Synthèse et devenir des ARN

BIOLOGIE MOLECULAIRE
PARTIE II : SYNTHESE ET DEVENIR DES ARN
CHAPITRE I : LA TRANSCRIPTION
Chez les procaryotes :
La transcription et la traduction s’effectue au même endroit
Lors de la transcription des ARN messagers, on passe directement de l’ADN a l’ARNm
Chez les Eucaryotes :
La transcription (noyau) est séparée de la traduction (cytoplasme)
Il y a des étapes de maturations de l’ARN pré-messager obtenus, aussi appelé ARNnh, en ARNm :
o L’ARNm peut être conçu à partir d’un tas de combinaisons différentes d’exons.
o Il est stabilise par coiffage et ajout d’une queue poly-A
La transcription se fait via une ARN polymérase, de 5’ vers 3’, jusqu’a un terminateur qui la fait se détacher (voir génie
génétique).
I – MECANISTIQUE DE TRANSCRIPTION
L’ARN polymérase est compose de plusieurs sous-unités qui chez les procaryotes ont chacune des caractéristiques et rôles
différents :
• α se lie aux séquences de régulation (il y en a deux)
• β et β’ forment des ponts phosphodiesters
• ω permet d’assembler les sous-unités (notamment β et β’)
Ensemble, cela forme l’Enzyme Core, qui doit se lier a une dernière sous-unité pour former une holoenzyme spécifique : σ. C’est
cette sous-unité qui donne la spécificité a l’enzyme pour le promoteur et lui permet de démarrer pour rechercher des séquences
spécifiques : la région « -35 » (appelée ainsi car située généralement 35 pb avant le début de la transcription), suivi de la
Pribnow Box ou séquence « -10 », 25 paires de bases plus loin. Elle va alors se fixer, puis σ se détache et la transcription peut
commencer a partir d’un point situe 10 pb plus tard : le point « +1 ».
On passe ensuite a la phase d’élongation de la transcription, ou la « bulle » de transcription de 17 pb, formée par l’enzyme et
l’ADN, se déplace, déroulant l’ADN pour transcrire une séquence d’ARN. Cette opération entraine, par l’action de
topoisomérases, une compensation par un super enroulement de l’ADN, positif en aval, et négatif en amont, de la séquence
transcrite.
Enfin, vient la phase de terminaison. Il y a deux types de terminaison. Dans les deux cas, le terminateur est une structure qui se
met en boucle lorsqu’elle est au contact de la polymérase (voir génie génétique) :
• Terminaison « Rho-indépendante » - exposée à la boucle, la polymérase marque un temps de pause. Déstabilisée, elle
lâche sa prise et quitte la séquence d’ADN.
• Terminaison « Rho-dépendante » - exposée a la boucle, la polymérase marque un temps de pause, mais tiens bon. Ce
battement suffit cependant a la protéine Rho, hexamère qui se lie des le départ a l’ARN en cours de formation sur une
séquence riche en C et pauvre en G, et qui ≪ poursuit ≫ la polymérase, pour rattraper celle-ci, et forcer le décrochage.
Le contrôle de l’expression génique est sous la direction des régions de contrôle génique, terme utilise pour décrire les
séquences régulatrices ou « éléments cis-régulateurs » et le promoteur du gène. Il s’effectue par la présence de protéines
régulatrices ou « éléments trans-régulateurs » et de facteurs de transcription généraux. Ces séquences peuvent appartenir a
deux catégories : les enhancers et les silencers. Ce sont des séquences d’ADN qui peuvent respectivement activer ou réprimer
l’activité du promoteur. Elles peuvent être situées n’ importe où (5’UTR, ORF, 3’UTR, même parfois très loin du promoteur !) et
régulent l’expression du gène spécifiquement dans un tissu ou au cours du développement, dans les deux sens. Elles sont
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également capables de moduler l’activité temporelle et spatiale de n’importe quel gène si elles sont fusionnées en amont ou en
aval du gène.
