I - Introduction - Le monde microbien

MICROBIOLOGIE GENERALE
ORGANISATION DE L’ENSEIGNEMENT
Responsable : Laurence Dupont – [email protected] – Module de 4 ECTS
er
22h de cours du 8 septembre au 1 décembre. Pas de cours le lundi 27 octobre.
5 séances de TD : 30/09, 7/10, 14/10, 25/11, 2/12 – 2 séances de TP (groupes impairs 21/10, groupes pairs
4/11, TD filé après midi et lendemain matin). Salle TP SN-II-4.
BIBLIOGRAPHIE
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Introduction à la microbiologie, Tortora, Funke, Case, Ed ERPI
Microbiologie, Perry, Staley, lory, Ed DUNOD
Physiologie de la cellule bactérienne : une approche moléculaire, Neidhardt, Ingraham, Schaechter, Ed
MASSON
Microbiologie, Prescott, Harley, Klein, Ed De Boeck Université
CHAPITRE I - LE MONDE MICROBIEN
Les microbes, germes, ou microorganismes sont des « bestioles minuscules » non visibles à l’œil nu, qui, à
première vue, ne sont ni animaux, ni végétaux, ni minéraux. Ce sont néanmoins des êtres vivants.
LA DIVERSITE DU MONDE MICROBIEN
Dans le règne du vivant, le monde microbien est réparti au sein de trois domaines : on les retrouve chez les
eucaryotes, avec les champignons unicellulaires et filamenteux, les protistes et les algues, et chez les
procaryotes, classifiés sous les deux règnes distincts des bactéries, aussi appelées eubactéries, et des
archéobactéries, ayant la particularité d’une extrêmophilie.
On retrouve donc sous le terme « microorganismes » :
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Bactéries (Bacteria et Archaea, procaryotes)
Mycètes (levures et moisissures, eucaryotes)
Protozoaires (eucaryotes)
Algues microscopiques (eucaryotes)
Cependant, il est parfois mentionné d’autres entités, comme des virus, entités non vivantes acellulaires
pratiquant le parasitisme animal, végétal ou bactérien, ou des parasites animaux pluricellulaires eucaryotes
souvent considérés car passant par un stade microscopique.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 1
BACTERIA
Ils sont quasiment toujours unicellulaires, ne possèdent pas de noyau
mais un nucléoïde, région cytoplasmique nucléaire où le matériel
génétique se retrouve plus ou moins diffus. Ils peuvent arborer
différentes formes, mais ont en commun la présence d’une paroi
majoritairement composée de peptidoglycanes, ainsi qu’un
métabolisme très varié. Illustration : bacilles.
ARCHAEA
Ce sont également des procaryotes, évolutivement différenciés de leurs
comparses bactéries, leurs phylums respectifs s’étant très tôt séparés.
Leur paroi ne possède jamais de peptidoglycane, ils peuvent néanmoins
ne pas en posséder. On les retrouve au sein d’environnements
extrêmes : certains de ces individus pionniers, par exemple les
thermophiles extrêmes, peuvent vivre à des températures avoisinant les
70°C, certains jusqu’à 100°C, et on les retrouve dans les eaux chaudes et
sulfureuses de zones volcaniques. Les bactéries halophiles extrêmes,
quant à elles, vivent à des concentrations salines de 1 à 5 molaires, que
l’on atteint dans le grand lac salé ou la mer morte. Un dernier exemple,
les bactéries méthanogènes, pratiquant une respiration éponyme. Illustration : Halobacterium sp.
MYCETES (MYCOTA)
Ce sont des eucaryotes, ils possèdent donc un noyau délimité par une
enveloppe nucléaire contenant le matériel génétique. Leur paroi est
essentiellement composée de chitine. Ils peuvent être unicellulaires,
on parlera de levures, ou pluricellulaires, des moisissures, qui
formeront des structures en hyphes s’allongeant et s’enchevêtrant
pour former un mycélium à l’aspect duveteux. Leur reproduction peut
être asexuée ou sexuée, cette dernière impliquant donc un stade
diploïde et une méiose. Illustration : Saccharomyces cerevisiae
PROTOZOAIRES/PROTISTES
Ce sont des microorganismes unicellulaires de type eucaryote, ils sont
donc entourés d’une membrane mais ne possèdent pas de paroi, et
arborent des formes variées. Ils vivent à l’état libre (dans l’eau ou les
sols) ou parasitaire, pratiquent une reproduction pouvant être sexuée,
asexuée, ou une forme intermédiaire de sexualité, et sont mobiles à
l’aide de pseudopodes ou cils. Il en existe jusqu’à 20000 espèces
différentes, qui sont rarement pathogènes comme la paramécie et
l’amibe, certains faisant même partie de la flore intestinale des
animaux et de l’homme, mais quelques-uns le sont néanmoins. Parmi
eux, nous citerons Trichomonas, provoquant des infections des voies
urinaires et génitales, Giardia, parasite intestinal, et Plasmodium, responsable du paludisme transmis par un
moustique. Illustration : Plasmodium vivax
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 2
ALGUES
Ces eucaryotes sont capables de photosynthèse, ce qu’à priori ne sont pas
capables protozoaires et mycètes, en faisant donc leur particularité. Comme
les plantes, ils sont le plus souvent munis d’une paroi cellulosique. Ils vivent
dans des milieux extrêmement variés, et pratiquent une reproduction
sexuée et asexuée. Ils ne sont néanmoins pas l’objet de ce cours.
Illustration : Anabaena sperica
VIRUS
N’étant pas vivants, ils ne sont ni
eucaryotes, ni procaryotes. Parasites cellulaires obligatoires, on les qualifie
d’agents filtrants, du fait de leur taille et étant capables de diffusion au
travers de filtres. On ne peut les observer qu’en microscopie électronique.
Illustration : Bactériophages observés au MEB
HELMINTHES
Parasites eucaryotes pluricellulaires, ce sont
leurs stades de développement microscopiques, en plus de leur impact médical, qui
permettent de les définir comme microorganismes. Pour exemple, on retrouve donc
chez les plathelminthes, la douve du foie, la douve pulmonaire (infectant l’homme
via un cycle comprenant un escargot), le ténia, et chez les némathelminthes,
Lascaris. Illustration : Ascaris lumbricoides
EVOLUTION ET PHYLOGENETIQUE
En conclusion, les microorganismes
possèdent des formes et des
habitats très variés tendant aux
extrêmes, ainsi qu’un mode de vie
qui peut être, ou non, symbiotique.
Ces caractéristiques sont propres
aux organismes pionniers.
Les premiers microorganismes sont apparus à l’Archéen, il y à 4Ga, ceux-ci étaient des procaryotes anaérobie.
Au Protérozoïque, c’est au tour des premiers microorganismes eucaryotes aérobies, puis pluricellulaires au
Précambrien à 570Ma, d’apparaître.
Les bactéries sont donc des
organismes pionniers.
Ce sont les cyanobactéries,
photosynthétiques, qui ont permis
l’apparition de l’oxygène sur Terre.
De la même manière, et d’un point
de vue évolutif, ce sont les
bactéries qui sont à l’origine des
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 3
organelles, les cyanobactéries étant à l’origine de la formation du chloroplaste par endosymbiose avec une
cellule eucaryote unicellulaire,, et les protéobactéries (bactérie aérobie) étant selon le même mécanisme à
l’origine de la mitochondrie, assurant respiration
r
et production d’ATP.
L’arbre phylogénétique présenté nous montre la séparation évolutive des grands groupes de microorganismes.
Afin de le dresser, les études ont été basées sur un marqueur moléculaire, qui est une molécule très bien
conservée dans le temps. Ici,, ces molécules sont l’ARNr 16s et 18s, la traduction étant un mécanisme universel,
et les ribosomes étant ubiquitaires et très conservés.
conse
On retrouve chez les procaryotes et les eucaryotes les
ARNr 16S, et 18s, respectivement.
NOMENCLATURE
Chez les microorganismes,
roorganismes, tout comme chez n’importe quelle espèce décrite, ill existe une hiérarchie
taxinomique. Pour l’illustrer celle utilisée chez les microorganismes,
microorganismes, prenons l’exemple de la bactérie
Escherichia coli,, dont on note que la souche au génome entièrement
entièrement séquencé est la K12.
Domaine
Règne
Embanchement ou phylum
•Bacteria
•[nul]
•Proteobacteria
Classe
•Gamma proteobacteria
Ordre
•Enterobacteriales
Famille
•Enteriobacteriaceae
Genre
•Escherichia
Espèce
•Coli
Souche
•Ensemble
Ensemble de cellules bactériennes descendant toutes d'une même cellule mère.
CARACTERES GENERAUX PROPRES AUX PROCARYOTES ET EUCARYOTES
Les deux organismes ont en commun le cytoplasme,
le matériel génétique (se retrouvant dans un
nucléoïde chez les procaryotes et dans
da un noyau
chez les eucaryotes), et la membrane plasmique,
plasmique très
comparable.
Les différences résident dans la présence d’une paroi
chez les bactéries dont la taille est comprise entre
0,5 à 1µm avec des extrêmes à 50µm, et dans la
taille : une
ne cellule eucaryote, une levure par
exemple, est 10 fois
ois plus grosse qu’une bactérie, et
mesure donc entre 5 et 20 µm, avec des extrêmes
e
de
l’ordre du mètre concernant des cellules neuronales.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie
Microbiol
générale - 4
Pour une absorption identique, dans une grosse cellule, la concentration de nutriments sera plus faible que
dans une petite cellule, expliquant pourquoi les microorganismes de petite taille ont une croissance très rapide
(pour certain d’entre eux, un cycle complet de division peut être réalisé en dix minutes) et répondent très
rapidement à des stimuli extérieurs.
Vis-à-vis du matériel génétique, les cellules procaryotes
possèdent un unique chromosome circulaire ainsi que, parfois,
des plasmides. Les eucaryotes possèdent quant à eux un
matériel présent en un ou deux voire quatre exemplaires.
Les procaryotes se reproduisent de manière asexuée par
scissiparité ou division binaire : l’unique molécule d’ADN se
réplique, et les chromosomes formés, arrimés à la membrane,
sont séparés lors de ma mitose au cours de laquelle se créé un
septum. Chez les bactéries, la reproduction sexuée n’existe donc
pas, mais on peut parler de parasexualité.
LA MICROBIOLOGIE D’HIER ET D’AUJOURD’HUI
LES « PERIODES SOMBRES »
Depuis bien longtemps et sans le savoir, nous nous intéressons aux microorganismes. Ce sont en effet ces
derniers qui, avant de participer à l’affinage de nos fromages, annihilaient nombre de vies humaines :
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En 565, les premières grandes épidémies de peste bubonique et de variole provoquent le déclin de
Rome
Au Moyen-âge, des épidémies de typhus, peste, variole, syphilis et choléra provoquant de lourdes
pertes humaines
En 1346, une épidémie de peste bubonique en provenance de la Chine et de la Route de la Soie
décime 25 millions de personnes en Europe.
