Microscopie en bacteriologie
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République du Sénégal Ministère de la Santé et de la Prévention Réseau National de Laboratoires * * * * * * * * * * MICROSCOPIE EN BACTERIOLOGIEBACTERIOLOGIE-VIROLOGIE RESAO RES AOLAB LAB Convention de Financement N° N° AFD CZZ 1338 01 C Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Introduction Examen microscopique : mise en évidence bactéries et virus Microscopes optiques, optiques à fond noir, à fluorescence: forme, constituants Microscope éléctronique : ultrastructure Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Microscopie en Bactériologie Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 EXAMEN MICROSCOPIQUE I. Examen sans coloration II. Examen après coloration 1. Colorations simples 2. Colorations différentielles 3. Colorations spécifiques III. Examen après réaction d’Immunofluorescence Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen sans coloration Etat Frais Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen sans coloration = Examen à l'état frais 1- A partir d’une suspension bactérienne - Technique • Déposer sur la lame une goutte de la suspension à l’aide d’une pipette pasteur débouclée • Recouvrir de lamelle couvre couvre-- objet propre Eviter d’enfermer des bulles d’air Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame dans une solution désinfectante et recommencer) • Observer au microscope à l’objectif 40 x, condenseur abaissé, sans huile à immersion Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012 Examen sans coloration = Examen à l’état frais - Lecture • Apprécier la flore bactérienne: présence ou absence ; abondance, morphologie (bacilles, cocci, spirilles), mobilité • Lors de la pose de la lamelle, des flux liquidiens entraînent toutes les bactéries dans le même sens et à la même vitesse… • Des bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très différents sont observés (déplacement dans toutes les directions). Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen sans coloration = Examen à l’état frais - Lecture • Veiller à observer une grande partie de la lame, mais ne pas prolonger l’observation au au--delà de 3 à 10 minutes • Ne pas hésiter à recommencer… recommencer… • Après observation, jeter la lame dans un bac contenant un désinfectant à large spectre car les bactéries sont vivantes… vivantes… Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen sans coloration = Examen à l’état frais ATTENTION ! • Une bactérie mobile peut apparaître immobile alors qu’elle est flagellée si les conditions de l’observation ne sont pas optimales - flagelles cassés par la préparation ou détruits par un instrument trop chaud - bactérie provenant d’une culture vieille • Mobilité influencée par la température d’incubation : - certaines bactéries immobiles à 37 37°°C et mobiles à 22° 22°C (Yersinia, (Yersinia, Hafnia… Hafnia …). • Une bactérie immobile est animée de mouvements d’agitation normaux dits mouvements browniens (agitation moléculaire) moléculaire) : ne pas confondre avec la mobilité Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen sans coloration = Examen à l’état frais 2- A partir d’une culture bactérienne sur gélose - Technique • Déposer sur la lame une goutte d’eau distillée stérile ou de sérum physiologique • Prélever une colonie et faire une suspension homogène dans la goutte d’eau en incorporant progressivement l’inoculum et en remuant très délicatement (afin de ne pas casser les flagelles) • Recouvrir de lamelle - Lecture • Procéder comme précédemment Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Réalisation d’un frottis • Frottis Frottis== étalement monocouche des bactéries/ lame • Déposer sur une lame propre une goutte de suspension ou d’eau stérile si la culture prélevée est solide, puis prélever à l’aide de l’anse de platine une parcelle de la culture • Mélanger afin d’obtenir une suspension homogène Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Réalisation d’un frottis • Réaliser le frottis en partant du centre de la lame, en décrivant avec l’anse des mouvements circulaires de façon à obtenir un étalement mince et homogène sur au moins 2/3 de la lame • Stériliser l’anse • Sécher et fixer le frottis au au--dessus de la flamme du bec Bunsen sans trop le chauffer • Effectuer alors la coloration désirée Rq:: Rq avant de colorer, attendre que la lame refroidisse sous peine de cristallisation du premier colorant ou de casse de la lame… lame… Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Réalisation d’un frottis Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Colorations simples Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Colorations simples 1/Coloration au Bleu de méthylène - Technique • Recouvrir le frottis de bleu de méthylène phéniqué • Laisser agir 1 minute • Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée ou à l'eau du robinet jusqu'à élimination des colorants