II – LES DIFFERENTES POLYMERASES
Chez les procaryotes il n’existe qu’un seul type d’ARN Polymérases, mais ce n’est pas le cas chez les Eucaryotes qui en disposent
de 3 types, qui ne synthétisent pas les mêmes types d’ARN :
Polymérases I (nucléole – insensible aux toxines) : Précurseurs d’ARNr et ARNr cytoplasmiques
Polymérases II (nucleoplasme – sensibles aux fortes concentrations de toxines) : ARNnh, ARNm
Polymérases III (nucleoplasme – très sensible aux toxines) : petits ARN (ARNt)
A] POLYMERASE I
Les promoteurs qui vont être reconnus par les polymérases de types I ont deux composants de séquences : le « core » du
promoteur qui comprends les séquences régulatrices évoquées plus haut (de -45 a +20 environ) et les éléments de contrôles
(UCE) situes environ de -180 a -107. Ces éléments ne sont pas nécessaires mais augmentent l’activité.
Deux facteurs entrent en jeu :
UBF1 qui se fixe sur des séquences GC a la fois dans l’UCE et sur le core
SL1 se fixe à UBF1 a la fois dans l’UCE et sur le core
La polymérase peut alors se positionner sur le core et démarrer. On ignore encore comment et pourquoi le fait d’avoir
cette configuration sur l’UCE également augmente l’activité de la polymérase.
Les ARN ribosomaux obtenus vont alors subir un épissage afin d’obtenir les différents types d’ARNr qui composeront le
ribosome.
B] POLYMERASE III
Contrairement a la polymérase de type I, il existe 3 types de promoteurs pour cette polymérase :
• Le promoteur de type 1, compose de deux séquences en aval du point +1 : la Box A et la Box C.
• Le promoteur de type 2, compose de deux séquences en aval du point +1 : la Box A, immédiatement âpres le point +1,
et la Box B, quelques bases plus loin.
• Le promoteur de type 3, compose de trois séquences en amont du point +1 : Une TATA Box (qui va jouer exactement le
même rôle que la Pribnow Box des Procaryotes) juste avant le promoteur, laquelle suffit à l’expression du gène, mais
également les séquences PSE, située un peu avant, et Oct qui se trouve tres loin en arrière du +1. Ces deux dernières
séquences augmentent l’activité du promoteur.
De la même manière que chez les polymérases de type I, toutes ces séquences servent à lier des facteurs. Il existe donc les
facteurs généraux, nécessaires au mécanisme en lui-même, qui peuvent se fixer en amont comme en aval du site d’initiation
(+1), les facteurs ubiquitaires se fixant en amont, mais proche du site d’initiation, augmentant l’efficacité, et les facteurs
inductibles, également en amont, mais loin du site d’initiation, régulant l’expression des gènes.
C] POLYMERASE II
La polymérase de type II est responsable de la synthèse des ARNnh (et donc des ARNm). Afin de déterminer la localisation du
promoteur, on peut employer la technique du run-off assay, une technique de transcription in vitro :
1. On digère un fragment linéaire de l’ADN, lequel possède un promoteur de polymérase type II dont on veut connaitre la
position, avec une enzyme de restriction : le site correspondant doit se trouver dans un emplacement connu de la
région codante du gène.
2. On met au contact notre gène tronqué avec une ARN polymérase II, des facteurs « ad hoc » ou un extrait partiellement
purifié, et des rXTP marqués.
3. La polymérase avance et arrive à l’ endroit de la coupure ou elle se retrouve donc éjectée dans le vide, formant des
fragments incomplets.
4. On récupère le fragment d’ARN marque. Sachant l’emplacement du site dans la région codante, il suffit de regarder la
taille du transcrit obtenu pour retrouver l’emplacement du point +1.
Cette technique peut être utilisée pour tester l’importance des protéines.
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La plupart des promoteurs PolII possèdent une TATA Box (-25 a -35) et un élément Inr (a cheval sur le +1). Certains ne possèdent
qu’un seul des deux et d’autres encore carrément aucun des deux. Il existe également une autre séquence, celle-ci se trouvant
en aval du site d’initiation cette fois : c’est la séquence DPE pour Downstream Promotor Element.
