymères s'associent entre eux par des liaisons intermoléculaires de type liaisons hydrogène, conférant ainsi une structure fibrillaire à la cellulose. L'hémicellulose est faite de monomères glucidiques. Par rapport à la cellulose, l'hémicellulose ne contient pas que des glucoses anhydres. Par exemple, en plus du glucose, les monomères de l'hémicellulose peuvent être du xylose, du mannose, du galactose, du rhamnose, ou de l'arabinose. La pectine est un polymère de polysaccharides acides. La chaîne principale est composée d'acide galacturonique lié en α1-4. Régulièrement entre ces monomères s'intercalent des molécules de rhamnoses par des liaisons 1-2 et 1-4. Ce type de liaison entre les molécules d'acide uronique et de rhamnose forme des coudes. La macromolécule de pectine ressemble à un zigzag. Cet agencement donne des propriétés particulières aux pectines. Pour compléter la composition chimique des pectines il faut préciser qu'il existe des ramifications au niveau des acides uroniques comme au niveau du rhamnose par des molécules (ex galactane, arabinane etc…). Cette grande hétérogénéité fait que l'on doit plutôt parler des pectines que de la pectine. 29 Introduction bibliographique Cette prévalence de polysaccharides conduit la plupart des phytopathogènes à produire un arsenal de saccharidases comme principal système d’attaque. Ainsi les Erwiniae pectinolytiques synthétisent des enzymes qui dégradent les polymères des parois végétales (Barras et al., 1994 ; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). Les plus importantes sont les pectinases, qui permettent la dégradation et l'assimilation de la pectine. De nombreuses pectinases ont été caractérisées chez E. chrysanthemi 3937 et seront détaillées par la suite. E. chrysanthemi 3937 synthétise également deux cellulases, la cellulase périplasmique CelY (EGY) et la cellulase extracellulaire Cel5 (EGZ), qui ont une action synergique sur la cellulose (Boyer et al., 1987; Zhou et Ingram, 2000). La faible incidence des mutations cel sur la virulence malgré l’importance quantitative de la cellulose dans la paroi primaire végétale suggère un rôle mineur des cellulases dans la pathogénicité (Boccara et al., 1988). D'autres enzymes dégradatives sécrétées par E. chrysanthemi ont été caractérisées dans différentes souches, dont une endoxylanases chez E. chrysanthemi D1 (Keen et al., 1996; Hurlbert et Preston, 2001) et plusieurs protéases (Wandersman et al., 1990 ; résultats non publiés). I.B.2.3 Les toxines A côté des facteurs extracellulaires qui favorisent l'invasivité, les bactéries peuvent produire des toxines qui sont responsables de symptômes ou même de certains syndromes associés à l'infection: les exotoxines et les endotoxines. Ces facteurs n’ayant été pour l’essentiel été étudiés que chez les pathogènes d’animaux, nous n’en ferons qu’une présentation succincte. I.B.2.3.a Exotoxines Les exotoxines bactériennes présentent en général une structure comportant un domaine A (activité) et un domaine B ("binding", liaison au récepteur). Le domaine B est responsable de l'introduction du domaine A dans le cytoplasme de la cellule eucaryotique à travers sa membrane. Le cas décrit porte sur Vibrio cholerae (Spangler, 1992). La toxine produite a pour cible les entérocytes, c’est-à-dire les cellules de l'épithélium intestinal dont la principale fonction est l'absorption des produits de la digestion. Les vibrions cholériques ne pénètrent 30 Introduction bibliographique pas dans les tissus : ils restent à la surface des entérocytes auxquels ils adhèrent et sur lesquels ils se multiplient. La toxine diffuse localement et dérègle les fonctions cellulaires en stimulant l'activité de l'adénylate cyclase. Située principalement dans la membrane cytoplasmique, l'adénylate cyclase joue un rôle prépondérant dans le contrôle des échanges cellulaires assurés par les entérocytes. Ces échanges sont gravement perturbés par l'adénylate cyclase que contient la toxine bactérienne. Quand cette adénylate cyclase bactérienne pénètre dans les entérocytes, elle se substitue à l'adénylate cyclase cellulaire. Sous son action, les mécanismes de régulation cellulaire sont détruits. Non seulement les liquides et les éléments nutritifs ne peuvent plus traverser les entérocytes pour gagner le système circulatoire mais les cellules laissent fuir l'eau et les électrolytes corporels vers l'intestin. Cette fuite liquidienne grave, irrépressible tant que la toxine n'a pas été neutralisée, entraîne l'acidose et la déshydratation. A son tour la déshydratation mène à la diminution du volume sanguin (hypovolémie), à la réduction du débit cardiaque et au ralentissement des fonctions rénales. Un malade souffrant du choléra peut perdre 15 à 20 litres de liquide par jour. I.B.2.3.b Endotoxines L'endotoxine des bactéries à gram négatif fait partie de leur paroi et est constituée par les lipopolysaccharides de la membrane externe. Elle est relâchée en grande quantité lors de la lyse cellulaire. Sa toxicité est variable et dépend en particulier de sa composition chimique qui est fonction de l'espèce bactérienne. Le lipide A, constituant du LPS, est généralement composé d'une ossature de glucosamine portant des chaînes aliphatiques: il est responsable de la toxicité de la molécule. Du point de vue fonctionnel, une partie saccharidique, même très limitée, est indispensable car elle assure la solubilité du lipide A. Au cours des septicémies, la lyse bactérienne peut être à l'origine d'un choc endotoxinique via une libération massive de lipopolysaccharides. Le LPS se fixe à une protéine sérique, la LBP (LPS binding protein). Le complexe LBP+LPS est reconnu à la surface des macrophages par le CD14 et le TLR-4. Ceci va activer un facteur transcriptionnel cellulaire NF-kB, qui induit la production massive de très nombreux gènes impliqués dans l’inflammation. 31 Introduction bibliographique IC Résistance aux systèmes de défenses de l’hôte En permanence, les organismes vivants sont susceptibles d’être en contact avec des micro-organismes pathogènes. Ils ont développé des mécanismes de défense pour lutter contre ces agents infectieux. Ces mécanismes de défense sont tout d'abord physiques comme par exemple les épithélia ou la cuticule chez les insectes, la paroi pectocellulosique des plantes. I.C.1 Défenses des animaux Chez les animaux, il existe surtout une réponse immunitaire qui repose sur des cellules de la lignée sanguine qui vont par exemple sécréter des molécules inflammatoires ou cytokines, des molécules toxiques et phagocyter les pathogènes. Chez les vertébrés, on distingue classiquement deux types de réponse, une réponse immédiate dite innée et une réponse dite adaptative ou spécifique. La réponse immunitaire innée est un système de défense ancien présent dans la majorité des métazoaires comme chez les insectes dont la drosophile et chez l’homme. C’est une réponse efficace aux infections qui repose notamment sur la reconnaissance de motifs microbiens, sur la sécrétion d'agents microbicides à spectre d'activité plus ou moins large ainsi que sur la phagocytose des pathogènes. De plus, chez les vertébrés, la réponse immunitaire innée est nécessaire à l'activation de la réponse immunitaire adaptative. L'immunité adaptative dépend de l'activation des lymphocytes et de la synthèse par les lymphocytes B d'immunoglobulines ou anticorps capables de reconnaître des antigènes précis et qui sont nécessaires à l'élimination du pathogène. I.C.2 I.C.2.1 Réactions de défenses des plantes La réaction hypersensible, induite par le stress oxydant Dans les cas des bactéries phytopathogènes, l’apparition de la maladie résulte de l’infection par le pathogène d’une plante dite hôte au cours d’une réaction dite compatible. Par contre, si une bactérie pathogène attaque une plante non hôte au cours d’une réaction incompatible, celle-ci met en place un système de résistance très efficace appelé réaction hypersensible. Cette réaction aboutit au confinement du pathogène au site de l’attaque et en sa 32 Introduction bibliographique neutralisation. La mise en place de la réaction incompatible est déterminée au niveau génétique par une réaction dite « gène pour gène », avec les gènes d’avirulence avr chez la bactérie et les gènes R de résistance chez la plante. La présence d’un gène avr chez le pathogène induit une réponse hypersensible si la plante infectée porte le gène R correspondant (Staskawicz et al., 1995). Dans le cas d’E. chrysanthemi qui possède un arsenal d’enzymes dégradatives, l’infection est si brutale que la plante n’a pas le temps de mettre en place une réponse hypersensible. Cependant, si la souche utilisée est mutée pour les principales pectate lyases (PelABCE), participant à la dégradation de la paroi végétale, alors la plante met en place une réponse hypersensible qui conduit à une nécrose localisée au site d’infection (Figure 7). Cette réaction hypersensible de la plante serait liée à la production de la harpine HrpN. En effet, une souche ne produisant ni les cinq Pels majeures, ni HrpN, perd sa capacité d’induire la réaction hypersensible. Ainsi, dans la souche parentale l’effet de la harpine HrpN serait masqué par l’action des cinq Pels majeures. Figure 7 : Réponse hypersensible élicitée par E. chrysanthemi sur feuille de tabac (Bauer et al., 1995). La feuille de tabac a été photographiée 24h après l’infection. Les souches d’E. chrysanthemi qui ont été utilisées dérivent de la souche parentale EC16 : 1, ∆pelABCE ; 2, 5, ∆pelABCE hrpN - ; 3, 6, ∆pelABCE hrpN - complémentée en trans par hrpN. 4: témoin négatif, inoculation avec du tampon ne contenant pas de bactéries. 33 Introduction bibliographique Parmi les mécanismes impliqués dans une interaction compatible ou non entre la plante et le pathogène, la cinétique de la genèse d’un stress oxydant est primordiale (Mehdy, 1994). Un parallèle peut être fait avec le stress oxydant observé lors de la phagocytose de pathogènes par les macrophages chez les mammifères (Babior, 1992). Dès la première heure suivant l’infection, les cellules végétales émettent transitoirement une première vague de radicaux oxygénés activés tels que les peroxydes (H2O2), des radicaux hydroxyles (OH·) ou des ions superoxydes O2- : c’est la réponse primaire aspécifique. Dans le cas d’une interaction incompatible, cette réponse aspécifique est suivie au bout de 3 à 6 heures d’une réponse secondaire spécifique consistant en une deuxième vague Radicaux oxygénés activés oxydative plus importante et plus soutenue (Figure 8). Incompatible I II Compatible 0 2 4 Temps après l’infection (heures) 6 Figure 8 : Production de composés oxygénés activés lors d’une interaction plantepathogène compatible ou incompatible. La production biphasique de composés oxygénés activés est caractéristique d’une réaction incompatible. Dans le cas d’une réaction compatible, seule la première phase oxydative a lieu. Ces radicaux oxygénés proviennent du détournement du flux électronique de la respiration vers une oxydase de la membrane cellulaire végétale (Mehdy, 1994). Ce stress oxydant provoque la mort des cellules végétales proches du site infectieux mais permet aussi 34 Introduction bibliographique d’activer la synthèse de lignine ainsi que de catalyser le pontage intermoléculaire des protéines riches en proline ou en hydroxyproline de la paroi végétale (Bradley et al., 1992). Cette condensation de la paroi la rend plus résistante à l’action des enzymes lytiques du pathogène et gène sa progression dans les tissus végétaux (Brisson et al., 1994). La lyse des cellules végétales par le stress oxydant ou par l’action des enzymes lytiques du pathogène aboutit à la libération de fragments de paroi végétale. Ces fragments oligosaccharidiques contribuent à l’activation des réactions de défense de la plante en stimulant notamment la synthèse de peroxydes (Hahn et al., 1993). Enfin, ces radicaux oxygénés participent à la peroxydation des lipides membranaires des cellules végétales lysées, qui génère des composés à activité biostatique ou antibiotique (Keppler et Baker, 1989 ; Peng et Kuc, 1992). Parmi ces composés, le jasmonate, produit de la peroxydation du linoléate, serait impliqué dans la protection des cellules végétales saines, proches du site d’infection, des composés oxygénés toxiques. Ceci permettrait de confiner la réaction hypersensible au site d’infection. Enfin, la réponse hypersensible aboutit à la production par les cellules végétales d’un pic d’acide salicylique, responsable de l’induction de l’expression de gènes codant des protéines liées à la pathogenèse (Delaney et al., 1994). Parmi ces protéines, on trouve des enzymes pouvant dégrader la paroi du pathogène (chitinases, glucanases). Par ailleurs, l’acide salicylique s’est révélé être un bon inhibiteur des pectate lyases produites par E. chrysanthemi (Tardy et al. 1997). I.C.2.2 Les systèmes de défenses contre le stress oxydant Les ions superoxydes ainsi que tout radical oxygéné activé sont des métabolites très toxiques attaquant l’ADN ainsi que toutes les enzymes du métabolisme cellulaire impliquées dans des fonctions d’oxydoréduction (Farr et al., 1986). En initiant la peroxydation des lipides, ils peuvent également entraîner de graves lésions au niveau des membranes et mettre ainsi en danger l’intégrité cellulaire (Storz et Imlay, 1999). Les bactéries ont donc développé des systèmes leur permettant de se protéger de l’action des agents oxydants. Plusieurs de ces systèmes sont bien caractérisés chez E. coli et également chez E. chrysanthemi. Le cas du régulateur OxyR a été bien décrit. OxyR est un facteur de transcription répondant spécifiquement à la présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2). En présence de peroxyde d’hydrogène, cette protéine tétramérique subit une oxydation conduisant à la formation de ponts disulfures intramoléculaires. Sous forme oxydée, OxyR active l’expression des gènes du régulon oxyR, dont la plupart sont clairement impliqués dans les réactions de défense contre le stress oxydant (Toledano et al., 1994 ; Pomposiello et Demple, 35 Introduction bibliographique 2001)). Ainsi, l’expression du gène katG est induite en présence d’OxyR sous forme oxydée. katG code la catalase hydroperoxydase I, qui constitue le système majeur de détoxification du peroxyde d’hydrogène (Gonzalez-Flecha et Demple, 1997). Les cellules phagocytaires animales (neutrophiles, monocytes, macrophages,…) sont capables de générer des ions superoxydes grâce à un transfert d’électrons du NADPH vers le dioxygène (Segal, 1989). Pour contrer ces défenses, le rôle des catalases bactériennes est déterminant. En effet, chez les bactéries Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes et Mycobacterium tuberculosis, il a été observé qu’une forte concentration intracellulaire de catalase est corrélée avec une résistance à ces défenses produites par les cellules phagocytaires (Mandell, 1975 ; Welch et al., 1979 ; Kusunose et al., 1976). De même, le gène oxyR d’E. chrysanthemi code une protéine présentant 88% de similarité avec celle d’E. coli (Miguel et al., 2000). Le mutant oxyR d’E. chrysanthemi possède une sensibilité accrue au peroxyde d’hydrogène, cependant il ne présente pas une virulence significativement réduite sur tubercules de pomme de terre ou sur plants de tabac (Miguel et al., 2000). Une hypothèse est qu’E. chrysanthemi possède plusieurs systèmes redondants de détoxification du peroxyde d’hydrogène. E. chrysanthemi possède également une superoxyde dismutase cytoplasmique, SodA, impliquée dans la détoxification des ions superoxydes. Dans ce cas également, la protéine d’E. chrysanthemi possède une forte homologie (85% de similarité) avec celle d’E. coli (Santos et al., 2001). Le mutant sodA d’E. chrysanthemi est plus sensible que la souche parentale à la présence de paraquat, capable de générer l’ion O2- (Santos et al., 2001). Sur tubercules de pomme de terre, ce mutant possède une capacité de macération identique à celle de la souche parentale. En revanche, sa virulence est fortement diminuée sur plants de Saintpaulia ionantha. Il existe également, chez cette bactérie, d’autres systèmes de résistance au stress oxydant, tels que la peptide méthionine sulfoxyde réductase MsrA, la flavohémoglobine HmpX ou la protéine SufC (El Hassouni et al., 1999 ; Favey et al., 1995 ; Nachin et al., 2001). L’ensemble de ces systèmes met en évidence le rôle déterminant d’une bonne résistance au stress oxydant pour une bactérie pathogène. 36 Introduction bibliographique ID Conclusion sur les intéractions hôte-pathogène A la vue de ces différents exemples, il ressort que les interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes animaux ou végétaux mettent en jeu des systèmes et des mécanismes similaires ; les spécificités des facteurs de virulence de ces deux types de pathogène étant en liaison étroite avec les caractéristiques du règne animal et végétal. II Régulation de l’expression génique chez les procaryotes Il est indispensable pour les bactéries de répondre et de s’adapter aux changements des conditions environnementales. Une des manières essentielles par lesquelles ces mécanismes adaptatifs sont réalisés consiste en une régulation de l’expression des gènes requis dans des conditions données. Ainsi la plupart des réponses adaptatives bactériennes est régie par l’ARN polymérase et des facteurs de transcription qui, en réponse à des signaux, déclenchent les réponses transcriptionnelles requises. Chaque étape du passage entre le gène et son produit est exploitée pour exercer ce contrôle, mais par souci d’une économie d’énergie, l’étape clef se situe au niveau de l’initiation de la transcription. IIA Au niveau de l’initiation de la transcription Cette étape cruciale de l’expression génique requiert l’interaction de l’ARN polymérase avec les promoteurs de l’ADN et l’ouverture de l’ADN double brin au niveau du point d’initiation de la transcription. L’étude de ce phénomène chez la bactérie modèle E. coli, a permis de comprendre le contrôle de la transcription dans tous les règnes vivants. II.A.1 L’ARN polymérase est l’élément central de la transcription La composante centrale de la régulation de l’initiation de la transcription chez les bactéries est l’ARN polymérase, qui est responsable de la transcription à proprement parler (Ebright, 2000). L’ARN polymérase est constitué de deux parties : l’enzyme core et le facteur sigma. Réunis, ils forment l’holoenzyme. Le rôle du facteur sigma est détaillé plus bas. 37 Introduction bibliographique II.A.1.1 L’enzyme core, la partie catalytique de l’ARN polymerase L’enzyme core est responsable de la transcription mais non de la reconnaissance du promoteur. Elle est constituée de cinq sous unités : β, β′, deux sous unités α identiques et une petite sous unité ω (Figure 9). Les études structurales ont montré que l’enzyme core adopte une structure en pince de crabes, qui est similaire à la structure de l’ARN polymérase II des levures (Zhang et al., 1999 ; Fu et al., 1999). Le site actif de l’ARN polymérase est formé des sous unités β et β’ (1342 et 1407 acides aminés respectivement chez E. coli (Korzheva et al., 2000), un ion Mg2+ est indispensable au bon fonctionnement du site actif. Chacune des sous unité α (329 acides aminés) est formée par deux domaines repliés indépendamment et reliés par une région charnière, partie flexible d’une vingtaine d’acides aminés (Blatter et al., 1994). La partie amino-terminale est la plus grande (résidus 1 à 235). Sa dimérisation permet d’assembler les deux sous unités β et β′. La petite partie carboxy-terminale des sous unités α (résidus 250 à 329) est un domaine de fixation à l’ADN, qui joue un rôle dans l’interaction avec certains promoteurs (Gourse et al., 2000). La petite sous-unité ω n’a pas de rôle direct dans la transcription, mais semble fonctionner comme une chaperonne pour le repliement de la sous unité β′. 38 Introduction bibliographique Figure 9 : Structure de l’ARN polymérase et son interaction avec un promoteur (d’après Browning et Busby, 2004). II.A.1.2 La région promotrice : à la fois structurée et modulaire Figure 10 : Eléments principaux du gène procaryote. 