Entre 1720 et 1722, une épidémie de peste décime la moitié de la population de villes du Sud de la
France (Toulon, Marseille, etc.) ainsi qu’un tiers de la population de villes plus septentrionales.
En 1815, le typhus, la pneumonie et la dysenterie affaiblissent les troupes napoléoniennes, étant
responsables en partie de la conclusion de la bataille de Waterloo, mais aussi de Moscou en 1812 et
Leipzig en 1813
VENUE DE LA SCIENCE SUR LE DEVANT DE LA SCENE
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Avant 1650, ce sont les « périodes sombres », où l’on traitait de miasmes, d’Être suprême, de magie,
de génération spontanée, etc. Aristote avait alors prouvé que l’on pouvait générer des grenouilles à
partir d’eau croupie, et des souris avec l’aide de graines en décomposition.
De 1650 à 1850, la Période des Lumières autorise la remise en question des doctrines traditionnelles.
Le premier microscope optique est mis au point par A. Van Leeuwenhoek, et sa résolution de 300x est
suffisante pour permettre à Robert Hooke de définir la notion de cellule individuelle. La doctrine de la
génération spontanée est contestée.
Après 1850, c’est la période moderne. Louis Pasteur, chimiste français, enterre pour toujours la
théorie de la génération spontanée et fixe les grands concepts de la microbiologie : stérilisation,
immunologie, explication des phénomènes de fermentation, guérison de maladies infectieuses. Entre
1843 et 1910, l’école de Koch est responsable de la découverte d’un grand nombre de germes, définit
les notions de colonies et de cultures pures, met au point des outils microbiologiques de référence
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 5
(boîte de Pietri, gels d’agarose), isole des microorganismes pathogènes responsables de maladies
comme les bacilles de l’anthrax… C’est également dans cette période que Beijerinck et Winogradsky
mettent en évidence le rôle des microorganismes dans les cycles de la matière.
POURQUOI FAIRE DE LA MICROBIOLOGIE ?
RECHERCHE FONDAMENTALE
Dun point de vue fondamental, les microorganismes sont des systèmes modèles utilisés en recherche pour
l’étude de phénomènes comme la nutrition, le métabolisme, la biochimie et la génétique. C’est grâce à eux que
les grands concepts des sciences du vivant ont été mis en évidence. A l’heure actuelle, les scientifiques ont à
leur disposition le génome séquencé d’une centaine de microorganismes.
BIOTECHNOLOGIES
Dans quels secteurs la biotechnologie microbienne est-elle utilisée ?
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Au sein de l’industrie agroalimentaire, dans la production « brute » d’aliments et boissons comme la
bière, le vin, le pain et les produits laitiers, et la production d’additifs alimentaires comme les alcools,
les acides aminés, les acides, les polysaccharides, ou les vitamines.
Dans l’agriculture, à des fins de production de plants transgéniques.
Dans le domaine médical pour la production d’antibiotiques, stéroïdes, vaccins, peptides, hormones…
Dans les domaines concernant l’environnement, pour le traitement de l’eau, de l’air et des sols pollués
dans le cas de bioremédiation notamment, la bioextraction de minerais, et en tant que biocapteurs.
Dans divers domaines de l’industrie, pour la production de papier (via la dégradation de la cellulose),
de biotensioactifs, biocosmétiques, biomatériaux, biocapteurs.
AUTRES INTERETS
Les microorganismes sont bénéfiques pour la santé : dans le corps humain, on en trouve autant voire plus que
de cellules eucaryotes. Ils peuvent également contribuer à des phénomènes de biodéterioration, comme c’est
le cas pour les grottes de Lascaux dont les peintures rupestres sont attaquées, ou pour les ostréiculteurs
français dont les parcs à huitres subissent des contaminations par des bactéries pathogènes.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 6
CHAPITRE II - NUTRITION ET CROISSANCE DES MICROORGANISMES
Dans ce chapitre, nous nous baserons sur l’étude des mycètes et des bactéries, les caractéristiques des deux
groupes étant équivalentes.
Les microorganismes ont la particularité d’une grande diversité métabolique, à l’opposé des plantes et
animaux, qui eux ont une grande diversité physiologique. En effet, les procaryotes étant assez proches
évolutivement les uns des autres, leur physiologie est assez semblable, mais pas leur métabolisme, en rapport
avec la colonisation de niches écologiques très différentes. Un procaryote peut se nourrir de sucres simples ou
complexes à partir d’un nombre de sources de carbone dépendant de la souche ou de l’espèce. Ce nombre
peut varier entre 1 et 100, définissant le caractère exigeant, ou non, d’une bactérie.
DIFFERENTS TYPES DE METABOLISME
On distingue différents types de métabolismes en fonction de différents paramètres, à savoir la source
d’énergie, et la source de carbone. La source d’énergie peut être la lumière, on parle de phototrophie, ou bien
un composé chimique, on parle de chimiotrophie. La source de carbone, quant à elle, peut être le dioxyde de
carbone atmosphérique, on parle d’autotrophie, ou bien un composé organique, c’est l’hétérotrophie. On peut
ainsi distinguer 4 grands groupes de métabolismes :
•
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•
Photoautotrophes
Photohétérotrophes
Chimioautotrophes
Chimiohétérotrophes
Les plantes sont photoautotrophes, et la plupart des animaux utilisent le métabolisme chimiohétérotrophe,
majoritaire sur Terre. Ces quatre groupes de métabolismes se retrouvent chez les bactéries, cette diversité
étant l’une de leur particularités.
CULTURE DES MICROORGANISMES AU LABORATOIRE
Chez un microorganisme, la nutrition est le processus par lequel celui-ci puise et utilise les nutriments pour
produire de l’énergie et des matériaux de structure. Nous considérerons dans ce paragraphe des cultures en
laboratoire afin de différencier nos études de celle menées en écologie microbienne, discipline à part entière
pratiquant l’étude du microorganisme dans son milieu naturel. Ces cultures de laboratoire consistent en un
état assez artéfactuel qu’est l’environnement artificiel du milieu de culture, qui sera très différent du milieu
naturel. Lorsque nous chercherons à cultiver un microorganisme d’intérêt, nous ferons donc en sorte de mimer
son milieu naturel, en reconstituant ses paramètres nutritifs et physiques.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 7
COMMENT CONÇOIT-ON UN MILIEU DE CULTURE ?
Dans le cas où nous voudrions isoler un nouveau
microorganisme, nous devrions nous interroger pour mettre au
point un nouveau milieu. La cellule bactérienne est constituée
de 80 à 90% d’eau, et l’on retrouve en pourcentage de poids
sec les espèces chimiques suivantes :
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•
Majoritairement, du carbone, qui va permettre la
synthèse de molécules d’intérêt
De l’oxygène sous différentes formes, que l’on
retrouve notamment dans les acides aminés
De l’azote, également au sein des acides aminés, mais
aussi
des
nucléotides,
des
phospholipides
membranaires et de la paroi cellulaire
De l’hydrogène, qui, en plus d’entrer dans la
constitution de molécules organiques, participe au
métabolisme énergétique en jouant un rôle important dans la production d’énergie au niveau du
transfert d’électrons de la chaîne respiratoire
Du phosphore, qui est un constituant des phospholipides, acides nucléiques et ATP
Du soufre, qui entre dans la composition des acides aminés Cis et Met, et de certaines vitamines,
notamment la biotine et thiamine
A plus faibles quantités, des cations qui jouent des rôles dans l’activité enzymatique (cofacteurs de
voie) et la stabilité cellulaire
D’autres éléments qui ne sont présents qu’à l’état de traces
A partir de ces données, nous allons pouvoir constituer un milieu à partir de trois groupes d’éléments dans des
concentrations mimant les concentrations relatives de ces molécules.
LES BESOINS NUTRITIFS COURANTS
LES MACROELEMENTS
Ils représentent 95% du poids sec de la cellule, on y trouve les espèces atomiques C, O, H, N, S, P dans des
+
2+
2+
2+
concentrations de l’ordre du g/L, et des cations K Ca , Mg , Fe dans des concentrations de l’ordre du mg/L.
Sources de carbone :
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•
•
•
•
•
si la bactérie est autotrophe, CO2,
sucre simple (glucose),
sucre complexe (cellulose) pour une bactérie possédant des enzymes appropriées (cellulase),
acides aminés, protéines pour une bactérie à protéases en milieu extracellulaire,
acides gras,
lipides pour une bactérie à lipases.
Sources d’azote:
•
•
Azote moléculaire N2 pour les bactéries du sol fixatrices d’azote,
+
Sulfate d’ammonium (NH4 )2SO4 qui amène également le soufre, pour une bactérie non fixatrice.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 8
2-
Source de phosphore : ions phosphate PO4 qui permettent également de tamponner le milieu (K2HPO4).
Source de cations : ils sont amenés dans le milieu sous forme de sels NaCl, KCl et MgCl2.
LES MICROELEMENTS (OU OLIGOELEMENTS)
Ils sont représentés par les espèces Mn, Zn, Co, Cu, Ni, Mo, à des concentrations de l’ordre du µg/L. Essentiels à
la croissance, ils sont souvent des contaminants naturels des sels rajoutés dans le milieu, ou de la verrerie. On
peut les rajouter, si besoin est, sous forme de sels.
•
•
Si un milieu de croissance contenant des macros et microéléments permet la croissance d’un
microorganisme, alors ce microorganisme isolé est prototrophe, c'est-à-dire qu’il n’a pas d’exigence
nutritionnelle particulière. En général, ces organismes sont relativement sauvages.
S’il n’y a pas de croissance, il faut alors ajouter d’autres composants dans le milieu, qui constituent des
facteurs de croissance. On isole ainsi des bactéries plus exigeantes, dites auxotrophes.
LES FACTEURS DE CROISSANCE
Les facteurs de croissance sont toujours des composés organiques de faible poids moléculaire devant être
présents dans le milieu de culture, le microorganisme n’étant pas en mesure de les synthétiser à cause d’un
défaut dans ses voies de biosynthèse. Il en existe trois catégories :
•
•
•
Les vitamines, constituant la partie catalytique d’enzymes, et étant le plus souvent du groupe B
comme la biotine, la thiamine et l’acide nicotinique.
Les bases puriques et pyrimidiques, dont l’absence de synthèse par le microorganisme est très rare
Les acides aminés, qui ne doivent être rajoutés dans le milieu que plus rarement
Dans le cadre de la description de son phénotype, une bactérie dite « leucine+ » sera capable de synthétiser la
leucine, elle possèdera donc une voie de biosynthèse fonctionnelle. Inversement, une bactérie dite « leucine» sera auxotrophe vis-à-vis de la leucine, elle ne possèdera pas de voie fonctionnelle de synthèse du composé
à cause, par exemple, de mutations du gène codant pour une enzyme de cette voie. Nous devrons dans ce cas
là rajouter le composé concerné dans le milieu de culture afin de permettre le développement du
microorganisme.
On note que certaines bactéries, comme les bacilles lactiques, sont dites multiauxotrophes. C’est au cours de
l’évolution, et relativement à leur milieu de vie que ces dernières ont perdu un grand nombre de voies de
biosynthèse.