III – LES FACTEURS GENERAUX DE LA TRANSCRIPTION
Comme évoqué précédemment, la synthèse d’ARN, toutes polymérases confondues, se fait en présence de facteurs qui se lient
sur les différences séquences (ou sur d’autres facteurs). Parmi eux, les facteurs généraux, qui sont obligatoire pour avoir
transcription. Ceux-ci vont en effet former, avec la Polymérase elle-même, le Complexe d’initiation de la Transcription.
Dans le cas des ARN polymérases de types I et III, il n’existe que peu de facteurs généraux. En revanche, la polymérase de type II,
celle qui nous intéresse le plus car à l’origine des ARNm et donc des protéines, dispose d’une multitude de facteurs :
Le premier à entrer en action est le TFIID, un complexe qui réunit en fait deux facteurs : une sous-unité de TBP qui va venir se
fixer a la TATA Box, et 12 sous-unités de TAF, dont le rôle est d’interagir avec l’Inr et le DPE afin de « brancher » TBP sur la TATA
Box. Toutefois, cette fixation ne peut se faire qu’a l’aide d’un autre facteur : TFIIA, facteur en 3 sous-unités qui dissocie le dimère
de TBP, dont la forme dimérique « de base » n’est pas compatible à un branchement sur l’ADN.
Le facteur TFIID dispose d’un second rôle – celui de recruter TFIIB (1 sous-unité), facteur qui va sélectionner le site de démarrage
ème
de la polymérase, et recruter celle-ci en plus d’un 4 facteur, TFIIF (2 sous-unités). Le rôle de TFIIF va être majoritairement de
cibler la polymérase sur le promoteur et de détruire toutes les interactions non spécifiques « parasites » qui pourraient se
former. A son tour, il appelle alors le facteur suivant, TFIIE (2 sous-unités). Celui-ci n’a pas d’autre rôle que de recruter TFIIH et
moduler les activités de celui-ci, des activités kinase, hélicase et ATPase, qui vont permettre la libération du promoteur (par
phosphorylation du domaine C-Terminal) et l’avancée de la polymérase.
IV – LES TECHNIQUES D’ANALYSE
Il existe plusieurs techniques que l’on utilise pour étudier les acides nucléiques.
Technique de Southern Blot (permet d’identifier de l’ADN de le séparer selon son poids moléculaire)
Migration sur gel en conditions non-dénaturantes d’ADN colore au BET, par le biais d’une électrophorèse.
Le gel est place sur une éponge, laquelle baigne dans une solution saline. On pose une membrane de nitrocellulose sur
le gel, et du papier absorbant par-dessus.
Récupération de la membrane sur laquelle l’ADN a filtré et a été transféré. Hybridation dans un sac spécifique avec une
sonde.
Lavage de la membrane pour éliminer l’excès de sonde.
Autoradiographie et obtention d’un autoradiogramme sur lequel la sonde s’est liée de façon complémentaire aux ADN
étudiés.
Technique de northern Blot (permet d’identifier de l’ARN de le séparer selon son poids moléculaire)
Migration sur gel contenant du formaldéhyde comme dénaturant d’ARN colore au BET, par le biais d’une
électrophorèse.
Le gel est place sur une éponge, laquelle baigne dans une solution saline. On pose une membrane de nitrocellulose sur
le gel, et du papier absorbant par-dessus.
Récupération de la membrane sur laquelle l’ARN a filtré et a été transféré. Hybridation dans un sac spécifique avec une
sonde.
Lavage de la membrane pour éliminer l’excès de sonde.
Autoradiographie et obtention d’un autoradiogramme sur lequel la sonde s’est liée de façon complémentaire aux ARN
étudiés.
Technique de la RT-PCR (permet d’amplifier un fragment d’ARN sous forme d’ADNc en combinant une transcription inverse et
une PCR)
Etape de transcription inverse : utilisation d’un reverse transcriptase pour passer de l’ARNm a un hybride ARNm/ADNc,
puis d’une RNAse H pour couper le brin d’ARN, et d’une ADN Polymerase pour détruire ce brin et synthétiser un brin
d’ADNc (voir le cours de génie génétique).