39 Introduction bibliographique L’étape clef de l’initiation de la transcription est la reconnaissance du promoteur par l’ARN polymérase. Les différents éléments de la séquence d’ADN constituants un promoteur ont été étudiés intensivement (Busby et Ebright, 1994) (Figure 10). Quatre éléments différents ont été identifiés. Les deux principaux sont l’hexamère -10 (Pribnow, 1975) et l’hexamère -35 qui sont centrés à 10 et 35 paires de bases en amont du point d’initiation de la transcription et distant entre eux généralement de 17 bases. L’hexamère -10 est reconnu par le domaine 2 de la sous unité σ de l’ARN polymérase alors que l’hexamère -35 est reconnu par le domaine 4 du facteur σ. Des séquences consensus pour les éléments -10 et -35 ont été établies : la séquence consensus TATAAT forme l’hexamère -10 et la séquence TTGACA constitue le consensus de l’élément -35. Des études cristallographiques ont permis l’élaboration de modèles qui expliquent les mécanismes de la reconnaissance de ces séquences par l’ARN polymérase (Campbell et al., 2002, Murakami et al., 2002). Les deux autres éléments importants de la structure d’un promoteur sont les éléments -10 étendus et les éléments UP. Le -10 étendu est un motif de 3 à 4 paires de bases situées immédiatement en amont de l’hexamère -10. Il est reconnu par le domaine 3 du facteur σ (Murakami et al., 2002 ; Sanderson et al., 2003). L’élément UP est composé d’une vingtaine de paires de bases située en amont de l’hexamère -35. Il est reconnu par les domaines carboxyterminaux des sous unités α de l’ARN polymérase (Ross et al., 2001). Ainsi, les éléments -10, -35, -10 étendus et UP assurent une fixation spécifique de l’ARN polymérase au niveau du promoteur (Figure 10), mais la contribution relative de chaque élément diffère d’un promoteur à un autre. Le rôle de ces éléments est donc de permettre la fixation initiale de l’ARN polymérase qui conduit à la formation du complexe ouvert puis aux étapes suivantes de la transcription. Dans la cellule bactérienne, l’ARN polymérase est face à un ensemble de presque 2000 séquences promotrices (Salgado et al., 2001). Les différences entre ces séquences participent fortement à la distribution inégale de l’ARN polymérase entre les différentes unités de transcription. Plus un promoteur à une séquence proche du consensus, plus il est efficace. Le fait que la quasi-totalité des promoteurs possèdent une séquence qui diffère du consensus met en évidence que l’activité de chaque promoteur est en balance avec celle des autres promoteurs (Tableau 1). Même si les différences de séquences permettent une régulation de l’activité des promoteurs, cette régulation est statique et ne peut pas être modulée en fonction des conditions environnementales perçues par la cellule. La plupart des régulations adaptatives sont médiées par des facteurs de transcription, comme décrit plus bas. 40 Introduction bibliographique -35 A C G T -10 T T G A C A T A T A A T 10 10 10 69 6 7 8 79 9 12 61 18 56 17 11 16 21 54 9 16 54 13 16 17 5 10 8 77 76 6 6 12 15 11 14 60 61 13 14 12 56 20 8 15 6 7 5 82 Tableau 1 : Fréquence d’apparition des nucléotides dans les éléments -35 et -10 du promoteur bactérien. Les fréquences sont indiquées en pourcentage, celles concernant les bases des consensus apparaissent en gras (Lisser et Margalit, 1993). II.A.1.3 Les étapes de l’initiation de la transcription Le processus de la transcription se divise en trois principales étapes : l’initiation, l’élongation et la terminaison. L’initiation de la transcription requiert l’interaction de l’ARN polymérase avec la région d’ADN correspondant à un promoteur (Figure 11). Cette fixation de l’ARN polymérase se fait via les domaines 2 et 4 du facteur σ qui vont interagir avec les hexamères -10 et -35, respectivement (De Haseth et al., 1998). Après la fixation initiale de l’ARN polymérase, les brins d’ADN compris entre les positions -10 et +2 par rapport au point d’initiation de la transcription s’ouvrent pour former une « bulle » appelée le complexe ouvert (Tsujikawa et al., 2002 ; Tomsic et al., 2001). La formation du complexe ouvert est due à une isomérisation. Cette isomérisation est encore mal comprise, mais il en résulte un mouvement de l’ADN simple brin de la « bulle » vers le site actif de l’ARN polymérase, étape qui se poursuit par la formation de la première liaison phosphodiester entre les deux premiers nucléosides triphosphates. Après que 9 à 12 nucléosides d’ARN aient été synthétisés, le complexe d’initiation entre dans le stade d’élongation. Cette transition est marquée par un changement conformationnel significatif qui conduit notamment au relargage du facteur σ (Ishihama, 2000). Ainsi, la synthèse d’ARN implique plusieurs étapes, qui peuvent toutes être sujet à régulation. Par soucis d’économie, la plupart de ces régulations ont lieu aux étapes initiales de la transcription. Le facteur limitant à cette étape est généralement la disponibilité de l’ARN polymérase. En effet, le nombre total de molécules d’enzyme core dans des cellules en croissance d’E. coli est d’environ 2000, ce qui est moins que le nombre de gènes d’E. coli (environ 5000) (Ishihama, 1981 ; Ishihama, 1997 ; Blattner et al., 1997). Dans ces conditions, la majorité de l’holoenzyme active est engagée dans la transcription des gènes codant les ARNs stables (ARN ribosomaux et de transferts), nécessaire à la traduction. Donc la quantité 41 Introduction bibliographique d’ARN polymérase disponible pour transcrire les quatre à cinq mille gènes de la cellule est limitée (Ishihama, 2000). Il y a donc une compétition intense entre les différents promoteurs pour la fixation de l’holoenzyme (Ishihama, 2000 ; Maeda et al., 2000). Ceci explique en partie comment les cellules peuvent synthétiser une grande quantité d’un ARN messager donné mais peu ou pas d’un autre. Ce constat a conduit à l’hypothèse selon laquelle la fixation de l’ARN polymérase sur les promoteurs et la formation du complexe ouvert constituent les étapes clefs de la régulation transcriptionnelle. Cinq éléments essentiels semblent diriger la répartition de l’ARN polymérase sur les différents promoteurs. Il s’agit, comme précédemment indiqué, de la séquence en ADN des régions promotrices, la proportion relative des différents facteurs σ, mais aussi de la présence des petits ligands, des facteurs de transcription et de l’organisation structurale du chromosome bactérien. 42 Introduction bibliographique Figure 11 : Les étapes de l’initiation de la transcription bactérienne (d’après Browning et Busby, 2004). 43 Introduction bibliographique II.A.2 II.A.2.1 La régulation de l’initiation de la transcription Les acteurs II.A.2.1.a Les facteurs sigma : acteurs de la reconnaissance des promoteurs II.A.2.1.a.i La sous-unité sigma (σ) Comme précédemment indiqué, la transcription commence par une interaction de l’enzyme core de l’ARN polymérase avec les régions promotrices de l’ADN. Cette interaction se fait par le biais de la sous-unité σ. Le premier facteur σ bactérien a été découvert en 1969 comme la sous unité de l’ARN polymérase d’E. coli essentielle pour la sélection du promoteur (Burgess et al., 1969). La sous unité σ, ou facteur σ, a trois fonctions principales : assurer la reconnaissance des séquences spécifiques d’un promoteur, positionner l’holoenzyme au niveau du promoteur cible et faciliter l’ouverture de la double hélice d’ADN au niveau du site d’initiation de la transcription (Wösten, 1998). La plupart des bactéries possède plusieurs facteurs σ qui permettent de reconnaître différents ensembles de promoteurs. A l’exception de la famille σ54, tous les facteurs σ partagent les mêmes caractéristiques (Merrick, 1993 ; Campbell et al., 2002). Ils possèdent généralement quatre domaines reliés par des régions charnières. Les domaines 2, 3 et 4 sont connus pour être impliqués dans la reconnaissance du promoteur (Murakami et al., 2002; Vassylyev et al., 2002). Le rôle du domaine 1 reste mal compris. E. coli possède un facteur σ70, dit facteur végétatif, qui permet la reconnaissance par l’holoenzyme de la plupart des promoteurs. Cependant le génome d’E. coli contient six autres facteurs σ qui s’accumulent en réponse à différents stress plus ou moins spécifiques (Ishihama, 2000). En raison de leur caractère inductible, ces facteurs σ alternatifs peuvent entrer en compétition avec le facteur σ70 pour la fixation à l’enzyme core. Ils se lient à une certaine quantité d’enzyme core et permettent d’initier la transcription au niveau de promoteurs portant des éléments de séquences particuliers (Maeda et al., 2000). Le nombre de facteur σ varie d’un pour Mycoplasma genitalium à 63 pour Streptomyces coelicolor (Gruber et Gross, 2003). Il apparaît une étroite corrélation entre le nombre de facteur σ et la diversité d’environnements dans lesquels le micro-organisme peut survivre. 44 Introduction bibliographique II.A.2.1.a.ii Les facteurs σ impliqués dans la transcription des gènes de virulence Chez les bactéries pathogènes, les facteurs σ alternatifs sont souvent impliqués dans la régulation de la virulence (Tableau 2). Ces effets se manifestent par une action directe sur la régulation des gènes de virulence ou par un effet indirect, en régulant les gènes qui augmentent le fitness de la bactérie durant l’infection. Ainsi, le facteur σB de Listeria monocytogenes active directement la transcription du gène inlA, qui code l’internaline A, protéine participant à l’invasion des cellules phagocytaire non professionnelles (Lingnau et al., 1995 ; Sue et al., 2004). Chez les souches pathogènes entérohémorrhagiques (EHEC) d’E. coli, le mécanisme d’adhésion aux cellules de l’épithélium intestinal nécessite un système de sécrétion de type III, codé par les gènes du locus LEE dont l’expression est activée par le facteur de transcription σS (Beltrametti et al., 1999). L’implication de ce facteur σ dans le contrôle de la virulence est encore plus marquée chez des bactéries comme Salmonella thyphimurium. En effet, des mutants rpoS, codant σS, de cette bactérie sont totalement avirulents sur des modèles murins (Hengge-Aronis, 2000a). Ce phénotype résulterait de l’absence de la mise en place de la réponse générale au stress ainsi que d’une régulation inappropriée des gènes de virulence. σS est également impliqué dans la régulation de la virulence chez des bactéries phytopathogènes comme Erwinia carotovora. Chez cette bactérie, σS contrôle négativement la synthèse d’enzymes extracellulaires, responsables de la dégradation de la paroi des cellules végétales et considérées comme un facteur de virulence essentiel (Andersson et al., 1999). Un mutant rpoS d’E. carotovora a une capacité macératrice augmentée in planta par rapport à celle de la souche parentale mais est incapable de croître à de fortes densités et d’entrer en compétition avec la souche parentale aussi bien in vitro qu’in planta. Ce défaut de croissance in vivo du mutant rpoS serait lié à une plus grande sensibilité aux stress oxydant et osmotique. Ces deux exemples suggèrent qu’un gène rpoS fonctionnel est requis pour la survie des bactéries S. typhimurium et E. carotovora dans un environnement compétitif et dans des conditions stressantes. Ceci met en évidence l’importance du couplage du contrôle de la réponse au stress et de l’expression des gènes de virulence. 45 Introduction bibliographique Famille, classe et facteur sigma Famille σ70 : réponse au stress σB σS σF ECF RpoE AlgU PvdS, Fpvl σC σD σE σH HrpL Espèces bactériennes B. anthracis, L. monocytogenes, M. tuberculosis, S. aureus, S. epidermidis E. coli, P. aeruginosa, S. enterica serovar Typhimurium, Erwinia carotovora M. tuberculosis H. influenzae, S. enterica serovar Typhimurium, V. cholerae P. aeruginosa P. aeruginosa M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis Erwinia spp., P. syringae σ28 FliA Famille σ54 σN C. jejuni, H. pylori, S. enterica serovar Typhimurium, V. cholerae, Y. enterocolitica C. jejuni, H. pylori, L. monocytogenes, P. aeruginosa, P. syringae, V. cholerae, V. parahaemolyticus Tableau 2 : facteurs sigma alternatifs impliqués dans la virulence (d’après Kazmierczak et al., 2005). Les facteurs sigma sont regroupés par classe. Les classes réponse au stress, ECF et σ28 font toutes partie de la famille σ70 des facteurs sigma. 46 Introduction bibliographique II.A.2.1.a.iii Régulation de l’activité des facteurs sigma Etant donné que différents facteurs σ régulent les réponses cellulaires à des stress variés, leur activité est étroitement contrôlée. Cette régulation peut s’effectuer en contrôlant la synthèse du facteur σ, mais dans la plupart des cas, la régulation est exercée par des facteurs anti-σ qui modulent l’activité d’un facteur σ indépendamment de sa transcription et de sa traduction (Hughes et Mathee, 1998). Beaucoup de facteurs anti-σ séquestrent le facteurs σ dont ils modulent l’activité de façon à ce qu’ils ne puissent plus se lier à l’enzyme core. Le cas du facteur σS sera traité en détail dans le paragraphe IIB « Autres mécanismes de la régulation de la synthèse protéique chez les procaryotes ». II.A.2.1.b Les petits ligands Les petits ligands permettent un mécanisme alternatif par lequel l’ARN polymérase peut répondre rapidement et efficacement aux variations de l’environnement. Un bon exemple est la guanosine 3′,5′ bisphosphate (ppGpp), qui est produite lors d’une carence en acides aminés (Chatterji et Ojha, 2001). Le ppGpp déstabilise les complexes ouverts des promoteurs qui contrôlent les gènes codant la machinerie de traduction (Barker et al., 2001). Les promoteurs sensibles au ppGpp ont une courte séquence riche en GC près du point d’initiation de la transcription. L’activité de ces promoteurs requiert également une forte concentration du nucléotide initiant la traduction, généralement l’ATP (Gaal et al., 1997). Il a été proposé que le ppGpp contrôle l’expression de la machinerie de traduction en réponse à une carence en nutriments alors que la disponibilité en ATP permet une régulation en fonction du taux de croissance (Schneider et al., 2003). La plupart de ces promoteurs recrutent l’ARN polymérase avec une grande efficacité et peuvent initier la transcription à un taux élevé. Cependant pour atteindre ces rendements, le complexe ouvert doit être stabilisé ce qui demande une forte concentration en ATP et un faible taux de ppGpp. Cet exemple met en évidence une régulation de l’initiation de la transcription par l’action directe de petits ligands. 47 Introduction bibliographique II.A.2.1.c Les facteurs de transcription Un facteur de transcription est une protéine nécessaire à l’activation ou la répression de l’expression d’un gène. Ils régulent spécifiquement la transcription de gènes en se fixant sur des séquences régulatrices situées au niveau des promoteurs de ces gènes. Les facteurs de transcription peuvent être classés en différentes familles sur la base de similarités entre leurs séquences. Une douzaine de familles ont été identifiées, dont les mieux caractérisées sont les familles LacI, AraC, LysR, CRP et OmpR. Lorsqu’un facteur de transcription se lie spécifiquement à un promoteur, il peut soit activer soit réprimer l’initiation de la transcription (Gralla, 1996 ; Barnard et al., 2004). Un facteur de transcription peut être activateur, répresseur ou peut remplir les deux rôles en fonction du promoteur cible. On estime que le génome d’E. coli K12 contient 314 facteurs de transcription dont 35% sont activateurs, 43% répresseurs et 22% peuvent exercés les deux fonctions (Perez-Rueda et Collado-Vides, 2000). Quelque uns de ces facteurs contrôlent une grande quantité de gènes, alors que d’autres régulent seulement un ou deux gènes. Il a été estimé que 7 facteurs de transcription contrôlent 50% des gènes régulés, alors qu’environ 60 facteurs régulent chacun un promoteur (Martinez-Antonio et Collado-Vides, 2003). Ces 7 facteurs de transcriptions, dits globaux, sont CRP, FNR, IHF, Fis, ArcA, NarL et Lrp. Les facteurs de transcriptions globaux : - contrôlent un grand nombre de gènes qui appartiennent à des classes de fonctions différentes, - contrôlent une cascade de régulations complexe par des mécanismes directs (fixation du régulateur sur le promoteur cible) et indirects (régulations de régulateurs du promoteur cible), - agissent sur des promoteurs qui interagissent avec différents facteurs σ. Les facteurs de transcription couplent l’expression des gènes avec les signaux environnementaux. Leur propre activité est donc être finement contrôlée par différents mécanismes. En premier lieu, l’affinité du facteur de transcription pour sa séquence d’ADN cible peut être modifiée par des ligands, dont les concentrations fluctuent en fonction des conditions nutritives ou de certains stress. Un exemple est la forte augmentation de la spécificité de liaison à l’ADN de l’activateur CRP par l’AMPc. Un second mécanisme implique des modifications covalentes des facteurs de transcription. Ainsi, NarL se lie à sa cible ADN uniquement lorsqu’il a été phosphorilé par les kinases NarX ou NarQ, qui répondent à la présence d’ions nitrite ou nitrate (Darwin et al., 1996). Troisièmement, la 48 Introduction bibliographique concentration intracellulaire de certains facteurs de transcription contrôle leur activité. L’expression mais aussi la protéolyse sont donc déterminantes dans l’activité de ces facteurs. Ainsi, une des réponses cellulaires à un stress oxydant est dépendante de la concentration de SoxS, un facteur de transcription régulant un ensemble de gènes impliqués dans la résistance au stress oxydant. La transcription de soxS est activée par SoxR sous forme oxydée. Ainsi, en présence de composé oxydant, comme des ions superoxydes, SoxR passe sous forme oxydée et induit la transcription de soxS (Demple, 1996). Enfin, un mécanisme moins commun pour réguler la concentration d’un facteur de transcription est la séquestration par une protéine membranaire. Ainsi, PtsG, sous sa forme déphosphorilée, fixe au niveau de la membrane le répresseur Mlc, impliqué dans la régulation de l’expression de plusieurs gènes du métabolisme du glucose (Plumbridge, 2002). II.A.2.1.c.i Les activateurs Un activateur améliore l’activité d’un promoteur en augmentant son affinité pour l’ARN polymérase. Dans la plupart des cas, l’activateur fonctionne en se liant d’abord au promoteur cible avant d’interagir avec l’ARN polymérase. Cependant, un mécanisme alternatif a été mis en évidence pour les régulateurs MarA et SoxS, qui interagissent avec l’ARN polymérase libre avant de se lier au promoteur (Griffith et Wolf, 2002 ; Martin et al., 2002). Pour la plupart des promoteurs, l’activation de la transcription est simple et implique un seul facteur de transcription activateur. Trois mécanismes généraux sont utilisés (Figure 12). L’activateur de Classe I se lie à sa séquence ADN cible, localisée en amont de l’élément -35 du promoteur, puis recrute l’ARN polymérase par une interaction directe avec la partie carboxyterminale des sous-unités α. La région charnière reliant les domaines carboxy et amino terminaux des sous unités α est flexible, ce qui permet aux activateurs de classe I de se lier à différentes zones en amont du promoteur, tout en permettant un contact avec les sous unités α. Le meilleur exemple d’activateur de classe I est la protéine réceptrice de l’AMP cyclique (CRP) et le promoteur lac (Ebright, 1993). L’activateur de classe II se lie à une séquence proche de l’élément -35 du promoteur, ce qui lui permet d’interagir avec le domaine 4 de la sous unité σ (Dove et al., 2003). Ce contact permet de recruter l’ARN polymérase au niveau du promoteur cible mais peut aussi affecter d’autres étapes de l’initiation de la transcription. Du fait de la faible flexibilité de la liaison entre le domaine 4 du facteur σ et l’élément -35 du promoteur, les positions de fixation 49 Introduction bibliographique des activateurs de classe II varient peu par rapport au point d’initiation de la transcription. Un exemple d’activateur de classe II est la protéine CI du bactériophage λ pour l’activation du promoteur prm (Nickels et al., 2002). Certains activateurs de classe II reconnaissent d’autres parties de l’ARN polymérase comme la partie amino terminale des sous unités α, mais ils conservent la liaison avec l’ADN au niveau de l’élément -35 (Busby et Ebright, 1997). Dans le troisième mécanisme d’activation, l’activateur altère la conformation du promoteur cible pour favoriser les interactions entre l’ARN polymérase et les éléments -10 ou -35 du promoteur. Ceci requiert, en général, que l’activateur se lie très près des éléments du promoteur. Ainsi, pour les promoteurs activés par les facteurs de transcription de la famille MerR, l’espacement entre les éléments -10 et -35 n’est pas optimal pour la fixation de l’ARN polymérase. Les activateurs de type MerR se lie entre ces deux éléments et vrille l’ADN de façon à les réorienter pour permettre la fixation de la sous unité σ de l’holoenzyme (Brown et al. 2003 ; Heldwein et Brennan, 2001). Figure 12 : Les différents types d’activateurs transcriptionnels (d’après Browning et Busby, 2004). 50 Introduction bibliographique II.A.2.1.c.ii Les répresseurs Dans la plupart des cas, la répression de l’expression d’un promoteur implique un seul facteur de transcription. Trois mécanismes sont utilisés (Figure 13). L’encombrement stérique gênant la liaison promoteur-ARN polymérase est le mécanisme de répression le plus simple. Dans ce cas, le site de fixation du promoteur est localisé dans ou à proximité des éléments clefs du promoteur, comme par exemple le site de fixation du répresseur du promoteur lac (Müller et al., 1996). Cependant, dans certains cas, le répresseur peut agir à une étape ultérieure à la fixation de l’ARN polymérase, en empêchant l’ARN polymérase d’initier la transcription, en se liant à l’ARN messager ou en empêchant le ribosome d’effectuer la traduction. Pour d’autres promoteurs, comme par exemple le promoteur gal qui est réprimé par GalR (Choy et Adhya, 1996 ), plusieurs molécules de répresseur se lient à des sites distaux du promoteur. La répression est causée par la formation d’une boucle d’ADN qui piège l’ARN polymérase au début de la transcription. Des cas plus complexes existent où le répresseur agit comme un anti-activateur. Ainsi, les promoteurs, qui sont réprimés par CytR, sont dépendants d’une activation par CRP. La répression exercée par CytR est une interaction directe entre CytR et CRP, empêchant l’activation par CRP (Shin et al., 2001). Dans la plupart de ces promoteurs CytR ne reconnaît pas son promoteur cible mais le complexe promoteur cible-CRP (Valentin-Hansen et al., 1996). 51 Introduction bibliographique Figure 13 : Les différents types de répresseurs transcriptionnels (d’après Browning et Busby, 2004). 