en excès • Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou délicatement entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter • Examiner au microscope, objectif à immersion Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012 - Résultats • Les bactéries sont colorées en bleu sombre • Coloration intéressante pour l'observation rapide des frottis mais permet seulement une étude morphologique • Nécessité de la compléter par une coloration de Gram, et de MayMay-Grünwald Grünwald--Giemsa pour la reconnaissance des éléments cellulaires - Applications Pus urétral, LCR Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 2/ Coloration au Giemsa • Coloration polychromatique douce • Colorant de Giemsa : 3 colorants (bleu de méthylène, azur de méthylène et éosine) éosinate d’azur de méthyle : - composé qui se forme spontanément dans le mélange - donne des colorations différentes selon le support - Étapes de coloration, coloration, épreuve et contre coloration faites simultanément lors de l’action du colorant de Giemsa Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Avantages : conserve mieux les cellules moins agressive que le Gram • Permet d’observer des bactéries fragiles : spirochètes, spirilles, mycoplasmes etc • Permet aussi de mettre en évidence la capsule bactérienne ou les bactéries intracellulaires Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • La technique =« coloration lente de Giemsa » • La solution de travail : à préparer extemporanément en diluant au dixième une solution mère (conservée à l’abri de l’humidité et de la lumière) avec de l’eau tamponnée pH=7 Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Réaliser un frottis et le fixer de manière douce (laisser sécher longtemps à l’étuve…) • Recouvrir de solution de Giemsa (diluée) et laisser colorer 30 minutes (cuve à coloration) • Eliminer le colorant et rincer à l’eau tamponnée.. Rincer ensuite à l’eau du robinet tamponnée • Sécher entre deux feuilles de papier absorbant et observer à l’objectif 100 à immersion Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Colorations simples 2/Coloration au Giemsa EPEC: adhésion localisée EAEC: adhésion agrégante Hep-2 E. coli Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Colorations différentielles Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Technique générale d’une coloration En général, les colorations en bactériologie suivent un même principe qui peut se définir en 3 (éventuellement 4) étapes : • • COLORATION (résultat positif à la fin) • Mordançage ou intensification de la coloration • Décoloration ou EPREUVE (c’est le caractère que l’on cherche à mettre en évidence) • CONTRE COLORATION permet d’observer les germes décolorés précédemment (résultat négatif à la fin) fin) Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Colorations différentielles 1/ Coloration de Gram base de l’identification d’une souche bactérienne - Principe Doit être parfaitement maîtrisée car c’est le point de départ du choix des examens complémentaires à effectuer, des milieux à ensemencer etc etc… … Les différences de coloration des bactéries reposent sur des différences de constitution de la paroi Teste l’alcoolo résistance d’une souche bactérienne Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 1/ Coloration de Gram -Technique • Réaliser un frottis et le fixer • Coloration : violet de Gentiane phéniqué durant une minute. Rincer à l’eau du robinet • Mordançage : recouvrir la lame de réactif de Lugol 1 minute (réactif iodo iodo--ioduré) • Rincer à l’eau Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Epreuve (alcoolo résistance) : Plonger 3 ou 4 fois une demi seconde dans un pot d’alcool ou laver 3 ou 4 fois à l’alcool • Rincer à l’eau du robinet immédiatement Les bactéries à Gram - sont alcoolo alcoolo--sensibles et sont donc décolorées La paroi des bactéries à Gram + ne laisse pas passer l’alcool et sont dites alcooloalcoolo-résistantes et restent colorées en violet Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Contre coloration : Fuschine diluée au 1/20ème ou safranine pendant une minute. Toutes les bactéries prennent le colorant mais le violet masque la fuschine Les « Gram positives » gardent le Violet de gentiane Les « Gram négatives » sont recolorées par la fuschine • Rincer à l’eau du robinet et sécher entre deux feuilles de papier absorbant • Observer à l’objectif 100 à immersion, à pleine lumière Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 - Résultats • Bactéries dites « à Gram Négatif » sont roses • Bactéries dites « à Gram Positif » sont colorées en violet Rq : certaines bactéries telles que Bacillus, Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le même frottis, on les dit « Gram labiles » et les différences de coloration sont dues à des différences d’âge des bactéries Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 1/Coloration de Gram Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Clostridium