Travaux Pratiques de Biologie Molculaire 2004-2005 Licence

Travaux Pratiques de Biologie Moléculaire 2007-2008 Licence Semestre 5
Module: Régulation de l’expression du génome – SC-L5-BH05
S. BOURGERIE
- TRAVAUX PRATIQUES -
REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES CHEZ LES PROCARYOTES
(3 séances de 5h)
Plan des expériences :
Jour 1 : croissance bactérienne / expériences d’induction
Jour 2 : évaluation activité β-galactosidase / mutagenèse aux UV
Jour 3 : analyse des résultats
QUELQUES RECOMMENDATIONS
Se munir d’une blouse, d’un marqueur noir indélébile et d’une montre avec une « trotteuse » (ou mieux un chronomètre) .
Le travail pratique est à faire individuellement et avec soin.
Le compte-rendu est à remettre à l’issue de la dernière séance.
Régulation du taux de synthèse de la β-galactosidase chez Escherichia coli
Introduction
Le lactose est un disaccharide composé d'une molécule de D-galactose et d'une molécule de D-glucose unies par
une liaison β1-4. La β-galactosidase est une hydrolase qui coupe spécifiquement la liaison β1-4 du lactose.
L'activité de cette enzyme peut être mesurée en utilisant un galactoside, l'ortho nitrophényl β-D-galactoside
(ONPG), substrat de la β-galactosidase dont l'action libère de l'ortho-nitrophénol (ONP), coloré en jaune. Le
système génétique gouvernant le métabolisme du lactose chez E. coli comprend 3 gènes de structure groupés en
un opéron.
organisation de l'opéron lactose :
Un opéron est défini comme une série de gènes adjacents dont la régulation est coordonnée (c'est à dire que si
l'un des gènes est off, les autres le sont aussi) ; c'est un système seulement retrouvé chez les procaryotes.
L'opéron lac comprend 3 gènes (lacY, Z et A) précédés par un seul et même promoteur et un opérateur.
Lac Z code la β-galactosidase, enzyme qui catalyse l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose ; LacY code une
perméase, une protéine qui siège dans la membrane cellulaire et qui facilite l'entrée du lactose dans la cellule ;
LacA code une transacétylase dont la fonction n'est pas connue.
Deux de ces trois gènes (et peut être aussi le troisième) doivent par conséquent être régulés avec le métabolisme
du lactose; donc selon les conditions nutritionnelles être on ou off.
régulation de l'opéron :
Le glucose pour E. coli constitue sa source de carbone favorite; si du glucose est présent, E. coli ignore les autres
sucres. E. coli a besoin des enzymes de l'opéron lac lorsque du lactose est présent mais pour elle il n'y a pas plus
facile à métaboliser que le glucose. Quand le lactose n'est pas présent, il n'est pas nécessaire que l'opéron lac
s'exprime; la répression de l'opéron lac se réalise par l'action d'un répresseur lequel se fixe à l'opérateur de
l'opéron lac empêchant ainsi toute transcription. Le répresseur lac est codé par le gène lacI lequel est situé à
proximité de l'opéron lac sans appartenir à celui ci. Le lactose se fixe au répresseur et empêche celui-ci de
réprimer l'opéron.
L'IPTG (isopropylthiogalactoside) est un analogue du lactose qui se fixe aussi au répresseur mais contrairement
au lactose ne nécessite pas la lac perméase pour rentrer dans la cellule. Parce que l'IPTG est plus hydrophobe que
le lactose (du fait du groupement isopropyl) elle passe au travers des membranes.
Principe du dosage de la β-galactosidase
L'ortho-nitrophényl-β-D-galactopyrannoside (ONPG) est un analogue du lactose qui peut être hydrolysé par la
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β-galactosidase en galactose et o-nitrophénol. L'ONPG est incolore tandis que l'o-nitrophénol est jaune avec un
maximum d'absorbance autour de 420 nm.