52 Introduction bibliographique II.A.3 La chromatine bactérienne a une organisation dynamique L’implication de l’organisation structurale du génome dans la régulation de l’expression génique a été mise en évidence dans les années 1990 (Higgins et al., 1988 ; Dorman et al., 1990). En effet, Higgins et collaborateurs avaient proposé, à cette époque, que la variation de l’état d’enroulement de l’ADN intervenait dans l’osmoadaptation d’E. coli. Une extension du rôle régulateur de l’état d’enroulement de l’ADN à d’autres conditions physiologiques dont l’anaérobiose a par la suite incité ces auteurs à proposer ce contrôle comme étant un mécanisme global de l’adaptation bactérienne aux changements des conditions environnementales (Dorman et al., 1988 et 1990). Ce concept, initialement controversé, est devenu une évidence depuis l’avènement des méthodes d’analyses globales de l’expression génique (Travers et Muskhelishvili, 2005b ; Dorman, 2006). L’utilisation de ces approches a non seulement conforté le rôle régulateur de l’état d’enroulement de l’ADN mais surtout fait ressortir l’importance cruciale de ce paramètre dans les mécanismes globaux du contrôle de l’expression génique (Dorman, 2006). En effet, il s’est avéré que le surenroulement négatif agit sur l’expression du génome entier. Chez E. coli, une relaxation rapide de l’ADN entraîne une diminution de l’expression de 30% des gènes alors que celle des gènes restant augmente (Travers et Muskhelishvili, 2005b et 2006). Le nucléoïde bactérien (chromosome et protéines associées) aurait donc une structure dynamique dont l’organisation varie en fonction des changements des conditions environnementales (Travers et Muskhelishvili, 2005a). L’exigence de compaction et la nécessité d’une adaptation de l’expression génique en fonction des changements de l’environnement nécessitent un haut degré d’organisation spatiale pour la bactérie. Par exemple, le chromosome d’une bactérie comme E. coli contient environ 4,7 millions de bases et mesure près de 1,5 mm de long. Compacter cette molécule dans une cellule mesurant 1 micron de large sur 2 microns de long rend compte de la complexité de la situation. L’ADN forme une double hélice où des nucléotides complémentaires s’enroulent autour d’un axe unique. La double hélice peut s’enrouler à son tour dans l’espace pour former une nouvelle hélice d’ordre supérieur : on dit alors que l’ADN est surenroulé. L'ADN circulaire isolé à partir des cellules procaryotes ou eucaryotes adopte une forme surenroulée négativement. Les domaines sont surenroulés négativement car l’hélice ADN qui les compose possède un déficit de tours sur elle-même. 53 Introduction bibliographique Le chromosome est organisé en domaines de surenroulement indépendants. Leur nombre a été difficile à déterminer et les estimations récentes indiquent la présence d’environ 400 domaines surenroulés par chromosome (Stein et al., 2005 ; Deng et al., 2005 ; Postow et al., 2004). Ainsi, la taille de certains domaines est réduite et pourrait contenir un seul opéron. La nature des frontières entre domaines reste à clarifier. Aucun facteur constituant définitivement un élément des frontières a été identifié, de même qu’aucune séquence du chromosome agissant en cis, ou une molécule d’ARN agissant en trans. Cependant, il y a de nombreux candidats tels que les protéines associées au nucléoïde, détaillées plus bas, ou les séquences d’ADN répétées formant des motifs agissant en cis (Trun et Marko, 1998 ; Stein et al., 2005 ; Deng et al., 2005 ; Postow et al., 2004). Une des caractéristiques des frontières de domaines est qu’elles sont éphémères. Elles sont abondantes dans le chromosome d’une bactérie en phase exponentielle de croissance mais deviennent rares quand la bactérie entre en phase stationnaire de croissance. Le nucléoïde a donc une structure dynamique qui influence l’expression génique (Figure 14). Figure 14 : Schéma illustrant l’effet de l’organisation spatiale du chromosome sur l’expression génique. La structuration du chromosome dépend de plusieurs facteurs mais les deux plus importants sont les ADN topoisomérases et les protéines associées au nucléoïde abondantes (NAP). Les ADN topoisomérases sont des enzymes qui modulent le degré de surenroulement de l’ADN. Chez E. coli, cette fonction est assurée par les activités opposées des topoisomérases, enzymes favorisant la relaxation de l’ADN, et de la gyrase, qui en présence d’ATP introduit du surenroulement négatif dans l’ADN relâché. 54 Introduction bibliographique Le surenroulement de l’ADN peut influencer la transcription à différents niveaux (Travers et Muskhelishvili, 2005b). Ainsi une étape sensible au surenroulement est l’isomérisation au cours du passage du complexe fermé vers le complexe ouvert. Les supertours négatifs facilitent l’ouverture de la double hélice d’ADN. La cassure des liaisons hydrogène reliant les deux brins d’ADN demande de l’énergie qui peut être fournie par le déroulement de l’ADN. Cependant, avant d’atteindre l’étape du complexe ouvert, l’ARN polymérase doit être recrutée au niveau du promoteur et le surenroulement peut influencer cette étape de différentes façons. Une d’entre elles concerne les promoteurs dont les éléments -10 et -35 sont espacés par une distance empêchant une fixation efficace du facteur σ. Ainsi, ajouter ou enlever des bases altère la disposition des deux hexamères sur la surface de la double hélice d’ADN. Cette distorsion rotationnelle peut être corrigée en modifiant le taux d’enroulement de la double hélice (Figure 15). Figure 15 : Effet du niveau du surenroulement de l’ADN sur l’expression des gènes. Le recrutement de l’ARN polymérase à un promoteur peut aussi dépendre de la présence d’un facteur de transcription et la fixation de ce facteur peut modifier localement la 55 Introduction bibliographique topologie de l’ADN. Inversement, le surenroulement de l’ADN peut participer à l’interaction du facteur de transcription avec l’ARN polymérase. Par exemple, les promoteurs répondant au contrôle stringent, médié par le ppGpp, possèdent une région riche en bases G et C immédiatement en aval de l’hexamère -10 (Travers et Muskhelishvili, 2005b). Ces promoteurs contrôlent l’expression de gènes impliqués dans la synthèse de la machinerie de traduction. Cette synthèse doit être réprimée quand la bactérie manque de nutriments, et la réponse stringente permet de remplir cette fonction. La région riche en GC est difficile à dénaturer car elle contient plus de liaisons hydrogènes qu’une région riche en AT, trouvée classiquement dans la plupart des promoteurs. L’énergie supplémentaire nécessaire pour dénaturer la région riche en GC peut être fournie par une modification de l’état de surenroulement de l’ADN. Cette modification est médiée par la gyrase dont l’activité est fonction de la concentration en ATP. Un fort taux en ATP, favorable à l’activité de la gyrase est disponible en présence de nutriments (Dorman, 2002). II.A.3.1 Les « Nucleoid Associated Proteins » (NAP) En plus du surenroulement, la condensation du chromosome implique l’interaction entre l’ADN et plusieurs protéines. La composition en protéines du nucléoïde est majoritairement constituée par les « Nucleoid Associated Proteins » (NAP), un groupe de petites et abondantes protéines se liant à l’ADN (Azam et Ishihama, 1999 ; Drlica et al., 1999 ; McLeod et Johnson, 2001). Les NAPs structurent le chromosome et exerce un contrôle sur la transcription, la recombinaison et la réplication de l’ADN. Les NAPs modifient la géométrie de l’ADN en créant ou en accentuant les courbures de la molécule et en modifiant le niveau de surenroulement local de l’ADN. Chez E. coli, les principales NAPs sont HU (heat-unstable nucleoid protein), IHF (integration host factor), H-NS (histone-like nucleoid structuring protein) et Fis (factor for inversion stimulation). Ils agissent directement ou indirectement, souvent en réseau, sur le contrôle d’une large variété de gènes. Ces gènes sont impliqués dans la viabilité de la cellule, comme ceux intervenant dans la synthèse des protéines ou dans le métabolisme du carbonne. Les NAPs régulent souvent les gènes dont l’expression varie en fonction de stimuli extérieurs, comme la température et l’osmolarité (Drlica et al., 1999 ; McLeod et Johnson, 2001). Les séquences en acides aminés des protéines HU et IHF sont voisines alors que Fis et H-NS sont structuralement distincts. IHF se lie avec une forte affinité à l’ADN (Ali et al., 56 Introduction bibliographique 2001) et possède une grande spécificité de liaison à l’ADN. La séquence consensus reconnue par IHF est bien définie (Tableau 3) (Ussery et al., 2001). La situation avec Fis et H-NS est moins claire mais une séquence consensus dégénérée a été identifiée pour ces deux protéines (Pan et al., 1996 ; Lang et al., 2007). Dans le cas de HU, il n’a pas été mis en évidence une séquence consensus, la fixation semble être aspécifique (Grove et Saavedra, 2002 ; Schröder et Wagner, 2002). H-NS se lie préférentiellement à l’ADN contenant une forte proportion en bases A et T, susceptibles d’adopter une structure courbe (Dame et al., 2001). NAP Propriétés et abondance Structure Gènes Fonctions principales H-NS - non-basique - 20000-40000 dimères/cellules - oligomérisation sur l’ADN -Séquence consensus de fixation : tCGATAAATT Homodimère 2 x 15.4 kDa hns - reconnaît l’ADN courbé - modifie la topologie de l’ADN - induit des courbures de l’ADN - impliqué dans la recombinaison Fis - basique - abondant en phase exponentielle (2000040000 dimères/cellules) -Séquence consensus de fixation : GNYAWWWTRNC Homodimère 2 x 11.2 kDa fis - induit une forte courbure de l’ADN (jusqu’à 90°) - modifie la topologie de l’ADN - participe dans la recombinaison, la transposition et la réplication de l’ADN IHF - basique - abondant en phase stationnaire (25000-30000 dimères/cellules) -Séquence consensus de fixation : WATCAANNNNTTR Hétérodimère ; IHFα : 11.2 kDa himA et IHFβ : 10.7 kDa himB - induit une forte courbure de l’ADN (jusqu’à 140°) - participe dans la recombinaison, la transposition et la réplication de l’ADN HU - basique - abondant en phase exponentielle (1500030000 dimères/cellules) Hétérodimère ; HUα : 9.2 kDa HUβ : 9.2 kDa - compacte l’ADN - induit des courbures de l’ADN - impliqué dans le réplication et la recombinaison de l’ADN hupA et hupB Tableau 3 : Les principales protéines associées au nucléoïde (NAP) (d’après Prosseda et al., 2002). Les codes des séquences consensus sont les suivants : N= A,G,C ou T ; R=A ou G ; W=T ou A ; Y=C ou T. 57 Introduction bibliographique Un aspect important conditionnant le rôle des NAPs est la variation de leurs concentrations cellulaires. En effet, elles sont produites à différents niveaux de la croissance bactérienne. Ainsi, Fis est synthétisée à un niveau très élevé en début de phase exponentielle de croissance (Figure 16), puis sa concentration diminue rapidement (Ali-Azam et al., 1999). Au contraire, IHF est à forte concentration dans les cellules entrant en phase stationnaire de croissance alors que la concentration d’H-NS est à peu près constante au cours de la croissance (Free et Dorman, 1995). La situation avec HU est plus complexe dans la mesure où la composition de ses deux sous unités varie avec la croissance. In fine, le taux de HU diminue en phase stationnaire (Balandina et al., 2001). Ces variations de concentrations introduisent une dynamique dans la composition en NAP du nucléoïde, permettant une régulation de l’expression des gènes. Ainsi le chromosome bactérien qui a un degré d’enroulement relativement important durant la phase exponentielle de croissance, adopte une structure plus relâchée à l’entrée de la phase stationnaire. Parallèlement, le facteur σ70 qui transcrit de manière efficace de l’ADN surenroulé, est remplacé par le facteur σS, qui a une préférence pour l’ADN relâché de manière à adapter l’expression génique. L’organisation topologique des différents promoteurs d’un génome dépend effectivement de l’état d’enroulement local qui est fixé à la fois par les activités des topoisomérases et de la gyrase mais aussi de la dynamique de fixation des protéines associées au nucléoïde. Le rôle de ces protéines dans l’expression des différents promoteurs reste toutefois assez peu étudié. H-NS est la protéine dont le mécanisme d’action a été le plus intensivement étudié. Cette protéine est capable de réduire fortement l’expression génique en formant des structures nucléo-protéiques étendues comme observé au niveau du promoteur virF (Falconi et al., 1998). 58 Introduction bibliographique Concentration cellulaire en protéines « NAP » Densité cellulaire Fis IHF HU HN-S Phase de latence Phase Phase stationnaire exponentielle Croissance Figure 16 : Concentrations cellulaires des protéines H-NS, Fis, HU et IHF au cours des différentes phases de la croissance bactérienne. L’une des caractéristiques des NAPs dans la régulation de l’expression génique est leur implication dans les mécanismes adaptatifs dont la pathogénie. II.A.3.1.a Les principales NAP impliquées dans la régulation de la virulence II.A.3.1.a.i H-NS Le rôle de H-NS a été abondamment décrit chez E. coli et les bactéries voisines comme Shigella flexneri ou Salmonella typhimurium. L’analyse du transcriptome, en utilisant des puces à ADN, a montré que H-NS est impliqué dans l’expression de plus de 5% des gènes chez E. coli, cultivée en milieu complexe LB. H-NS est donc un régulateur global qui contrôle entre autres la régulation de l'expression de gènes de virulence (Hommais et al., 2001). H-NS agit essentiellement comme répresseur et son mécanisme d'action a été récemment caractérisé (Dame et al., 2002). H-NS se fixe à l'ADN via une séquence consensus dégénérée localisée dans des régions d'ADN présentant une structure courbe en amont des promoteurs à réprimer. La liaison de plusieurs protéines H-NS conduit à la formation d’une boucle dans laquelle est piégée l’ARN polymérase. En général, H-NS régule indirectement l’expression des gènes de virulence. Par exemple chez les souches EIEC d'E. coli, l’expression des gènes permettant l’adhésion, la 59 Introduction bibliographique pénétration et la dissémination intra et inter cellulaire est activée par deux régulateurs transcriptionnels : VirF et VirB (Adler et al., 1989). En réponse à différents stimuli (température, pression osmotique, pH) il y a une augmentation de la synthèse de VirF qui va activer l'expression de VirB, régulateur spécifique des gènes codant les protéines IPA nécessaires à l'invasion de la barrière intestinale (Sasakawa et al., 1993). A température inférieure à 32°C, H-NS réprime l'expression de virF en se liant spécifiquement à une région présentant une structure courbée et localisée dans la région promotrice de ce gène (Figure 17) (Falconi et al., 1998). A des températures voisines de celle de l'hôte (37°C), une modification topologique de cette région s'oppose à la fixation de H-NS, permettant une dérépression de l'expression de virF qui va conduire à une forte production des protéines IPA et de l'appareil de sécrétion. La courbure de l’ADN, permettant la fixation de H-NS, pourrait agir comme un senseur de la température et disparaîtrait à plus de 32°C. Cet exemple met en évidence la connexion entre la levée de la répression exercée par H-NS et les conditions environnementales. Un mécanisme similaire serait mis en œuvre en réponse à un stress osmotique ou thermique. En effet , ces différents stress modifient la topologie de l’ADN (Dorman et Deighan, 2003). Température 20°C Fis H-NS 37°C 32°C ARN polymérase virF ARNm virF VirF VirB Protéines IPA Figure 17 : Mode d’action du répresseur H-NS et de l’activateur Fis en fonction de la température sur l’expression du gène virF chez les souches d’Escherichia coli entéroinvasives. Dans certains cas, H-NS peut avoir un rôle activateur de la synthèse des facteurs de virulence. Par exemple, chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, l’expression 60 Introduction bibliographique des gènes pel, codant les pectate lyases, facteurs de virulence majeurs, est fortement diminuée dans un mutant hns. Ce phénotype d’activateur est le résultat d’un contrôle indirect mettant en jeu PecT, un répresseur des gènes pel (Nasser et Reverchon, 2002). Dans le mutant hns, l’augmentation de la synthèse de PecT conduit à une répression de l’expression des gènes pel. Le signal auquel répond PecT n’est pas encore identifié. II.A.3.1.a.ii Fis Un des rôles essentiels de Fis est d’activer la transcription de gènes codant les ARN stables (ARN de transfert et ribosomaux) en début de phase exponentielle de croissance. Fis est également impliqué dans divers processus biologiques tel que l’intégration dans le chromosome du phage Mu. Fis se lie à l’ADN sous forme de dimère via un consensus assez dégénéré et peut jouer soit un rôle d’activateur soit de répresseur. La répression par Fis s’effectue via une compétition avec l’ARN polymérase ou des activateurs pour l’occupation d’une même région d’ADN. Dans le cas d’une activation, la fixation de Fis à l’ADN induit une modification locale de la topologie de l’ADN, facilitant la fixation de l’ARN polymérase sur les promoteurs (Muskhelishvili et Travers, 2003). Ainsi, Fis active le gène virF d’E. coli (figure 17) (Falconi et al., 2001). Fis permet donc l’expression des gènes d’adhésion et de colonisation de la bactérie. De même, Fis active l’expression des gènes de l’îlot de pathogénie SPI-1 chez S. typhimurium. Les produits de ces gènes permettent le franchissement de la barrière intestinale de l’hôte (Wilson et al., 2001). Récemment, l’analyse du transcriptome de S. typhimurium a montré un rôle central de Fis dans la coordination de l’expression des gènes de ménage et des gènes de virulence nécessaires à la survie de la bactérie dans les poumons ou au cours d’une infection systémique (Kelly et al., 2004). L’adhésion aux cellules épithéliales des souches enteropathogéniques d’E. coli est médiée par les bundle-forming pili (BFP). Ce processus est activé par Fis (Goldberg et al., 2001). Dans ces différents cas, Fis active la synthèse de facteurs de virulence précoces (adhésion). Il existerait donc une bonne adéquation entre la forte concentration cellulaire de Fis en début de phase exponentielle de croissance et la fonction des gènes de virulence dont il active l’expression. Fis contrôle par ailleurs l’expression de H-NS (Falconi et al., 1996) et du facteur σS chez S. typhimurium (O Croinin et Dorman, 2007). 61 Introduction bibliographique II.A.3.1.a.iii IHF Contrairement à H-NS et Fis, IHF reconnaît un consensus bien défini pour sa fixation à l’ADN (Ali et al., 2001). Plusieurs études mettent en évidence le rôle de IHF dans la régulation de la virulence chez les entérobactéries. L’un des cas les mieux étudiés porte sur les gènes spv de S. typhimurirum. Dans ce cas, le facteur σS et le régulateur SpvR activent conjointement l’expression des gènes de virulence spv à l’entrée de la phase stationnaire. L’expression de spvR est également activée par IHF à forte densité cellulaire (Marshall et al., 1999). Afin d’exprimer les gènes spv au moment opportun, la bactérie exerce un double contrôle sur l’expression de ces gènes impliquant σS et IHF qui sont présents durant la phase stationnaire. Un cas atypique a été décrit chez les coli entéropathogènes chez lesquelles IHF active l’expression des gènes LEE codant les protéines nécessaires à la formation des lésions attachement/effacement sur les cellules épithéliales. IHF stimule la synthèse de la protéine Ler, activateur de la plupart des gènes du locus LEE (Bustamante et al., 2001 ; Friedberg et al., 1999). IHF active par ailleurs l’expression de Fis en début de phase exponentielle de croissance (Pratt et al., 1997). II.A.3.1.a.iv HU Les distorsions de l’ADN provoquées par HU permettent de former des complexes nucléoprotéiques spécifiques avec des séquences d’ADN distants. Ainsi HU stimule la fixation des protéines régulatrices sur le promoteur cible, notamment dans le cas de l’opéron lac. HU peut également induire la formation d’une boucle qui va stabiliser les interactions entre protéines régulatrices, comme pour l’opéron gal (Drlica et al., 1999 ; McLeod et Johnson, 2001 ; Perez-Martin et de Lorenzo, 1997). HU semble peu impliqué dans le contrôle de l’expression des gènes de virulence. Ainsi, chez la bactérie pathogène Salmonella typhimurium, HU active l’expression de hilA, dont le produit est impliqué dans la régulation de la synthèse du système de sécrétion de type III (Schechter et al., 2003). 62 Introduction bibliographique II.A.4 II.A.4.1 Dynamique de régulation Un régulateur spécifique couplé à un régulateur général L’activité de la plupart des promoteurs bactériens est dépendante de multiples conditions environnementales plutôt que d’un seul signal. Beaucoup de promoteurs sont contrôlés par plusieurs facteurs de transcription, où chaque acteur relais la perception d’un signal. Cependant, dans certains cas, une protéine régulatrice peut intégrer plusieurs signaux. Ainsi le système NifL-NifA chez Azotobacter vinelandii contrôle l’expression des gènes impliqués dans la fixation de l’azote en fonction du taux d’oxygène, de la disponibilité en carbone et en azote. Les systèmes de régulation de cette complexité sont assez rares et, dans la plupart des cas, pour un promoteur régulé par plusieurs signaux, plusieurs facteurs de transcription sont nécessaires. En général, lorsque deux facteurs de transcription sont impliqués, un des facteurs répond à un signal d’un métabolisme spécifique alors que le deuxième facteur relais un signal du métabolisme général. Un bon exemple est le régulon gal chez E. coli qui contient des gènes impliqués dans le transport et le métabolisme du galactose. La transcription des gènes du régulon gal est réprimée par deux régulateurs isoformes, GalR (Gal repressor) et GalS (Gal isorepressor) (Weickert et Adhya, 1993). Ces deux répresseurs reconnaissent le même site de fixation à l’ADN (Weickert et Adhya, 1992). Cette fixation est inhibée par la présence de Dgalactose, métabolite responsable du signal spécifique. La plupart des gènes du régulon gal sont par contre activés par le complexe CRP-AMPc, le régulateur général de la répression catabolique (Weickert et Adhya, 1993). Cet exemple met en évidence un dialogue cellulaire entre métabolisme général et métabolisme spécifique, permettant une adaptation de la bactérie aux conditions environnementales. Il y a peu d’exemples de régulations intégrées impliquant seulement des répresseurs, mais, dans la majorité des cas étudiés, les régulations complexes dépendent de combinaisons d’activateurs et de répresseurs. En général, les régulateurs agissent indépendamment sur le promoteur, cependant, dans certains cas comme pour les promoteurs qui sont réprimés par CytR, le répresseur et l’activateur interagissent entre eux directement (Chahla et al., 2003). Pour les promoteurs qui sont régulés par deux ou plusieurs régulateurs, des mécanismes plus complexes sont mis en œuvre. Quatre mécanismes généraux ont été trouvés chez E. coli, impliquant le repositionnement de l’activateur, les contacts avec l’ARN polymérase 63 Introduction bibliographique indépendants entre les activateurs, les contacts coopératifs entre activateurs ainsi que les interactions conduisant à une anti-répression par un activateur (Figure 18). Pour le mécanisme de repositionnement, le promoteur cible peut être activé pleinement par un activateur primaire, mais en absence de l’activateur secondaire, l’activateur primaire est mal positionné. Le repositionnement peut impliquer le déplacement de l’activateur primaire d’un site de fixation à l’ADN à un autre, comme par exemple pour le repositionnement de MalT par CRP au niveau du promoteur malK (Richet et al., 1991). Par ailleurs, l’activateur secondaire peut altérer la conformation de l’ADN, par exemple en créant une courbure, pour permettre l’interaction entre l’activateur primaire et l’ARN polymérase qui conduit à l’activation de la transcription. Un mécanisme différent existe pour les promoteurs où les deux activateurs se lient de façon indépendante par rapport à l’ARN polymérase. Ces promoteurs contrastent avec les promoteurs dépendant des activateurs simples de classe I et II, où les interactions avec un seul facteur de transcription sont suffisantes pour une transcription optimale (Joung et al., 1994 ; Scott et al., 1995). Dans certains cas, des promoteurs complexes sont dépendants d’un activateur de classe I et d’un de classe II, comme le promoteur proP P2, où Fis et CRP fonctionnent comme activateurs de classe I et II respectivement (McLeod et al., 2002 ; Belyaeva et al., 1998). Une autre combinaison est l’action de deux activateurs de classe I, comme pour le promoteur acs P2, qui est dépendant de la fixation de deux dimères CRP aux sites d’activation de classe I (Beatty et al. 2003 ; Tebbutt et al., 2002). Le mécanisme d’activation sans contact direct permet de coupler un promoteur avec deux activateurs. Ce mode d’action semble ubiquitaire, en effet il permet de combiner de nombreux régulateurs ensemble puisque aucune interaction entre eux est nécessaire, donc le mécanisme présente beaucoup de possibilités d’évolution. La plupart des activateurs se fixent à leur promoteur cible de façon indépendante par rapport aux autres régulateurs de ce promoteur. Cependant, il y a quelques promoteurs dont les activateurs se fixent de façon coopérative, ce mécanisme assure une co-dépendance puisqu’un activateur ne peut se fixer de façon efficace sans l’autre. Un bon exemple est le promoteur melAB, pour lequel CRP est incapable de se fixer sans la fixation préalable de MelR (Wade et al., 2001). Les répresseurs qui empêchent l’activation par l’activateur primaire peuvent aussi créer une co-dépendance entre deux activateurs (Wu et al., 1998). La présence de l’activateur secondaire est nécessaire pour modifier l’action du répresseur de façon à ce qu’il n’interfère plus avec l’action de l’activateur primaire. Ainsi les promoteurs nir et nrf d’E. coli sont dépendants de FNR, un régulateur répondant à l’anaérobiose, et de NarL ou NarP, facteurs de transcription activés par la présence de nitrite ou de nitrate (Browning et al., 2000 ; Browning 64 Introduction bibliographique et al., 2002). Les deux promoteurs sont fortement activés par l’activateur primaire FNR, qui interagit avec l’ARN polymérase par un mécanisme de classe II. Cependant l’action de FNR est abolie par la fixation de IHF et de Fis au niveau de sites adjacents. La fixation de l’activateur secondaire NarL ou NarP est requise pour contrecarrer les effets de IHF ou Fis, notamment en inhibant la fixation de IHF (Browning et al., 2002). 