PCR : Amplification du brin d’ADNc (plus stable que l’ARN) avec des amorces, une Taq polymérase (résistante a la
chaleur) et des dNTP, selon les 3 étapes classiques d’une PCR sur n cycles – dénaturation des brins par portage a 94°C,
hybridation des amorces aux brins isoles (possible uniquement si la température est baissée a 55°C), puis
polymérisation (a 72°C, température optimale de la polymérase).
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n
On obtient alors, après n cycles de PCR, 2 fois la quantité d’ADNc de départ. Cette version d’analyse de PCR est dite « PCR en
point final » du fait que l’on obtient les données à la fin des n cycles.
Technique de qPCR (permet d’évaluer en temps réel la quantité d’ADN forme par PCR)
Cette technique, aussi appelée « PCR en temps réel » permet de détecter et
quantifier l’amplification de l’ADN à l’aide d’un marqueur fluorescent et du
suivi de la quantité de fluorescence a chaque cycle. On utilise comme
marqueur, par exemple, le SYBR Green, un agent qui se lie a l’ADN double
brin et devient plus fluorescent lorsqu’il est lié. On obtient ce genre de
courbe, et l’on peut ainsi déterminer la valeur du cycle seuil, Ct. Celle-ci
dépend du nombre de matrices au départ : plus il y a de matrices à
amplifier, plus on arrivera vite au seuil Ct.
Cela nous permettra de quantifier relativement les ARNm sans courbe de
standard, en comparant simplement les Ct, avec l’aide d’un gène
domestique qui nous servira de contrôle endogène (vérificatif du dosage de
l’ARN, de la qualité de celui-ci, et de l’efficacité de la Reverse Transcription) et d’un calibrateur (qui représente l’état normal
physiologiquement – c’est le standard).
Cartographie a la RNAse (permet d’analyser un fragment d’ARN)
Cela nécessite d’avoir déjà un morceau de l’ADN correspondant.
Insertion dans un vecteur que l’on va ensuite faire exprimer avec une RNA Polymérase sp6 et des rNTP marqués, pour
obtenir de l’ARN marqué qui nous servira de ribosonde.
Hybridations de nos fragments d’ARN avec les ribosondes obtenues
Digestion par RNAse A, enzyme qui dégrade spécifiquement l’ARN simple brin, pour conserver uniquement le fragment
accroché à la sonde.
Analyse sur gel en condition dénaturante suivie d’une autoradiographie. Le fragment digéré par RNAse va plus loin que
le fragment non digéré.
Transcription sur noyaux isoles (Run-on) (permet de déterminer le type de régulation d’un gène étudié)
Lyse ménagée de cellules afin de récupérer les noyaux isolés.
Incubation des noyaux 5 minutes a 30 °C avec des XTP marques.
Ajout d’héparine, qui stoppe l’initiation de transcription. Subsiste alors les ARN dont la transcription a débuté in vivo
avant la lyse. Ceux-ci vont donc continuer leur élongation de façon in vitro.
Purification et récupération des ARN marqués qui vont servir de sonde
Hybridation avec les ADN correspondants aux gènes étudiés fixes sur membrane. Selon le résultat du run-on et d’un
northern complémentaire, on peut alors déterminer le type de régulation :
o Si le run-on ne nous montre aucune décroissance de la transcription, tout comme le northern, c’est qu’il n’y a
pas de régulation.
o Si le run-on ne nous montre aucune décroissance de la transcription, mais que le northern montre qu’il y a de
moins en moins d’expression, c’est que la régulation du gène est post-transcriptionnelle.
o Si le run-on nous présente une décroissance au cours du temps, et que le northern nous montre que le gene
est de moins en moins exprime, c’est que la régulation est transcriptionnelle.
o Si le run-on nous présente une décroissance au cours du temps, et que le northern nous montre un arrêt de
l’expression brutal et rapide, c’est que la régulation est à la fois transcriptionnelle et post-transcriptionnelle.
Digestion a la nucléase S1 (permet de trouver le 5’ d’un transcrit)
Marquage d’un brin d’ADN en 5’.
Hybridation du brin avec l’ARN correspondant.
Digestion du surplus avec une nucléase S1, enzyme digérant tout ce qui est simple brin (ADN et ARN).