LES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE
MILIEU MINIMUM
Le milieu que l’on vient plus ou moins de décrire est un milieu
minimum, on le dit également synthétique, ou défini, car on en
connaît la composition exacte. Il manque néanmoins une source de
carbone. Ainsi, en fonction du type métabolique de l’organisme,
nous rajouterons, ou non, des éléments carbonés.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 9
MILIEU RICHE OU COMPLEXE
En opposition aux milieux définis, les milieux riches ou complexes sont utilisés pour des bactéries
multiauxotrophes, comme par exemple les bactéries lactiques précitées. Dans ces milieux, on ne connaît ni la
nature, ni la concentration des nutriments, mais ce « bouillon » comportera néanmoins différentes sources de
carbone, d’azote, ainsi que des vitamines, des nucléotides prêts à l’emploi, des acides aminés voire des
peptides, des sels, etc., permettant ainsi de mettre toutes les chances de notre côté pour que notre bactérie
multiauxotrophe d’intérêt puisse se développer.
En pratique, on ajoute à ces milieux des peptones ou des tryptones, qui sont respectivement des hydrolysats
protéolytiques ou trypsiques de protéines de viande, de caséine, ou de soja. Généralement, cela ne suffit pas à
la croissance des microorganismes, c’est pourquoi l’on peut rajouter de l’extrait de bœuf contenant des acides
aminés, nucléotides, acides organiques, vitamines et minéraux, ou de l’extrait de levure de bière, amenant une
source de carbone, d’azote et de vitamines. Pour certains microorganismes le nécessitant, il est enfin possible
préparer une gélose au sang ou au sérum.
PREPARATION DU MILIEU
Après préparation et ajustement du pH, on obtient un milieu en phase liquide au sein duquel il est nécessaire
de rajouter de l’agar à une concentration de 15g/L afin de le gélifier. La température de fonte de l’agar est de
80°C. Après préparation, il convient de stériliser le milieu, le labo étant un milieu ouvert où l’on travaille à partir
de préparations non stériles. On utilise pour cela un autoclave fournissant une chaleur humide de 120°C durant
15 minutes. Dans le cas où se trouveraient au sein des milieux des substances thermolabiles, il faudra procéder
à une stérilisation par une méthode douce, qui consiste en une filtration à 0,45µm, les plus petites bactéries
ayant un diamètre de 1µm.
LES TYPES DE MILIEUX
On distingue différents types de milieux : sélectifs, différentiels, de conservation, et industriels. Les milieux
sélectifs, ou milieux d’enrichissement, ont pour but de favoriser la croissance de microorganismes particuliers:
•
•
•
Le milieu « McConkey » contient du Cristal Violet, et des sels biliaires, permettant la sélection de
microorganismes Gram- résistants à de faibles pH. Il permet donc la sélection de bactéries d’intérêt du
milieu intestinal.
Un milieu minimum dont la cellulose est l’unique source de carbone permettra l’isolement de
bactéries capables de son hydrolyse, donc de phénotype de catabolisme « cellulose + ».
Un milieu contenant un antibiotique, par exemple un antifongique, un anti-Gram+ ou Grampermettra également la sélection des bactéries résistantes.
Tableau d’enrichissement pour les organismes chimiohétérotrophes aérobies ou aérobies facultatifs. Un sol
pasteurisé éliminera la plupart des microorganismes, saufs les microorganismes à spores.
Les milieux différentiels permettent de repérer visuellement deux souches aux propriétés différentes, sans
pour autant tuer les germes. Par exemple, la préparation d’une gélose au sang permet de repérer des bactéries
hémolytiques, celles-ci libérant une enzyme hémolytique qui diffusera et fera éclater les globules rouges
présents dans le milieu. On peut ainsi effectuer une distinction visuelle entre une bactérie hémolytique, et une
autre qui ne l’est pas.
Un milieu de conservation est différant du milieu de croissance : dans le cas où un germe possède une durée de
vie limitée, le milieu de conservation nous permet un maintien à -80°C de la bactérie d’intérêt grâce au
glycérol, jouant un rôle cryoprotecteur.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 10
Les milieux industriels sont utilisés lors de biosynthèses contrôlées en fermenteurs, où l’on retrouve des
produits de dégradation et des résidus industriels comme la mélasse, dans le but de faire baisser au maximum
les coûts de revien, et ainsi créer un milieu de croissance « low-cost ».
ISOLEMENT D’UNE CULTURE PURE A PARTIR D’UNE POPULATION MIXTE : METHODE DES
STRIES
A titre d’exemples, au sein d’un gramme de prélèvement d’un milieu naturel et sans compter les champignons,
7
9
on trouve de 10 à 10 espèces bactériennes différentes dans le sol, et une centaine dans le tractus digestif des
animaux. Lorsque l’on travaille, l’important étant d’éviter les contaminations, il faudra donc séparer les
espèces. On utilise pour cela une méthode simple et efficace, dite des stries.
Partant d’un échantillon constituant une population mixte, on veut arriver à une souche pure. On travaille dans
des conditions d’asepsie, donc près d’une source de chaleur et à l’aide de matériel stérile, ici une anse de
platine. Avec celle-ci, on effectue des prélèvements par la méthode des cadrans : on prélève avec l’anse une
faible quantité d’un échantillon, l’inoculum, puis, on strie la boîte, on stérilise l’anse sur une flamme, et l’on
répète l’opération d’étalement et de stérilisation deux fois de suite. A chaque passage, l’inoculum, initialement
très chargé en microorganismes, s’épuise. De moins en moins de germes sont donc étalés. S’en suit une
période d’incubation pouvant durer de 24h à trois semaines. Dans le cas de bactéries anaérobies, les cultures
peuvent être effectuées dans des cuves à vide.
Après incubation, on observe les résultats des travaux. Lors de l’incubation, une bactérie déposée en surface de
la gélose se sera divisée pour former une colonie ou UFC (« unité formatrice de colonies »). Sur les premières
stries, on observe donc un mélange de ces colonies, et sur les dernières stries, on obtient des colonies isolées.
A l’aide de l’aspect sur boîte, la
morphologie de la colonie, les
microbiologistes
peuvent
réussir à reconnaître les
espèces en présence. Cet
aspect peut être décrit selon
plusieurs critères, à savoir leur
forme (par exemple, circulaire
pour E. coli), leur élévation, et
l’aspect de leurs bords. Ces
morphologies
sont
très
variables en fonction de l’espèce.
En particulier, les moisissures et levures forment un mycélium élevé, et l’aspect duveteux des champignons est
dû à leur fructifications ; cependant, ce dernier aspect n’est pas forcément significatif de ce groupe, car on peut
le retrouver chez les actinomycètes, qui sont un groupe de procaryotes intéressants car grands producteurs
d’antibiotiques.
Pour enfin obtenir une culture pure, nous prélèverons une colonie isolée et pratiquerons une nouvelle strie.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 11
ENTREE DES NUTRIMENTS DANS LA CELLULE BACTERIENNE
INTRODUCTION
Pour commencer, nous noterons que les procaryotes ne pratiquent pas de mécanisme d’endocytose. D’une
manière générale, les membranes plasmiques, hautement sélectives, ne laissent pas passer la plus grande
partie des nutriments à travers la bicouche phospholipidique. Seules l’eau et quelques petites molécules
comme certains alcools et acides gras diffusent librement. Ainsi, il faut alors faire appel à des systèmes de
transport afin de permettre l’entrée des sources de carbone et d’azote.
Les transports passifs se font selon le gradient de concentration, et ne nécessitent donc pas d’énergie
cellulaire, au contraire des transports actifs, qui utilisent de l’énergie en provenance de la cellule pour effectuer
un transport contre un gradient de concentration. Les entrées de nutriments sont importantes, on note qu’il
est nécessaire de concentrer de 100 à 1000 fois les composants du milieu extracellulaire extérieur pour
permettre la vie du microorganisme. L’énergie peut alors être fournie par l’hydrolyse d’ATP dans le cas de
systèmes de transport ABC « ATP Binding Cassette », ou par la force proton-motrice dans le cas d’organites
spécialisés. D’autres systèmes de transport existent, comme la translocation de groupe dans le cas du système
PTS « phosphotransférase », ou le transport du fer via des sidérophores.
TRANSPORT PASSIF
La diffusion est un principe permettant le passage de molécules entre deux systèmes jusqu’à l’atteinte d’un
état d’équilibre. Cette diffusion peut par exemple avoir lieu à travers la membrane dans le cas de petites
molécules liposolubles comme le glycérol. On en distingue cependant deux types: la diffusion passive, où aucun
complexe enzymatique membranaire n’est impliqué, et la diffusion facilitée, qui fait donc appel à une
perméase membranaire ne nécessitant néanmoins pas d’énergie.
En observant les vitesses de transport d’un nutriment à travers la bicouche lipidique en fonction de sa
concentration dans le milieu extérieur, on note que la cinétique du système de diffusion facilitée mène à un
plateau correspondant à la saturation de l’enzyme perméase, permettant de définir pour celle-ci un Km,
incidemment un Vmax. Certains acides aminés peuvent être transportés par un système de diffusion facilitée.
TRANSPORT ACTIF
Les transporteurs actifs sont les systèmes les plus fréquemment rencontrés, les nutriments à l’état de trace
dans le milieu extérieur devant être concentrés. Ils sont mis en évidence à l’aide d’inhibiteurs de la synthèse
d’énergie cellulaire. Incidemment, lors de l’étude du transport d’un nutriment donné, si, en présence
d’inhibiteurs celui-ci est nul, on en déduit que celui-ci est de nature active. Inversement, s’il est non nul, le
transport est passif.
ENERGIE PROVENANT DE L’ATP
Le système ABC utilise l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP. Celui-ci est partagé avec les eucaryotes, chez
lesquels il sera notamment plus complexe. Chez les bactéries, ce système possède trois composants
protéiques : une protéine affine pour le substrat (se trouvant libre dans le périplasme pour une bactérie Gram
+
et ancrée à la membrane plasmique pour une Gram ) dont la liaison au substrat dépendra du Km, une protéine
hydrophobe dans la bicouche phospholipidique membranaire, la perméase, et une protéine transductrice
d’énergie cytoplasmique en association avec la perméase, l’ATPase. Il existe des sites de reconnaissance entre
protéine affine et perméase, permettant au complexe substrat-protéine se présentant à la perméase d’être
transporté sous réserve d’apport d’énergie à l’ATPase.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 12
ENERGIE PROVENANT DE LA FORCE PROTON-MOTRICE
+
+
La force proton-motrice peut permettre un transport direct dans le cas d’un antiport H /Na ou symport
+
+
H /sucre ou acide aminé, ou indirect via le gradient électrochimique de H ou la génération de gradients
d’autres composés via les antiports et symports.
FORCE PROTOMOTRICE DIRECTE
Cette force est due à la présence d’un gradient de protons entre le milieu extérieur et le cytoplasme, qui est la
résultante du transport des électrons au sein des chaînes respiratoires bactériennes : celles-ci ne possédant pas
de mitochondrie, c’est la membrane plasmique elle-même qui assure l’hébergement de chaîne respiratoire.