tetani Clostridium perfringens Bactéries à Gram positif Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Association Fuso-spirillaire Bactéries à Gram négatif Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Colorations différentielles 2/Coloration de Ziehl Neelsen - Principe Basée sur la capacité de bactéries à conserver, après coloration à chaud à la fuschine, fuschine, la teinte rose malgré l’action d’un acide fort concentré et d’éthanol à 95° 95° Propriété de la paroi : très riche en lipides (acide mycolique,, acides gras à longues chaînes et cires) mycolique qui ne sont retrouvés que chez ces bactéries dites « acido acido--alcoolo alcoolo--résistantes » ou BAAR Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Paroi des Mycobactéries Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Coloration de Ziehl Neelsen - Technique • Réaliser frottis d’épaisseur moyenne et le fixer • Recouvrir complètement la lame de fuschine de Ziehl concentrée et chauffer la lame jusqu'à émission de vapeurs blanches de phénol Le frottis ne doit jamais sécher (rajouter de la fuschine si nécessaire) • Eliminer le surplus de colorant, laisser refroidir la lame et rincer à l’eau du robinet Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Epreuve (acido résistance) : Recouvrir la préparation d’une solution d’acide sulfurique au 1/4 (ou d’acide nitrique au 1/3) puis d’alcool • Rincer à l’eau du robinet • Recouvrir de bleu de méthylène pendant 1 minute • Rincer à l’eau du robinet et sécher entre feuilles de papier absorbant • Observer à l’objectif 100 à l’immersion Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012 - Résultats Les BAAR apparaissent en rouge sur fond bleu Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 3/Coloration à l’acridine orange - Technique • Couvrir la lame par une solution d'acridine orange à 1% et laisser agir 15 minutes. Rincer à l’eau • Couvrir la lame avec la solution de décoloration et laisser agir 1 minute. Rincer à l’eau • Couvrir la lame de bleu de méthylène et laisser agir 1 minute. Rincer à l’eau • Couvrir la lame avec la solution de décoloration et laisser agir 3 minutes. Rincer à l’eau • Laisser sécher et lire au microscope à fluorescence Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 - Résultats • Les mycobactéries présentent une fluorescence rouge à orange • Il faut lire environ 70 champs par lame avant de déclarer une lame négative • Alternative à la coloration de ZiehlZiehl-Neelsen pour la mise en évidence des mycobactéries et doit être confirmée par cellecelle-ci en cas de positivité • Permet d'augmenter la sensibilité de l'examen direct et permet un screening plus rapide Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 4/Coloration à l’auramine l’auramine - Technique • Couvrir la lame par de l'alcool méthylique et laisser agir pendant 2 minutes. Rincer à l’eau • Couvrir la lame avec de l'l'auramine auramine et laisser agir pendant 15 minutes. Rincer à l’eau • Couvrir la lame d'acide d'acide--alcool et laisser agir 3 minutes. Rincer à l’eau • Couvrir la lame de rouge de thiazine et laisser agir 1 minutes et 30 secondes. Rincer à l’eau • Laisser sécher et lire au microscope à fluorescence Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 - Résultats Les mycobactéries apparaissent jaunes sur fond rouge Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 5/Coloration de Vago utilisée pour Treponema Treponema,, Leptospira et Borrelia - Technique : • Réaliser un frottis du prélèvement pathologique. Ne pas le fixer • Recouvrir la lame d'une solution filtrée de mercurochrome à 2% pendant 3 à 5 minutes • Laver à l'eau distillée • Colorer pendant 5 minutes avec une solution filtrée de vert de méthyle à 2% • Laver à l'eau distillée, laisser sécher • Examiner à l'objectif 100 Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 - Résultats Les bactéries apparaissent en violet clair sur un fond clair Leptospira Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012 6/Coloration de Köster • Pour les bactéries partiellement acido acido-résistantes (Brucella, Rhodococcus, Rhodococcus, Nocardia Nocardia,, Chlamydia, Actinobacillus Actinobacillus,, Bordetella Bordetella…) …) • Ne sont pas colorées par le Ziehl, Ziehl, méthode trop agressive Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 6/Coloration de Köster - Technique • Coloration : solution de fuschine (ou safranine) à 2% dans de la soude molaire pendant 1 mn • Laver à l’eau du robinet • Epreuve : Décolorer par acide sulfurique 0.1% pendant 10 à 20 sec • Rincer à l’eau du robinet • Contre Contre--coloration par du bleu de méthylène • Rincer Rincer,, sécher • Observer à l’objectif 100 à immersion. Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Les bactéries partiellement acidoacido-résistantes apparaissent roses orangées sur fond bleu Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après coloration Colorations spécifiques Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Colorations spécifiques 1/Coloration de Rhodes (flagelles) Les flagelles sont fragiles et la préparation du frottis délicate - Technique • Préparation du frottis (utiliser une lame neuve) : laisse couler, sur la lame inclinée à 45° 45° au dessus de la cuve à coloration (mettre de l’eau de Javel dans la cuve), 2 gouttes d’une culture en bouillon (culture jeune : 6 à 12 heures) de la souche à étudier. Laisser sécher. sécher. Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Recouvrir la préparation de mordant de Rhodes (préparé extemporanément) pendant 3 mn • Laver soigneusement à l’eau distillée • Recouvrir de nitrate d’argent ammoniacal (préparé extemporanément), chauffé presqu’à ébullition, et laisser agir 3 à 5 mn • Rincer à l’eau distillée • Sécher et observer à l’immersion Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 - Résultats Les corps bactériens apparaissent presque noirs, les flagelles sont teintés en brun plus ou moins foncé Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Ciliature péritriche : flagelles répartis sur toute la surface de la bactérie Ex : entérobactérie mobile • Ciliatures polaires : flagelles localisés à un ou deux pôles de la bactérie - Ciliature polaire monotriche Ex : Pseudomonas aeruginosa aeruginosa,, Aeromonas spp spp,, Vibrio spp - Ciliature polaire multitriche Ex : Pseudomonas fluorescens - Ciliature amphitriche et multitriche Ex : Plesiomonas Plesiomonas,, Helicobacter Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Colorations spécifiques 2/Colorations des spores • Espèces des genres Bacillus et Clostridium sont capables de former des spores quand les conditions deviennent défavorables : température, milieu pauvre… • Les spores = formes de résistance Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 • Forme de la spore - spore sphérique - spore cylindrique - spore ovoïde • Position de la spore - Spore centrale - spore subterminale - spore terminale • Déformation éventuelle de la bactérie par la spore - spore non déformante - spore déformante Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 2/Colorations des spores - Technique de BARTHOLOMEW : vert malachite à froid • Fixer le frottis par la chaleur : 20 passages dans la flamme (altération des structures pariétales et perméabilisation de la spore) spore) • Recouvrir de vert malachite et laisser en contact 10 minutes. • Laver à l’eau distillée pendant 10 secondes •Recouvrir le frottis de fuchsine à 0,25% et laisser en contact 10 secondes • Laver à l’eau distillée • Sécher et observer à l’immersion Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 2/Colorations des spores - Technique de BENITO TRUJILLO : vert malachite à chaud • Réaliser un frottis et le fixer • Recouvrir d’une solution de vert malachite à 5% • Chauffer jusqu’à émission de vapeurs ; laisser refroidir et chauffer à nouveau. L’opération doit durer 10 minutes au total (rajouter du colorant si nécessaire) • Laver soigneusement à l’eau distillée • Recouvrir le frottis de fuchsine basique à 0,25% pendant 1 mn • Laver à l’eau distillée, Sécher et observer à l’immersion Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 2/Colorations des spores - Résultats Les spores apparaissent vertes dans un corps bactérien coloré en rouge Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 NB : Les spores peuvent être mises en évidence : - Etat frais : elles apparaissent très réfringentes - Coloration de Gram : elles apparaissent sous forme de structures incolores bien délimitées à l’intérieur des bacilles les enveloppes sporales interdisent la pénétration des colorants Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après réaction d’Immunofluorescence Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après réaction d’Immunofluorescence Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés de la fluorescéine comme le FITC (Fluoresceine Iso Thio Cyanate). Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012 Examen après réaction d’Immunofluorescence 1/Immunofluorescence directe – Utilisation d’ un anticorps dirigé contre la molécule recherchée = antigène – Cet anticorps est couplé à un fluorochrome – Révélation: microscope à fluorescence Fluorochrome Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après réaction d’Immunofluorescence 2/Immunofluorescence indirecte Dans ce cas, on a deux anticorps: – Ac primaire dirigé contre l’antigène recherché – deuxième Ac marqué par un fluorochrome, fluorochrome, et possédant une haute affinité pour Ac primaire = antiglobuline ETAPES Fluorochrome Traceur Anticorps secondaire 2 Anticorps primaire 1 AntigËne Echantillon Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 Examen après réaction d’Immunofluorescence Lames d’immunofluorescence directe (IFD) IFD Influenza A IFD Legionnella Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012 MERCI Réseau National de Laboratoires - Module Microscopie - Avril 2012
