Phytopathologie

Phytopathologie
Le point sur les méthodes d’analyse relatives à la phytopathologie
Les plantes constituent un maillon indispensable de la chaîne alimentaire. Les maladies causées par les phytopathogènes sont donc source de déséquilibre, avec des répercussions parfois graves sur l’économie et la santé
publique. Afin de prévenir les problèmes, ou au pire leur propagation, une surveillance est nécessaire. Les efforts
doivent se concentrer sur 2 aspects : la communication internationale avec considération du facteur spatial et le
développement de méthodes d’analyse pour l’obtention d’un diagnostic précis.
Une multitude d’organisations préoccupées par la santé des végétaux existent déjà à diverses
échelles, au sein des pays ou par-delà les frontières. Un exemple remarquable est celui de
L’OEPP, Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes, impliquant une cinquantaine de pays. Cette organisation est active à différents niveaux : groupes
de travail, groupes d’experts autour de sujets variés, émissions de protocoles de diagnostic,
publications d’articles scientifiques, inventaires et classifications des nuisibles, collection
d’illustrations des maladies, organisations de conférences, tenue d’un annuaire des laboratoires, etc.
Concernant les méthodes de diagnostic, diverses approches analytiques sont actuellement utilisées, classiques
ou modernes. De nouvelles méthodes font leur apparition régulièrement, avec une attention particulière pour
l’amélioration de 6 critères clefs : la vitesse, la facilité de mise en œuvre, le niveau d’information fourni (spécificité),
la sensibilité, la fiabilité et le coût.
La première approche d’un végétal malade est avant tout visuelle. Dans certains cas, un pré-diagnostic peut être
posé sur base des symptômes touchant les plantes (malformations, lésions, décolorations, …) ou directement sur
base de la présence d’organismes ou de leurs traces (insectes, œufs, exsudats, galeries, …). Mais en général, une
confirmation en laboratoire est nécessaire. Ceci est d’autant plus vrai que certaines pathologies sont présentes de
manière latente ou asymptomatique.
Photo de gauche : rouille blanche du chrysanthème.
Photo du centre : feu bactérien sur poirier, avec exsudat visible.
Photo de droite : nid de chenilles processionnaires dans un pin.
En laboratoire, les méthodes d’analyses s‘appuient sur divers principes d’identification. La majorité peuvent être
regroupées dans les catégories suivantes : observation du phytopathogène (à l’œil nu ou avec un instrument
d’optique), culture in vitro, biotest (test sur plantes), analyse des acides nucléiques (ADN/ARN), analyse des protéines, analyse des acides gras, tests sérologiques (avec anticorps), tests nutritionnels et enzymatiques. Plusieurs
principes peuvent être combinés dans un seul test, comme par exemple pour l’immunofluorescence, qui consiste
à observer au microscope des organismes marqués avec des anticorps spécifiques couplés à un fluorochrome.
En dehors des catégories majeures, des tests supplémentaires sont utilisés dans certains cas particuliers (ex. test
water-streaming ou test du fluide blanc s’écoulant dans l’eau pour la pourriture annulaire, coloration DAPI (4,6diamidino-2-phénylindole) pour les phytoplasmes, mesure du taux d’azote et de pigments,…).
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Photo de gauche : culture in vitro de la bactérie du feu bactérien.
Photo du centre : immunofluorescence sur la bactérie de la pourriture brune.
Photo de droite : test enzymatique sur la bactérie de la pourriture annulaire.
Parmi les méthodes favorites actuellement, la biologie moléculaire est incontournable. Elle est applicable à tous
les vivants, fonctionne avec des faibles quantités de matériel et fourni des données très précises. L’approche
classique de PCR est à ce sujet largement utilisée, éventuellement en association avec des analyses de profils de
restriction (découpage enzymatique de l’ADN), par rapport soit à une cible définie, soit à un génome entier (techniques RFLP, AFLP). Dans une optique de modernité, la PCR en temps réelle tend à se généraliser. L’exploitation
de technologies existantes à des fins de diagnostic constitue aussi une nouvelle approche en phytopathologie,
comme par exemple pour les puces à ADN et le séquençage. Notons pour le séquençage que des nouvelles
méthodes plus performantes et moins coûteuses, dites « de seconde génération » sont aussi en développement.
Enfin, un projet international « Barcoding » se met en place, dont le but est d’attribuer à chaque vivant, et ainsi
les phytopathogènes, un « code-barre » unique consistant en une ou plusieurs courtes séquences d’ADN, afin de
simplifier les diagnostics et garantir leur fiabilité.
Photo de gauche: PCR en temps réel.
Photo du centre : projet DNA barcoding.
Photo de droite : séquençage de seconde génération.