Dénaturation et autoradiographie du brin d’ADN.
Extension d’amorce (permet de trouver le 5’ d’un transcrit)
Marquage d’un oligonucléotide en 5’.
Hybridation de l’oligonucléotide avec notre ARN.
Reverse Transcription (avec Reverse Transcriptase + dNTPs).
Dénaturation et autoradiographie du brin d’ADN.
RACE PCR (permet de trouver le 5’ ou le 3’ d’un transcrit)
A l’aide d’une ligase, lier un adaptateur en 5’ sur l’ARNm.
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Réaliser une Reverse Transcription pour obtenir un hybride ARNm/ADNc
Digérer l’ARN a la RNAse.
Lier un autre adaptateur en 5’ de l’ADNc.
er
1 tour de PCR avec un OligodT en 5’.
ème
2 tour de PCR avec un OligodT spécifique en 5’ sur l’autre brin
N tours de PCR, puis recommencer avec deux autres oligos (un sur chaque brin) décalés par rapport aux premiers.
Technique du gène rapporteur (permet de déterminer les séquences régulatrices importantes en 5’UTR d’un promoteur)
Introduction d’un « gène rapporteur » dans la séquence génétique, en aval de la région 5’ étudiée, via transfection,
introduction par vecteur viral ou transgénèse. Selon le type de détection, on emploiera :
o Enzymatique : β-galactosidase, luciferase, CAT
o Immunologique : TSV40, β-globine
o Fluorescente : GFP
Mesure de l’activité de transcription du gène rapporteur lorsque l’on supprime différentes parties du 5’UTR étudié. Les
parties qui, lorsqu’elles sont supprimées, détruisent ou faiblissent sévèrement l’activité transcriptionnelle sont les
parties essentielles.
Protection a la DNAse I (footprint) (permet de localiser et identifier les sites de liaisons Protéines/ADN)
Marquage de fragment d’ADN (amplifié par PCR par exemple)
Constitution de deux pools : un avec de l’ADN marque, l’autre avec de l’ADN marque mis au contact de protéines de
liaisons
Digestion partielle à la DNAse I des deux pools
Electrophorèse/Autoradiographie. Les fragments manquants à l’image sur le pool mis au contact avec les protéines sont
les résultantes du fait que les protéines étaient liées à ces endroits la, protégeant ainsi l’ADN de la digestion. Ce qui
permet de connaitre l’emplacement de la séquence de liaison.
Méthode de retard sur gel (EMSA) (permet de vérifier l’interaction entre une protéine et l’ADN)
Marquage d’ADN
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Incubation de cet ADN a la fois sans protéine mais aussi avec la protéine susceptible de se lier dessus, si connue, ou une
mixture de protéine.
Electrophorèse : dans le puits ADN + Protéine, on droit retrouver une bande au même niveau que dans l’autre puits,
mais également, si la protéine s’est effectivement bien liée, elle a « retardé » l’ADN et donc créer une bande
« Complexe ADN/Protéine » se trouvant plus haut.
Si cette technique est utilisée avec de l’ADN froid en plus pour faire compétition, c’est une « Compétition de Retard sur Gel ».
Méthode de Super-retard sur gel (permet de connaitre avec précision la protéine spécifique de la région)
Marquage d’ADN
Incubation de cet ADN a la fois avec les protéines dans un puits, mais aussi dans l’autre puits le mélange ADN + Protéine
+ Anticorps spécifique à cette protéine.
Electrophorèse : dans le puits ADN + Protéine, on retrouve deux bandes – une pour l’ADN libre, une pour le complexe.
Dans le puits ADN + Protéine + Anticorps, on doit retrouver une bande pour l’ADN libre, et une bande « superretardée » encore plus haute que le simple complexe ADN/Protéine, due a l’interaction avec l’anticorps. Si c’est le cas,
alors c’est bien cette protéine qui interagit.
V – LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION
Les facteurs de transcriptions (autres que généraux qu’on a déjà étudiés) sont composes de plusieurs domaines : un domaine de
liaison à l’ADN, séparé d’un domaine d’activation par un domaine de connexion.