65 Introduction bibliographique Figure 18 : Les mécanismes de régulations mettant en jeu plusieurs facteurs de transcriptions (d’après Browning et Busby, 2004). 66 Introduction bibliographique II.A.4.2 Connexion entre régulateurs : réseau de régulation génétique En plus des mécanismes de régulation au niveau de gènes impliqués dans une fonction particulière, il existe un ensemble de régulation ayant un degré de hiérarchisation plus élevé. En effet, les régulateurs globaux sont eux-mêmes régulés. L’existence d’un réseau de régulation de ce niveau assure à la bactérie un contrôle plus fin de l’ensemble de son métabolisme. Ainsi l’expression des gènes codant des régulateurs globaux tels que CRP ou les NAP est régie par un système de rétrocontrôle interdépendant (Figure 19). Il a été mis en évidence que Fis réprime la transcription de crp (González-Gil et al., 1998), de même que CRP influence directement l’expression de fis (Nasser et al., 2001b). Aussi bien Fis que CRP se fixent aux promoteurs de hupA et hupB (Claret et Rouvière-Yaniv, 1996). Fis est également impliqué dans le contrôle de l’expression de hns (Falconi et al., 1996). La complexité de ces interactions reste pour le moment mal comprise, en particulier la nature des changements en composition de NAP dans un mutant inactivé au niveau du gène codant l’une des autres NAP. Toutefois, les données actuelles indiquent que le réseau d’interactions entre régulateurs est un élément essentiel de la modulation de l’expression génique. Figure 19 : Réseau de régulations entre les régulateurs globaux. Le schéma est simplifié en omettant les autorégulations de certains gènes tels que fis, hns, crp. Les gènes sont indiqués en italique, les protéines en type droit. Les effets activateurs sont représentés par une flèche bleue, les effets répresseurs par une ligne rouge. L’expression des gènes est signalée par une flèche grise (d’après Travers et Muskhelishvili, 2005b). 67 Introduction bibliographique II.A.4.3 La régulation de la synthèse des facteurs de virulence est un processus complexe. Au cours de l’infection, la bactérie pathogène doit faire face à un environnement complexe et hostile. Elle doit donc être capable de mettre en place des réponses adaptatives appropriées, médiées par une modification de l’expression génique (Cotter et Miller, 1998). Les facteurs de transcription régulant l’expression des gènes de virulence peuvent sentir les signaux rencontrés dans l’hôte, comme des changements de température, l’osmolarité, le pH, la concentration en fer, la disponibilité en nutriments, les agents anti-microbiens, le taux d’oxygène,… (MacKichan et al., 2004 ; Mandin et al., 2005 ; Lamy et al., 2004 ; Dramsi et al., 2004 ; Rickman et al.,2005 ; Deziel et al., 2005 ; Dong et al., 2005). En plus de leur action directe sur l’expression des gènes de virulence, les régulateurs de la virulence sont généralement organisés en réseaux qui permettent d’imposer une chronologie dans la synthèse des différents facteurs de virulence. En effet, comme précédemment indiqué, l’infection de l’hôte par le pathogène requiert une production adéquate par ce dernier des facteurs requis aux différents stades du processus infectieux. Le cas du réseau de régulation des gènes de virulence d’E. chrysanthemi sera traité dans le chapitre suivant. IIB Autres mécanismes de la régulation de la synthèse protéique chez les procaryotes Le contrôle de l’expression génique peut également avoir lieu à d’autres niveaux de la chaîne de production. Ainsi, il existe des régulations post transcriptionnelles et post traductionnelles. Ces deux types de contrôle possèdent deux avantages principaux : le premier est de réaliser la synthèse des produits quand les conditions environnementales sont favorables et non quand la bactérie est en stress nutritionnel par exemple, condition limitante pour l’initiation de la transcription. Le deuxième avantage est de disposer immédiatement du produit requis, en s’affranchissant du temps de synthèse et du coût énergétique à cet instant précis. La régulation de l’activité du facteur σS illustre bien ces deux cas. Comme précédemment indiqué, la synthèse de σS est fortement stimulée lors de l’entrée en phase stationnaire de croissance et par divers stress environnementaux (Hengge-Aronis, 2000b). Cette protéine, codée par le gène rpoS, a un poids moléculaire d’environ 38 kDa. Les facteurs 68 Introduction bibliographique σS et σ70 peuvent reconnaître un même promoteur avec la même efficacité in vitro (Ding et al., 1995; Jishage et al., 1996). Pourtant ils contrôlent l’expression de gènes différents puisqu’une inactivation de rpoS réduit fortement ou élimine l’expression des gènes cibles de σS. Comment est assurée la spécificité de σS pour ses séquences promotrices? La structuration des régions régulatrices des gènes cibles (présence d’éléments UP proximale ou distale) et l’augmentation de la concentration cellulaire de σS dans les conditions où il est requis pourrait favoriser la fixation de ce facteur de transcription sur les promoteurs de ses gènes cibles au détriment de σ70. Par ailleurs, comme précédemment indiqué, l’ADN génomique est associé in vivo à différentes protéines, appartenant à la famille des NAP (« protéines associées au nucléoïde »), pour former le nucléoïde ; certaines de ces protéines, notamment H-NS et Fis, interviennent également dans la spécificité des facteurs sigma (Arnqvist et al., 1994; HenggeAronis, 1999). En fait, l’ARN polymérase ne reconnaît pas des séquences sur un ADN linéaire mais plutôt une structure nucléoprotéique complexe dans laquelle l’accessibilité à l’ADN est modulée par les protéines NAP. La sélection des promoteurs par L’ARN polymérase σ70 ou l’ARN polymérase σS serait donc liée à la relative disponibilité des deux facteurs σ et à l’action de certaines protéines NAP. Cet exemple met encore une fois en évidence l’existence d’une connexion entre les protéines NAP et σS. En plus de la phase de croissance, il a été observé que la concentration cellulaire de σS est régulée par différents stimuli tels que : une forte osmolarité, une température faible, un pH acide… (Figure 20). La régulation de la synthèse de σS s’avère donc très complexe. 69 Introduction bibliographique Diminution de la croissance Densité cellulaire Faible Forte température osmolarité rpoS σS Traduction Transcription Absence de source de Température pH acide haute carbone Protéolyse ARNm Enzyme core ARN polymérase Expression des gènes: de virulence de la réponse générale au stress Figure 20 : Régulation du niveau cellulaire de σS en fonction des stimuli extérieurs chez la bactérie Escherichia coli (Hengge-Aronis, 2000b). Stimulus extérieur activateur Stimulus extérieur répresseur La transcription du gène rpoS se fait via un promoteur majeur de type σ70. Durant la phase exponentielle de croissance, chez E. coli, le gène rpoS est significativement transcrit et le niveau de transcription augmente d’un facteur trois à quatre lors de l’entrée en phase stationnaire (Takayanagi et al., 1994). Ce contrôle transcriptionnel implique essentiellement des métabolites s’accumulant en phase stationnaire (le guanosine-3’ 5’bispyrophosphate (ppGpp), l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et le polyphosphate). Les mécanismes d’actions de ces métabolites demeurent non élucidés. Toutefois, la régulation transcriptionnelle influe peu sur la concentration cellulaire de σS chez E. coli ; c’est par contre le niveau de régulation principal dans le genre Pseudomonas où la transcription du gène rpoS est fortement activée en phase stationnaire de croissance (Fujita et al., 1994). Chez E. coli, il y a une quasi absence du facteur σS durant la phase exponentielle de croissance, malgré l’existence d’une transcription effective du gène rpoS, laissant présager une régulation post-transcriptionnelle. L’utilisation de différentes approches expérimentales a montré que la traduction des transcrits rpoS est activée par les divers stimuli qui modulent la concentration cellulaire de σS (Figure 20) (Lange et Hengge-Aronis, 1994). L’augmentation de l’efficacité de la traduction implique une interaction entre les ARNms rpoS et différentes protéines régulatrices d’ARNs (Hfq, RprA, DsrA, la protéine NAP HU), rendant leurs 70 Introduction bibliographique séquences de Shine et Dalgarno plus accessibles aux ARNs ribosomaux. Les régulateurs DsrA et RprA seraient impliqués dans l’induction de la traduction de rpoS par le froid et le stress osmotique, respectivement (Majdalani et al., 2002; Repoila et Gottesman, 2001). En plus de ces systèmes d’activation, deux mécanismes de répression impliquant la protéine NAP H-NS et le régulateur OxyS ont également été mis en évidence ; H-NS et OxyS antagonisent l’action de HU et Hfq, respectivement (Hengge-Aronis, 2000b). Le facteur σS est soumis à une forte protéolyse lors de la phase exponentielle de croissance. Cette dégradation requiert deux partenaires : la protéase ClpXP et le régulateur RssB (Muffler et al., 1996; Schweder et al., 1996). Un modèle du fonctionnement de la protéolyse a été proposé par Hengge-Aronis (Hengge-Aronis, 2000b): sous sa forme phosphorylée, RssB se lie à σS, le complexe est reconnu par ClpXP et σS est dégradé. Les mécanismes de signalisation contrôlant la phosphorylation de RssB sont inconnus. Il apparaît donc que σS est un facteur de transcription de la réponse générale au stress plutôt qu’un régulateur spécifique de la phase stationnaire de croissance. La régulation du niveau cellulaire de σS est donc essentiellement régie par des contrôles post-transcriptionnels chez E. coli et transcriptionnels chez les Pseudomonas. Cette différence de contrôle pourrait être lié au fait que σS a un rôle relativement limité dans la réponse générale au stress chez Pseudomonas. III Erwinia chrysanthemi, une bactérie phytopathogène IIIA Taxonomie des Erwiniae Le genre Erwinia, nommé d’après le phytobactériologiste Erwin F. Smith, a été fondé en 1920 pour réunir les bactéries phytopathogènes à Gram négatif, en forme de bacille, anaérobies facultatives et mobiles (Winslow et al., 1920). Les Erwiniae appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae, elle-même incluse dans le phylum des protéobactéries. Pendant de nombreuses années, une classification proposée par Dye et basée sur des critères de virulence a largement été adoptée (Dye, 1968, 1969a, b, c). Elle subdivisait le genre Erwinia en 4 groupes : les Erwiniae provoquant une nécrose, les Erwiniae pectinolytiques, les Erwiniae à pigment jaune et les Erwiniae atypiques. 71 Introduction bibliographique La comparaison d’une trentaine de séquences d’ADNr 16S d’espèces différentes du genre Erwinia (Hauben et al., 1998; Kwon et al., 1997) et la comparaison de la structure secondaire des ARNr correspondants ont conduit Hauben et al. (1998) à répartir les Erwinia dans quatre genres différents : - Le genre Erwinia regroupe désormais les Erwiniae nécrotiques strictes telles que E. amylovora ou E. rhapontici. - Le genre Pectobacterium regroupe les espèces pectinolytiques dont E. chrysanthemi, E. cypripedii et les cinq sous-espèces d’E. carotovora. Ce genre, comprend les espèces possédant une forte activité pectinolytique qui provoquent la macération des tissus végétaux. - Le genre Brenneria rassemble des espèces responsables des maladies affectant les arbres telles que E. alni ou E. nigrifluens. - Enfin, le genre Pantoea déjà existant (Gavini et al., 1989) comprend les espèces E. herbicola et E. stewartii qui sécrètent un pigment jaune. Quelques autres espèces d’Erwinia ont été reclassées dans le genre Enterobacter, comme E. dissolvens. Certains microbiologistes s'opposent toutefois au classement d'E. chrysanthemi dans le genre Pectobacterium, notamment suite à la comparaison de diverses séquences nucléiques qui tendraient à rapprocher E. chrysanthemi du genre Yersinia. De récentes analyses de ce groupe de bactéries suggèrent qu’E. chrysanthemi devrait être renommée Dickeya dadantii (Samson et al., 2005). Cette nouvelle proposition démontre que la classification des entérobactéries phytopathogènes reste à clarifier. Ces remises en questions perpétuelles et l’usage beaucoup plus courant du terme Erwinia chrysanthemi nous conduisent à continuer d’utiliser l’ancienne dénomination. IIIB Distribution géographique E. chrysanthemi est couramment rencontrée dans les sols (saprophyte) ou à la surface des plantes (épiphyte). D’autres Erwiniae pectinolytiques, comme Erwinia carotovora atroseptica et Erwinia carotovora carotovora, produisent le même type de symptômes. Les pertes économiques associées aux Erwiniae pectinolytiques varient en fonction du climat, mais aussi des pratiques culturales et des conditions de conservation post-récolte. Jusqu’à présent, ces bactéries étaient retrouvées dans des niches écologiques distinctes : Erwinia 72 Introduction bibliographique carotovora atroseptica spécifiquement sur pomme de terre en milieu tempéré, E. chrysanthemi sur de nombreux hôtes en milieu tropical, et Erwinia carotovora carotovora sur une grande diversité d’hôtes et une large répartition géographique (Pérombelon, 2002). Depuis quelques années, les producteurs d’endive et de pomme de terre du nord de la France font face au développement de bactérioses causées par E. chrysanthemi (Hélias et al., 2006). Réchauffement et variations climatiques brusques pourraient en être la cause. L’émergence en milieu tempéré de cette bactérie d’origine tropicale est d’autant plus inquiétante qu’aucun cultivar résistant n’est connu à ce jour et que les moyens de lutte sont limités. Les Erwiniae pectinolytiques sont donc caractérisées par leur répartition géographique mondiale. E. chrysanthemi et E. carotovora sont retrouvées aussi bien sous des climats tropicaux ou subtropicaux que tempérés. Selon les données de l'O.E.P.P., E. chrysanthemi est définitivement présente dans de nombreuses régions du monde (Figure 21). Dans certaines d'entre elles, comme l'Australie, l'Afrique du sud, le Brésil ou Cuba, la bactérie est très largement répandue. Dans la plupart des pays concernés, E. chrysanthemi est répertoriée dans la liste des organismes phytopathogènes de quarantaine. Figure 21 : Distribution géographique d’Erwinia chrysanthemi (O.E.P.P, 2006). 73 Introduction bibliographique IIIC Le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi Comme précédemment indiqué, E. chrysanthemi infecte une large gamme d'hôtes parmi lesquels des plantes monocotylédones et dicotylédones, ornementales (chrysanthème, Saintpaulia ionantha) ou d'intérêt économique (maïs, pomme de terre) (Perombelon et Salmond, 1994). Elle s'attaque aussi bien aux feuilles, qu'aux tiges et aux organes de réserve de ses hôtes (Figure 22). A B C D E Figure 22 : Symptômes causés par E. chrysanthemi. A et B : Pourriture de feuilles de chrysanthème (Institut national de production végétale et de la protection des plantes, de Mayence, Allemagne) C : Macération d’un tubercule de pomme de terre (Laboratoire Microbiologie Adaptation Pathogénie) D : Macération d’un plant d’aloe vera (National Research Centre for Medicinal and Aromatic Plants, India) E : Macération d’une feuille d’endive (Laboratoire Microbiologie Adaptation Pathogénie). 74 Introduction bibliographique Avant d'initier une infection, les Erwiniae se comportent comme des bactéries saprophytes dans le sol et l'eau (Toth et al., 2003). Elles peuvent pénétrer dans les plantes par l'intermédiaire des ouvertures naturelles (les stomates ou les lenticelles) et artificielles (les blessures). Elles peuvent alors rester latentes ou proliférer (Perombelon et Salmond, 1994). La mobilité des bactéries leur permet d'atteindre les différents organes de l'hôte. Même après être parvenues dans les espaces intercellulaires, les bactéries peuvent résider dans ces zones, parfois pendant plusieurs mois, dans un état de quiescence (Perombelon, 2002; Toth et al., 2003). La prolifération dans les tissus vasculaires déclenche une maladie dont les symptômes dépendent des conditions environnementales. Généralement, les Erwiniae pectinolytiques envahissent le parenchyme et provoquent la macération des tissus. Le symptôme de la maladie provoquée par E. chrysanthemi est appelé "pourriture molle", celui dû à E. carotovora est appelé "jambe noire" sur plants de pomme de terre. Le processus de macération implique la déstructuration des parois intercellulaires végétales. Pour ce faire, les bactéries sécrètent un arsenal d’enzymes dégradatives. III.C.1 Un pouvoir pathogène multifactoriel L’interaction entre E. chrysanthemi et ses hôtes est un processus multifactoriel complexe impliquant de nombreux facteurs de virulence. Au cours de l’interaction, les Erwiniae pectinolytiques vont progressivement passer d’un état biotrophe à un état nécrotrophe ce qui implique une chronologie dans la mise en place des fonctions nécessaires à la virulence et à la survie de la bactérie dans la plante. La première phase de l’infection passe par une étape d’adhésion de la bactérie à la plante qui implique des structures de surface telles que le lipopolysaccharide (LPS), les exopolysaccharides (EPS) et l’adhésine HecA. Dans un deuxième temps, E. chrysanthemi doit se multiplier et survivre dans la plante. Cette multiplication est liée à une adaptation à des conditions particulières. Ainsi, E. chrysanthemi, en réponse à la faible disponibilité en fer libre dans les espaces intercellulaires, produit deux sidérophores : la chrysobactine et l’achromobactine qui lui permettent d’entrer en compétition avec les cellules végétales vis-à-vis de l’assimilation du fer (Expert, 1999). Le fer, toxique à l’état libre et très peu soluble, n’existe pratiquement que sous forme complexée dans les plantes et la quantité de fer libre dans les fluides intercellulaires est très faible. E. 75 Introduction bibliographique chrysanthemi 3937 possède plusieurs voies d’acquisition du fer. Outre les gènes fct et acr qui correspondent respectivement aux récepteurs des complexes ferri-chrysobactine et ferriachromobactine, elle possède également un gène fepA qui code le récepteur de l’entérobactine, un sidérophore produit par d’autres entérobactéries notamment Escherichia coli, un gène fhuA qui code le récepteur du ferrichrome, un sidérophore produit par des champignons, ainsi que trois autres gènes codant d’autres récepteurs de ferri-sidérophores potentiels. E. chrysanthemi peut donc assimiler, en plus de ses propres sidérophores, des complexes ferriques produits par d’autres microorganismes (Enard et al., 1988; Enard et Expert, 2000; Persmark et al., 1992). La disponibilité du fer coordonne l’expression de gènes impliqués dans le transport du fer et de plusieurs pectate lyases (Franza et al., 1999; Franza et al., 2002). Au cours de l’interaction avec la plante, E. chrysanthemi produit des signaux éliciteurs qui induisent les défenses de l’hôte. Ces signaux sont les oligogalacturonides issus de la dégradation de la pectine (Legendre et al., 1993; Norman et al., 1999; Reymond et al., 1995) ou des protéines bactériennes comme la flagelline (Zipfel et al., 2004), la harpine HprN (Bauer et al., 1995; Yang et al., 2002), la pectate lyase PelI-3 d’E. chrysanthemi (Shevchik et al., 1998). La mise en place des réactions de défenses de la plante aboutit à la production de peptides antimicrobiens, de composés phénoliques et d’agents oxydants qui ont un fort pouvoir bactéricide. Pour survivre, E. chrysanthemi va alors devoir contrer ces réactions de défense en induisant la synthèse d’un ensemble de facteurs impliqués d’une part dans la détoxification des composés bactéricides et d’autre part dans des mécanismes de réparation des composants cellulaires (El Hassouni et al., 1999; Lopez-Solanilla et al., 1998; Miguel et al., 2000; Reverchon et al., 2002; Santos et al., 2001). E. chrysanthemi a également la capacité de manipuler et de supprimer les réactions de défense de la plante. En effet, cette bactérie produit des protéines effectrices DspE qui, grâce à un système de sécrétion de type III, sont injectées dans la cellule végétale où elles vont interférer avec des cascades de phosphorylation et supprimer l’activation des gènes de défenses (DebRoy et al., 2004; Holeva et al., 2004). Enfin dans une dernière phase du processus infectieux, la bactérie libère une quantité massive des enzymes dégradatives de la paroi végétale provoquant la pourriture molle. Parmi ces enzymes, les pectinases ont un rôle prépondérant puisque purifiées ces enzymes sont capables à elles seules de reproduire les symptômes de la pourriture molle (Collmer et Keen, 1986). De concert avec ces pectinases, d’autres enzymes participent à la dégradation des parois végétales. Deux cellulases, CelY et Cel5, ont été identifiées dans la souche 3937 et 76 Introduction bibliographique participent à la dégradation des fibres de cellulose. D’autres enzymes dégradatives sécrétées par E. chrysanthemi ont été caractérisées dans différentes souches sauvages, parmi lesquelles quatre métalloprotéases PrtA, PrtB, PrtC et PrtG qui sont sécrétées par l’ABC transporteur spécifique PrtDEF (Barras et al., 1994; Delepelaire et Wandersman, 1990), une endoxylanase chez E. chrysanthemi D1 (Hurlbert et Preston, 2001; Keen et al., 1996) et la phospholipase PlcA chez E. chrysanthemi EC16 (Keen et al., 1992). Les gènes correspondant à ces différentes protéines caractérisées chez d’autres souches d’E. chrysanthemi sont présents au sein du génome de la souche 3937 (Glassner et al., en préparation). III.C.1.1 La paroi végétale et la pectine Comme décrit brièvement dans la première partie, la paroi végétale est constituée de matrices polysaccharidiques complexes comprenant de la pectine, de la cellulose et des hémicelluloses (Albersheim et al., 1996). Tous les composants de cette paroi sont interconnectés de façon à former un squelette rigide capable de maintenir la cohésion des tissus végétaux et de résister à la pression de turgescence des cellules végétales. Les polymères de pectine sont les plus complexes des polysaccharides pariétaux. La pectine comprend de longues chaînes linéaires d'homogalacturonanes interrompues par des rhamnogalacturonanes ramifiés, le RG-I et le RG-II (Schols et Voragen, 1996) (Figure 23). Figure 23 : La paroi végétale et la structure biochimique de la pectine A : Composition de la paroi végétale. 