D’autres méthodes modernes plus ou mois audacieuses sont par ailleurs déjà d’application ou en développement
à l’attention des phytopathologistes, comme par exemple le nez électronique (reconnaissance de molécules
volatiles), l’analyse du point isoélectrique, les Lateral Flow Devices (principe du test de grossesse), des variantes
de la PCR (LAMP-PCR à température constante, Proximity ligation couplant ADN et anticorps, etc.), les analyses
acoustiques pour les insectes xylophages, l’imagerie satellite pour surveiller les forêts, etc.
Photo de gauche: tests Lateral Flow Device en tigettes.
Photo du centre : analyses acoustiques.
Photo de droite : imagerie satellite.
Sandrine Léonard (LFSAGx, Gembloux)
[email protected]
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Feedback des symposiums
European Association of Phytobacteriologists
L’European Association of Phytobacteriologists (EAP) a été créée début
2007 par des experts en phytobactériologie de huit Etats membres de
l’UE en vue d’encourager la coopération dans le domaine du diagnostic,
de la détection, de l’identification et de la classification des pathogènes
végétaux bactériens.
L’association s’adresse spécifiquement aux phytobactériologistes
d’agences, d’institutions ou de laboratoires (gouvernementaux) qui sont
constamment impliqués dans le diagnostic et l’expérimentation.
Une Charte de création a été élaborée et approuvée par le Comité exécutif le 5 février 2007. Une Charte amendée a été ratifiée par le Comité
exécutif le 28 octobre 2008.
Les objectifs de l’EAP sont :
• le développement, l’amélioration et l’implémentation du diagnostic, de la détection, de l’identification et de la
classification des pathogènes végétaux bactériens
• l’éducation et la formation aux principes et à la pratique de la phytobactériologie
• fournir des conseils et de l’expérience aux instances de contrôle de la santé des végétaux
• promouvoir la collaboration technique et scientifique
• échanger des informations via un réseau de communication
Les principales activités d’EAP pour atteindre ses objectifs sont :
• développer, standardiser, revoir, mettre à jour et valider les méthodes et procédures de diagnostic existantes et
nouvelles pour les pathogènes végétaux bactériens contrôlés et non contrôlés
• organiser des tests inter-laboratoires, des tests de compétence et des validations de méthodes
• organiser des ateliers sur des sujets spécifiques
• identifier les possibilités de recherches collaboratives
• partager l’accès aux banques de données ex. collections de cultures, séquences d’acides nucléiques, anticorps,
protocoles de test validés,…
• construire et entretenir un site web
• diffuser une newsletter
• créer et entretenir un forum de discussion
• une réunion annuelle organisée à tour de rôle par l’un des membres
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L’adhérence à l’EAP est individuelle. Il n’y a pas de cotisation. Le Comité exécutif distingue les membres suivants :
• membres réguliers enregistrés sur le site web et qui ont accès aux principaux dispositifs d’information de l’EAP
• membres avec au moins 10 ans d’expérience dans le domaine du diagnostic, de la détection, de l’identification
et de la classification des pathogènes végétaux bactériens, comme justifié dans l’application des membres et
approuvé par le Comité exécutif EAP
• membres honoraires, nommés par le Comité exécutif à titre de récompense pour leur œuvre.
• Le président de l’EAP est J.D. Janse, phytobactériologiste au Service d’inspection générale (NAK), Pays-Bas.
Le secrétariat de l’EAP est assuré par J. Van Vaerenbergh, phytobactériologiste à l’Instituut voor Landbouw- en
Visserijonderzoek (ILVO), Belgique.
La première réunion de l’EAP a eu lieu conjointement à la réunion EPPO Panel on Bacterial Diseases à Izmir, Turquie les 4/5 février 2009. Les sujets suivants ont été abordés:
• présentation du site web www.eapnet.eu et formulaire d’inscription pour les membres. Ce site web est temporairement hébergé sur le serveur ILVO et peut être visité sur www.ilvo.vlaanderen.be\eap.
• projets EUPHRESCO (test interlaboratoire Clavibacter & Ralstonia, test Pantoea stewartii )
• coopération pour fournir les résultats des tests inter-laboratoires (contrôles 3ième ligne) pour l’accréditation
ISO 17025 (ex. échange de lames d’immunofluorescence, extraits d’ADN, etc ...)
• validation de méthodes PCR en temps réel
• Erwinia pectinolytique (Pectobacterium and Dickeya) sur des semences de pommes de terre
• code-barres génétiques pour l’identification et la phylogénie de Pseudomonas et Xanthomonas phytopathogéniques
• discussion sur des critères pour qualifier les bactéries pathogènes végétales contrôlées
La deuxième réunion de l’EAP a eu lieu conjointement à la réunion EPPO Panel on Bacterial Diseases à Ljubljana,
Slovénie les 24/25 mars 2010.
Johan Van Vaerenbergh (ILVO Plant, Merelbeke)
[email protected]
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