Le SDS et le dichloroéthane sont ajoutés au mélange d'essai afin de casser les cellules. Ceci permet à l'enzyme et
au substrat de se « retrouver ». L'addition de ce détergent et de ce solvant organique n'affecte pas l'activité de la
β-galactosidase. De nombreuses enzymes (dont la β-galactosidase) préfèrent des conditions réductrices pour
fonctionner (ceci est assuré par l'addition de β-mercaptoéthanol dans le mélange essai).
Le pH optimum d'activité de la β-galactosidase se situe à environ 7,0. Cette enzyme ne fonctionne pas aux pH
extrêmes; aussi l'addition de carbonate de sodium amenant le pH au delà de 9,0 permet à la réaction en cours
d'être immédiatement arrêtée. L'absorbance mesurée sur une suspension bactérienne est proportionnelle au
nombre de bactéries présentes (à condition que la densité en bactéries ne soit pas trop importante).
But de l'expérience :
L'expérience a pour but de provoquer l'induction de l’expression du gène lacZ en utilisant différents agents
inducteurs, naturels ou artificiels et ceci pour différentes densités bactériennes (suivi au cours du temps).
L'évaluation de l'induction se fera par la mesure de l'activité β-galactosidase en utilisant un substrat synthétique,
l'ONPG.
Dans les manipulations, il sera utilisé la souche E. coli BL21(DE3).
Mutagenèse de l’opéron lactose
Si l’on fait croître E. coli exponentiellement, une cellule donne végétativement naissance à de multiples
descendants tous identiques au parent d’origine. Mais de temps en temps, avec une fréquence de l’ordre de 10-710-8 par cellule et par génération, il apparaît une cellule qui diffère du type parental par un caractère donné. Cet
organisme est appelé mutant et le type parental type sauvage. Le mutant peut être aussi stable que le type
sauvage ; il peut en différer par la résistance à un antibiotique donné, par la morphologie de ses colonies, par le
besoin en un facteur de croissance exogène, par sa résistance à un bactériophage donné, par l’incapacité à
fermenter tel ou tel sucre etc.
Il est possible d’augmenter le taux de mutation spontanée par action de mutagènes chimiques ; d’autres agents
mutagènes existent, comme les rayonnements ultraviolets.
Il est relativement simple à partir de très grandes populations bactériennes, d’isoler des mutants qui peuvent se
multiplier dans un milieu où la souche parente ne se multiplie pas. Par exemple des mutants résistants à des
agents chimiques inhibiteurs de la croissance : il suffit d’étaler un grand nombre de bactéries sur une boîte de
Petri contenant l’agent toxique ; la méthode est totalement sélective : seul le mutant désiré pourra se multiplier et
donner naissance à des colonies.
L’objectif des manipulations réalisées est d’obtenir des mutants de la bactérie E. coli qui expriment de manière
constitutive l’opéron lac ; chez ces mutants, sans ajout d’un inducteur, il y a expression de l’opéron lac.
L’obtention des mutants se fera soit par exposition aux UV (mutagenèse aléatoire) soit en utilisant un milieu de
sélection.
Evaluation de la croissance d’Escherichia coli
La bactérie Escherichia coli est un outil essentiel en biologie moléculaire, après avoir été le micro-organisme
de choix pour les études biochimiques et génétiques chez les procaryotes.
Cette bactérie se prête à la « transformation », c'est-à-dire, qu'après un traitement au CaCl2 par exemple,
elle devient « compétente » : capable d'accepter l'ADN plasmidique exogène que l'on souhaite amplifier. Il
apparaît donc indispensable de savoir manipuler ce micro-organisme et en premier lieu de savoir le cultiver. La
croissance se définit comme l'augmentation de la taille des bactéries puis de leur nombre.
L'évaluation de la croissance bactérienne peut se faire par :
- numération de colonies bactériennes sur milieu solide.
Un aliquote de la culture de bactéries est prélevée à différents temps et étalée sur une gélose nutritive
coulée dans une boîte de Pétri. Après incubation une nuit à 37°C, chaque bactérie engendre une colonie qui
constitue sa descendance, visible à l'œil nu.
- turbidimétrie de la culture bactérienne.