77 Introduction bibliographique B : La pectine est un polymère d’acides galacturoniques (GA) liés en α 1-4. Ce squelette contient des zones riches en rhamnose (R), liés en β 1-2 avec les galacturonates suivant, qui introduisent des courbures dans le squelette de la pectine. D’autre part, dans le RGI ces résidus de rhamnose servent d’ancrage aux chaînes d’arabino-galactanes (molécules de pectine neutre) riche en arabinose (A) et en galactose (GL). Le RGI et le RGII constituent les régions ramifiées de la pectine. Les résidus galacturonates peuvent être méthylés sur le carbone 6 ou acétylés sur le carbone 2 et/ou 3. G : D-glucose, X : D-xylose, A : L-arabinose, GA : acide D-galacturonique, R : L-rhamnose, GL : D-galactose, HA : acide 3-désoxy-Dlyxo-heptulosarique, OA : acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique, Ap : D-apiose, F : Lfucose, AA : acide L-acérique, GU : acide D-glucuronique. L'homogalacturonane est un homopolymère de résidus D-galacturonate liés par des liaisons α1-4, parfois interrompu par des résidus rhamnose solitaires qui servent d’ancrage à des chaînes latérales d’oses neutres (arabinogalactanes) dans le RGI. La présence de rhamnose, lié en α 1-2 au galacturonate suivant introduit des courbures dans la molécule de pectine. Le RG-I est composé d'un squelette de disaccharides (2-α-L-rhamnose-(1-4)α-Dgalacturonate-1) portant des chaînes ramifiées riches en galactose et en arabinose (les arabinogalactanes) (Mc Neil, 1980). Le RG-II est composé d'un squelette d'oligogalacturonates (7 à 12 résidus liés en α 1-4) portant des chaînes latérales incluant des monosaccharides divers, dont certains rares et avec des liaisons inhabituelles (Schols et Voragen, 1996; Thomas et Darvill, 1989). La pectine est liée à la cellulose grâce aux hémicelluloses (Bauer et al., 1973). L’ensemble est maintenu en cohésion grâce aux ions Ca2+ qui assurent un pontage entre les molécules de pectine mais aussi grâce à des liaisons covalentes entre les différents constituants pariétaux. La pectine n’est pas un polymère homogène, elle varie par le degré de méthylation du C6 et d’acétylation du C3 ou C2 des résidus galacturonates (on parlera de pectine lorsque l’homogalacturonane est estérifié et de polygalacturonate (PGA) lorsqu’il ne l’est pas), par la longueur de la chaîne principale, par la présence de RGI et la longueur des chaînes d’arabinogalactanes et enfin par la présence de RGII. III.C.1.2 Les pectinases, facteurs de virulence majeurs chez E. chrysanthemi Du fait de la complexité des pectines se trouvant dans les parois végétales, E. chrysanthemi produit diverses pectinases. Elles peuvent être séparées en deux groupes différents : les pectine estérases et les dépolymérases. Une dégradation efficace de la pectine par E. chrysanthemi résulte de l’action concertée de ces deux groupes d’enzymes (Shevchik et 78 Introduction bibliographique Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997) (Figure 24). Nous ne décrirons que les enzymes les plus importantes pour le pouvoir pathogène. Figure 24 : La voie de dégradation et d’assimilation de la pectine Les pectinases extracellulaires (Pem : pectine méthylestérase, Pae : pectine acétylestérase, Pnl : pectine lyase, Pel : pectate lyase, RhiE : rhamnogalacturonate lyase) dégradent les polymères pectiques en oligogalacturonides, majoritairement insaturés (uGAn), qui entrent dans la cellule. Ils sont alors dégradés par les pectinases périplasmiques (PehV, W et X : exopolygalacturonases ainsi que PelX et PaeX) et traversent la membrane interne. Dans le cytoplasme, ils sont catabolisés en pyruvate et 3-phosphoglycéraldéhyde qui entrent dans le 79 Introduction bibliographique métabolisme cellulaire. La pectine peut donc être utilisée comme source de carbone pour la croissance d’E. chrysanthemi. La localisation cellulaire de PelN, PehN, PehK, PnlG et PnlH n’est pas encore connue. L’activité enzymatique de PelN, PehK, PnlG, PnlH n’a pas encore été démontrée. III.C.1.2.a Les pectine estérases Les pectine estérases hydrolysent les groupements méthyles et acétyles de la pectine. Ces enzymes, en diminuant les estérifications présentes dans la pectine, donnent naissance au polygalacturonate (PGA) qui est un substrat plus facilement accessible aux principales pectine dépolymérases produites par E. chrysanthemi. Les pectine méthyl-estérases (Pem) clivent les méthylations de la pectine au niveau des régions d’homogalacturonanes, libérant du méthanol et du PGA. Les pectine acétyl-estérases (Pae) hydrolysent les groupes O-acétyle des homogalacturonanes et libèrent de l’acide acétique et du PGA. E. chrysanthemi 3937 synthétise deux pectine méthyl-estérases, PemA sécrétée et PemB qui est ancrée dans la membrane externe (Laurent et al., 1993; Shevchik et al., 1996), et deux pectine acétylestérases, PaeY sécrétée et PaeX localisée dans le périplasme (Shevchik et HugouvieuxCotte-Pattat, 1997, 2003) (Figure 25). O-CH 3 O-CH 3 CO CO O OH OH COOH COOH O OH O OH O OH COCH 3 O O OH OH OH O O O O COOH COOH COOH O O O O O O OH OH O OH OH acetylesterase pectate lyase methylesterase pectin COCH 3 PelE PemB PelD PemA PaeY PelC PelB PaeX PelA Figure 25 : Production de deux pectine méthyl-estérases et de deux pectine acétyl-estérases ches Erwinia chrysanthemi 3937. Electrofocalisation d’extraits d’Erwinia suivie de révélation 80 Introduction bibliographique enzymatique spécifique. L’action des pectate lyases, principales dépolymérases, est également représentée et utilisée comme marqueur de pI. III.C.1.2.b Les dépolymérases En ce qui concerne les dépolymérases, on distingue deux types d’activités selon le mode de clivage de la liaison glycosidique. D’une part, les pectate lyases qui clivent les liaisons glycosidiques par β-élimination en enlevant un proton et créant une insaturation à l’extrémité non réductrice du polymère. D’autre part, les polygalacturonases qui clivent la liaison glycosidique par un mécanisme d’hydrolyse en incorporant une molécule d’eau par une catalyse acide. Les dépolymérases se distinguent également par leur mode d’attaque du substrat (endo : clivage aléatoire à l’intérieur de la chaîne peptidique ou exo : clivage à partir d’une extrémité de la chaîne de pectine) et par leur substrat préférentiel (degré de méthylation, longueur des polymères…) (Figure 26). COOH COOH O O O-CH 3 O-CH 3 CO CO O O O COCH 3 O OH COOH O O O OH O OH OH OH OH OH OH OH mutant COCH 3 ∆ pel souche sauvage COCH 3 OH PelI PelE PelD PelL PehX, PehW, PehV PelX PelC PelB PelW PelA (cc x 1 x 30) Figure 26 : Production de dépolymérases chez Erwinia chrysanthemi Electrofocalisation d’extraits d’Erwinia suivie de révélation enzymatique spécifique. 3937. Le récent séquençage du génome de la souche 3937 d’E. chrysanthemi (Glasner et al., en préparation) a prédit l’existence de deux pectine lyases potentielles (PnlG et PnlH), onze pectate lyases (PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL, PelN, PelW, PelX, PelZ), cinq 81 Introduction bibliographique polygalacturonases (PehK, PehN, PehV, PehW et PehX) ainsi qu’une rhamnogalacturonate lyase, RhiE. Les pectate lyases jouent un rôle déterminant dans les symptômes de pourriture molle. Elles clivent la pectine faiblement méthylée et libèrent des oligogalacturonides insaturés (uGAn). Chez E. chrysanthemi, parmi les dix pectate lyases caractérisées biochimiquement, neuf sont des endo-pectate lyases et deux des exo-pectate lyases. Au moins 11 pectinases (PemA, PaeY, PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL, PelZ et RhiE) sont sécrétées dans le milieu extérieur par le système de sécrétion de type II Out, où elles génèrent des oligomères pectiques (Laatu et Condemine, 2003; Roy et al., 1999). Les oligomères extracellulaires entrent dans le périplasme dans lequel ils sont désestérifiés et clivés par des enzymes périplasmiques (PemB, PaeY, PelX, PehV, PehW, PehX) (Shevchik et al., 1999b). Les petits oligomères, des dimères aux tétramères, entrent dans le cytoplasme grâce à deux systèmes de transport : TogT et l’ABC transporteur TogMNAB. Dans le cytoplasme, ils sont dégradés en monomères, générant essentiellement du 5-céto-4-désoxyuronate (DKI) et de faibles quantités de galacturonate (Shevchik et al., 1999a) (Figure 24). III.C.1.2.c Les endo-pectate lyases : déterminantes dans le pouvoir pathogène Parmi les endo-pectate lyases, cinq isoenzymes à forte activité in vitro, PelA, PelB, PelC, PelD et PelE, représentent 95% de l’activité pectate lyase en culture. Elles jouent un rôle crucial dans le pouvoir pathogène et elles sont capables hormis PelA de provoquer la pourriture molle sur divers organes végétaux dont des tubercules de pommes de terre et des feuilles d’endives (Barras et al., 1994; Collmer et Keen, 1986). Les autres endo-pectate lyases, PelI, PelL et PelZ (Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al., 1998; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997), sont dites secondaires car elles présentent une activité plus faible sur le polygalacturonate en dosage in vitro. Les endo-pectate lyases ont été arbitrairement séparées en trois groupes en fonction de leur point isoélectrique (pI) (Figure 26). La protéine PelA est la seule à posséder un pI acide, les protéines PelB, PelC, PelI et PelZ ont un pI légèrement alcalin (de 8 à 9.0), enfin le pI de PelD, PelE et PelL est fortement alcalin (>9) (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996; Lojkowska et al., 1995; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997). Par contre toutes ces enzymes possèdent un pH optimum d’activité alcalin, variant entre 8.0 et 9.3. Cependant, à pH neutre, PelA, PelD et PelE conservent une partie non négligeable de leur activité, (25 à 82 Introduction bibliographique 30%), alors que PelB et PelC sont quasiment inactives (Tardy et al., 1997). Au début de l’infection, le milieu intercellulaire végétal colonisé par Erwinia présente un pH légèrement acide (entre 5,0 et 6,5 selon le végétal), ce qui suggère que les enzymes PelA, PelD et PelE sont probablement les plus actives lors de cette étape. L’activité des endo-pectate lyases dépend également de la présence d'un cofacteur ionique divalent, le calcium (Lojkowska et al., 1995; Shevchik et Hugouvieux-Cotte-Pattat, 1997; Tardy et al., 1997). Elles peuvent être séparées en deux groupes : PelA, PelD et PelE agissent préférentiellement sur la pectine non méthylée, les autres pectate lyases ont une activité optimale sur la pectine partiellement méthylée (Tardy et al., 1997). L’activité in vitro des Pels varie selon la longueur de la chaîne du substrat. Ainsi, PelD a une activité optimale sur des tétramères, PelB sur des hexamères et PelA, PelI et PelL sont plus actives sur des heptamères et octamères (Roy et al., 1999). Cette diversité des pectate lyases permet à E. chrysanthemi de dégrader des pectines variées et d’infecter un large spectre d’hôtes. Des tests d’infection sur des plants de Saint paulia, hôte naturel d’E. chrysanthemi, ont révélé une relative forte implication des pectate lyases E, A et D dans le pouvoir pathogène de cette bactérie (Figure 27). Figure 27 : Rôle de différentes pectinases dans le pouvoir pathogène d’Erwinia sur Saintpaulia. Le pourcentage des plants présentant une infection généralisée, 15 jours après inoculation, est indiqué en rouge. Au contraire, le pourcentage de plants pour lesquels une absence de symptômes ou une macération localisée a été observée après le même délai est indiqué en bleu (d’après Boccara et al., 1988). 83 Introduction bibliographique III.C.1.2.d Organisation génétique des pectinases Les gènes de pectinases sont dispersés en 14 loci sur le chromosome bactérien (Figure 28). pel pehV pehW Ori pelB pelC pnl 4910/ 4572 0 4433 peh pelA pelE 630 pe (4922 kb) 3430 cel5 pelL 3099 2879 2575 pnl kduI peh 1306 3573 pae rhi Erwinia chrysanthemi 1030 3856 3937 2014 2225 pem ogl Organisation transcriptionnelle : P pelA PpelE PpelB PpelC P pelD paeY PpemA PpelZ ADN } ARNm P pehW P pehX pnlG pehK pelX pnlH pehN pelI ADN } ARNm kduI PpehV pelN pemB kduD pelW togM togN togA togB kdgM paeX cel5 ADN ARNm rhiE pelL Figure 28 : Organisation génétique des pectinases. A: Localisation chromosomique des gènes codant les pectinases. La direction des flèches indique le sens de transcription sur le chromosome et les chiffres correspondent à la position en kb par rapport à l’origine de réplication OriC. B : Organisation transcriptionnelle des pectinases. Les différentes pectinases sont indiquées par des couleurs : vert, pectate lyases; rose, polygalacturonases ; rouge, pectine méthylestérases ; bleu, pectine acétylestérases, bleu ciel, rhamnogalacturonate lyase. Certains loci contiennent un gène isolé, c'est le cas pour rhiE, pelI, pelL, pelX, pelN, pnlG, pnlH, pehK, pehN et pemB alors que d'autres loci regroupent plusieurs gènes de pectinases, notamment dans le locus pelA, pelE, pelD, paeY, pemA, le locus pelB, pelC, pelZ, ainsi que le locus pehV, pehW, pehX (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1989; Pissavin et al., 1996). Lorsque les ARN issus de ces loci sont étudiés, on constate qu'à l'exception du gène paeY, chaque gène peut être exprimé comme une unité transcriptionnelle indépendante (Figure 28). Il existe un ARN polycistronique couvrant les gènes pelD, paeY et pemA, ainsi 84 Introduction bibliographique qu'un ARN polycistronique pour les gènes pelC et pelZ (Shevchik et Hugouvieux-CottePattat. 1997 ; Pissavin et al. 1996). Les gènes pelW et paeX sont quant à eux insérés dans un locus qui réunit différents gènes impliqués dans la voie catabolique de la pectine, notamment kdgM codant une porine de la membrane externe spécifique des oligogalacturonides, les gènes togMNAB codant l’ABC transporteur impliqué dans l'entrée des oligogalacturonides dans le cytoplasme ainsi que les gènes kduI et kduD permettant l'isomérisation et l'oxydation du 5céto-4-désoxyuronate (DKI), le monomère principal issu du clivage des oligogalacturonides. L’existence de promoteurs indépendants pour la plupart des gènes de pectinases suggère que chaque gène va pouvoir être exprimé de façon différentielle dans les conditions particulières rencontrées dans la plante. IIID Régulation de la dégradation de la pectine chez Erwinia chrysanthemi La synthèse des Pels est soumise à un contrôle très fin qui permet à la bactérie de s’adapter rapidement aux conditions rencontrées lors de l’infection. La présence de la pectine et la densité cellulaire sont les facteurs agissant le plus fortement sur la synthèse des pectinases. D’autres facteurs environnementaux (présence d’extraits de plante, température, pH, osmolarité, carence en fer, en azote ou en oxygène, nature du sucre métabolisable) contrôlent la synthèse de ces enzymes (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996; Nasser et Reverchon, 2002; Reverchon et al., 1998). Pour certains de ces signaux, les régulateurs associés ont été caractérisés. III.D.1 Inductions par les composés végétaux III.D.1.1 Le répresseur KdgR KdgR est un régulateur global des gènes impliqués dans le catabolisme de la pectine et des fonctions associées dont le système Out nécessaire à la sécrétion des pectinases et de la cellulase Cel5 (Condemine et al., 1992; Reverchon et al., 1991). Le gène kdgR code une protéine de 30 kDa appartenant à la famille du répresseur transcriptionnel IclR (Reverchon et al., 1991; Thomson et al., 1999). L’induction des gènes de la pectinolyse par la pectine est 85 Introduction bibliographique principalement contrôlée par ce répresseur qui se fixe sous forme de dimère sur les régions régulatrices des gènes cibles in vivo (Nasser et al., 1994). KdgR interagit avec une séquence d’ADN de 25 pb qui comprend le motif palindromique AAATGAAACANTGTTTCATTT (Nasser et al., 1994). En absence de pectine, KdgR réprime l’expression des gènes pel en masquant le site de fixation de l’ARN polymérase ou en s’opposant à l’initiation de la transcription (Nasser et al., 1994; Robert-Baudouy et al., 2000; Shevchik et al., 1997a). En revanche, en présence de pectine, le niveau de base de synthèse des pectinases permet la formation de KDG (2-céto-3-désoxygluconate), un produit de dégradation de la pectine (Figure 24). Ce dernier, qui est l’inducteur intracellulaire vrai, va se complexer avec le répresseur KdgR qui perd alors son affinité pour l’ADN et les gènes pel sont efficacement transcrits (Nasser et al., 1994). Les complexes KdgR-ADN peuvent être dissociés par le KDG (Nasser et al., 1992). Bien que la fixation directe de KdgR sur les régions régulatrices de nombreux gènes contrôlés in vivo ait été mise en évidence in vitro (Nasser et al., 1994), d'autres gènes, comme pemA, pelZ, kdgA et outC, semblent indirectement régulés par KdgR. Les régions régulatrices des gènes pemA, pelZ, outC, kduD et kdgA ne fixent pas KdgR in vitro dans les conditions testées. KdgR pourrait réguler l'expression de ces gènes de manière indirecte, soit en impliquant le promoteur d’un gène situé en amont via la formation d’un messager polycistronique soit via une cascade de réactions impliquant d’autres protéines régulatrices. Par exemple, KdgR contrôle directement l'expression du gène outT dont le produit est un activateur de la transcription de l'opéron outC-M (Condemine et Robert-Baudouy, 1995). Le gène pelZ peut être transcrit comme une unité transcriptionnelle indépendante mais également en opéron avec pelC, dont la région régulatrice comporte un site de fixation de KdgR (Pissavin et al., 1996). Récemment, l’utilisation d’une approche bioinformatique, couplée à une vérification expérimentale, a révélé l’existence de nouveaux gènes contrôlés par le régulateur KdgR (Rodionov et al., 2004). Dix nouveaux gènes présentent un site de fixation de KdgR et sont fortement régulés in vivo par KdgR. La fonction de ces gènes n’est pas encore connue. Les gènes pecT et sotA, codant un régulateur et un transporteur de sucres sont également régulés par KdgR, mais à un niveau plus faible. De plus, dans le cas de pecT, KdgR agit en tant qu’activateur. Cette fonction d’activation par KdgR n’avait jamais été soupçonnée pour cette protéine considérée précédemment comme répresseur uniquement (Rodionov et al., 2004). Le régulateur KdgR n’est pas la seule protéine responsable de l’induction des gènes pel par les composés pectiques. En effet, les gènes pel sont déréprimés dans un mutant kdgR 86 Introduction bibliographique mais restent inductibles en présence de pectine (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1996). De plus, l’expression du gène pelL est induite en présence de PGA, mais ce gène n'est pas une cible de KdgR (Lojkowska et al., 1995). Ces observations suggèrent l'existence d'autres mécanismes de régulation répondant à la présence de pectine. III.D.1.2 Le régulateur Pir Chez E. chrysanthemi EC16, dans un mutant pir (pour plant-inducible regulator), la synthèse des Pels est fortement diminuée et n’est plus inductible par les extraits de plantes. La virulence de ce mutant est atténuée (Nomura et al., 1998). Pir agirait donc comme un activateur. Pir active également l’expression de son propre gène (Nomura et al., 1999). La protéine Pir a une masse moléculaire de 30 kDa et appartient tout comme KdgR à la famille des régulateurs transcriptionnels IclR. Elle se fixe à l’ADN sous forme de dimère sur une séquence de 35 pb, identifiée à ce jour uniquement sur le promoteur de pelE de la souche EC16 (Nomura et al., 1998). Le site de fixation à l’ADN de Pir recouvre celui de KdgR suggérant une compétition entre les deux régulateurs pour leur fixation sur la région