Etude du developpement embryonnaire et

J. Embryol. exp. Morph. Vol. 15, 1, pp. 39-60, February 1966 39
With 3 plates
Printed in
Great Britain
Etude du developpement embryonnaire et
recherches sur les cellules de regeneration
chez Fembryon de la Planaire Polycelis
nigra (Turbellari^, Triclade)
Par A. LE MOIGNE1
Laboratoire de Biologie Animate S.P.C.N.
(Directeur: Th. Lender)
Depuis les travauxde Dubois
(1949) sur la regeneration chez les Planaires, il est
admis par la plupart des auteurs, que ce sont des cellules totipotentes du paren-
chyme, les neoblastes, qui participent a la formation du blasteme de regenera-
tion. Une blessure declenche leur migration vers la region lesee. On considere
que les neoblastes ont conserve les caracteres de cellules embryonnaires
indif-
ferenciees; ils se differencient dans le blasteme pour reconstituer les organes
manquants.
Cependant, nos connaissances actuelles ne permettent pas de dire s'il existe
deja chez l'embryon des cellules presentant les caracteres des neoblastes, et si,
dans l'afnrmative, l'embryon est apte a les utiliser pour regenerer. On ne sait
rien des mecanismes qui feraient qu'a un moment donne du developpement
embryonnaire des cellules formeraient des ebauches d'organes et se differencie-
raient, tandis que d'autres resteraient a l'etat embryonnaire.
Dans ce travail, j'ai cherche a savoir s'il existe des neoblastes chez l'embryon
de Polycelis nigra, et
s'ils peuvent former un regenerat, en utilisant trois
methodes:
La recherche du RNA dans les cellules embryonnaires par des colorations au
vert de methyle pyronine.
Des cultures d'embryons degangues et sectionnes a differents stades.
Des irradiations d'embryons de differents ages.
La teneur en RNA des cellules embryonnaires de Planaires a ete examinee au
cours d'une etude descriptive du developpement normal de Polycelis nigra (Le
Moigne, 1963). Les neoblastes sont fortement colores par la pyronine, etant
donne leur richesse en RNA (Pedersen, 1959; Lender & Gabriel, 1960); j'ai
pense pouvoir utiliser cette technique de coloration pour les retrouver chez
1 Adresse de
Vauteur: Laboratoire de Biologie Animale S.P.C.N., Universite de Paris,
Faculte des Sciences d'Orsay, Orsay (Seine et Oise), France.

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l'embryon. Son efficacite est cependant assez limitee ici, car les cellules embryon-
naires sont generalement toutes riches en RNA; Brachet (1959) en donne de
nombreux exemples.
Des experiences ont ete faites pour controler si la regeneration est possible
avant la fin du developpement embryonnaire, ce qui permettrait de conclure a la
presence chez l'embryon de cellules totipotentes, capables de migrer et de resti-
tuer les parties amputees comme les neoblastes chez l'adulte.
On sait que les cellules d'une ebauche embryonnaire deja determinee sont plus
resistantes aux rayons X que des cellules encore indeterminees. J'ai employe les
irradiations pour rechercher si, au cours de l'organogenese, on pouvait identi-
fier, a cote d'ebauches determinees, des cellules completement indeterminees qui
pourraient etre a l'origine des neoblastes. Des irradiations de cocons de
Planaires par Benazzi (1959), qui cherchait a induire des mutations, avaient
montre qu'on pouvait obtenir des eclosions apres cette operation.
HISTORIQUE
Les etudes descriptives du developpement des Triclades sont nombreuses
mais anciennes: Knappert, 1865; Metschnikoff, 1883; Iijima, 1884; Hallez,
1887; Curtis, 1902; Mattiesen, 1904; Stevens, 1904; Fulinski, 1916. II n'existait
pas de description detaillee de l'embryogenese de Polycelis nigra.
Peu d'auteurs ont etudie la regeneration chez l'embryon.
Bardeen (1902) decrit le developpement de Planaria maculata et etudie la
regeneration d'embryons. II les sectionne en avant du pharynx: les moities
anterieures reforment un pharynx et une queue dans quelques cas, les moities
posterieures ne regenerent une tete que chez des embryons ages, elles ne re-
generent pas chez des plus jeunes, ce qu'il explique par l'absence de cordons
nerveux bien formes dans les jeunes embryons.
Seilern-Aspang (1958) montre que le groupement des cellules vitellines autour
des premiers blastomeres serait du a un facteur que ceux-ci emettent. L'auteur
agit d'autre part sur les ebauches du cerveau et de la region posterieure: elles se
dedoublent a un certain stade; s'il les separe alors par centrifugation, ou s'il
empeche leur dedoublement par compression, les individus obtenus sont dis-
symetriques. Ceci montrerait que les Triclades n'ont pas un pouvoir de regula-
tion aussi etendu que leur pouvoir de regeneration.
Liotti & Bruschelli (1964) ont confirme l'hypothese de Bardeen, dans une
etude de la regeneration chez l'embryon de Dugesia lugubris. Le pouvoir de
regeneration d'une tete s'accroit avec le developpement des troncs nerveux.
L'absence de regeneration cephalique serait lie au manque d'elements nerveux
differencies dans le fragment isole.