Un aliquote de la culture de bactéries est prélevée à différents temps. On mesure l’absorbance de la
suspension au spectrophotomètre dans le visible à 600 nm. L'absorbance (Abs) est proportionnelle au nombre de
bactéries par ml dans les limites : 0,1 < Abs600 < 1,0.
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Abs.600 = k Nb bact./ml
La valeur de k est une constante pour une bactérie donnée cultivée dans des conditions définies. Cette
relation s'établit en couplant la mesure de l’absorbance avec une numération sur milieu solide pour l’absorbance
mesurée.
L'expression mathématique de la croissance est :
Nt2 = Nt1 2µ(t2-t1) ou encore Abst2 = Abst1 2µ(t2-t1)
Nt = nb de bactéries au temps t
No = nb de bactéries au temps 0 de l'expérience
µ = nb de divisions par unité de temps.
Si pendant le temps t, la population double (Nt = 2N0), t représente alors le temps de génération t =1/µ. µ est le
taux de croissance ou nombre de divisions par heure.
La valeur de µ est une constante pour une bactérie donnée cultivée dans des conditions définies.
La courbe de croissance bactérienne est généralement caractérisée par une succession de phases :
- phase de latence µ = 0
- phase exponentielle µ > 0
- phase stationnaire µ = 0
- phase de mortalité µ < 0.
avec
Les expériences d’induction et le suivi de la croissance d’E. coli sont menés conjointement :
une seule et même manipulation est réalisée.
Réactifs et matériel
Souche : E. coli BL21
Milieux de culture : milieu LB (+/- agar) (pour 1 litre: Tryptone 10g, Extraits de levure 5g et NaC1 10g) ; milieu M63 (pour
1 litre : 2g (NH4)2SO4, 13,6g KH2PO4, 0,5mg FeSO4 – pH7,0 + 1mM MgSO4 + 0,2 à 0,5% source carbonée (glycérol ou
mélibiose))
Produits chimiques :
IPTG : 100 mM dans l'eau
Lactose : 8% dans l'eau
ONPG : 4 mg/mL en tampon phosphate de sodium 0,1 mol/L pH 7,0 (Mr = 301,3 ; une
solution à 4mg/mL correspond à 13,3 mM)
Tampon phosphate de sodium : Na2HPO4-NaH2PO4 0,1 mol/L pH 7,0
Tampon Z : 50 mM β-mercaptoéthanol (2-ME) ; 100 mM phosphate de sodium pH 7,0; 10 mM
KCl ; 1 mM MgSO4
Carbonate de sodium : 1 M dans l'eau
SDS : 0,1%
Dichloroéthane
(solution commerciale de 2-ME : d = 1,12 ; Mr = 78,13)
Manipulations
Cette étude de la régulation du taux de synthèse de la β-galactosidase chez Escherichia coli est réalisée par une série d'expériences menées sur 2 jours
consécutifs.
Au jour 1 : suivi de la croissance bactérienne et expériences d'induction
Au jour 2 : dosage de l'activité β-galactosidase
Toute manipulation de bactéries doit se faire stérilement, c'est-à-dire dans un diamètre de 20
cm autour de la flamme d'un bec Bunsen, avec du matériel stérile chaque fois que cela est
précisé.
Au jour 1
1- Evaluation de la croissance bactérienne à 37°C par turbidimétrie
- Transférer stérilement 20 ml de milieu de culture (milieu M63 + glycérol + MgSO4) dans un erlen de
100 ml.
- Ensemencer stérilement les 20 ml à partir d’une préculture E. coli BL21 , avec un volume qui
vous sera indiqué au début du T.P. Agiter modérément.
- Prélever immédiatement 1 ml de suspension, le mettre dans une cuve de spectrophotomètre
- Placer très rapidement l'erlen dans le bain agitateur thermostaté à 37°C. Noter l'heure
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- Lire l'absorbance à 600 nm. (vérifiez périodiquement le zéro de l’appareil)
- Répéter le prélèvement et la mesure après 30 minutes et 60min.
- Reporter les valeurs de l'absorbance dans un tableau.