régulatrice de pelE. En présence de PGA, les inducteurs intracellulaires comme le KDG empêchent la fixation de KdgR, ce qui permettrait la fixation de Pir et une surinduction en présence du signal auquel répond Pir, ce composé n’étant pas encore identifié. Dans la souche d’E. chrysanthemi 3937, un mutant pir présente par contre une augmentation de la synthèse des pectinases en condition non induite ce qui suggère plutôt un rôle de répresseur pour la protéine Pir (Reverchon et al., résultats non publiés). III.D.2 La répression catabolique La synthèse des Pels est fortement diminuée en présence de glucose (HugouvieuxCotte-Pattat et al., 1996). Ce phénomène connu sous le terme de répression catabolique implique la protéine CRP (cyclic AMP Receptor Protein) et la molécule signal AMP cyclique (AMPc). CRP est une protéine de 210 acides aminés qui présente 98% d’identité avec les protéines CRP d'E. coli, S. typhimurium ou K. pneumoniae. Le complexe CRP-AMPc activerait la transcription des gènes pel par un mécanisme direct en favorisant la fixation de l’ARN polymérase (Nasser et al., 1997). En présence de glucose, le taux d’AMPc dans la cellule chute, ce qui aboutit à une diminution de la disponibilité du complexe CRP-AMPc et 87 Introduction bibliographique par voie de conséquence à une diminution de l’expression des gènes pel. Un mutant crp est déficient dans la production des pectinases et son pouvoir pathogène est sévèrement affecté. D’autre part, un mutant crp se développe sur glucose mais est incapable d'assimiler la plupart des autres sources de carbone comme le PGA, le galacturonate, le glycérol et le mannitol (Reverchon et al., 1997). CRP active l'expression des gènes pelB, pelC, pelD et pelE mais pas de pelA (Reverchon et al., 1997). En l’absence de KdgR, l’expression de pelA semble au contraire être réprimée par CRP (Reverchon et al., 1997). L'affinité de CRP pour la région régulatrice de ses gènes cibles est bien corrélée au taux de régulation observé in vivo. Cette affinité est maximale pour les promoteurs de pelD et pelE, ce qui est parfaitement en accord avec le fort niveau d'expression de ces gènes en conditions induites (Nasser et al., 1997). III.D.3 Régulation par diverses conditions physico-chimiques III.D.3.1 Osmolarité La pression osmotique est une variable importante de l’environnement qui peut affecter le pouvoir pathogène. Chez E. chrysanthemi, la pression osmotique affecte à la fois la croissance de la bactérie et la production des Pels. Une forte osmolarité induit l’expression de pelE mais diminue celles de pelD et pelL (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Lojkowska et al., 1995). L’expression des gènes pelA, pelB, pelC, pelI et pelZ ne semble pas régulée par l'osmolarité (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al., 1997b). L'effet inhibiteur d'une forte osmolarité peut être relevé par les osmoprotectants (glycine bétaïne, proline, ectoïne, acide pipecolique...) (Gouesbet et al., 1995; Prior et al., 1994) qui s'accumulent dans les cellules via des systèmes de transport spécifiques comme OusA, et OusB (Choquet et al., 2005; Gouesbet et al., 1996). Les principaux régulateurs globaux contrôlant le stress osmotique chez E. coli, à savoir sigma S, H-NS et Hfq sont présents chez E. chrysanthemi et sont également impliqués dans le stress osmotique (Gouesbet et al., 1996). Chez E. chrysanthemi, un mutant hns présente une plus grande sensibilité aux fortes osmolarités, suggérant une implication de cette protéine dans l’osmoadaptation de cette bactérie (Nasser et al., 2001a). 88 Introduction bibliographique III.D.3.2 Température La production des pectate lyases diminue généralement lorsque la température est supérieure à la température optimale de croissance de la bactérie (30°C). Cette thermorégulation est plus importante pour les gènes pelA, pelD et pelE que pour les autres gènes pel (Hugouvieux-Cotte-Pattat et Robert-Baudouy, 1992; Lojkowska et al., 1995). Chez E. chrysanthemi, la modulation de la synthèse des Pels en fonction de la température pourrait faire intervenir la protéine H-NS. En effet, l’induction de l’activité Pel à 25°C n’est plus observée dans un mutant hns (Nasser et al., 2001a). III.D.3.3 pH Quand les Erwiniae spp. infectent les plantes, elles colonisent dans un premier temps le fluide intercellulaire apoplastique dont le pH varie entre 5 et 6,5 (Nachin et Barras, 2000). Dans les étapes plus avancées de la colonisation, les bactéries induisent la lyse des cellules végétales et provoquent une alcalinisation du milieu. Les feuilles de chicorée passent ainsi d’un pH acide à basique lors de l’infection par E. chrysanthemi. La synthèse des Pels est affectée par le pH qui peut donc jouer un rôle important dans leur production lors de l’infection (Nachin et Barras, 2000). Les gènes pelA et pelD sont plutôt exprimés en milieu acide alors que pelE est transcrit à pH alcalin. Ces résultats suggèrent que PelA et PelD seraient importants lors des étapes précoces de l’infection quand le pH environnant est acide et inversement, PelE serait nécessaire lors des étapes plus tardives de l’infection lorsque le pH devient basique. Ainsi le pH pourrait être responsable d’une production séquentielle des Pels au cours de l'infection. Le mécanisme de régulation de l'expression des gènes pel en réponse au pH est inconnu. III.D.3.4 Carence en fer En réponse à une carence en fer, E. chrysanthemi synthétise deux sidérophores, la chrysobactine et l’achromobactine (Expert et al., 1996). La chrysobactine a beaucoup plus d’affinité pour le fer et sa synthèse est nécessaire lorsque la carence en fer est très sévère. La disponibilité du fer est très importante dans la régulation de la virulence d’E. chrysanthemi. La privation de fer induit la synthèse de pelB, pelC, pelD, pelE et pelL (Masclaux et al., 1996; 89 Introduction bibliographique Sauvage et Expert, 1994). Le répresseur transcriptionnel Fur (pour ferric uptake regulation) qui utilise l’ion fer comme co-facteur, est responsable de cette régulation des pectinases. Dans un mutant fur, l’expression des gènes pelD et pelE est déréprimée indépendamment de la concentration en fer dans le milieu (Franza et al., 1999). Les sites de fixation de Fur sont situés au voisinage des séquences d’ADN reconnues par CRP. Fur inhiberait ainsi la fixation de CRP et donc l’activation de la transcription qui en résulte (Franza et al., 2002). Cependant le maintien de l'induction de l'expression de pelD et pelE dans un mutant fur en carence en fer suggère l'existence d'un autre système de régulation par le fer (Franza et al., 1999). Fur régule également directement l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse et le transport de la chrysobactine et de l’achromobactine (Franza et al., 1999; Franza et al., 2002; Franza et al., 2005; Sauvage et al., 1996). III.D.3.5 Carence en oxygène et en azote La maladie provoquée par les Erwiniae pectinolytiques est plus sévère si la concentration en oxygène est faible (Perombelon, 1990). Bien que la synthèse globale des pectate lyases augmente en semi-anaérobiose, chaque gène répond différemment à la limitation en oxygène. Ainsi l’expression de pelA, pelD, pelE et pelI est stimulée, celle de pelB, pelC et pelL n'est pas affectée, et celle de pelZ est réduite (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992). La carence en azote inhibe l’expression de l’ensemble des gènes codant les endopectate lyases (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992; Lojkowska et al., 1995; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al., 1997b). La respiration anaérobie sur le nitrate, qui se trouve en quantité suffisante dans les tissus végétaux, faciliterait la prolifération bactérienne (Smid et al., 1993). Les fertilisants azotés favoriseraient ainsi la pourriture molle, à l'inverse d'une carence en azote (Canaday, 1992; Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992). Les régulateurs contrôlant l’expression des gènes pel en réponse au taux d’oxygène et d’azote n’ont pas encore été identifiés. III.D.4 Les régulateurs répondant à des signaux encore inconnus Lors d’expériences de mutagenèses aléatoires, deux régulateurs PecS et PecT ont été identifiés comme des répresseurs de l’expression des gènes pel. Le rôle précis de ces deux 90 Introduction bibliographique régulateurs ainsi que celui de H-NS restent mal définis en raison de l’absence d’informations concernant les signaux qui modulent l’activité de ces régulateurs. Cependant, il apparaît clairement que ces régulateurs participent à la coordination de l’expression de diverses fonctions impliquées dans le pouvoir pathogène, incluant les Pels, ce qui permet à E. chrysanthemi d’ajuster de façon coordonnée la production des divers facteurs de virulence. III.D.4.1 PecS L’inactivation du gène pecS chez E. chrysanthemi aboutit à la dérepression des gènes pel, du gène cel5, des gènes prtA, B, C et G codant quatre métalloprotéases extracellulaires, des gènes out impliqués dans la machinerie de type II nécessaire à la sécrétion des pectinases et des cellulases, et des gènes indA, B et C impliqués dans la production d’un pigment bleu, l’indigoïdine (Reverchon et al., 1994). Des mutants déficients dans la production d’indigoïdine sont incapables d’envahir la plante hôte et l’indigoïdine confère une résistance accrue au stress oxydant, indiquant que ce composé pourrait protéger les bactéries contre les radicaux oxygénés générés pendant la réaction de défense de la plante (Reverchon et al., 2002). D’autre part, PecS réprime également la synthèse de la protéine harpine HrpN (Nasser et al., 2005) qui induit les réactions de défense de la plante et en particulier la production de radicaux oxygénés suspectés d’inactiver le régulateur PecS (Reverchon et al. 2002). La protéine PecS, de 20 kDa, appartient à la famille des régulateurs transcriptionnels de type MarR qui sont généralement impliqués dans des processus de détoxification (Sulavik et al., 1995). Le signal auquel répond PecS est encore inconnu mais les protéines de la famille MarR reconnaissent généralement des composés phénoliques. PecS se fixe sous forme de dimère aux promoteurs de ses gènes cibles (Praillet et al., 1996; Reverchon et al., 2002b). PecS réprime également l’expression de son propre gène. Le site de fixation de PecS sur l’ADN peut recouvrir le promoteur comme dans le cas de pecS et cel5 (Praillet et al., 1996, Rouanet et al., 2004), ou se trouve en aval des promoteurs des gènes contrôlés comme dans le cas des gènes outC et expI (Praillet et al., 1996 ; Reverchon et al., 1998). III.D.4.2 PecT Le répresseur PecT contrôle la synthèse de la plupart des Pels mais également celle des EPS et de la harpine HrpN (Condemine et al., 1999; Pissavin et al., 1996; Shevchik et al., 91 Introduction bibliographique 1997; Surgey et al., 1996; Nasser et al., 2005). Outre sa capacité à surproduire des pectate lyases, un mutant pecT forme des colonies muqueuses sur milieu minimum solide et les cellules floculent en milieu minimum liquide. PecT agit donc à plusieurs niveaux dans l'expression des facteurs de virulence. PecT est un régulateur de type LysR et, comme beaucoup de régulateurs de cette famille, il contrôle fortement sa propre synthèse (Castillo et Reverchon, 1997). III.D.4.3 H-NS La protéine H-NS d’E. chrysanthemi contrôle la synthèse de différents facteurs de virulence parmi lesquels les pectate lyases (Nasser et al., 2001a). H-NS exerce un effet global d’activateur sur l’expression des gènes pel. Comme précédemment indiqué, cette activation résulte principalement d’un contrôle négatif direct de H-NS sur l’expression du gène pecT (Nasser et Reverchon, 2002). Ainsi, dans un mutant hns, la surproduction du répresseur PecT aboutit à une forte inhibition de la synthèse des pectinases. H-NS contrôle également la mobilité et la synthèse des EPS. III.D.5 Régulation en fonction de la phase de croissance III.D.5.1 Sigma S Chez les Erwinia pectinolytiques, l'expression des gènes pel est fortement induite à la fin de la phase exponentielle de croissance (Hugouvieux-Cotte-Pattat et al., 1992). Chez E. coli, l'expression des gènes induits en phase stationnaire et dans certaines conditions de stress requiert le facteur sigma S de l'ARN polymérase. L’analyse d’un mutant rpoS d’E. carotovora révèle qu’il présente une plus grande sensibilité au stress oxydant et produit plus de pectinases (Andersson et al., 1999; Mukherjee et al., 1998). Ce dernier phénotype serait en fait lié au contrôle positif qu'exerce RpoS sur la transcription du gène rsmA qui participe à la régulation de la synthèse des Pels via un mécanisme post-transcriptionnel. La construction d’un mutant rpoS de la souche d’E. chrysanthemi 3937 a également révélé une légère augmentation de la synthèse des pectinases dans ce contexte génétique mais cette synthèse reste dépendante de la phase de croissance (Reverchon et al., résultats non publiés). 92 Introduction bibliographique III.D.5.2 Régulation par la densité cellulaire : le quorum sensing Un mécanisme couramment utilisé par les bactéries pour assujettir l’expression des gènes de virulence à la densité cellulaire est le « quorum sensing » (QS). Il s’agit d’un mécanisme de communication intercellulaire via de petites molécules diffusibles dont la concentration est le reflet de la densité cellulaire. Chez les bactéries à Gram négatif, ce contrôle se fait principalement par le biais des N-acyl-homosérine lactones (acyl-HSLs) (Fuqua et al., 1994). Ce système a été décrit pour la première fois chez la bactérie Vibrio fischeri où le QS implique le couple de protéines LuxI/LuxR. LuxI est une synthétase catalysant la formation d’acyl-HSLs tandis que LuxR est un régulateur transcriptionnel (Fuqua et al., 1994). Chez E. chrysanthemi, deux acyl-HSLs différentes ont été caractérisées : la N-(3oxohexanoyl)-homosérine lactone (3-oxo-C6-HSL) et la N-hexanoyl-homosérine lactone (C6HSL) (Nasser et al., 1998). Un troisième composé capable d’activer des systèmes rapporteurs sensibles aux acyl-HSLs a également été détecté dans le surnageant de culture de la souche 3937 mais la structure de ce composé reste inconnue. De plus, deux gènes convergents, expI et expR, codant deux protéines homologues à LuxI et LuxR de V. fischeri ont été caractérisés (Nasser et al., 1998). ExpI catalyse la synthèse des composés 3-oxo-C6-HSL et C6-HSL. En revanche, le locus responsable de la production du troisième composé n’est pas connu. Le mutant expR ne présente pas de phénotype notable en ce qui concerne la synthèse des Pels. Cependant, des expériences d’interaction ADN-protéine réalisées in vitro ont montré que la protéine ExpR purifiée se fixe de façon spécifique sur les régions régulatrices des gènes pelA, B, C, D et E (Nasser et al., 1998). L’absence de phénotype du mutant expR laisse donc présager l’existence chez E. chrysanthemi, d’un ou plusieurs homologues fonctionnels de ExpR. Par ailleurs, dans un mutant expI, l’activité Pel totale n’est pas significativement affectée et, parmi les gènes codant les Pels majeures, seule l’expression de pelA et pelB est diminuée (Nasser et al., 1998). ExpR se fixe sur les régions régulatrices des gènes pel mais aussi sur celles du gène expI et de son propre gène (Reverchon et al., 1998). La 3-oxo-C6HSL dissocie les complexes ExpR-ADN dans le cas du gène expR et modifie la migration des complexes obtenus avec les gènes expI ou pel, ce qui suggère que l’interaction de ExpR avec cette acyl-HSL modifie sa fixation à l’ADN (Nasser et al., 1998; Reverchon et al., 1998; Castang et al., 2006). Les sites de fixation de ExpR sont situés en amont des régions –10 et – 35 dans le cas des gènes pel et expI. En revanche, dans le cas de expR, la zone protégée par la fixation de ExpR recouvre en grande partie les deux promoteurs de ce gène (Nasser et al., 93 Introduction bibliographique 1998; Reverchon et al., 1998a; Castang et al., 2006). De manière cohérente, des travaux récents ont montré que ExpR réprime directement l’expression de son propre gène en agissant au niveau de l’initiation de la transcription et que cette action est levée en présence de 3-oxoC6-HSL (Castang et al., 2006). III.D.6 Modulation de l’expression des gènes de régulateurs : réseau Comme nous venons de le voir, la régulation de la synthèse des Pels met en jeu plusieurs régulateurs répondant à différents signaux. Une étude intégrative a montré que les régulateurs sont interconnectés, laissant présager une organisation en réseau (Reverchon et al., 1998 ; Nasser et Reverchon, 2002). Cette hypothèse a été récemment confirmé par modélisation mathématique (Sepulchre et al., 2007) (Figure 29). 94 Introduction bibliographique Figure 29: Réseau de régulation contrôlant l’expression des gènes pel chez Erwinia chrysanthemi. Les régulations négatives et positives sont représentées en bleu et en rouge, respectivement. L’épaisseur des traits traduit l’importance d’une régulation. Les formes inactives des régulateurs apparaissent en jaune. 95 Introduction bibliographique Le régulateur global H-NS réprime l’expression de expI, expR et pecT (Nasser et Reverchon, 2002). CRP active la transcription de expR et réprime celle de expI ce qui pourrait expliquer l'effet répresseur de CRP sur l'expression de pelA (Reverchon et al., 1998). En effet, dans un mutant crp l’expression de pelA est augmentée alors qu’aucune interaction directe entre ce régulateur et la région promotrice de pelA n’a pas été mise en évidence (Nasser et al., 1997). L’accumulation d’acyl-HSLs chez un mutant crp pourrait être responsable de l’induction de pelA (Reverchon et al., 1998). PecS réprime l'expression de expI et ExpR active l’expression de pecS (Reverchon et al., 1998). La régulation par la protéine Pir semble indépendante de KdgR, PecS et CRP puisque aucun de ces régulateurs ne semble contrôler l'expression du gène pir (Nomura et al., 1999). L’effet activateur de KdgR sur la synthèse du régulateur PecT est un nouvel exemple de connexion entre deux systèmes de régulation de la synthèse des Pels (Rodionov et al., 2004). En résumé, il apparaît que le réseau de régulation des gènes pel est hiérarchisé avec un rôle prépondérant pour les régulateurs généraux CRP et H-NS ; ces deux régulateurs pourraient constituer des nœuds permettant une mise en œuvre séquentielle du réseau (Sepulchre et al., 2007). L’existence d’un tel réseau de régulation pourrait permettre à E. chrysanthemi de moduler finement la synthèse des Pels en fonction des conditions de l’environnement et de son état physiologique. Ainsi la bactérie pourrait induire l’expression des différents gènes pel au bon moment et au bon endroit lors du processus infectieux. Par ailleurs, étant donné que la plupart des acteurs de ce réseau contrôlent d’autres facteurs de virulence en plus des Pels, cette organisation hiérarchisée pourrait permettre une bonne coordination de la production des facteurs requis aux différents stades du processus infectieux. 96 1er article Résultats Objectifs de l’étude L’agressivité de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, comme nous l’avons vu précédemment, est essentiellement liée à sa capacité à coordonner une production massive de différents facteurs de virulence dont les pectate lyases (Pels), enzymes essentiels du pouvoir pathogène. La synthèse des Pels est soumise à une régulation complexe et répond à divers stimuli, tels que la présence de pectine ou d’extraits de plantes, la phase de croissance, la température et la concentration en fer. Les effets de la pectine et de la phase de croissance sont prépondérants. En dépit des travaux déjà réalisés, les réponses à certains stimuli, notamment la phase de croissance, sur la synthèse des facteurs de virulence n’ont pas encore été élucidées. Le génome d’E. chrysanthemi étant séquencé, une approche prometteuse pour élucider ce mode de régulation consistait à analyser l’action des homologues des régulateurs contrôlant la synthèse de facteurs de virulence en fonction de la phase de croissance chez des bactéries taxonomiquement proches. Des résultats publiés au début de cette thèse faisaient état d’une implication de la protéine associée au nucléoïde Fis dans la régulation phase de croissance-dépendante s'exerçant sur la synthèse de différents facteurs de virulence chez des bactéries pathogènes de l’homme dont les souches entéropathogéniques d’Escherichia coli et Salmonella typhimurium (Falconi et al., 2001 ; Wilson et al., 2001 ; Kelly et al., 2004). Fis apparaissait donc comme un candidat prometteur pour la régulation des facteurs de virulence par la phase de croissance chez E. chrysanthemi. L’objectif principal de cette thèse était de vérifier cette hypothèse. La première partie du travail a consisté à caractériser génétiquement le mutant fis d’E. chrysanthemi, à évaluer son pouvoir pathogène et à déterminer l’effet de Fis sur la régulation de la synthèse des principaux facteurs de virulence, dont les Pels. La deuxième partie de cette étude a porté sur une caractérisation plus fine du mécanisme moléculaire de Fis sur la régulation de la production des Pels. Pour ce faire, l’action de Fis a été intégrée au complexe multiprotéique agissant au niveau des promoteurs des gènes pel ainsi qu’au réseau de régulation de ces gènes. Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec le laboratoire du professeur Georgi Muskhelishvili (Jacobs University of Bremen, Germany) dont les études portent en partie sur la caractérisation fonctionnelle de la protéine Fis chez E. coli. 97 1er article Résultats RESULTATS I 1er ARTICLE: La protéine associée au nucléoïde Fis coordonne l’expression de s principaux g è ne s de virulence de la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi. Les enzymes pectinolytiques, en particulier, les pectate lyases (Pels), jouent un rôle clef dans les symptômes de pourriture molle générée par Erwinia chrysanthemi. Toutefois une colonisation efficace des plantes par la bactérie requiert des facteurs de virulence additionnels. Ces facteurs incluent la harpine HrpN, la cellulase principale Cel5, des protéases (Prts), les protéines flagellaires et le système Sap, impliqué dans la détoxification des peptides antibactériens produits par la plante en réponse à l’infection. HrpN et les flagelles sont principalement impliqués dans les étapes initiales de l’infection alors que les enzymes dégradatives (Pels, Cel5, Prts) sont requis dans les stades avancés de l’infection. La production de ces facteurs de virulence est finement régulée par les conditions environnementales. Ce premier article décrit la caractérisation génétique et biochimique de l’opéron fis d’E. chrysanthemi et l’implication de Fis dans le contrôle de la virulence de la bactérie. Comme précédemment montré chez Escherichia coli et chez plusieurs entérobactéries pathogènes des animaux, Fis constitue un opéron avec le gène orfI. La régulation de cet opéron par la phase de croissance et le rétro-contrôle négatif observés chez E. chrysanthemi sont également similaires à ceux précédemment décrits. Notons que la synthèse de Fis est maximale en tout début de phase exponentielle de croissance et que ce pic de synthèse est suivi par une diminution progressive de la concentration cellulaire de la protéine qui devient quasiment indétectable durant la phase stationnaire (voir introduction bibliographique, chapitre II.A.3.1). De plus, le mutant fis d’E. chrysanthemi présente des caractéristiques communes avec ceux du pathogène humain Salmonella typhimurium à savoir la perte de mobilité et une croissance ralentie en milieu riche LB. En revanche, le mutant fis d’E. chrysanthemi a révélé 98 1er article Résultats une particularité, non décrite chez les autres bactéries, qui est une forte capacité d’agrégation en milieu liquide complexe LB. Cette observation laisse présager une implication de Fis dans le contrôle de la synthèse d’une structure de surface d’E. chrysanthemi encore inconnue. Ces analyses phénotypiques générales ont été complétées par une évaluation de l’action de Fis sur la synthèse des protéases et des pectate lyases, enzymes dont l’activité est quantifiable sur des milieux synthétiques. Ainsi le mutant fis s’est avéré produire moins de protéases que la souche parentale. Concernant l’activité Pel, elle s’est avérée retardée et augmentée durant la phase stationnaire de croissance dans un mutant fis. La synthèse des Pels étant sous le contrôle d’un réseau de régulation complexe, les mécanismes d’action de Fis sur la régulation de la production de ces enzymes sont présentés dans le deuxième article. L’effet de Fis sur l’expression de différents gènes de virulence a été par la suite analysé au cours des différents stades de la croissance bactérienne. Les choix pour cette étude concernent les gènes impliqués dans les étapes initiales (codants le composant du flagelle FliC et la harpine HrpN), précoces (Sap, un système de détoxification) et des étapes avancées du processus infectieux (Cel5, cellulase majeure et PrtC, une protéase). L’utilisation de la technique de fusion de gènes ou de la RT-PCR quantitative a révélé que Fis active l’expression de hrpN, fliC, sap et prtC au cours de la croissance avec une action très marquée sur l’expression de hrpN, prtC et fliC. Pour cel5, une action de répresseur est observée également le long de la croissance mais avec un effet plus prononcé au début de la phase exponentielle de croissance. Ainsi, le profil de régulation de ces gènes cibles ne concorde pas strictement avec l’accumulation temporelle de Fis dans la cellule. La plupart de ces contrôles se fait via un mécanisme d’action direct de Fis puisque la protéine purifiée se lie spécifiquement aux régions promotrices de fis, hrpN, sapA, cel5 et fliC. De plus, les empreintes à la DNase I et au permanganate de potassium et les expériences de transcription in vitro ont révélé que Fis réprime l’expression de cel5 en empêchant l’élongation des transcrits. Des tests d’infection ont révélé une absence de macération par le mutant fis sur des organes végétaux non blessés alors que la souche parentale développe des symptômes de macération significatifs. Par contre, sur des organes blessés, le pouvoir pathogène du mutant n’est qu’atténué en comparaison de celui de la souche parentale. L’absence de macération provoquée par le mutant fis sur les organes végétaux est certainement liée à la faible synthèse, dans cette souche, des systèmes requis durant les étapes initiales et précoces de l’infection. Nous proposons un modèle intégratif de l’action de Fis sur les différents facteurs de virulence 99 au cours du processus infectieux. 1er article Résultats The DNA nucleoid-associated protein Fis coordinates the expression of the main virulence genes in the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi Thomas Lautier and William Nasser* Université de Lyon, F-69003, France ; Université Lyon 1, F-69622 ; INSA-Lyon, Villeurbanne, F-69621 ; CNRS, UMR 5240, Unité Microbiologie Adaptation et Pathogénie, F-69622. * For Correspondance: E-mail:[email protected]; Tel.: (33) 4 72 43 26 95; Fax: (33) 4 72 43 15 84; Accepted in Molecular Microbiology, the 15th october 2007 Key words: phytopathogenic bacteria/ Fis/ virulence genes/ regulation Running title: E. chrysanthemi fis and virulence gene regulation Summary Erwinia chrysanthemi strain 3937 is a necrotrophic bacterial plant pathogen. Pectinolytic enzymes and, in particular, pectate lyases (Pels) play a key role in soft rot symptoms but the efficient colonization of plants by E. chrysanthemi requires additional factors. These factors include the harpin HrpN, the cellulase Cel5, proteases (Prts), flagellar proteins and the Sap system, involved in the detoxification of plant antimicrobial peptides. HrpN and flagellum are mostly involved in the early steps of infection whereas the degradative enzymes (Pels, Cel5, Prts) are mainly required in the advanced stages. Production of these virulence factors is tightly regulated by environmental conditions. This report shows that the nucleoid-associated protein Fis plays a pivotal role in the expression of the main virulence genes. Its production is regulated in a growth phase-dependent manner and is under negative autoregulation. An E. chrysanthemi fis mutant displays a reduced motility and expression of hrpN, prtC and the sap operon. In contrast, the expression of the cel5 gene is increased in this mutant. Furthermore, the induction of the Pel activity is delayed and increased during the stationary growth phase in the fis mutant. Most of these controls occur through a direct effect since purified Fis binds to the promoter regions of fis, hrpN, sapA, cel5 and fliC. Moreover, potassium permanganate footprinting and in vitro transcription assays have revealed that Fis prevents transcription initiation at the fis promoter and also transcript elongation from the cel5 promoter. Finally, the fis mutant has a decreased virulence. These results suggest a coordinated regulation by Fis of virulence factors involved in certain key steps of infection, early (asymptomatic) and advanced (symptomatic) phases. 100 1er article Résultats 101 1er article Résultats 102 1er article Résultats 103 1er article Résultats 104 1er article Résultats 105 1er article Résultats 106 1er article Résultats 107 1er article Résultats 108 1er article Résultats 109 1er article Résultats 110 1er article Résultats 111 1er article Résultats 112 1er article Résultats 113 1er article Résultats 114 1er article Résultats 115 1er article Résultats 116 1er article Résultats 117 1er article Résultats 118 1er article Résultats 119 1er article Résultats 120 1er article Résultats 121 1er article Résultats 122 1er article Résultats 123 1er article Résultats 124 1er article Résultats 125 1er article Résultats 126 1er article Résultats 127 1er article Résultats 128 1er article Résultats 129 1er article Résultats 130 1er article Résultats 131 2ème article Résultats II 2eme ARTICLE : Intégration de deux signaux essentiels modulant la virulence au niveau des promoteurs des gènes pel d’Erwinia chrysanthemi : un rôle pour Fis dans la régulation par le phase de croissance. La production des pectate lyases (Pels), facteurs de virulences essentiels d’Erwinia chrysanthemi, est contrôlée par un réseau de régulation complexe et réponds à différents signaux environnementaux, tels que la présence de pectine ou d’extraits de plante, la phase de croissance, la température ou la concentration en fer. La présence de pectine et la phase de croissance sont les plus importants signaux identifiés. Huit régulateurs modulant l’expression des gènes pel ont été caractérisés. Ces régulateurs sont organisés en réseau permettant leur mise en œuvre séquentielle au cours de l’infection. Malgré les nombreuses études précédentes, le mécanisme de contrôle de la production de Pels par la phase de croissance n’a pas été encore élucidé. Dans ce second article, nous montrons qu’un mutant fis d’E. chrysanthemi présente une forte augmentation de la transcription des gènes pel durant la phase exponentielle de croissance alors que l’induction de l’expression dans la souche parentale n’a lieu qu’à la fin de la phase exponentielle de croissance. De plus, le taux d’induction des gènes pel par les dérivés pectiques est plus fort dans le mutant fis que dans la souche parentale. Ces données suggèrent que KdgR, le répresseur majeur répondant à la présence de composés pectiques, et Fis répriment de manière coopérative l’expression des gènes pel. Cette hypothèse a été confirmée dans un premier temps par des expériences in vitro qui ont révélé que Fis et KdgR réprime chacun l’expression des gènes pel en agissant au niveau de l’initiation de la transcription et que la présence simultannée des deux régulateurs se traduit par une diminution encore plus forte de l’accumulation des transcrits. Ces expériences in vitro ont été complétées par une quantification in vivo de l’expression des gènes pel. Il s’est avéré que le niveau d’expression observé dans les deux mutants simples fis et kdgR, notamment au début de la phase exponentielle de croissance, sont plus faibles que ceux obtenus dans le double mutant kdgR-fis. Au vu des résultats décrits ci-dessus, il apparaît que la répression de l’expression des gènes pel par Fis est plus marquée au début de la phase exponentielle de croissance. En 132 2ème article Résultats revanche, des expériences de quantification réalisées sur des surnageants de culture avaient montré que l’induction de l’activité Pel est augmentée durant la phase stationnaire de croissance dans le mutant fis. Ce constat suggère une implication de Fis dans la translocation des Pels dans le milieu extérieur. Cette hypothèse a été validée par une comparaison de l’activité Pel présente à la fois dans les surnageants de culture et dans les cellules. Ces expériences ont révélé que l’activité Pel intracellulaire du mutant fis est beaucoup plus forte, notamment en début de phase exponentielle, que celle de la souche parentale. L’ensemble de ces données suggèrent fortement que Fis contrôle finement la disponibilité en Pels durant le processus infectieux en agissant aussi bien sur leur production que sur leur translocation dans le milieu extérieur. Nous présentons un modèle intégrant les actions de Fis et de KdgR pour contrôler la disponibilité des Pels au cours du processus infectieux. 133 2ème article Résultats Integration of two essential virulence modulating signals at the Erwinia chrysanthemi pel gene promoters: a role for Fis in the growth phase regulation Thomas Lautier1, Nicolas Blot2, Georgi Muskhelishvili3 and William Nasser1* 1 Université de Lyon, F-69003, France ; Université Lyon 1, F-69622 ; INSA-Lyon, Villeurbanne, F-69621 ; CNRS, UMR 5240, Unité Microbiologie Adaptation et Pathogénie, F-69622. 2 Present adress: Station Biologique de Roscoff; CNRS, UMR7144 ; Roscoff, F-29680 3 Jacobs University, Bremen, Campus Ring1, D-28759 Bremen, Germany *For Correspondance: E-mail:[email protected]; Tel.: (33) 4 72 43 26 95; Fax: (33) 4 72 43 15 84; Accepted in Molecular Microbiology, the 13th october 2007 Key words: phytopathogenic bacteria/ Fis/ virulence genes/ growth-phase regulation Running title: E. chrysanthemi fis and virulence growth-phase regulation Summary Production of the essential virulence factors, called pectate lyases (Pels), in the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi is controlled by a complex regulation system and responds to various stimuli, such as the presence of pectin or plant extracts, growth phase, temperature and iron concentration. The presence of pectin and growth phase are the most important signals identified. Eight regulators modulating the expression of the pel genes (encoding Pels) have been characterized. These regulators are organized in a network allowing a sequential functioning of the regulators during infection. Although many studies have been carried out, the mechanisms of control of Pel production by growth phase have not yet been elucidated. Here we report that a fis mutant of E. chrysanthemi showed a strong increase in transcription of the pel genes during exponential growth whereas induction of expression in the parental strain occurred at the end of exponential growth. This reveals that Fis acts to prevent an efficient transcription of pel genes at the beginning of exponential growth and also provides evidence of the involvement of Fis in the growth-phase regulation of the pel genes. By using in vitro DNA-protein interactions and ranscription experiments, we find that Fis directly represses the pel gene expression at the transcription initiation step. In addition, we show that Fis acts in concert with KdgR, the main repressor responding to the presence of pectin compounds, to shut down the pel gene transcription. Finally, we find that active Fis is required for the efficient translocation of the Pels in growth medium. Together, these data indicate that Fis tightly controls the availability of Pels during pathogenesis by acting both on their production and their translocation in the external medium. 134 2ème article Résultats 135 2ème article Résultats 136 2ème article Résultats 137 2ème article Résultats 138 2ème article Résultats 139 2ème article Résultats 140 2ème article Résultats 141 2ème article Résultats 142 2ème article Résultats 143 2ème article Résultats 144 2ème article Résultats 145 2ème article Résultats 146 2ème article Résultats 147 2ème article Résultats 148 2ème article Résultats 149 2ème article Résultats 150 2ème article Résultats 151 2ème article Résultats 152 2ème article Résultats 153 2ème article Résultats 154 2ème article Résultats 155 2ème article Résultats 156 2ème article Résultats 157 2ème article Résultats 158 2ème article Résultats 159 2ème article Résultats 160 2ème article Résultats 161 2ème article Résultats 162 2ème article Résultats 163 2ème article Résultats 164 2ème article Résultats 165 Résultats Résultats non publiés III Résultats non publiés : intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. En présence de dérivés pectiques, une augmentation de l’expression des gènes pel, notamment celle de pelD et pelE, est observée le long de la croissance dans le mutant fis, avec toutefois un effet plus marqué au début de la phase exponentielle de croissance (2ème article). Le profil de régulation des gènes pel ne s’accorde donc pas strictement avec celui de la concentration cellulaire en Fis. Pour expliquer cette différence, l’hypothèse émise dans le 2ème article serait que la faible concentration cellulaire de Fis durant la phase stationnaire soit suffisante pour exercer une répression de l’expression des gènes pel à ce stade de la croissance. Une autre possibilité serait que la régulation par Fis durant la phase stationnaire se fasse par un mécanisme indirect impliquant un ou plusieurs autres régulateurs du réseau des gènes pel (voir introduction bibliographique, chapitre III.D.6). Afin de clarifier ce dernier point, l’étude de l’action de Fis sur l’expression des gènes essentiels du réseau de régulation a été initiée. Les investigations ont porté sur les gènes codant : -CRP, l’activateur principal des gènes pel, -Pir, un régulateur répondant à des composés de la plante, -PecS et PecT, deux répresseurs dont les signaux n’ont pas été encore caractérisés, -H-NS, la protéine associée au nucléoïde qui joue un rôle central dans le réseau, -KdgR, le principal répresseur répondant à la présence de composés pectiques. La plupart des régulateurs du réseau étant soumis à un rétro contrôle, nous avons dans un premier temps retenu la méthode de la RT-PCR quantitative (voir 1er et 2ème article) pour évaluer l’accumulation des transcrits dans la souche parentale et dans le mutant fis cultivées en LB et en LB supplémenté en PGA (Figure R1 ). Les méthodes utilisées pour le calcul des niveaux d’expression et pour les normalisations sont celles décrites dans les deux articles précédents. 166 Résultats Résultats non publiés Figure R1 : Comparaison par RT-PCR quantitative de l’expression des gènes crp, hns, kdgR, pir, pecT et pecS dans le mutant fis par rapport à la souche parentale à différents stades de la croissance et dans différents milieux de culture (LB ou LB+PGA). La normalisation a été effectuée en utilisant les transcrits rsmA et pAW 109 comme décrit dans les articles précédents. La ligne rouge met en évidence la valeur 1 correspondant à une expression équivalente du gène étudié dans le mutant fis et la souche parentale. Au vu de ces résultats, il ressort que Fis régule négativement l’expression de : - crp, pir et pecS à la fin de la phase exponentielle uniquement en présence de PGA, - pecT au début et à la fin de la phase exponentielle de croissance en présence de PGA, avec un effet plus marqué en début de croissance. Par contre, Fis a un effet activateur sur l’expression du gène hns en début de croissance, suivie d’une légère répression à la fin de la phase exponentielle. Aucun effet significatif de Fis n’a été observé sur l’expression de kdgR dans les conditions de cultures réalisées. Les résultats de RT-PCR quantitative ont été complétés par des dosages de fusions transcriptionnelles mettant en jeu les régions régulatrices de kdgR, crp et pecT (Figure R2). 167 Résultats Résultats non publiés Figure R2 : Expression des fusions transcriptionnelles kdgR::uidA, crp::uidA et pecT::uidA en fonction de la densité cellulaire dans la souche parentale et dans le mutant fis. Les cultures ont été réalisées en LB (A) et en LB supplémenté de PGA (4g L-1) (B). L’activité spécifique β-glucuronidase est exprimée en nmoles de p-nitrophenol produit par minute par mg de poids sec bactérien. Les résultats obtenus par ces deux approches sont globalement concordants mis à part dans les cas de kdgR et de crp. En effet, en LB supplémenté de PGA, un effet d’activation significatif par Fis sur l’expression de la fusion kdgR::uidA a été observé dans les phases exponentielles tardives alors qu’aucune action significative n’a été mise en évidence sur l’expression de la fusion impliquant la région régulatrice de crp. La raison de ces différences n’est pas encore élucidée mais les expériences mettant en jeu les fusions n’ayant été réalisées qu’une fois, nous avons surtout considéré les résultats de RT-PCR quantitative. Ces résultats 168 Résultats Résultats non publiés préliminaires permettent tout de même d’intégrer Fis dans le réseau de régulation des gènes pel (Figure R3). Figure R3 : Intégration de Fis dans le réseau de régulation des gènes pel. Le rôle de Fis dans le réseau de régulation devra être précisé en évaluant l’impact des régulations en cascades mises en évidence sur l’expression des gènes pel. Toutefois, quelques 169 Résultats Résultats non publiés hypothèses peuvent être émises. PecT étant un répresseur dont l’activité est intimement liée à sa concentration cellulaire (Castillo et Reverchon, 1997 ; Nasser et Reverchon, 2002), une augmentation de la concentration de ce régulateur dans le mutant fis, notamment au début de la croissance, pourrait retarder et réduire la dérépression des gènes pel. Par contre, l’augmentation de la synthèse de l’activateur CRP dans le mutant fis durant la phase stationnaire en présence de composés pectiques pourrait contribuer à la stimulation de l’expression des gènes pel ou compenser l’augmentation de l’expression de certains gènes répresseurs (pecT, pecS et pir) à ce stade de la croissance. Concernant l’action de Fis sur la synthèse des régulateurs généraux CRP et H-NS, un parallèle peut être établi avec les résultats obtenus chez l’entérobactérie modèle E. coli. Dans le cas de hns, les deux mécanismes de contrôle sont sensiblement identiques compte tenu du fait que chez E. coli une activation par Fis a été observée durant la première moitié de la phase exponentielle de croissance (Falconi et al., 1996). Par contre, des différences notables existent dans le contrôle de l’expression du gène crp par Fis chez ces deux bactéries. Chez E. coli, il a été montré que Fis réprime l’expression de crp au cours de la croissance via un mécanisme direct (Gonzalez-Gil et al., 1998) alors que seul un contrôle relativement modéré en phase plateau a été observé chez E. chrysanthemi. Des travaux préliminaires semblent indiquer que cette différence serait due à une organisation différente des régions régulatrices du gène crp chez les deux bactéries. En effet, sur le gène crp d’E. coli, deux sites de fixation de CRP et cinq de Fis ont été mis en évidence par des expériences d’empreintes à la DNAse I (Gonzalez-Gil et al., 1998) alors qu’aucun site évident pour ces deux régulateurs n’a été observé, par des approches identiques, sur la région promotrice du gène crp d’E. chrysanthemi (Figure R5). Les résultats obtenus in vitro sont en accord avec une régulation relativement limitée de l’expression du gène crp par Fis chez E. chrysanthemi. La signification biologique de cette différence de régulation du gène crp devra être clarifiée. Enfin, une intégration appropriée de Fis dans le réseau de régulation requiert également d’étudier l’effet des régulateurs précédemment caractérisés sur l’expression du gène fis. Des études préliminaires, réalisées en système hétérologue chez E. coli, à l’aide d’une fusion transcriptionnelle plasmidique mettant en jeu les régions régulatrices de fis d’E. chrysanthemi, ont montré que l’absence de CRP se traduit par une diminution de l’expression de la fusion (Figure R4). Ce résultat montre que CRP est un activateur majeur de l’expression du gène fis. Cependant, le profil d’expression reste dépendant de la phase de croissance, suggérant que CRP agit sur le niveau d’expression de fis mais non sur le profil de 170 Résultats Résultats non publiés l’expression. Ces premiers résultats montrant une interconnexion entre les régulateurs globaux CRP et Fis devront être confirmés chez E. chrysanthemi. Figure R4 : Expression de la fusion transcriptionnelle impliquant la région régulatrice du gène fis d’E chrysanthemi portée sur le plasmide pNB4 (Bardonnet et Blanco, 1992). L’activité spécifique β-glucuronidase est exprimée en nmoles de p-nitrophenol produit par minute par mg de poids sec bactérien. 