Des protons en sont donc expulsés lors de la respiration des microorganismes, induisant un déséquilibre de
charges de part et d’autre de la membrane plasmique : le milieu extracellulaire est chargé positivement, et
l’intérieur négativement, d’où le gradient électrochimique.
Un premier type de système de transport concerne l’entrée de cations à l’intérieur de la cellule. Nous avons
pour cela affaire à un système uniport, un seul composé traversant la membrane cytoplasmique via une
perméase. Dans le cas du potassium par exemple, cette perméase est énergisée par le gradient
électrochimique : la charge positive étant plus importante à l’extérieur, les cations entrent spontanément afin
de l’équilibrer. C’est néanmoins un transport actif nécessitant de l’énergie sous forme électrochimique.
D’autres systèmes de transport de type symport vont quant à eux utiliser les protons de manière directe, ces
derniers étant en large excès dans le milieu extérieur. Nous sommes dont en présence d’un cotransport, où par
+
exemple deux molécules comme H et sucre entrent simultanément dans la cellule. La force protomotrice est
utilisée de manière directe : en effet, c’est le proton qui s’associera à la perméase membranaire afin de
modifier sa conformation et ainsi permettre l’entrée du sucre. Ce système est rencontré chez les
microorganismes afin de faire entrer sucres, acides aminés ou anions. On rencontre par exemple chez E. coli un
système symport proton/lactose.
FORCE PROTOMOTRICE INDIRECTE
On retrouve dans toutes les cellules microbiennes un système antiport
sodium/proton, lequel sera spontanément traversé par les protons et
permettra la sortie d’un ion sodium de manière très localisée. De cette
manière, l’excès de sodium extracellulaire induit servira de cofacteur au
sein d’un un antiport tel sodium/sucre, ou d’un quelconque symport
sodium/soluté, ces deux faisant également appel à des perméases : c’est la
fixation de l’ion sodium qui permettra un changement de conformation de
la perméase, et la fixation d’un soluté.
Un soluté unique peut avoir de 1 à 5 systèmes de transport différents, qui
sont spécifiques de l’espèce ou de la souche. Ils n’ont néanmoins pas tous
les mêmes systèmes d’induction, et peuvent ne pas avoir les mêmes Km
(affinité du transporteur pour le substrat).
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 13
SYSTEME DE TRANSLOCATION PTS (PHOSPHOTRANSFERASE)
Ce système n’ayant pas d’équivalent chez les eucaryotes n’est utilisé que pour le transport des sucres (glucose,
fructose, α-glucosides). Une autre façon d’énergiser un système de transport est d’utiliser des molécules
possédant des liaisons riches en énergie, ici le phosphoénol pyruvate (PEP). Nous le séparerons des autres
systèmes de transport car dans ce cas, sa particularité réside dans le fait que le soluté à transporter subira une
modification selon la réaction bilan suivante :
PEP+sucre extérieur pyruvate+sucre-P intérieur
Ce système fait intervenir quatre protéines.
L’entrée du substrat dans le cytoplasme va se
faire par une cascade de phosphorylations de
proche en proche : le PEP va transférer son
groupement phosphate sur E1, qui va transiter
ensuite sur HPr (Heat Protein). Ces protéines
sont toutes deux solubles dans le cytoplasme. Ce
groupement passera ensuite sur E3, protéine
membranaire périphérique associée à la membrane cytoplasmique, puis sur la perméase E2, protéine
hydrophobe du système membranaire. Une fois énergisée, la perméase peut alors faire entrer le sucre sous la
forme sucre-P, après transfert du groupement.
TRANSPORT DU FER VIA DES SIDEROPHORES
Le fer est un constituant essentiel de la bactérie et plus généralement de toute
cellule, car il entre dans la composition des cytochromes, coenzymes
intermédiaires de la chaîne respiratoire et constituant des protéines fersouffre. Nous verrons plus tard que les systèmes de transport du fer sont des
facteurs de virulence. Dans le milieu extérieur, le fer est présent sous sa forme
3+
ferrique Fe qui est insoluble, donc intransportable. Afin de lui permettre la
traversée de la membrane phospholipidique, les bactéries libéreront dans ce
milieu des agents chélateurs, dont la synthèse est activée en cas de baisse de
la concentration de cet ion. Pour les agents chélateurs du fer, on parle de
sidérophores. Ceux-ci vont permettre la solubilisation de l’ion ainsi que son passage, via un système
membranaire permettant le passage du complexe sidérophore-fer, dans le cytoplasme. Les sidérophores sont
spécifiques aux espèces bactériennes, par exemple E. coli produisant l’entérobactine, un cathécolate.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 14
LA CROISSANCE DES MICRO-ORGANISMES
INTRODUCTION
Comment peut-on, de manière concrète, décrire la croissance d’un microorganisme ? Il faut d’abord distinguer
deux principaux modèles de croissance : la culture en batch, et le système ouvert.
La culture en batch, ou discontinue, correspond à un milieu en système fermé où il n’y a pas d’apport de milieu
frais et où la quantité de nutriments est fixée en début de culture. Le système ouvert, ou culture continue,
permet l’apport continu d’un milieu frais et des nutriments incidents. Dans ces conditions, la physiologie de la
croissance est connue et peut être décrite mathématiquement. En TD et TP, nous nous intéresserons surtout à
la culture en batch.
MESURE DE LA CROISSANCE D’UN MICROORGANISME
Il existe différentes méthodes permettant de mesurer la croissance d’un microorganisme. La première consiste
en la mesure de la concentration en cellules au sein du milieu de culture, on parle de titre de la culture.
DENOMBREMENT SUR BOITE
Cette méthode a l’avantage de permettre le comptage exclusif des germes totaux vivants. Afin de réaliser ce
dénombrement, on prélève un volume connu d’une culture de départ que l’on dilue de façon sérielle, en
-7
général jusqu’à 10 fois. 100µl des dernières dilutions sont étalées sur des milieux gélosés qui sont ensuite
laissés à incuber dans les conditions optimales de croissance du germe. Ceci explique l’intérêt des dilutions
sérielles, qui permettent de ne pas étaler un nombre trop important de microorganismes induisant la
formation d’un tapis bactérien complètement inutilisable. A la suite de l’incubation, on effectue le comptage
du nombre de colonies, entre 25 et 250 sur boîte est l’idéal. On remonte enfin par le calcul au titre initial de la
colonie. Afin de pratiquer leurs tests, l’on note que tous les laboratoires d’analyse jouent sur les paramètres
des milieux.
COMPTAGE DIRECT
Cette autre méthode est utilisée pour les levures, qui sont plus grosses que les bactéries. Pour cela, on dispose
de chambres microscopiques dites de « Petrof-Hauser » incluant des grilles dont on connait le volume.
Néanmoins, on compte de cette façon les microorganismes vivants comme morts.
COMPTAGE AUTOMATIQUE
Pour d’autres microorganismes comme les globules rouges, on peut utiliser des compteurs électroniques dits
de « Coulter » au sein desquels les cellules eucaryotes de grande taille passent et sont dénombrées par un
faisceau généralement laser. Ce système est néanmoins rarement utilisé pour les bactéries.
DENSITE ET MASSE MICROBIENNES
Cette méthode peut être appliquée aux bactéries, mais elle se pratique surtout pour les mycètes, et plus
particulièrement pour les champignons filamenteux, pluricellulaires. Elle revient à calculer le poids frais ou sec
de la culture. On doit néanmoins la pratiquer avec de grandes quantités de culture, vis-à-vis de la masse des
microorganismes : elle est donc très utilisée dans le cas de biofermenteurs. On prélève par exemple 100mL
d’une culture que l’on met à centrifuger une vitesse de 8000rpm et dont on prélève le culot microbien. Grace à
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 15
la différence de volume ou de masse, on en déduit le poids frais. Pour le poids sec, il suffit de sécher le microbe
à 50°C, par exemple dans une étuve.
Nous pouvons également pratiquer, puisqu’il existe une relation entre masse, concentration, et densité
optique, pratiquer des mesures spectrophotométriques. Méthode la plus utilisée, elle est également la plus
rapide et pratique, nous l’utiliserons en TP. Nous effectuerons nos mesures à des longueurs d’onde comprises
entre 420 et 600nm à calibrer en fonction de l’espèce. Selon la loi de Beer-Lambert, les mesures effectuées
9
seront valables pour des concentrations maximales de 10 cellules par millilitre.
AUTRES METHODES
Il existe d’autres méthodes de dénombrement adaptées aux spécificités des microorganismes. Pour des
champignons ou bactéries filamenteuses par exemple, il est possible de mesurer l’allongement du mycélium au
microscope ; pour d’autres microorganismes, des mesures indirectes de la croissance via suivi d’une activité
microbienne représentative de la physiologie du microorganisme sont possibles, à travers, par exemple, le
dosage d’une enzyme, la production d’ATP, etc.
LA CROISSANCE EN CULTURE DISCONTINUE/ CULTURE EN BATCH
PARAMETRES CINETIQUES DE LA CROISSANCE
La cinétique de croissance est relative au suivi de la croissance en fonction du temps. Les paramètres consistent
en le temps de génération « g », le taux de croissance « µ », le nombre de générations « n », et la biomasse
« M ». Ces paramètres sont fonction de divers paramètres : espèce ou souche du microorganisme, type du
milieu de croissance (riche ou minimum), conditions physicochimiques (température, pH, etc.).
n
Les bactéries pratiquent une division binaire. Leur nombre, au bout de n générations, sera donc égal à 2 . Le
nombre de bactéries déposées sur le milieu de culture à t=0 étant différents de 1, nous définirons X0 comme
n
étant le nombre de bactéries initial. Après n générations, le nombre de bactéries sera donc de X0.2 . Le temps
de génération correspond à la vitesse de division cellulaire, et le taux de croissance au nombre de générations
-1
écoulées par unité de temps. µ=n/t(h), µ est donc en h . On en déduit n=µ*t. A n’importe quel moment, le
nombre de bactéries dans une culture varie selon :
0 2
Nous pouvons passer cette formule au logarithme et effectuer notre tracé sur papier semi-log, ramenant notre
formule à 0 2 μ, qui est l’équation d’une fonction affine de pente log 2*µ. Après cette
linéarisation, nous pouvons avoir un accès graphique au taux de croissance des microorganismes par simple
calcul de la pente. Le temps de génération g correspond au temps de division binaire, et est donc égal à
t(h)/n=1/µ.