- L’absorbance, mesurée à 600nm, avant les expériences d’induction doit impérativement
atteindre la valeur de 0,400 (A600 >0,4).
Il faut attendre entre 45 et 60min pour atteindre l’absorbance désirée.
2- Expériences d’induction
lorsque l’absorbance mesurée atteint au minimum la valeur de 0,4 (à 600nm), l’expérience
d’induction peut commencer.
- 2 expériences d’induction en parallèle sont menées :
soit l’expérience 1 (addition de lactose uniquement) soit l’expérience 2 (addition d’IPTG). Un témoin de
non induction est à prévoir.
ceci est fait pour 6 temps de cultures, c’est-à-dire à 0, 30, 60, 90, 120 & 150min d’induction.
- dans l’erlen utilisé, ajouter selon les cas
1- 60µl d’IPTG 100mM
2- 1520µl de lactose 8%
- après addition de l’inducteur, dans chacun des cas, bien mélanger le contenu du récipient
- prélever immédiatement 1ml de la suspension bactérienne dans l’erlen pour le mettre dans un tube
eppendorf clairement identifié (t0); placer l’échantillon aussitôt dans la glace
- replacer l’erlen dans l’agitateur thermostaté ; relever le temps
- réaliser les mêmes opérations toutes les 30min jusqu’au temps 150min d’induction (maintenez les
échantillons dans la glace, juste après le prélèvement)
-
-
pour les temps 60, 90, 120 & 150min prélever 2 fois 1ml
Pour le temps 90 min, prélever en plus, 0,5 ml de suspension, le mettre dans un tube eppendorf stérile noté 0 (zéro).
-
en parallèle n’oubliez pas de (toujours) réaliser les mesures d’A600nm
en fin d’expérience, vous disposez d’une série de tubes (10 au total) correspondant aux différents
prélèvements effectués
centrifuger tous les tubes (2min, vitesse max.) ; éliminer avec soin le surnageant (sans entraîner le
culot)
laver les culots par 500µl de tampon phosphate : attention à ne pas perdre le culot !!
stocker vos bactéries au froid pour le jour n°2 (congélation des culots)
3- Numération sur milieu solide
PENDANT LES TEMPS MORTS DE LA PREMIERE EXPERIENCE
- Préparer 7 boîtes de Pétri : noter sur la tranche du contenant (sans les ouvrir):
votre nom (PAS D'INITIALES) et le contenu prévu (n° de dilution)
- Couler par boîte 15 ml (minimum) de milieu nutritif gélosé LB maintenu en surfusion à 50°C.
- Bien faire sécher chaque boîte
- Préparer une série de tubes eppendorf stériles numérotés de 1 à 7
- Introduire 450 µl de milieu de culture LB stérile dans chaque tube.
- A partir de votre tube eppendorf 0 (correspondant au prélèvement réalisé à t90min), réaliser des
dilutions en série au 1/10ème comme suit:
- Homogénéiser le tube 0 par aspiration/refoulement
- Transférer 50 µl dans le tube 1; homogénéiser (par aspiration/refoulement)
- Transférer 50 µl du tube 1 dans le 2 ; homogénéiser etc... jusqu'au tube 7.
- A l’aide de billes de verre stériles, procéder aux étalements sur boite de Pétri selon les
indications qui seront fournies en TP.
- Les 3 dernières dilutions sont étalés (10-5, 10-6 et 10-7) ; à raison de 100µl par boîte, à faire en
double
- Incuber les boîtes ainsi ensemencées, retournées, une nuit à 37°C
La 7ème boîte sert de « boîte de secours ».
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4- recherche de mutants bactériens exprimant de manière constitutive l’opéron lactose
OBJECTIF : obtenir une souche mutante d’E. coli BL21 pour laquelle l’expression de l’opéron lac se trouve
déréprimée : c’est à dire que la répression exercée par LacI ne se produit plus.
Pour cela, la souche sauvage est cultivée sur milieu minimum contenant comme seule source de carbone du
mélibiose et à la température de 42°C.