171 Résultats Résultats non publiés Figure R5 : Absence de fixation de Fis et de CRP sur la région promotrice du gène crp d’E. chrysanthemi. Ces expériences d’empreintes à la DNAse I ont été réalisées comme décrit dans les deux articles précédents. La région d’ADN utilisée comprend les bases localisées de –140 à +293 (position de l’ATG) par rapport au point d’initiation de transcription du gène crp (Reverchon et al., 1997). 172 Résultats Résultats non publiés Tableau R1 : Souches bactériennes, plasmides et oligonucléotides utilisés dans ce travail. Génotype / Description (a) Souches / Plasmides / Oligonucléotides Référence ou source Escherichia coli CHS50 CHS50 ∆fis CHS50 ∆crp ara ∆(lac pro)thi rpsL ara ∆(lac pro)thi rpsL ∆fis ara ∆(lac pro)thi rpsL ∆crp Miller, 1972 Koch et al., 1988 Gonzalez-Gil et al., 1998 Erwinia chrysanthemi A350 lmrT(con) lacZ2 A4374 A4549 A4550 A4591 A4592 A4606 A4607 lmrT(con) lacZ2 fis::Cm lmrT(con) lacZ2 , crp::uidA -Km lmrT(con) lacZ2 fis::Cm, crp::uidA-Km lmrT(con) lacZ2 pecT::uidA-Km lmrT(con) lacZ2 fis::Cm, pecT::uidA-Km lmrT(con) lacZ2 kdgR::uidA-Km lmrT(con) lacZ2 fis::Cm, kdgR::uidA-Km Hugouvieux-Cotte-Pattat and Robert-Baudouy, 1985 Ce travail Reverchon et al., 1997 Ce travail Surgey et al., 1996 Ce travail Ce travail Ce travail Plasmides pTL7 pTL8 pNB4 pNB4fis pGEM-T avec les 433 pb contenant la région régulatrice de crp (de -140 à +293 pb (ATG) par rapport au point +1 de transcription) pBluescript, Apr (Stratagene) avec la region codante de kdgR contenant la cassette uidA-Km insérée dans le site HpaI vecteur de clonage, Apr uidA pNB4 avec les 442 pb contenant la région régulatrice de fis issue du pTL1 (Lautier et Nasser, 2007) Ce travail Ce travail Bardonnet and Blanco, 1992 Ce travail Oligonucléotides AW158 crp qPCRf crp qPCRr DM152 hns qPCRf hns qPCRr kdgR qPCRf kdgR qPCRr pecS qPCRf pecS qPCRr pecT qPCRf pecT qPCRr pir qPCRf pir qPCRr RR crp deb RR crp fin rsmA qPCRf rsmA qPCRr 5’-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3’ 5’-AAACAGACCCGACTCTCGAA-3’ 5’-ACTGCGTTCCTGACCATCTT-3’ 5’-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3’ 5’-GCGAAGCACTTAAGATTCTAAACA-3’ 5’-CTTTACCGGCAACTTTGCTT-3’ 5’-TAAACAACCCGATTCCGTGT-3’ 5’-GCGGATCAGATCAACGTTCT-3’ 5’-GGCACGCTACCTGGAAGTAT-3’ 5’-TGTTGATCATCAGTGCGTTG-3’ 5’-ATACAAGTCGCCCTGTCCTC-3’ 5’-AGGCCTCATCGTTAAACTGC-3’ 5’-CATTGATGACGAGGGAAAGG-3’ 5’-CCGATAGCGATGAACTTGGT-3’ 5’-CTGCATAAGTTTGCCCTCAA-3’ 5’-TTCGAGAGTCGGGTCTGTTT-3’ 5’-GAGTTGGCGAAACCCTCAT-3’ 5’-GCTGAGACTTCTCTGCCTGAA-3’ a Applied Biosystems Ce travail Ce travail Applied Biosystems Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Ce travail Les génotypes sont donnés en utilisant les critères définis par Berlyn (1998). lmrT(con) indique que le système de transport du mélibiose, du lactose et du raffinose codé par le gène lmrT, est constitutivement exprimé dans la souche. Résistances aux antibiotiques : kanamycine (Km), chloramphenicol (Cm), ampicilline (Ap), streptomycine (Sm). 173 Conclusion et perspectives CONCLUSION ET PERSPECTIVES La coordination de la synthèse des facteurs de virulence chez les agents pathogènes est un prérequis pour conduire une infection appropriée de l’hôte. La régulation en fonction du nombre de cellules est un des mécanismes les plus utilisés par les agents pathogènes pour satisfaire cette exigence. La densité cellulaire ou « quorum sensing » est généralement le mécanisme de ce type de régulation le plus décrit dans la littérature (Burr et al., 2006 ; Lenz and Bassler, 2007 ; Deziel et al., 2005). Contrairement aux observations faites chez des bactéries taxonomiquement proches telle qu’Erwinia carotovora (Burr et al., 2006), ce mécanisme ne semble pas jouer un rôle prépondérant chez Erwinia chrysanthemi. En effet, l’inactivation des gènes d’E. chrysanthemi impliqués dans la synthèse des différents types de phéromones (expI et luxS) ne s’accompagne ni d’une perturbation significative de la synthèse des facteurs de virulence, ni d’une modification importante de son pouvoir pathogène (Nasser et al., 1998 ; Reverchon et al., résultats non publiés). Ce constat nous a incité à prendre en considération des mécanismes de régulation liés à la phase de croissance, contrôlés d’une manière générale par les protéines associées au nucléoïdes (NAPs). Parmi ces NAPs, Fis a particulièrement retenu notre attention en raison de la forte variation de sa concentration cellulaire au cours de la croissance. De plus des résultats parus au début de ma thèse faisaient état d’une implication de cette NAP dans la régulation phase de croissance-dépendante de différents facteurs de virulence, impliqués notamment dans les étapes précoces du processus infectieux chez les bactéries pathogènes humaines E. coli et S. typhimurium (Falconi et al., 2001 ; Goldberg et al., 2001 ; Kelly et al., 2004). Les mécanismes de ces contrôles n’ont généralement pas été clairement élucidés mais plusieurs hypothèses allant du contrôle direct (Kelly et al., 2004) à des mécanismes indirects mettant en jeu d’autres régulateurs (Kelly et al., 2005, O Croinin et al., 2006 ; Lenz et al., 2007) ou via une action sur l’organisation structurale des régions régulatrices des gènes de virulence (O Croinin et al., 2006) ont été avancées. Nous montrons dans ce travail que, chez E. chrysanthemi, les étapes clés de l’infection sont régulées de manière coordonnée par la protéine associée au nucléoïde Fis. En effet, il s’est avéré que la présence de Fis est requise pour l’induction de l’expression des gènes codant les facteurs impliqués au début du processus infectieux. Le contrôle de la synthèse des facteurs de virulence impliqués dans les phases précoces de l’infection par Fis semble donc être une caractéristique retrouvée à la fois chez les bactéries pathogènes des animaux et des végétaux. 174 Conclusion et perspectives En revanche, Fis réprime la synthèse des facteurs de propagation essentiels d’E. chrysanthemi. L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de ma thèse permet de proposer un modèle de l’action de Fis au cours des différentes étapes du processus infectieux (Figure D1). Le pic de production du régulateur en début de croissance permet une stimulation de la synthèse des systèmes requis dans les étapes précoces de l’infection (flagelles, HrpN et système Sap) ainsi que les machineries de translocation des Pels. Parallèlement, Fis réprime la synthèse des systèmes de propagation (Pels et Cel5) afin d’éviter d’éveiller les réactions de défense de l’hôte. Lorsque la concentration intracellulaire du régulateur diminue dans les stades de croissance avancés, la synthèse des Pels et de Cel5 est déréprimée. Par ailleurs, la forte accumulation des systèmes de translocation des enzymes à ce stade assure un bon couplage entre synthèse et sécrétion des enzymes dégradatives. Il s’en suit une attaque brusque de l’hôte qui n’a pas, dans ces conditions, le temps de mettre en place efficacement ses réactions de défense. 175 Conclusion et perspectives Figure D1 : Modèle du mécanisme d’action de Fis dans le contrôle de la production de différents types de facteurs de virulence au cours de la croissance bactérienne. Des points restent toutefois à éclaircir avant de comprendre parfaitement les mécanismes de contrôle de la virulence par Fis chez E. chrysanthemi. Par exemple, le mutant fis d’E. chrysanthemi s’est révélé être avirulent lorsque les tests d’infection sont réalisés sur des organes végétaux non blessés alors que sur des organes blessés, il présente un pouvoir pathogène atténué. Ce constat conforte l’implication de Fis dans la régulation de la synthèse de facteurs intervenants dans les phases précoces de l’infection dont certains n’ont vraisemblablement pas encore été identifiés. En effet, l’un des phénotypes caractéristique du mutant fis d’E. chrysanthemi est sa forte capacité d’agrégation dans certains milieux de culture liquides. Cette propriété, résultant généralement de la surproduction de structures impliquées dans l’adhérence des bactéries, s’est avérée être conservée dans toutes les souches 176 Conclusion et perspectives double-mutantes inactivées à la fois pour le gène fis et pour un des gènes codant les différents facteurs de virulence étudiés. Ces éventuels systèmes d’adhésion pourraient être identifiés en utilisant une approche protéomique. En effet, la comparaison d’extraits contenant les structures de surface de la souche parentale et du mutant fis d’E. chrysanthemi sur gel de polyacrylamide a révélé la présence de protéines additionnelles dans les extraits du mutant fis (Figure D2). Figure D2 : Extraits de surnageants de cultures de la souche parentale et du mutant fis d’E. chrysanthemi analysés sur gel de polyacrylamide. Les protéines surproduites dans le mutant fis sont indiquées par des flèches. Ces protéines seront purifiées et caractérisées par MALDI-TOF, les gènes correspondants seront inactivés et leurs effets sur le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi évalués. Les structures de surface régulées par Fis pourront également être recherchées en caractérisant les gènes codant des structures similaires mise en évidence dans des bactéries taxonomiquement proches. Le gène hecA, codant une adhésine chez la souche d’E. chrysanthemi EC16 (Rojas et al., 2002) est un candidat de choix. Les premières tentatives en vue du clonage du gène de la souche de référence 3937 se sont soldées par des échecs en raison de difficultés rencontrées pour l’amplification du gène. L’expression des gènes pel est augmentée le long de la croissance dans le mutant fis avec toutefois un effet beaucoup plus marqué en début de phase exponentielle. Le mécanisme de la régulation de l’expression de ces gènes par Fis en phase plateau n’a pas encore été totalement clarifié. Dans le deuxième article, il a été suggéré que ce contrôle pourrait se faire via un mécanisme direct par la faible quantité cellulaire de Fis. Cette hypothèse repose sur la relative forte affinité de Fis pour les régions promotrices des gènes pel. Cependant, les résultats obtenus sur le réseau de régulation suggèrent que le contrôle en phase plateau pourrait se faire également via un mécanisme indirect mettant en jeu certains régulateurs du 177 Conclusion et perspectives réseau, notamment le répresseur PecT. Enfin, une troisième hypothèse pouvant expliquer l’effet de Fis sur l’expression des gènes pel en phase plateau serait une structuration différente des régions régulatrices de ces gènes dans le mutant fis et la souche parentale. Cette hypothèse est confortée par des résultats préliminaires non présentés qui ont montré que l’expression des gènes pel est modulée par l’état d’enroulement de l’ADN (expression in vitro plus forte sur plasmide superenroulé par rapport au même plasmide linéarisé). La première hypothèse pourra être vérifiée par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine suivie d’une quantification par RT-PCR de la quantité des gènes pel complexés à Fis à différents stades de la croissance. La deuxième possibilité de contrôle pourra être appréciée en comparant la quantité de transcrits des gènes pel en absence de Fis à celle observée dans les mutants doubles impliquant fis et chacun des régulateurs cibles de Fis. Par exemple dans le cas de PecT, il s’agira de quantifier les transcrits des gènes pel dans la souche parentale, les mutants simples fis et pecT et dans le double mutant fis-pecT. Il serait également informatif d’analyser l’effet des régulateurs du réseau précédemment caractérisés sur l’expression du gène fis et de poursuivre l’étude des mécanismes de signalisation agissant sur l’expression de ce gène en s’intéressant notamment au nucléotide modifié ppGpp, connu pour agir chez E. coli sur la concentration intracellulaire de Fis (Ninnemann et al., 1992). Ces investigations permettront de situer précisement le niveau d’action de Fis dans le réseau de régulation. La troisième hypothèse, l’implication de Fis dans l’organisation structurale des promoteurs des gènes pel, pourra être analysée en adoptant une double approche in vivo et in vitro. In vivo, il s’agira de comparer, à l’aide de la RT-PCR quantitative, l’expression des gènes pel obtenue dans les conditions standard de croissance à celle obtenue dans les conditions altérant l’état d’enroulement de l’ADN aussi bien dans la souche parentale que dans le mutant fis. Une évolution différente de l’expression génique dans la souche parentale et dans le mutant fis après ajout des composés altérant la structuration du chromosome serait la preuve de l’implication de Fis dans ce mécanisme. Ces expériences pourront être complétées par des travaux similaires réalisés sur la souche parentale et une souche dérivée comportant des gènes pel inactivés au niveau de leur(s) site(s) de fixation de Fis. Les constructions ont déjà été réalisées pour les gènes pelD et pelE. En plus de l’avantage de s’affranchir de l’effet pléiotropique du mutant fis, cette dernière approche permettra de vérifier si l’implication éventuelle de Fis dans ce mécanisme de régulation se fait par une action directe ou non. In vitro, des expériences de transcription pourront être réalisées avec des matrices d’ADN ayant des niveaux d’enroulement différents en présence et en absence de Fis. 178 Conclusion et perspectives Pour le cas où ces différents travaux ne permettraient pas de clarifier totalement la régulation phase de croissance-dépendante s’exerçant sur les gènes pel, la recherche de nouvelles protéines régulatrices impliquées directement dans ce contrôle pourra être entreprise en privilégiant une approche biochimique. Elle consistera à identifier dans des extraits de cultures d’E. chrysanthemi à différents stades de la croissance, des protéines susceptibles d’interagir spécifiquement avec les régions régulatrices des gènes pel. Les régulateurs dont l’activité est liée à la phase de croissance seront caractérisés. Une telle démarche devrait aboutir à l’identification de nouvelles protéines contrôlant la régulation par la phase de croissance s’exerçant sur l’expression des gènes pel. Si la caractérisation des régulateurs transcriptionnels s’avère insuffisante pour expliquer la régulation phase de croissance-dépendante des gènes pel, les études pourraient être étendues au contrôle post transcriptionnel en privilégiant les mécanismes décrits chez des bactéries taxonomiquement proches telle qu’E. carotovora. En effet, chez cette dernière, RsmA est impliqué dans la régulation phase de croissance-dépendante des enzymes extracellulaires en favorisant en début de croissance à la fois la dégradation des ARNs des gènes codant les enzymes extracellulaires et le système de signalisation de type « quorumsensing » ExpI-ExpR (Liu et al., 1998). Enfin, ces études ont révélé une discordance entre le profil d’expression des gènes pel dans le mutant fis et celui de l’activité Pel obtenu dans les surnageants de culture de cette souche. Cette discordance serait due à un défaut de la translocation des Pels dans le milieu extracellulaire dans le mutant fis. Les acteurs responsables de ce défaut de translocation pourront être identifiés en analysant l’expression des systèmes impliqués (systèmes Sec et Out et les constituants de la membrane externe) dans les expériences de RT-PCR quantitative ou de protéomique précédemment indiquées. Le contrôle de Fis sur les autres facteurs de virulence laisse également présager la mise en œuvre de mécanismes indirects comme précédemment indiqué. A plus long terme, ces circuits pourront être clarifiés par une approche globale de transcriptomique en adoptant une stratégie similaire à celle mentionnée pour les gènes pel. En effet, la comparaison à différents stades de croissance (début de phase exponentielle et phase stationnaire) du profil d’expression de la souche parentale et de sa dérivée fis dans des conditions de culture standard ou favorisant une altération structurale du génome (par exemple présence de substance agissant sur la gyrase ou les topoisomérases) devrait permettre d’identifier les cibles de Fis et de distinguer celles dont l’expression dépend fortement de l’organisation structurale de l’ADN de celles dont l’expression n’en dépend que modérément. Une attention particulière 179 Conclusion et perspectives sera portée sur les gènes codant des facteurs de virulence avérés ou potentiels. Cette approche permettra également d’apprécier l’implication de Fis dans la régulation dépendant de l’organisation structurale de l’ADN des gènes d’intérêt. De plus, la caractérisation des régulateurs différentiellements exprimés non encore étudiés pourrait permettre l’identification de protéines additionnelles servant de relais à Fis pour le contrôle de l’expression de certains gènes de virulence. Une approche similaire a été récemment utilisée pour identifier, chez E. coli, les gènes régulés par Fis et l’état d’enroulement de l’ADN (Blot et al., 2006). Ces différentes investigations devraient permettre de satisfaire totalement l’objectif de cette thèse qui était d’élucider les mécanismes de la régulation de la synthèse des facteurs de virulence par la phase de croissance. L’intégration de l’action des différents acteurs impliqués dans ce contrôle au réseau de régulation précédemment caractérisé devrait permettre de comprendre comment la bactérie perçoit les signaux provenant de l’environnement et comment, en retour, elle adapte la synthèse de ses facteurs de virulence. De telles connaissances pourraient favoriser l’identification de nouveaux agents interférant avec le pouvoir pathogène d’E. chrysanthemi. Enfin, comme présenté dans la partie bibliographique et conforté par les résultats des travaux de ma thèse, les facteurs de virulence ainsi que les mécanismes utilisés pour réguler leur synthèse sont similaires chez les pathogènes des animaux et des végétaux. Les résultats obtenus sur E. chrysanthemi pourraient donc être étendus à un grand nombre de bactéries pathogènes. 180 Références bibliographiques Références bibliographiques Adler, B., Sasakawa, C., Tobe, T., Makino, S., Komatsu, K., et Yoshikawa, M. (1989) A dual transcriptional activation system for the 230 kb plasmid genes coding for virulenceassociated antigens of Shigella flexneri. Mol Microbiol 3: 627-635. Aizawa, S.I., Harwood, C.S., et Kadner, R.J. (2000) Signaling components in bacterial locomotion and sensory reception. J Bacteriol 182: 1459-1471. 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NATURE : Doctorat Numéro d'ordre : 2007-ISAL-0116 Ecole doctorale : Evolution, Ecosystème, Microbiologie, Modélisation Spécialité : Microbiologie Cote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 ---CLASSE :---RESUME : Erwinia chrysanthemi est une entérobactérie phytopathogène responsable de la pourriture molle et qui engendre des pertes économiques importantes sur différentes plantes. Une colonisation efficace de l’hôte requiert l’action séquentielle de plusieurs facteurs de virulence. Certains de ces facteurs sont essentiellement requis dans les étapes précoces du processus infectieux tels que la harpine HrpN, le système de détoxification Sap ou les flagelles assurant la mobilité bactérienne. D’autres agissent par contre dans les étapes tardives du processus tels que les enzymes dégradatives. Parmi ces enzymes, les pectate lyases (Pels) jouent un rôle déterminant dans le pouvoir pathogène, en raison de leur capacité à reproduire le symptôme de pourriture molle. La synthèse des facteurs de virulence est finement régulée pour conduire une infection efficace. L’essentiel des travaux de cette thèse a consisté à caractériser le rôle de la protéine associée au nucléoïde Fis dans le contrôle de la virulence chez E. chrysanthemi. Un mutant fis présente une synthèse diminuée des facteurs de virulence impliqués dans les étapes précoces de l’infection (flagelles, harpine et système de détoxification). De plus, l’induction de l’activité pectate lyase est retardée et augmente durant la phase stationnaire de croissance dans le mutant fis. Le contrôle exercé par Fis sur l’expression des gènes codant ces facteurs se fait par un mécanisme direct. In planta, le mutant fis présente une virulence atténuée qui serait le résultat de la modification du profil de synthèse des facteurs de virulence. Le mécanisme moléculaire de la régulation exercée par Fis a été étudié plus en détail sur les gènes pel dont l’expression est modulée par un grand nombre de régulateurs (8 sont déjà caractérisés). Une étude intégrative réalisée en adoptant une double approche in vivo et in vitro a montré que Fis réprime directement l’expression des gènes pel au niveau de l’initiation de la transcription. Dans certaines conditions, Fis agit de concert avec KdgR, un autre répresseur essentiel, pour verrouiller l’expression des gènes pel. L’ensemble de ces données met en évidence un rôle pivot de Fis dans la coordination de l’expression des principaux gènes de virulence d’E. chrysanthemi au cours du processus infectieux. MOTS-CLES : Bactérie phytopathogène / Fis / gènes de virulence / régulation de la transcription / Erwinia chrysanthemi. Laboratoire de recherche : Microbiologie, Adaptation et Pathogénie, UMR 5240 CNRS-UCBL-INSA-BayerCropScience, Domaine Scientifique de la Doua, Université Lyon 1, Bat. André Lwoff, 10 rue Raphaël Dubois, 69622 Villeurbanne Cedex France Composition du jury : Mr Carlos BLANCO, Professeur à l’Université de Rennes I, Rapporteur Mr Claude GUTIERREZ, Professeur à l’Université Toulouse III, Rapporteur Mr Hafid ABAIBOU, Responsable Senior R&D, Biomérieux, Examinateur Mr Philippe LEJEUNE, Professeur à l’INSA de Lyon, Examinateur Mme Marie-Andrée MANDRAND-BERTHELOT, Directeur de Recherche CNRS, Examinateur Mr William NASSER, Directeur de Recherche CNRS, Directeur de thèse 200