Regeneration chez Vembryon de Polycelis41
METHODES
Les cocons sont recoltes chaque jour dans un elevage de Polycelis et sont
maintenus a 18 °C.Etude descriptive
Les cocons jeunes sont fendus et fixes a des intervalles de 24 heures. Us sont
degangues apres fixation. Pour les stades ages, on ouvre les cocons frais et fixe
les embryons apres les avoir anesthesies au chloretone a 2 pour mille.
Etude experimental
Les cocons sont ouverts sous la loupe binoculaire. Les embryons operes et les
temoins sont eleves a 18 °C dans une solution de Holtfreter normale ou diluee de
moitie.
(1) Regeneration d'embryons
Des jeunes a l'eclosion et des embryons aux stades 5, 6 et 7 sont sectionnes en
avant du pharynx (Fig. 1). Les individus d'un meme cocon forment un lot qui est
suivi isolement. Us sont generalement tous au meme stade. Ce stade est deter-
mine par un temoin que Ton fixe a l'ouverture du cocon. Queues et tetes
St. 5 St. 6 St. 7
Fig. 1. Schema des experiences de section d'embryons aux stades 5, 6, 7. C,
Cerveau; T.N., troncs nerveux. Les traits transversaux indiquent le niveau de section.
regenerent dans des salieres distinctes pendant 9 a 19 jours. On suit chaque jour
les progres de la regeneration a la loupe binoculaire. Quand un ou plusieurs
individus d'un lot ont regenere, l'experience est arretee, des essais preliminaires
ont en effet montre que ceux qui n'ont pas regenere a ce moment n'evoluent plus
jusqu'a leur mort.
(2) Irradiations
J'utilise un appareil Pickers X-rays, tension 60 kV, intensite 10 mA. La cible
etant a 10 cm de la source, l'appareil debite 1000 roentgens a la minute environ.