E. coli possède une perméase (transporteur) pour le mélibiose mais elle est inactivée à 42°C ; par contre la souche
peut utiliser LacY (en effet, le transporteur de lactose qui peut aussi transporter le mélibiose) à condition qu’il
soit exprimé. Or le milieu de culture ne contient aucun inducteur donc les seules bactéries qui s’y développent
sont celles qui ont fait « sauter » la répression et expriment donc constitutivement l’opéron lactose.
Préparation du milieu de culture
2 boîtes de Petri renfermant le milieu minimum M63 + mélibiose + X-Gal sont préparés
- réaliser le mélange suivant dans un erlen stérile
. 23,5ml d’agar maintenu en surfusion (à 25g/l)
. 6ml de milieu minimum M63 x5 stérile
. 0,6ml mélibiose stérile 20% (en solution aqueuse)
. 30µl 1M MgSO4-7H2O (stérile)
- bien mélanger (éviter la formation de bulles)
- couler aussitôt en répartissant le mélange dans 2 boîtes de Petri
- laisser sécher prêt de la flamme
- étaler 40 µl X-Gal (2% dans DMF) à l’aide de billes ; bien laisser sécher
Ensemencement
Une culture d’E. coli BL21 en phase exponentielle de croissance vous est fournie.
- mesurer son A600nm après l’avoir diluée au 1/10ème
- étaler 100µl par boîte de la dilution 10-3 (réaliser en milieu minimum M63 de la même manière que
précédemment) à l’aide de billes stériles de la bactérie E. coli BL21. A faire en double.
- placer à 42°C la nuit, boîtes retournées.
Au jour 2
1- Mesure de l’activité β-galactosidase
Vous disposez de 10 prélèvements en final de culture d’E. coli BL21 menées dans 2 conditions différentes (cf.
jour n°1).
Pour la souche étudiée, la culture a été réalisée en présence de lactose ou d’un analogue du lactose non
métabolisé par les bactéries (IPTG).
Les prélèvements effectués (env. 1ml) de chacune des 2 cultures ont été effectués à des temps différents ; le t0
correspond au moment où la culture a atteint la valeur de 0,4 d’absorbance à 600nm juste avant l’addition ou
non de l’inducteur.
Ces prélèvements ont été stockés au froid, ce qui assure la conservation des bactéries.
A partir des culots bactériens, des « extraits » seront préparés dans un premier temps ; cela correspond à la
perméabilisation des cellules. Le traitement que les bactéries subissent désorganise partiellement la membrane
cellulaire, ce qui permet à de petites molécules comme l’ONPG, de diffuser librement dans la bactérie ; le toluène
ou le dichloroéthane associé au SDS sont utilisés pour perméabiliser les cellules.
A partir de ces extraits, un dosage de la β-galactosidase est réalisé dans un deuxième temps.
-
-
à chacun des culots bactériens, ajouter (dans l’ordre) 400µl de tampon Z (+2-ME), 10µl de
SDS 0,1% et 50µl de dichloroéthane (attention lors de la manipulation : à faire sous la
hotte)
vortexer 10 secondes (minimum) puis placer les tubes eppendorf dans un bain thermostaté
à 37°C pendant environ 5min (pré-chauffage)
ajouter 200µl d’ONPG (4mg/ml) dans chacun des tubes, mélanger brièvement (par
retournement) et replacer aussitôt les tubes à 37°C ; déclencher votre chronomètre
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-
-
-
suivre l’apparition d’une coloration jaune (cela peut prendre quelques min. ; au maximum
30min.) ; arrêter la réaction en ajoutant dans le tube 0,5ml de carbonate de sodium 1M :
relever le temps
centrifuger chacun des tubes 2min à vitesse max.
placer 200µl de la phase supérieure de chaque milieu réactionnel dans un puits de la
microplaque fournie ; ne pas entraîner de phase organique (ne pas entraîner également
de débris cellulaires ; en fait surtout de l’ADN : filament blanc)
lire l’absorbance à 420nm et 550nm en faisant le zéro d’absorbance sur le tube témoin
- prévoir un témoin négatif : à partir du culot bactérien des culture t150min
le carbonate de sodium est ajouté aux cellules avant qu’elles soient mises au contact du substrat
de la β-galactosidase.