Citons quelques ordres de grandeur de temps de génération « g » en fonction des espèces :
•
•
•
Bactéries : leur temps de génération est globalement très rapide, avec certaines espèces un peu plus
lentes, g est donc variable mais est de moins d’1h
Algues et protozoaires : assez long, entre 1 et 10h
Mycètes : entre 1 et 10h
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 16
DIFFERENTES PHASES DE CROISSANCE EN MILIEU NON RENOUVELE
A partir d’un milieu stérile et un inoculum, on ensemence le
milieu, et l’on suit le nombre de bactéries en fonction du
temps. La courbe obtenue (a) n’est pas exploitable, la phase
d’intérêt étant la phase C. Afin d’obtenir le temps de
génération, on passe en représentation log (b), sur laquelle
nous travaillerons par la suite. On observe 6 phases
différentes :
• A : phase de latence, la croissance y est nulle. µ est
donc nul, les bactéries ne se divisent pas.
• B : phase d’accélération, les bactéries commencent
à utiliser le milieu de croissance, puis entament leurs
divisions jusqu’à une vitesse de croissance maximale.
Les phases A et B sont donc des phases d’adaptation au
milieu : la cinétique observée peut être due à des cellules
âgées en attente de retour d’un métabolisme optimal, ou
bien à des cellules provenant d’un milieu différent nécessitant un temps d’adaptation au milieu de
croissance.
•
•
•
•
C : phase exponentielle de croissance, où toutes les réactions métaboliques sont à l’équilibre. µ=µmax.
D : phase de ralentissement, ou décélération, durant laquelle µ diminue. Des éléments commencent à
manquer aux germes.
E : phase stationnaire. La croissance atteint un plateau, µ devient nul. Les microorganismes passent
dans un état de dormance où ils ne se divisent plus. Le métabolisme devient inactif, les mécanismes
de survie se mettent en marche.
F : dans de rares cas, on observe une phase de déclin ou phase de lyse. µ devient inférieur à 0, les
bactéries meurent en libérant dans le milieu extérieur leur contenu cellulaire. Cela peut consister en
une stratégie de survie à l’échelle communautaire : les éléments relargués par la lyse de cellules
permet un certain apport de nutriments, réutilisés de manière saprophytique.
Les phases D et E peuvent être dues à plusieurs facteurs, en premier lieu les nutriments : leur quantité ayant
été fixée, il en manque alors un ou plusieurs au cours du développement. En général, c’est la source de carbone
et d’énergie qui devient rapidement limitante. Des déchets toxiques métaboliques peuvent également
s’accumuler dans le milieu, inhibant la croissance. Des déséquilibres ioniques peuvent également survenir,
comme par exemple auprès de bactéries lactiques pratiquant la fermentation du lactose en acide lactique,
acidifiant leur milieu et inhibant leur propre croissance.
NOTION DE BIOMASSE
La biomasse correspond à la croissance totale des microorganismes, égale à la différence entre la masse de
microorganismes en phase stationnaire et la masse de microorganismes initiale. Cette notion a un intérêt
industriel, dans la mesure où elle permet de rendre compte de la production d’un milieu. Cette biomasse sera
fonction d’un élément limitant dans le milieu, qui est généralement la source de carbone et d’énergie. En
mettant en excès tous les éléments du milieu sauf le substrat à tester, nous pourrons à l’aide de la mesure de la
biomasse comparer l’effet de ce substrat sur la croissance avec d’autres substrats afin de permettre une
production maximale de biomasse.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 17
Dans l’expérience ci-contre, on représente la
biomasse atteinte en fonction du temps et pour
différentes concentrations en glucose. On voit que
plus la concentration en glucose est élevée, plus la
biomasse produite est importante, et ce selon une
relation de type linéaire.
Il existe donc une relation directe entre la quantité
de substrat et la biomasse. On tire de cette courbe
le paramètre Y, rendement de croissance en mg/g,
qui est égal au rapport de la biomasse produite
(mg/L) sur la concentration en substrat limitant (g/L). Ce paramètre ne peut se calculer que lorsque les autres
conditions ne font pas défaut dans le milieu, c'est-à-dire avec un pH et un équilibre ionique non perturbé, et les
autres substrats en excès.
Par exemple, dans un milieu minimum de culture pour
E. coli, on déterminera que 0,4mg de matière
bactérienne sont synthétisés à partir d’1g de glucose, et
0,2mg à partir d’1g de succinate. Il est donc intéressant
de rechercher ainsi les substrats pour lesquels la
synthèse d’ATP est la plus favorisée. Il existe un cas
particulier de croissance lors de la présence de deux
sucres, c’est le phénomène de dauxie : la source de
carbone est double, mais la bactérie métabolise
préférentiellement le fructose, s’adapte, et métabolise
enfin l‘arabinose.
LA CROISSANCE EN CULTURE CONTINUE DES MICROORGANISMES
A l’inverse du système décrit, la culture continue consiste en un renouvellement permanent du milieu frais, et
l’élimination des déchets. Le but est de contrôler tous les paramètres de la croissance, et de se placer ainsi et
maintenir des conditions physiologiques particulières, à savoir la phase exponentielle, pendant lesquelles les
microorganismes synthétisent leurs produits. A ces fins, on distingue deux types de montages :
CHEMOSTAT
C’est un système ouvert comprenant tous les nutriments sauf un, qui sera limitant. Naturellement, certains
éléments synthétisés subissent des répressions, comme par exemple la synthèse d’un sucre qui sera soumise à
une répression catabolique, signifiant que le produit formé inhibera sa propre néosynthèse. Pour éviter ces
répressions, il faut donc que la source de carbone soit limitante : ce rétrocontrôle négatif sera levé en dessous
d’une certaine concentration en substrat, qui sera maintenue en jouant sur un seul paramètre, la vitesse de
dilution. Celle-ci est égale à D=f/V avec f vitesse d’écoulement du milieu à travers la chambre de culture en
mL/h et V volume de la chambre de culture en mL.
TURBIDOSTAT
Le principe est le même que précédemment, à la nuance près qu’il n’y a ici pas de nutriment limitant. Tous les
constituants sont introduits en large excès dans le milieu frais. Le flux de milieu est cependant régulé afin de
maintenir une densité cellulaire prédéterminée.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 18
INFLUENCE DE L’ENVIRONNEMENT SUR LA CROISSANCE
Maintenant que nous avons étudié le rôle du milieu et des conditions de croissance, voyons quels paramètres il
est nécessaire de modifier afin de mimer l’écosystème dont le microorganisme à été extrait pour ainsi
optimiser sa croissance.
PRESSION OSMOTIQUE
La plupart des Eubactéries ne sont pas halophiles au sens strict, mais osmotolérantes dans des concentrations
de sel allant de 0,5 à 3M. Les Archéobactéries sont quant à elles halophiles extrêmes, et vivent à des
concentrations de sel entre 2,8 à 6,2M.
La pression osmotique est exprimée à l’aide de la relation suivante :
– . . ln Où Vw est le volume occupé par l’eau, Aw le volume d’eau libre pour réagir, Cs la concentration en soluté, R la
constante des gaz parfaits, T la température en Kelvin.
Dans les conditions normales, les nutriments se retrouvent dans le milieu extérieur sous une faible
concentration : la pression osmotique intérieure est donc supérieure à la pression osmotique extérieure. La
membrane étant semi-perméable, des mouvements d’eau auront lieu par osmose afin d’équilibrer les
concentrations, induisant un gonflement du cytoplasme, ainsi qu’une poussée sur la membrane selon une
pression π. Celle-ci se répercutera également sur la paroi, selon une pression de turgescence P, qui peut être
exprimée par la relation !" #$ %. Dans les conditions de vie normales d’un microorganisme,
cette pression positive contribue à l’homéostasie de la cellule.
Afin de donner des valeurs, prenons quelques exemples :
•
•
-
La pression de turgescence d’une bactérie Gram est comprise entre 0,8 et 5atm
+
Pour une bactérie Gram , entre 5atm et 22atm
Une bactérie mise en contact avec une grande quantité de sel subit un choc dit hyperosmotique, au sein
duquel la cellule entrera en plasmolyse, et où la membrane et la paroi se rétracteront. La cellule arrêtera sa
croissance. La déshydratation suscitée aura des conséquences sur les fonctions cellulaires :
•
•
•
•
•
Non-réplication de l’ADN
Arrêt du fonctionnement des systèmes de transport actifs nécessitant de
Dysfonctionnement du métabolisme énergétique et respiratoire, arrêt de la synthèse d’ATP
Perte des structures biologiquement actives des protéines
Augmentation de la concentration de métabolites initialement non toxiques avec risques
d’interférences avec des voies de signalisation
De cette façon, un microorganisme même osmotolérant arrêtera de croître. La bactérie est cependant capable
d’osmoadaptation. Afin de permettre une nouvelle entrée d’eau dans la cellule, une molécule devra être
accumulée afin de pratiquer une osmose inverse. La réponse primaire au stress osmotique, de l’ordre de la
nanoseconde, consiste en l’activation de systèmes de transport de potassium, qui sera ainsi concentré dans le
milieu intracellulaire. Cependant, celui-ci a un effet toxique car délétère de par sa force ionique. Une réponse
secondaire, de l’ordre de la milliseconde, résidera dans l’accumulation de solutés cytoplasmiques compatibles
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 19
avec les fonctions vitales jusqu’à hauteur de 1 molaire. Ces molécules peuvent être des sucres, des acides
aminés, ou des bétaïnes.
La bétaïne est la molécule universelle de l’osmorégulation. Elle est N-méthylée. En la rajoutant dans un milieu
contenant une certaine quantité de sel, elle permet une reprise de la croissance : c’est donc un
osmoprotectant. Lorsque la concentration en N-glycine bétaïne atteint 1 molaire, la pression de turgescence à
nouveau positive permet la reprise de la croissance.
Trois mécanismes permettent l’accumulation de solutés :
•
•
•
Biosynthèse
Transport
Métabolisme freiné
PH
Nous distinguons plusieurs catégories de microorganismes en fonction du pH :
•
•
•
•
les Acidophiles, surtout représentés par les mycètes et les algues, affectionnent des pH entre 1 et 5,5,
les Neutrophiles, représentés par les bactéries, poussent dans une gamme entre 5,5 et 8,
les Alcalophiles, entre 8,5 et 11,5,
et les Alcalophiles extrêmes, plutôt représentés par les archéobactéries, supérieur à 10.
TEMPERATURE
Nous pouvons pratiquer de manière identique en fonction de la température :
•
•
•
•
•
Psychrophile, entre 0 et 20°C, avec un optimum à 15°C
Mésophile entre 15 et 45°, opt. 30°C
Thermophile entre 45 et 100°C, opt. 65°c
Thermophiles extrêmes entre 65 et 95°C
Hyperthermophiles entre 85 et 110 °C
Les températures citées définissent les minimum et maximum d’une répartition courbe de gaussienne.
Avec une répartition de -12 a 110°C, les microorganismes sont des organismes pionniers en comparaison avec
les microorganismes eucaryotes, répartis de 0 à 60°C, et les organismes les plus évolués, entre 0 et 50°C.
O2
A l’aide de géloses molles au sein desquelles l’oxygène
est réparti selon un gradient de concentration, les
microorganismes ont la possibilité de se mouvoir dans le
milieu jusqu’à un environnement leur étant favorable.