42 A. LE MOIGNE
J'irradie des jeunes a l'eclosion, des embryons degangues et des cocons entiers.
Les animaux sont ensuite eleves dans les meraes conditions que precedemment.
(a) Irradiations d? embryons
degangues. Un premier temoin est fixe a l'ouver-
ture du cocon, indiquant le stade des embryons mis en experience. Une partie
des embryons est irradiee, puis elevee dans le liquide de Holtfreter; l'autre partie
elevee sans irradiations fournira les temoins. Quand ils ont atteint le stade 7
depuis quelques jours, soit le stade normal de l'eclosion, un jeune est preleve
dans chacun des deux lots, pour etudier l'etat du parenchyme au debut de
l'experience de regeneration qui suit. Les autres Planaires sont sectionnees en
arriere du cerveau. Au bout de 10 a
13 jours, temps necessaire pour la regenera-
tion, elles sont fixees.
(b) Irradiations de cocons entiers. La methode precedente entraine une forte
mortalite qu'on evite en supprimant le choc operatoire du deganguage. On peut
ainsi faire des irradiations plus precoces. Le stade est determine en observant
les cocons chaque jour par transparence: des embryons qui deviennent visibles
et sont encore entoures d'un vitellus secondaire abondant sont au debut du stade
3; 24 a 48 heures plus tard, les embryons tres nettement spheriques et separes les
uns des autres sont au stade 4; au stade
5 on voit nettement l'ebauche du pharynx.
Les embryons plus ages sonttoujours degangues avant irradiation. Apres irradia-
tion, les cocons sont conserves jusqu'a l'eclosion, ou ouverts si elle n'a pas lieu.
Un ou plusieurs jeunes eclos de chaque cocon sont fixes pour apprecier l'etat de
developpement et l'aspect du parenchyme. Les autres sont sectionnes en arriere
du cerveau et mis a regenerer.Histologie
Les echantillons sont fixes au Helly, au Carnoy ou au Bouin alcoolique. Les
coupes de 5/i sont colorees aux Mann-Dominici, hemalun picro-indigo-carmin
et vert de methyle pyronine. Cette coloration specifique du RNA a ete controlee
par le test a la ribonuclease.
Dans les experiences de regeneration, les regenerats complets, de tete avec
cerveau et yeux, ou de queue avec pharynx, sont simplement observes a la loupe
binoculaire. II en est de meme pour quelques irradies ne presentant pas de
blasteme un certain temps apres decapitation.
RESULTATS
(1) Developpement embryonnaire de Polycelis nigra, et recherche du RNA
dans les cellules embryonnaires
De la ponte a l'eclosion,
j'ai distingue sept stades chez cette espece(Le Moigne,
1963). Je les rappellerai brievement:
Stade 1: multiplication des blastomeres
Les cellules-oeuf (o) sont spheriques, de 25 a 30/t de diametre. Le cytoplasme
d'abord peu pyroninophile se colore ensuite plus vivement (Planche 1, fig. 1).

Regeneration chez Vembryon de Polycelis 43
Les cellules vitellines sont de deux categories, les plus petites (F2) formeront le
syncytium nourricier, les plus grandes (Fj) seront absorbees par l'intestin em-
bryonnaire.
La segmentation est irreguliere, les blastomeres (B.) se separent des la telo-
phase. Nucleoles et cytoplasme sont tres riches en RNA (Planche 1, fig. 2).
Quand l'embryon compte une cinquantaine de blastomeres (Fig. 2), l'epiderme
embryonnaire (Ep.) s'ebauche et les cellules migrent vers l'emplacement des
futurs pharynx et intestin embryonnaires.
Fig. 2. Reconstitution d'un embryon au stade 1. On compte 60 blastomeres dans le
syncytium, groupes la ou s'ebaucheront le pharynx et l'intestin embryonnaires.
B., Blastomere; Ep., epiderme embryonnaire; Sy., syncytium nourricier.
Stade 2: edification d'un pharynx et d'un intestin embryonnaires (Fig. 3)
La structure de ces organes est classique, comparable a celle des autres
Triclades (Mattiesen, 1904; Fulinski, 1938).
Le nombre des blastomeres libres, riches en RNA passe a vingt ou trente.
Stade 3: absorption des cellules vitellines et multiplication des cellules embryon-
naires
L'embryon prend l'aspect d'une sphere creuse (Fig. 4). L'intestin est distendu.
Le pharynx conserve sa structure.
Les cellules embryonnaires sont repoussees dans le syncytium nourricier a la
peripherie. Tres pyroninophiles, elles se multiplient activement par mitoses.
Certaines presentent des bourgeonnements tres riches en RNA (Bg.) (Planche 1,
fig.
3).