- prévoir un témoin positif : une solution commerciale de β-galactosidase vous est
proposée ; la β-galactosidase de contrôle est un produit Sigma (G5160), enzyme isolée
d’Aspergillus oryzae, annoncé à 25000 unités avec 11,2u/mg de solide ; une unité est définie
comme la quantité d’enzyme permettant d’hydrolyser 1µmol de substrat par min. La
solution fournie est à 1,5mg/100ml ; en une min, une nmol d’ONPG hydrolysé donnera
une A420nm d’environ 0,002.
L’activité β-galactosidase mesurée est proportionnelle à l’absorbance à 420 nm résultant de l’absorption de l’ONP et est inversement
proportionnelle au temps de réaction, au volume de l’échantillon utilisé pour faire la réaction et à la concentration de l’échantillon (donnée par
l’absorbance des cellules à 600 nm).
L’absorbance à 420 nm est en fait la somme de l’absorbance de l’ONP et de l’absorbance des débris cellulaires qui peuvent subsister dans les
cuves. Pour éliminer cette dernière, il convient de retrancher à la mesure lue à 420 nm la mesure de l’absorbance à 550 nm (due aux débris
cellulaires seuls) multipliée par un facteur empirique de 1,75.
2- Mutagenèse aux UV (aléatoire) de la bactérie E. coli ; recherche de mutants capables de
produire la β-galactosidase en l’absence d’inducteur
Notre planète est de façon permanente exposée à un flux de radiations cosmiques pouvant provoquer des
mutations ; des sources de radiation d’origine tellurique naturelle (par exemple le radon ou l’uranium) et issues de
certaines substances chimiques constituent également des agents mutagènes.
Une mutation de l’ADN se définit comme un changement intervenu au niveau d’une paire de base. Les
mutations constituent la base de l’évolution à l’origine des variations génétiques aléatoires observées. Les
mutations spontanées sont celles dont l’origine ne peut être précisée ; elles se produisent peu souvent.
L’exposition des cellules bactériennes à la lumière UV provoque à la fois la mort des cellules et introduit des
mutations (lesquelles peuvent être sélectionnées).
Les variations de phénotype et le nombre de colonies obtenues sont directement liées au temps passé sous UV.
Ces mutations se transmettent à toutes les cellules issues de la division de la cellule mutée (ici les colonies de
bactérie sont des clones issus d’une cellule unique souche de toutes les autres).
Pour identifier dans une macromolécule ce qui est essentiel à sa fonction, il faut pouvoir en modifier certains
éléments ; ceci peut par exemple se faire par mutagenèse. Cette méthode, qu’elle soit dirigée ou aléatoire, est
actuellement en plein essor et présente un potentiel novateur aussi bien au niveau des recherches fondamentales
que des applications biotechnologiques. On peut ainsi concevoir des molécules douées de nouvelles fonctions.
L’objectif des manipulations réalisées est d’isoler un mutant bactérien capable de produire la β-galactosidase en
l’absence d’inducteur.
Les manipulations réalisées vont également permettre d’évaluer la viabilité cellulaire après irradiation.
Traitement aux UV & procédure de sélection
1- mutagenèse de la suspension bactérienne
- placer 10ml de milieu LB dans un erlen de 50ml
- inoculer le milieu LB en diluant 50 fois la culture d’une nuit fournie
- incuber 1,5-2h à 37°C sous agitation
- mesurer l’A600nm
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centrifuger la totalité de la culture ; reprendre le culot par 10ml de MgSO4 0,1M (stérile)
placer la suspension bactérienne 5-10min dans la glace
prélever 5ml de la suspension ; les placer au fond d’une boîte de Petri
placer la boîte (sans son couvercle) sous la rampe UV (ATTENTION DANGER ! ! !)
pendant 10sec précisément ; prélever 50µl
- exposer 20sec supplémentaires ; prélever 50µl
- exposer 30 sec de plus et prélever à nouveau 50µl
- diluer dans du MgSO4 0,1M les prélèvements effectués :
o 106 fois la suspension de départ (bactéries non exposées aux UV)
o 105 fois les échantillons exposés 10 & 30sec
o 104 fois l’échantillon exposé 60sec.