•
Une bactérie aérobie obligatoire, repérée à
l’interface entre le milieu de culture et l’air,
nécessitera obligatoirement la présence
d’oxygène, signifiant que celui-ci est accepteur
final de la chaîne transporteuse d’électrons.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 20
•
•
•
•
Une bactérie microaérophile ne croîtra qu’à une certaine distance de la surface, à des concentrations
en oxygène 10x réduites par rapport à l’atmosphère, donc entre 2 et 10%.
Une anaérobie aérotolérante poussera de manière indifférente qu’il y ait ou non de l’oxygène dans le
milieu. Exemple : Enterococcus faecalis, Lactobacillus.
Une bactérie anaérobie stricte ne doit pas être en contact d’oxygène, cette espèce leur étant létale.
Exemple : Clostridium pasterianum.
Une bactérie aérobie facultatif comme E. coli peut être anaérobie, aérobie, microaérophile, et pousse
de la même façon que les levures.
-
Certaines espèces de l’oxygène sont toxiques, comme O2∙ oxygène singulet ou O2∙ radical superoxyde. Celles-ci
vont réagir avec l’ADN, les membranes, les lipides, ainsi que d’autres constituants cellulaires. Les organismes
possèdent afin de s’en protéger des systèmes de détoxification, qui sont principalement :
•
•
•
-
-
+
Superoxyde dismutase SOD, catalysant la réaction O2∙ + O2∙ +2H ->H2O2 + O2
Catalase, catalysant 2H2O2->2H2O+O2
+
Peroxydase, catalysant H2O2+2H ->2H2O
Les bactéries anaérobies strictes ne possèdent ni catalase, ni SOD, alors que les bactéries anaérobie facultatif et
aérobie obligatoire possèdent toutes deux l’équipement enzymatique complet.
PRESSION
En règle générale, les microorganismes sont cultivés à pression atmosphérique. En revanche, si l’on ne
maintient pas à la pression de son environnement un microorganisme prélevé en profondeur, il mourra. On
distingue donc :
•
•
Microorganismes Barotolérants, vivant de 400 à 500atm
Microorganismes Barophiles, jusqu’à 600 à 1000atm
CHAPITRE III - STRUCTURE DE LA CELLULE BACTERIENNE
Au cours de ce chapitre, nous observerons la structure ainsi que l’ultrastructure des microorganismes de type
bactérien. Les premières observations sont effectuées à l’aide de microscopes optiques à fond clair, revenant à
éclairer le fond de la préparation. Il est possible d’observer les bactéries à l’état frais, ou en frottis.
La réalisation d’un état frais consiste en un prélèvement de culture appliqué entre lame et lamelle. Il permet
d’observer les cellules vivantes et ainsi repérer leur mobilité, tous les microorganismes n’étant pas équipées
d’un système motile.
Afin de préparer un frottis bactérien, une suspension bactérienne est étalée sur une lame de verre. Puisque le
contraste d’observation des microorganismes est faible, il convient de pratiquer une coloration. Nous
commençons donc par fixer la préparation à l’aide d’alcool à la chaleur. Le colorant ajouté pourra être
spécifique des structures internes. Certains colorants basiques ou chromophores se fixent à la surface des
microorganismes de charge globale négative :
•
•
Cristal violet (violet de gentiane)
Bleu de méthylène
Certains autres se fixent à la membrane de cellules chargées positivement :
•
•
Fuschine
Eosine
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 21
A la suite de la coloration, la lame est lavée, puis on procède à l’observation au microscope. Les
microorganismes mesurant entre 1 et 10µm, il convient d’utiliser un système d’observation de grandissement
d’ordre 1000x. Nous pouvons alors utiliser un objectif à immersion. Mieux encore, l’utilisation de la
microscopie électronique peut s’avérer intéressante.
PRINCIPALES FORMES BACTERIENNES
BACTERIES UNICELLULAIRES
FORMES SPHERIQUES : COQUE OU COCCUS
En fonction de la division du microorganisme, du nombre de plans de
division, et de l’état de séparation des cellules, on distingue différents
morphotypes :
•
•
•
•
•
Diplocoques : un seul axe de division, deux cellules accolées
Streptocoques : un seul axe de division, n cellules accolées
Tétrades : deux plans de divisions, 4 cellules accolées
Sarcines : trois plans de divisions et 8 cellules accolées
Staphylocoques : plans de division désorganisés, n cellules
accolées
FORME CYLINDRIQUE : BATTONNET OU BACILLE
•
•
•
•
Bacille simple, un seul bâton, exemple : Bacillus subtilis
Diplobacille, deux bâtons
Streptobacille, les bâtons ne se séparent pas, exemple :
Lactobacillus bulgaricus
Coccobacille, le bâton est fortement réduit en longueur
FORME HELICOÏDALE
On les classifie en fonction de la longueur, et la souplesse ou flexibilité
de l’hélice.
•
•
•
Vibrion, en forme de virgule, l’hélice est inférieure ou égale à
un tour, exemple : Vibrio cholerae
Spirille, hélice longue et rigide, exemple : Spirullum
Spirochète, hélice longue et flexible, exemple : Borrelia burgdoferi,
responsable de la maladie de Lyme
BACTERIES A PROSTHEQUE
Ce sont, en général, des bactéries photosynthétiques. Elles possèdent des
protubérances, les prosthèques, leur conférant leur aspect étoilé.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 22
BACTERIES PLURICELLULAIRES
Ces bactéries sont composées de plus d’une centaine de cellules collées les unes aux autres.
ACTINOMYCETES
Cet embranchement regroupe des bactéries du sol. Malgré leur nom, il ne s’agit pas de champignons au sens
vrai. Ces bactéries possèdent une structure microscopique sous forme de chaînette pouvant être ramifiée, leur
conférant lors d’une culture sur boîte un aspect duveteux : le microorganisme semble alors avoir un mycélium.
On y retrouve notamment le genre Streptomyces, au sein duquel se trouve un grand nombre de bactéries
productrices d’antibiotiques.
CYANOBACTERIES
Les cyanobactéries pratiquent une activité photosynthétique. L’espace entre les cellules étant très réduit, les
communications au sein du trichome sont très rapides. Nous prendrons l’exemple du genre Oscillatoria.
Certains autres genres, comme Anabaena, possèdent également des cellules particulières, les hétérocystes,
pratiquant la fixation de l’azote afin de le mettre à disposition des cellules voisines.
DIVISION CELLULAIRE DES BACTERIES
Les bactéries ne pratiquent pas de reproduction sexuée au sens vrai, puisque ne subissant ni mitose, ni méiose.
-9
-12
La reproduction est toujours clonale, à l’erreur de mutation près dont la fréquence varie de 10 à 10 . Les
différents modes de reproduction sont les suivants :
•
•
•
Division binaire transversale
Bourgeonnement, principalement pour les bactéries à prosthèque, puisque leur étant difficile de
produire un septum.
Fragmentation, principalement chez les bactéries à forme mycélienne Actinomyces et Streptomyces,
où les microorganismes peuvent perdre une partie de leur filament, reformant un mycélium puis une
colonie.
On ne peut donc pas parler de reproduction sexuée dans la mesure où les génomes ne se rejoignent pas pour
former un zygote, mais il existe des phénomènes dits de parasexualité durant lesquels du matériel génétique
est échangé d’une bactérie à une autre :
•
•
•
Transformation
Conjugaison
Transduction
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 23
STRUCTURE FINE, COMPOSITION ET FONCTION DE LA CELLULE BACTERIENNE
Dans ce chapitre, nous regarderons pas
à pas les différents constituants de la
cellule
bactérienne,
à
savoir
chromosomes, plasmides, ribosomes,
matériel de stockage, membrane
cytoplasmique, paroi, capsule quand
présente, poils, flagelles.
STRUCTURES INTERNES
ADN
Cette molécule hélicoïdale bicaténaire
circulaire, universelle dans sa composition chimique, arbore en microscopie électronique un aspect fibreux. Le
matériel génétique y est porté au sein de deux structures distinctes : un unique chromosome, ainsi que des
plasmides facultatifs.
9
10
Le chromosome, représenté en une copie circulaire unique, possède une masse moléculaire de 10 à 10
Dalton. La taille du génome qu’il porte varie de 0,65Mb à plus de 10Mb, avec une moyenne à 4Mb. La liste des
organismes dont le génome est entièrement séquencé en date du 06/10/2008 est la suivante : 54 Archées, 701
Bactéries, 77 eucaryotes. Pour exemple, Escherichia coli possède 4,6Mb, c'est-à-dire approximativement 4600
gènes différents. Présent dans le cytoplasme procaryote sous forme d’un nucléoïde, il n’est pas délimité par
une membrane. En cas de lyse douce de la bactérie, il est possible de le libérer. Initialement surenroulée, la
molécule d’ADN le composant mesure en réalité 1mm de longueur.
Les plasmides, ADN double brin extra-chromosomiques, peuvent être naturels ou cryptiques, et se répliquent
de manière indépendante et autonome par rapport au chromosome. Lorsqu’ils sont capables de s’intégrer
dans ce dernier, on parle alors d’épisome. Il est possible de curer une souche de ses plasmides, on remarque
alors que ceux-ci jouent un rôle dans l’adaptation du microorganisme, sans être essentiels au développement.
RIBOSOMES
Les ribosomes, repérables sur les microscopies électroniques sous forme de petits points, peuvent être libres
dans le cytoplasme ou bien organisés en polysomes, également appelés polyribosomes. Leur rôle est identique
à celui de leurs homologues eucaryotes, à savoir qu’ils permettent la traduction de l’ARNm en protéines, à la
différence près que la catalyse de la réaction a lieu dès la sortie de l’ARNm de l’ARN polymérase, incidemment
immédiatement à la suite de la polymérisation du messager. La non-compartimentalisation du matériel
chromosomique permet d’expliquer ce phénomène.
L’aspect d’un ribosome procaryote ne diffère pas beaucoup de celui des eucaryotes. Il est composé de deux
sous-unités de complexité différente assemblées au cours de la traduction pour former une grande sous-unité.
Examinons de plus près la constitution de ces molécules, et explicitons l’utilisation de l’unité Svedberg, notée S,
qui correspond à une valeur de taux de sédimentation.
•
Ribosome procaryote : 80S
o Grande Sous-unité : 50S
ARNr 23S
ARNr 5S
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 24
31 protéines
Petite Sous-unité : 30S
ARNr 16S – utilisé en tant que marqueur moléculaire phylogénétique
21 protéines
Ribosome eucaryote : 70S
o Grande Sous-unité : 60S
ARNr 28S
ARNr 5,8S
49 protéines
o Petite Sous-unité 40S
ARNr 18S – utilisé en tant que marqueur moléculaire phylogénétique
33 protéines
o
•
VESICULES A GAZ
Ces vésicules à gaz sont propres à quelques espèces de procaryotes, plus particulièrement les microorganismes
sans flagelle des lacs profonds, chez lesquels elles leur permettent de se déplacer entre différentes
profondeurs pour y trouver les conditions particulières nécessaires à leur développement.