Il existe plusieurs types de domaines de liaison :
Le motif Zinc Finger (doigt de Zinc), une boucle de 23 acides amines dotée d’un site de liaison au Zinc formé par des
Histidines et des Cystéines. Il y en a plusieurs par protéines et concerne par exemple les récepteurs aux stéroïdes ou les
récepteurs nucléaires.
Le motif Helix-Loop-Helix (HLH), motifs de 40 à 50 acides amines qui comprennent deux hélices α de 15-16 résidus
séparés par une boucle. Les hélices sont responsables de la formation de dimères et peuvent se lier à l’ADN a l’aide de
leur partie basique.
Les motifs Leucine Zipper (Motif a Leucine) sont des répétitions de leucines tous les 7 résidus qui se trouvent
positionnés du même coté d’une hélice α longue d’au moins 6 tours. Elles aussi se dimérisent, en général en
homodimères, l’heterodimérisation pouvant altérer leur spécificité.
Parmi les facteurs, on en retrouve qui servent a indiquer le tissu spécifique dans lequel la protéine doit être exprimée, et
d’autres ayant diverses fonctions :
Facteur
CREB
AP1
GR
MTF
TR
HSTF
Fonction
Liaison à l’élément de réponse à l’AMP Cyclique
Protéine Activatrice
Récepteur aux glucocorticoïdes se liant à l’élément GRE
Facteur de transcription répondant aux métaux
Récepteur à l’hormone thyroïdienne se liant à l’élément TRE
Facteur de transcription répondant à un choc thermique
L’activité de ces facteurs est souvent modulable rapidement, par fixation d’un ligand, phosphorylation en réponse à un stress,
expression d’une protéine régulatrice, ou dégradation.
Il faut également garder a l’esprit que l’ADN est condensé sous forme chromatine avec des histones. On parle
d’hétérochromatine condensée lorsque les histones sont déacetylés par une histone déacetylase et d’eurochromatine relâchée
s’ils sont acétyles par une histone acétylase, ce qui est nécessaire pour avoir action des facteurs.
VI – ELONGATION, TERMINAISON, MATURATION
Des que l’ARN commence a sortir de l’ARN Polymérase, il est immédiatement pris en charge par les facteurs de coiffe,
d’épissage, et de polyadénylation. Ce dernier suit le mouvement jusqu’a la séquence signal de polyadénylation qui se trouve sur
l’ADN, et, en s’y liant, permet à la terminaison d’être plus favorable que l’élongation.
Le transcrit primaire peut donc subir les modifications suivantes, dans le noyau.
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1- ADDITION DE LA COIFFE
Se fait en 5’ par action de 4 enzymes différentes : Phosphatase, Guanylyl-transférase, Guanine 7-méthyl-transférase et 2’-Ométhyl-transférase. Sa structure est en grande partie commune pour tous les eucaryotes, mais les eucaryotes unicellulaires ont
un ribonucléotide en plus, alors que les vertébrés en ont carrément deux en plus.
2- CLIVAGE ET POLYADENYLATION
Lorsque CPSF, le facteur de polyadénylation, se lie à la séquence signal, d’autres protéines le rejoignent, induisant la courbure de
l’ARN, ce qui permet a la Poly-A Polymérase de venir se loger et générer, en consommant de l’ATP et en libérant tout les
facteurs associes sauf le CPSF, digérant ainsi l’ARN courbe, une queue poly-A devenant la fin de la séquence. Cette
polyadénylation est dite « polyadénylation lente ». Lorsqu’elle est suffisamment avancée, la Poly-A Binding Protein II se fixe sur
la queue, déclenchant la « polyadénylation rapide ».
3- ARN EDITING
Il s’agit de tout procédé autre que l’épissage et conduisant a un changement de la séquence de l’ARN par rapport à la séquence
de l’ADN de base. Il s’agit par exemple d’insertion, délétion, ou modification de nucléotides. L’apolipoproteine B, par exemple,
est éditée dans l’intestin pour donner lieu à une forme courte qui n’est pas endocytosée comme dans le foie.
4- EPISSAGE
C’est l’élimination des introns, traitée dans le chapitre sur l’épissage.
