Relations structure-fonction des interactions de l`annexine 2 avec

Relations structure-fonction des interactions de l'annexine 2 avec les membranes
Contenu scientifique du programme de la thèse.
Les membranes cellulaires sont responsables de milliers de fonctions chez les organismes. Elles sont
composées de deux grands groupes de molécules : les lipides et les protéines. A côté de ces
composants permanents de la membrane, plusieurs groupes de protéines cytosoliques s’associent aux
lipides membranaires de manière réversible en fonction des différents états physiologiques de la
cellule. Les annexines font partie de ce dernier groupe. Ces protéines sont structurées en deux
domaines. Le corps très conservé dans la famille contient quatre domaines répétés chacun possédant
un site de liaison au Ca2+. Le calcium est en général responsable de la liaison aux membranes,
association qui nécessite la présence de phospholipides acides dans la bicouche, mais une liaison
indépendante du Ca2+ a été aussi démontrée.
L’annexine 2 est une protéine qui a été impliqué dans des fonctions cellulaires liées au trafic
intracellulaire (exo- et endocytose), à l’association du cytosquelette d’actine avec les membranes et, à
l’établissement des jonctions adhérentes. L’annexine 2 en se liant à un dimère de S100A10, forme un
complexe hétérotétramérique dont les besoins en Ca2+ pour créer des ponts entre deux membranes sont
plus faibles que ceux nécessaires pour la protéine non associée à la S100A10. De son côté, la protéine
monomérique présente des besoins en Ca2+ différents en fonction des modifications sur sa partie Nterminale comme par exemple la phosphorylation des résidus sérine ou des délétions.
Les domaines lipidiques jouent un rôle régulateur sur certaines fonctions cellulaires. Les propriétés de
liaison de l’annexine 2 aux domaines membranaires et à des phospholipides spécifiques dans la cellule
en présence ou en absence du Ca2+ ne sont pas bien caractérisées. Il est couramment admis qu’elle se
trouve associée aux membranes résistantes aux détergents, qu'elle lie la phosphatidylsérine et le
phosphatidylinositol-bisphosphate, mais la les paramètres régulateurs de l'interaction (Ca2+, H+) restent
inconnus. Plusieurs questions sont donc très importantes pour la biologie des annexines : Quels sont
les domaines membranaires cibles de la protéine? Quelle est le rôle de la composition moléculaire de
ces domaines dans la régulation de l'interaction de la protéine avec des domaines différents? Et, quels
sont les changements que la protéine induit sur l’organisation des lipides des différentes membranes
cibles et leur dynamique? Notre projet de recherche vise à donner des réponses à ces questions
fondamentales.
La réponse à ces questions devient encore plus intéressante dans un contexte biologique. Différentes
lignes de recherche ont montré que l’annexine 2 dans les cellules en prolifération est cytosolique et en
partie associée à certains domaines de la membrane plasmique et aux endosomes. Elle s’associe aux
domaines spécifiques de la membrane plasmique après la différenciation de cellules épithéliales. Plus
récemment il a été suggéré que l ‘annexine 2 jouerait un rôle dans la formation des jonctions
adhérentes dépendantes de la E-Cadhérine. La formation des jonctions cellulaires apparaît comme un
point clé dans la relation de l'annexine 2 avec les membranes non seulement dans les cellules normales
mais aussi dans les cellules cancéreuses qui ont perdu leur capacité de former des jonctions.
Notre projet de recherche vise donc à faire des études aux niveaux structural, physicochimique,
moléculaire et cellulaire. Nous utiliserons des membranes modèles dont la composition en lipides sera
contrôlée, et des membranes cellulaires de différentes sources. Les changements dans l'organisation
des lipides des membranes modèle seront étudiés par divers méthodes. Diffraction des rayons X
(synchrotron), fluorescence avec des sondes d'environnement comme le laurdan, l'ANEPPDHQ et le
pyrene, et par résonance paramagnétique électronique en utilisant des marqueurs de spin à différents
niveaux de profondeur de la bicouche. Nous chercherons les partenaires lipidiques cellulaires de la
protéine, par fractionnement biochimique des membranes. La recherche de ces partenaires se fera à
partir de cellules non différenciées (sans jonctions intercellulaires) et dans des cellules épithéliales
différenciées polarisées car l'annexine 2 change de localisation dans ces deux stades cellulaires. Une
complémentarité entre les données obtenues avec les membranes cellulaires et modèles nous permettra
de reposer les questions et définir les compositions lipidiques importantes pour l'étude. Après avoir
identifié des partenaires lipidiques de la protéine nous procéderons à la vérification des interactions
moléculaires sur des membranes cellulaires par microscopie de fluorescence (Anx2-GFP et sondes
lipidiques appropriées). La modification du taux de cholestérol sur les membranes a été envisagée
comme première approche fonctionnel. Postérieurement, l'utilisation de protéines mutantes déjà
fabriquées au laboratoire servira à étudier les effets de la phosphorylation de la protéine sur les
membranes.
Ces expériences nous aideront à mieux comprendre la fonction et les mécanismes d'action de
l’annexine 2 aux niveaux structural, moléculaire et cellulaire. Finalement, il est à noter que
l'expérience de notre groupe de recherche dans le domaine des interactions des protéines et peptides
avec les membranes et de sa capacité d'intégration interdisciplinaire et collaborative à l'intérieur de
l'unité de recherche, en France et à l'étranger, garantissent l'avancement d'un projet ambitieux et
multidisciplinaire.
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