Par exemple, nous trouverons chez Ancylobacter aquaticus des vacuoles à gaz contenant elles-mêmes des
vésicules à gaz constituées de protéines aux chaînes latérales intérieures hydrophobes, induisant la formation
de compartiments réfractaires à l’eau. Les gaz y diffusant de manière libre, les microorganismes pourront donc
jouer sur la quantité de ces vésicules afin de se déplacer dans les colonnes d’eau. Afin de, par exemple,
remonter en surface, les bactéries répondront à un signal pour l’instant inconnu en augmentant la synthèse de
ces vésicules.
SUBSTANCES INTRACELLULAIRES DE RESERVE
N’étant pas forcément visibles au microscope et tout comme chez les eucaryotes, nous trouverons chez les
procaryotes des substances classiques de réserve sous forme de polymères, ces derniers permettant à la cellule
le maintien d’une pression osmotique suffisamment basse nécessaire au fonctionnement du métabolisme.
Certaines de ces substances sont partagées par les deux domaines du vivant, comme le glycogène et l’amidon,
des polymères de glucose en α-1,4, et d’autres sont propres aux procaryotes, à savoir :
•
•
•
Poly-β-hydroxybutyrate (PBH), polymère d’acide stocké sous forme de granules et vésicules visibles au
microscope optique.
Cyanophycine, copolymère d’acide aspartique et d’arginine stocké par les cyanobactéries sous forme
de granules visibles en microscopie optique. Ils sont utiles à la cellule en cas de carence en azote dans
un milieu riche en carbone organique.
Composés inorganiques comme des polyphosphates et du soufre sous forme de granules jouant un
rôle lors de la synthèse d’ATP et de phospholipides. Ils sont visibles sous forme de tâches foncées chez
Pseudomonas aeruginosa et Thiothrix nivea.
MEMBRANE CELLULAIRE OU MEMBRANE CYTOPLASMIQUE
Chez E. coli, la membrane plasmique est composée d’au maximum sept phospholipides différents représentant
de 15 à 40% de celle-ci, de 40 à 70% de protéines, ainsi que de 10 à 20% de glucides. En comparaison aux
membranes des eucaryotes, on ne trouve pas de stérols, mais des cations bivalents participeront à la
stabilisation de la structure.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 25
Le rôle de cette membrane est le même que pour n’importe quelle autre cellule vivante : elle compose une
barrière de séparation avec le milieu extérieur. Cette membrane possède cependant une perméabilité
sélective aux substances chimiques : des composés simples comme l’eau et les gaz diffusent librement alors
que les autres molécules nécessitent la présence de transporteurs.
Chez les procaryotes, la membrane cytoplasmique possède également un rôle équivalent à la membrane
mitochondriale, dans la mesure où elle contient les protéines de la chaîne de transport d’électrons ainsi que les
protéines responsables de la synthèse d’ATP. Elle joue enfin un rôle lors de la réplication du chromosome
circulaire, au cours de laquelle les deux cellules filles se séparent à la suite d’un phénomène de constriction
membranaire.
LES PAROIS
La paroi est le constituant cellulaire le plus externe de l’individu procaryote, et est indispensable à la survie de
la cellule le produisant, ce qui n’est pas vrai dans le cas d’une capsule.
La paroi a pour rôle de maintenir l’intégrité cellulaire en empêchant l’éclatement de la membrane
cytoplasmique lors des phénomènes de lyse cellulaire. Fait inhabituel, certaines bactéries comme les
mycoplasmes peuvent vivre sans paroi, car possédant tout comme les cellules eucaryotes des stérols jouant un
rôle lors de la stabilisation de la membrane plasmique. Equation bilan :
*+,- ./.0,+1/ /12/**/ 3/4+-,/
CONSTITUANTS ET STRUCTURE DE LA PAROI : LE PEPTIDOGLYCANE
Au sein de la paroi, nous trouvons le peptidoglycane, aussi appelé mucocomplexe ou muréine, constitué de
l’enchaînement de deux osamines, la N-acétylglucosamine NAG et l’Acide N-acétyl Muramique NAM.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 26
Des liaisons peptidiques relient glycanes et
chaînes peptidiques, composées de quatre
acides aminés de série L ou D alternés. Des
liaisons entre les différents tétrapeptides
peuvent être réalisées de la position 3 à la
position 4 : l’acide aminé en position 3
nécessite donc deux fonctions amine, et
peut par exemple consister en une Lysine
tout comme un acide diaminopimélique. En
cas de pontage indirect, comme par
exemple l’établissement d’un pont
pentaglycine, les bactéries sont définies
+
comme Gram . A contrario, les pontages
directs définissent les bactéries Gram .
Ce réseau bidimensionnel définira la rigidité et la solidité de la paroi. On soulignera le rôle important des diaminoacides dans le pontage peptidique, avec un premier NH2 engagé dans le pontage, et un second NH2
engagé dans la structure du tétrapeptide. La nature des ponts peptidiques est extrêmement variable selon
l’espèce, avec plus de 100 structures différentes identifiées. Les glycanes sont invariants, mais la nature des
acides aminés composant le tétrapeptide peut être également variable. Notons qu’il est cependant impossible
de retrouver au sein d’un pontage des acides aminés soufrés ou aromatiques.
COMPARAISON DES PAROIS DES BACTERIES GRAM- ET GRAM+
Des colorations différentielles effectuées selon un protocole mis au point par un certain M. Gram (qui l’eût
cru ?) permettent de différencier de manière directe les deux types de pontage. Ainsi, une couleur violette est
+
spécifique d’un germe Gram , et rose, Gram .
Le principe de la coloration différentielle de Gram est le suivant :
1.
2.
3.
4.
5.
On réalise un frottis à partir d’une dilution de suspension bactérienne que l’on fixe à la chaleur.
On pratique une coloration au cristal violet, basique, interagissant avec les protéines chargées
négativement
Une « morsure » au Lugol (iodure de potassium et iode) est réalisée, qui permet de fixer le cristal
+
violet chez Gram uniquement en se complexant au cristal violet et aux composés cellulaires.
On décolore à l’alcool. On parle d’une étape de dédifférenciation, durant laquelle on retire l’excès de
cristal violet ne s’étant pas lié de manière forte à la paroi. Les Gram se retrouvent donc décolorées.
Enfin, on pratique une contre coloration à la fuschine ou safranine, permettant une observation sur
microscope à fond clair.
DIFFERENCES DE STRUCTURE DE L’ENVELOPPE CELLULAIRE
Observons maintenant de plus près les différentes structures de l’enveloppe cellulaire. Chez une bactérie
+
Gram , incidemment tous les bacilles, nous pouvons observer en microscopie électronique le cytoplasme, la
membrane cellulaire, un espace virtuel, puis une paroi cellulaire homogène aux électrons.
-
Chez une bactérie Gram comme E. coli, la structure semble plus complexe, avec un cytoplasme, une
membrane cellulaire interne, une paroi cellulaire plus complexe comprenant des peptidoglycanes, puis une
membrane externe ayant en microscopie électronique l’aspect d’une membrane plasmique. Il existe donc chez
Gram un espace au sens vrai entre membrane interne et externe, le périplasme.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 27
+
Le peptidoglycane de Gram , plus épais et plus dense, permet d’empêcher la décoloration du cytoplasme par
l’éthanol. Celui-ci étant plus réduit chez Gram , la décoloration est donc plus aisée.
ENVELOPPE GRAM+
+
Chez les bactéries Gram , la paroi, épaisse et
uniforme, comprend de 40 à 80% de
peptidoglycanes selon l’espèce et la culture, et
entre 20 et 60% d’autres espèces comme les
acides teichoïques et teichuroniques.
Les premiers consistent en des polyalcools
reliés par des esters de phosphate et ribitolphosphate sur lesquels nous trouverons des
sucres
(glucose,
galactose,
osamines
(glucosamine)) ou un acide aminé : la DAlanine. Les seconds sont des polymères de
différents acides uroniques comme l’acide glucuronique
ainsi
qu’un
dérivé
d’acide
aminé,
l’acide
aminoglucoronique.
Ceux-ci peuvent être libres, associés au feuillet externe de
la membrane, ou liés aux peptidoglycanes via le
groupement hydroxyle en C6.
ENVELOPPE GRAMLa paroi est ici beaucoup plus complexe car
hétérogène :
une
nouvelle
bicouche
phospholipidique fait son apparition en milieu
extérieur. Le maillage peptidoglycanique ne
représente que 5% de la structure de la paroi.
Celui-ci est de faible poids moléculaire, et
possède un empilement monocouche. On ne
trouve ni acides teichoïques, ni acides
teichuroniques.
STRUCTURE DE LA MEMBRANE EXTERNE
DES BACTERIES A GRAM NEGATIF
Des connecteurs, comme la lipoprotéine
d’ancrage, permettent la liaison entre le
peptidoglycane et la membrane externe, induisant une certaine stabilité du périplasme. Puisqu’il n’existe pas
+
de membrane externe chez Gram , on n’y trouvera donc ni lipoprotéine, ni lipopolysaccharide.
On retrouvera au sein de cette membrane des phospholipides classiquement organisés en bicouches et
similaires à ceux constituant la membrane cytoplasmique. Des particularités se retrouveront néanmoins au
niveau de la constitution protéique :
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 28
Les protéines majeures, représentant
jusqu’à 70% des protéines totales de la
membrane externe, sont des porines (de
type OmpC et OmpF chez E. coli),
induisant une imperméabilité plus faible
de la membrane externe. Les protéines
mineures consistent en quelques rares
systèmes de transport spécifiques des
sucres comme LamB pour le maltose,
pouvant servir secondairement de
récepteurs phagiques.
La
lipoprotéine
connectée
au
peptidoglycane,
ou
lipoprotéine
d’ancrage présente dans le feuillet
interne de la membrane externe, possède 58 acides aminés connectés au lipide. Dans 1/3 des cas seulement
elle est connectée au peptidoglycane, et ce en s’ancrant au di-aminoacide de son tétrapeptide en formant un
complexe stable peptidoglycane-lipoprotéine.
On trouve également dans la membrane externe un
liposaccharide LPS, organisé en trois domaines :
• le lipide A, enchâssé dans le feuillet externe, composé
de deux glucosamines portant un groupement phosphate ainsi
que quatre chaînes d’acides gras au moins
• le « core », ou noyau polysaccharidique, consistant en
un enchaînement de sucres en C7 et C6 à l’extérieur de la
membrane
• le polysaccharide O ou antigène O, qui est une chaîne
latérale de composition variable différant d’une espèce à l’autre.
Un exemple fourni pour le genre Salmonella.
Les microorganismes pathogènes peuvent posséder un LPS
toxique dit endotoxine, dont l’élément actif est le lipide A. La
toxicité du LPS dépend de sa répartition : après injection
intraveineuse de lipide A apparaissent rapidement des symptômes de fièvre, chocs hémorragiques,
avortements et perte de connaissance entraînant rapidement la mort. C’est donc la lyse bactérienne plus que
la bactérie en elle-même, donc l’action du système immunitaire dégradant le microorganisme, qui libèrera la
toxine dans des compartiments stériles comme le sang. Les doses nécessaires à l’apparition de symptômes sont
très faibles. Prenons l’exemple de la peste bubonique, transmise par le microorganisme Yersina pestis, chez
lequel l’agent responsable de la pathologie est un lipopolysaccharide, dont la toxicité est liée aux acides gras du
lipide A, au compartiment, ainsi que des doses.