CHAPITRE II : L’EPISSAGE
I – INTRODUCTION
On peut mettre en évidence les introns par Southern, en dégradant l’ADN via enzyme de restriction, qu’on séparé alors par
électrophorèse et qu’on fait migrer avant de faire une hybridation avec de l’ADNc ne contenant pas de site de l’enzyme utilisée.
L’autoradiographie nous révèle alors les introns.
On peut également, pour déterminer le nombre d’exons, utiliser la technique de la nucléase S1. Cette enzyme peut digérer
l’ADN qui n’est pas en double brin. On l’utilise sur un hybride ARNm/ADN pour couper les parties « seules » de l’ADN, qui
correspondent donc aux introns. Par analyse sur gel, on peut ensuite retrouver ces brins.
Enfin, on peut utiliser la technique de la PCR en parallèle sur de l’ADNg et de l’ADNc avec les mêmes amorces pour amplifier des
fragments de tailles différentes.
L’épissage est un phénomène dont l’importance augmente avec la complexité du génome, puisque le nombre, et la longueur des
introns, augmentent avec la complexité du génome.
II – MECANISMES D’EPISSAGE
Les introns commencent généralement par GU et finissent par AG, bien qu’il en existe, de façon minoritaire, qui sont AU/AC.
Cet épissage ne se fait que grâce au splicéosome (malgré que certains génomes comprennent des introns « auto-épissables »
(qui peuvent s’exciser seuls), un complexe qui entoure la région ou ces deux réactions auront lieu. Ce complexe est composé
d’environ 200 protéines, mais surtout de 5 particules snRNP (U1, U2, U4, U5 et U6) qui sont en fait des complexes contenant
chacun 1 ARNsn, lequel reconnait les sites d’épissage en adoptant des structures secondaires, et environ 20 protéines qui
accompagnent les ARN.
U1 se fixe sur le GU initial (que l’on appelle « consensus gauche ») de l’intron à éliminer.
U2 termine de baliser l’ARN en se fixant sur un site de branchement proche du AG final (le « consensus droit »)
U4 et U6 s’associent et rapprochent, par courbure de l’ARN, la particule U1 de la particule U2.
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U5 arrive à son tour et stabilise la courbure en s’attachant aux deux cotes de l’ARN et en maintenant le consensus
gauche très proche du site de branchement. U4 et U1 peuvent alors quitter le complexe.
De par ce rapprochement, l’adénosine du site de branchement peut attaquer le 5’ de l’intron, et, par réaction avec l’OP-O final de l’exon 1 qui se trouve juste avant, provoquer un clivage : l’intron est désormais rebranche sur lui-même (on
parle d’un « lasso ») et séparé de l’exon 1 – c’est la première transestérification.
Enfin, le OH ainsi forme de l’exon 1, toujours relie au 3’ de l’intron par la particule U5, attaque celui-ci, et, par réaction
avec l’O-P-O initial de l’exon 2, se lie à lui dans un nouvel O-P-O (c’est la deuxième transestérification), clivant l’intron
également en 3’ : celui-ci se retrouve alors évacué.
III – L’EPISSAGE ALTERNATIF
Le génome humain comprend 32 Mpb. Seulement 1.5 % de cet ADN est codant, ce qui fait qu’on a environ 30 000 gènes qui
codent pour 100 a 200 000 protéines… Cette incohérence s’explique par un phénomène : l’épissage alternatif. C’est un
mécanisme par lequel un ARN immature peut conduire a PLUSIEURS ARNm différents, par les mécanismes suivants :
Existence de site 3’ et 5’ alternatifs
Elimination de certains exons
Exclusivité de certains exons a certains tissus
Existence de promoteurs alternatifs
Existence de poly-A alternatifs
Tout cela nous permet d’avoir une diversité génétique énorme. C’est un événement fréquent chez les mammifères, chez
l’homme 50 % des gènes subissent l’épissage alternatif. La régulation de ce phénomène passe par des signaux enhancers (les
protéines SR, phosphoprotéines nucléaires dont l’état de phosphorylation régule les interactions qu’elles peuvent faire,
intervenant dans l’épissage et le choix des sites 5’ et 3’ alternatifs) et silencers (famille des hnRNP).