2- étalement des cellules
- préparer 4 boîtes LB + X-Gal
- étaler (à l’aide de billes) 100µl de chaque dilution
- incuber la nuit à 37°C, boîtes retournées.
-
d’après Miller, J.H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY
Au jour 3 (remettre la feuille de résultats)
RESULTATS:
1- Evaluation de la croissance bactérienne à 37°C par turbidimétrie
1- Tracer lnA600nm = f(t) pour les deux expériences (la pente correspond à µln2 et G = 1/µ)
2- Indiquer sur le graphique les conditions de la culture et les différentes phases de la croissance, si elles
sont observées.
3- Déterminer graphiquement µ en phase exponentielle de croissance (c’est à dire le nombre divisions
bactériennes par heure) et G.
4- Déterminer par le calcul la valeur de µ en phase exponentielle de croissance en utilisant vos valeurs
expérimentales. Comparer et commenter.
2- Numération sur milieu solide
Le nombre de bactéries par ml de culture au temps t correspond au nombre de colonies comptées (Nt), corrigé
par le volume (v) ensemencé de la dilution (d) de culture.
Nb bact./ml = Nt x 1/v x 1/d
1- Indiquer sous forme d'un tableau le nombre de colonies d' E. coli comptées sur vos boîtes en fonction
des dilutions ainsi que le nombre de colonies contaminantes qui seraient apparues pour chaque boîte.
2- Calculer le nombre de bactéries par ml de la culture bactérienne au temps 90 minutes. Justifiez les
comptages que vous ne prenez pas en compte pour vos calculs.
3- Déterminer la concentration bactérienne (c’est à dire le nombre de bactéries par ml) pour une culture d'
absorbance 1 à 600nm.
3- Expériences d’induction
Données utiles :
. une unité d’absorbance à 600nm correspond pour E. coli à 300µg de bactéries poids sec ; cela correspond également à une
densité cellulaire de 2.107 cellules par ml.
. coefficient d’extinction molaire (à 420nm) de l’o-nitrophénol : ε420nm = 18400 M-1.cm-1.
. trajet optique : 1cm en cuve plastique ; 0,4cm si 200µl de milieu réactionnel sont placés dans une microplaque à fond plat.
Exploitation des résultats expérimentaux
- rassemblez vos résultats dans un tableau
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-
calculez l’activité enzymatique à partir des mesures d’absorbance faites à 420nm (établir la relation
entre l’activité enzymatique et les A420nm & A600nm)
tracer les courbes de l’activité de la β-galactosidase en fonction du temps de croissance pour les 2
conditions expérimentales testées
indiquez pour la souche testée, le taux d’induction (rapport d’activité mesurée sur un laps de temps
de 1h) en phase exponentielle
critiquez vos résultats
4- Obtention de bactéries mutantes exprimant de manière constitutive l’opéron lactose : analyse des
résultats
Sur milieu sélectif M63 + mélibiose, les seules colonies bactériennes obtenues sont celles qui expriment de
manière constitutive l’opéron lac.
- déterminer le nombre de colonies obtenues (préciser si elles sont blanches ou bleues)
- calculer la fréquence à laquelle s’est produite la mutation
- qu’est ce qui au niveau moléculaire peut s’être produit rendant compte de l’expression constitutive
de l’opéron lac chez les mutants obtenus ?
- pourquoi y a t il à la fois des colonies blanches et bleues ?
- proposer une série de manipulations simples à mettre en œuvre permettant de faire l’analyse
phénotypique des mutants obtenus.
Après irradiation :
- déterminer le nombre de colonies obtenues sur milieu LB; évaluer le nombre de mutants
- en déduire la fréquence d’apparition des mutants en fonction du temps d’exposition aux UV
- conclure.
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