Spectrométrie de masse (caractérisation structurale)

La Glycobiologie, ou
les tribulations des sucres de la cellule
Isabelle Gasnereau*, Pierre-Edouard Bodet*, Véronique Friand*,
Mehdi Prull-Janssen, Cédric Przybylski, Isabelle Salard-Arnaud, Florence Gonnet, Régis Daniel.
* Ces auteurs ont participé de manière équivalente à ce poster.
Laboratoire Analyse et Modélisation pour la Biologie et l’Environnement, Université d’Evry Val d’Essonne, CNRS UMR 8587, 91025 Evry Cedex, France
Les sucres: un code secret ?
Les sucres appelés Glycosaminoglycanes (GAGs)
La biosynthèse de ces polysaccharides linéaires anioniques, le plus souvent sulfatés,
n’est pas codée génétiquement. Elle implique généralement:
 répétition d’unités disaccharidiques [acide uronique + ose aminé ]
 modification, à priori non déterministe, de la chaîne de GAG (sulfatation,
acétylation, épimérisation)
GAGs + protéine =
protéoglycanne (PG)
Rôles cruciaux des PGs dans de
nombreux processus biologiques
Signalisation
cellulaire
Interactions cellulaires
Différentiation cellulaire
Morphogenèse
PGs
Recrutement
leucocytaire
Inflammation
(1)
LES ENJEUX :
(2)
(3)
Porte d’entrée
microbienne
et virale
Prolifération cellulaire
Processus
métastatiques
ELUCIDATION DE LA RELATION STRUCTURE/FONCTION DES GAGS
À L’IMAGE DE L’ADN, DÉCRYPTAGE DU CODE INFORMATIONEL
Trois niveaux d’analyses
Structural
Temporel
Pathologique
O-sulfatation : évènement régulateur des
processus physiopathologiques ?
Les cellules souches comme modèle
d’étude de la dynamique structurale du
glycome exprimé à la surface cellulaire
GAGs: biomarqueurs glucidiques des
mucopolysaccharidoses
Mucopolysaccharidoses (MPS) = accumulation lysosomale et extracellulaire de GAGs d’origine génétique.
Analyses et comparaison de Liquides Céphalo-Rachidien de sujets:
Neurones
Précurseurs
neuronaux
3-O-sulfatation: sulfatation rare
 présente dans le motif de
reconnaissance:
de l’antithrombine  coagulation
de la protéine gD du virus de l’herpès  infection virale
Ostéoblastes
(4)
Analyse structurale et étude de la régiosélectivité des
enzymes impliquées dans les O-sulfatations.
Enzymologie-Spectrométrie de masse
Ce projet est financé par Universud Paris, et en
collaboration avec l’équipe de David Bonnaffé, ICMMO
Université Paris-Sud 11, CNRS UMR 8182; de Hugues
Lortat-Jacob, IBS; et de Fabrice Allain, CNRS UMR 8576.
Cellules souches
Précurseurs
mésenchymateux
cellule
Sains
Chondrocytes
cellule
Atteints de MPS
et non traités
cellule
Atteints de MPS et traité
par thérapie génique
(5)
Identification et rôles des GAGs au cours de la
différentiation des cellules souches
Biologie cellulaire-Spectrométrie de masse.
Ce projet est en collaboration avec l’équipe de Cécile
Martinat, I-STEM (Inserm UEVE U861/AFM).
Identification/quantification des GAGs biomarqueurs
des MPS et évaluation de l’efficacité de la
thérapie génique.
Glycomique-Spectrométrie de masse
Ce projet est en collaboration avec l’équipe de JeanMichel Heard, Institut Pasteur (INSERM U622).
Stratégies d’analyses des GAGs, un véritable challenge dû à leur hétérogénéité, l’absence
de codage génétique, leur faible bio-disponibilité et difficulté de synthèse
Purification et séparation:
Chromatographie d’exclusion (taille), échange d’anions (charge) ou adsorption (affinité)
Dialyse
Tétrasaccharide d’héparine
totalement sulfaté (6 sulfates):
Dosage par spectrophotométrie:
Grâce aux extrémités réductrices, sulfatations et insaturations
Enzymologie:
Héparinases et chondroïtinases
Sulfotransférases
R= H ou SO3- et R1= H ou Ac ou SO3-
Identification structurale:
Spectrométrie de masse (caractérisation structurale): MALDI-TOF, ESI-Orbitrap, AP-MALDI-Orbitrap
Interaction protéines cibles:
Couplages électrophorèse capillaire-MS, Résonance plasmonique de surface (SPR)-MS
Pour plus de renseignements sur ces techniques, voir le poster «Plate-forme de Spectrométrie de Masse du LAMBE».
Spectre de masse MALDI obtenu avec un tétrasaccharide d’héparine plurisulfaté
References: 1. Kiessling et al, Annu Rev Biochem. 2010. 2. Häcker et al, Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. 3. d’après (2). 4. http://www.glycoforum.gr.jp/science/now/now2E.html 5. http://www.servier.fr/servier-medical-art