Par épissage alternatif, un activateur peut ainsi devenir répresseur : c’est le rétrocontrôle de l’épissage. On peut aussi retrouver
le phénomène d’exonisation par lequel certains introns deviennent des exons.
L’épissage alternatif peut être également responsable de pathologies, par mutation, activation, ou création de sites d’épissages.
CHAPITRE III : TRANSPORT ET STABILITE DES ARNm
I – TRANSPORT DES ARN MESSAGERS
Apres sa maturation, l’ARNm reste associe avec des protéines spécifiques, formant des complexes mRNP de manière cotranscriptionnelle. Le transport en lui-même se fait a l’aide de protéines riches en Serine et en Arginine qui sont reconnues par le
pore nucléaire. Apres la reconnaissance, l’ARN passe dans le cytoplasme, où il est lâché par les protéines des mRNP mais
immédiatement pris en charge par des protéines cytoplasmiques de liaison a l’ARN. Les besoins énergétiques sont assurés par
les protéines RAN.
Dans certaines cellules, on retrouve des transports d’ARNt allant de noyau à mitochondrie, ou d’ARNm allant de cellule à cellule
(comme chez les plantes).
II – STABILITE DES ARN MESSAGERS
La concentration des ARNm donne une idée du taux de synthèse/dégradation. Il faut donc réguler la stabilité de ceux-ci pour
être sur que les protéines qu’ils vont donner soit là durant la bonne période de temps (certaines protéines, comme les signaux,
ne doivent s’exprimer que de façon très brève, alors que d’autre doivent être traduites tout le temps).
Plus les organismes sont compliques, plus la demi-vie de leurs ARNm est grande. On peut mesurer ce temps via plusieurs
techniques (marquage et chasse, marquage a l’état stationnaire, arrêt de la transcription).
Il existe plusieurs choses pouvant affecter la stabilité des ARN messagers :
• La coiffe (qui protège contre les exonucléases).
• Boucle en 5’UTR qui, en inhibant la traduction, peut stabiliser l’ARN.
• Eléments dans l’ORF permettant d’en masquer d’autres parfois.
• Codon précoce de terminaison.
Par Krys3000 (Groupe « The Trust » - http://www.cours-en-ligne.tk/)
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Jonction entre exons, qui sert de liaison pour les protéines navettes.
Eléments ARE dans le 3’UTR qui permettent de lier des protéines stabilisantes ou déstabilisantes (réduction du temps
de vie). C’est le cas de la ferritine et du récepteur a la transferrine qui sont des régulations de deux types différents
mais orchestrées par la même protéine selon si elle est active ou pas.
Queue Poly-A (qui protège contre les exonucleases).
Il existe 4 voies de dégradation des ARN eucaryotes :
1. Décoiffage puis digestion par des exonucléases 5’ 3’
2. Réduction de la queue poly-A puis décoiffage et digestion par des exonucléases 5’ 3’ (l’emprisonnement de la coiffe
par la protéine DCP1 est enclenchée par déadénylation, puis dégradation par XRN1)
3. Réduction de la queue poly-A et dégradation par un exosome (complexe d’exonucléases) de façon 3’ 5’
4. Digestion endonucléolytique
Ce sont des voies générales. On pourrait entrer plus dans le détail des voies pour chaque type d’espèces.
La stabilité est également assurée par le NMD (Non-sense mediated decay) qui empêche l’accumulation des protéines tronquées
(suppression des ARN avec codons stop précoces, des ARN non épissés, et des ARN ayant des 3’UTR trop longs) : c’est un
système de surveillance.
Enfin, le dernier système de stabilité est l’inhibition par les ARNi, des petits ARN d’interférence simple ou double brin, allant de
20 a 25 nucléotides, générés par une ribonucléase de type III nommée « Dicer » et qui sont pris en charges par des complexes
RISC pour se fixer sur l’ARN par homologie et le dégrader.
III – LOCALISATION DES ARN MESSAGERS
Les ARN peuvent êtres localises dans des compartiments subcellulaires, par des processus orchestres par l’actine et la tubuline.
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