PERIPLASME GRAM+
-
Rappelons qu’il n’existe pas d’espace intermembranaire vrai chez les Gram . Cet espace est, chez les Gram , le
lieu d’une activité enzymatique intense où se déroulent en particulier les différentes étapes de la synthèse de
paroi. Nous y retrouvons également des chimiorécepteurs jouant un rôle dans la mobilité, ainsi que des
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 29
+
protéines de liaison des systèmes de transport ABC. Chez les Gram , il est nécessaire d’ancrer les protéines à
l’aide d’un groupement lipidique, alors que chez les Gram , la protéine diffuse librement dans le périplasme.
La fonction de la paroi est toujours la même, elle permet d’empêcher la lyse osmotique au sein d’un
environnement naturel le plus souvent hypotonique. Un antibiotique, par exemple la pénicilline, permettra
ainsi de tuer les bactéries en division en remplaçant un acide aminé du tétrapeptide par un analogue structural,
ayant effet bactériostatique, on parle d’un antibiotique bactériolytique. Il est également possible de faire agir
des éléments comme les lysozymes coupant les liaisons β-1,4 et faisant exploser la paroi cellulaire. Ainsi,
connaître les propriétés de l’enveloppe cellulaire peut être commode lors de l’élaboration d’antibiotiques.
LA CAPSULE
Egalement appelée glycocalix, sa présence dépend de l’espèce considérée, et n’est pas essentielle : dans
certaines conditions de croissance, il est possible de l’éliminer. Elle jouerait un rôle de protection vis-à-vis de
l’environnement extérieur, empêchant notamment la fixation de certains phages dont les récepteurs se
trouvent sur les membranes plasmiques, permettant un ralentissement de la déshydratation en cas de pénurie
d’eau, mais aussi la modulation de la virulence d’un microorganisme pathogène.
Réalisons une expérience : prenons une souche sauvage de Streptococcus pneumoniae capsulée (aspect lisse
« smooth »), ainsi qu’une souche mutante de Streptococcus pneumoniae non capsulée (aspect rugueux
« rough »). Injectées dans une souris, seules les bactéries de type S provoquent la mort. La capsule offre donc
ici une protection contre la phagocytose. Notons que la capacité d’adhésion à la surface d’un épithélium ou
d’un matériau est également un facteur de virulence, et citons à titre d’exemple Streptococcus mutans, ayant la
capacité d’adhérer à l’émail des dents pour y métaboliser le sucre en acide, lequel est responsable de
l’apparition de caries. Les capacités de colonisation sont un facteur de pathogénicité.
Les capsules étant relativement imperméables aux colorants, nous les observons donc à l’aide de couleurs de
fond ou d’anticorps dirigés contre les constituants cellulaires.
Vis-à-vis de la composition chimique des capsules de différentes espèces bactériennes, nous pouvons
distinguer deux types de capsules : les polysaccharidiques, et les polypeptidiques. Voyons rapidement la
répartition de ces deux types en fonction des genres bactériens :
•
•
Bacillus possède des capsules de type polypeptidique.
Streptococcus et les bactéries lactiques possèdent une capsule polysaccharidiques composée d’homo
ou d’hétéropolymères.
APPENDICES CELLULAIRES
Les appendices cellulaires consistent en des éléments extracellulaires pouvant jouer différents rôles.
Salmonella typhimurium et E. coli sont recouverts d’un réseau de quelques centaines de poils, les fimbriae,
ainsi que de pili en faible nombre. Ces éléments sont constitués d’une seule structure protéique hélicoïdale.
Nous les retrouvons plus communément chez les Gram .
Les fimbriae ont un rôle à jouer dans les mécanismes de pathogénicité, notamment pour l’adhésion aux
muqueuses, l’augmentation des surfaces de contacts, etc. Les pili sexuels ou F-pili sont moins fréquents. Au
nombre de 1 à 2 par cellule, ils consistent en des ponts cytoplasmiques conçus dans le but de pratiquer des
échanges. Ils peuvent également permettre un simple accouplement des cellules bactériennes. Enfin, les
flagelles, lorsqu’ils sont présents, jouent un rôle important au sein de la mobilité en milieu aqueux. Leur taille
est incluse entre 10 à 20nm de diamètre et 5 à 20µm de long. Dans le cas d’un seul flagelle, on parle de
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 30
monotriche ; dans le cas d’un faisceau à un seul pôle, lophotriche ; dans le cas de deux pôles seulement et un
faisceau, amphitriche ; pour les flagelles au moins au nombre de 10 et situés sur tout le pourtour, péritriche.
COMPOSITION DU FLAGELLE
Le flagelle est composé de 3 parties majeures :
•
•
•
Un filament de flagelline, protéine de structure hélicoïdale creuse,
jouant le rôle d’hélice de la bactérie.
Un crochet rattachant le filament au corps basal, par analogie avec le
monde naval, on peut dire qu’il représente le cardan de la bactérie.
Un corps basal, moteur responsable de la rotation du flagelle,
incidemment de l’avancée du microorganisme. Ce corps est constitué
de quatre disques :
o Le disque L dans la membrane externe
o Le disque P dans le peptidoglycane
o Les disques S et M dans la membrane interne
La longueur du flagelle dépend de l’espèce et des ses conditions de culture. Celui-ci étant constitué de 60
protéines différentes, une mutation sur l’un des 60 gènes suffit à altérer suffisamment le flagelle pour
empêcher son fonctionnement.
Les disques M et S sont entourés de protéines Mot transformant l’énergie
chimique en énergie mécanique de rotation du système de disques au
cours d’un mouvement antihoraire. L’énergie chimique fournie par
l’entrée de protons dans les Mot permet au système d’effectuer de 200 à
1000 tours par minute propulsant la bactérie à une vitesse de 10 à 20
micromètres par seconde, équivalent à une vitesse de 65 km/h pour un
Homme. 1000 protons sont nécessaires par tour de flagelle, et malgré une
quantité de particules à première vue importante, cela ne représente
moins d’un pourcent d’énergie cellulaire.
Chez une bactérie péritriche, c'est-à-dire possédant de multiples flagelles
répartis sur l’intégralité de la cellule, il est nécessaire que tous les flagelles
tournent dans un même sens. Afin d’effectuer un virage, la bactérie
péritriche passe par une phase de « culbute » de moins d’une seconde
durant laquelle les protéines FLI commanderont l’inversion du sens de
rotation. Les flagelles ainsi dispersés induisant l’arrêt brusque de la
bactérie qui culbute et change ainsi de direction.
LE TACTISME
Le tactisme correspond au phénomène de déplacement de la bactérie à la suite d’un stimulus. En effet, la
bactérie peut être attirée par certaines substances et repoussée par d’autres, correspondant à une recherche
naturelle du milieu optimum. Le tactisme peut ainsi être positif ou négatif.
EXEMPLES DE TACTISMES POSITIFS
•
Le tactisme chimio-attractant correspond à l’attraction de la bactérie par une substance chimique. On
le retrouve par exemple lors du déplacement de bactéries au sein d’un gradient de glucose vers des
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 31
•
•
•
concentrations croissantes de ce composé. On peut aussi utiliser pour cette expérience des acides
aminés voire des dipeptides. Quel que soit le nombre de flagelle, en absence de nutriment, la bactérie
se déplacera selon un mouvement aléatoire. Dès mise en présence de l’un d’entre eux, leur
mouvement devient moins erratique et s’affirme être orienté vers la nourriture.
Le phototactisme correspond à l’attraction par la luminosité, particulièrement pour organismes
phototrophes.
L’aérotactisme équivaut à l’attrait des bactéries aérobies strictes pour les zones riches en O2.
Concernant le magnétotactisme, il convient de dire que toutes les bactéries de l’hémisphère nord
sont attirées vers le pôle magnétique nord, et inversement.
EXEMPLE DE TACTISME NEGATIF
Tactisme répulsif de substances toxiques voire létales, selon un
phénomène purement lié à la capture d’un signal chimique. L’arabinose,
par exemple, entre via des porines dans le périplasme, où il sera capté par
un récepteur spécifique puis apporté à un récepteur Methyl Carrier
Protein MCP. Ces dernières, protéines du chimiotactisme, sont acceptrices
de groupement méthyle. Une transduction du signal est effectuée lorsque
celles-ci s’hyperméthylent, entraînant une cascade de phosphorylation
aboutissant à une nouvelle classe de protéines, les Chemotaxis CHE, qui
activeront les protéines Mot.
Notons que chez les Spirochètes, bactéries entourées d’une gaine externe, le flagelle est compris à l’extérieur
de la paroi. Passent dans la gaine externe les filaments axiaux constituant les flagelles.
ENDOSPORES
+
Seules les bactéries Gram sont capables de sporuler, comme les genres Clostridium ou Bacillus. La genèse des
spores a lieu lorsque les conditions nutritionnelles sont défavorables. Ces cellules dormantes, très
déshydratées et incidemment légères, possèdent de grandes capacités de résistance, notamment aux chocs
suivants :
•
•
•
•
•
Dessiccation, alors que les cellules végétatives sont très sensibles aux stress hydriques.
Rayonnements, en particulier UV
Substances chimiques, telles produits chlorés, désinfectants, alcool
Gel
Chaleur, un microorganisme meurt à 70°C environ, les spores sont quand à elles détruites à la suite
d’expériences grâce à un autoclavage entre 105 et 110°C pendant 30 minutes ou 120°C pendant 20
minutes.
Cette très haute résistance cause beaucoup de problèmes à l’Homme, notamment au sein de milieux devant
être stériles.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 32
SPORULATION
On parle également de sporogenèse. Il s’agit
d’un cas très rare de différenciation
cellulaire procaryote. Afin de sporuler, une
carence nutritionnelle est nécessaire.
1.
2.
3.
La bactérie s’allonge, l’ADN se
réplique. Se forme un septum
transversal, repli membranaire
isolant une des copies de l’ADN
ainsi qu’une partie du cytoplasme
du reste de la bactérie. La
membrane englobe finalement
l’ensemble, créant une entité
unique à deux membranes qui
flottera ensuite dans le cytoplasme:
c’est la préspore.
Une couche de peptidoglycane se
forme entre les deux membranes
de la préspore : il s’agit du cortex.
La tunique sporale est ensuite
formée autour du cortex, et
l’endospore se libère ensuite de la
cellule.
Ces processus sont tous liés à l’action des gènes de types SPO, régulant les phénomènes de sporulation.
En fonction de la forme et de la position de la spore, nous sommes en mesure de déterminer le type de
bactérie auquel nous avons affaire. Les spores peuvent ainsi être non-déformantes et flotter dans le
cytoplasme, ou déformantes car plus grosses que la bactérie et formant un renflement. Celles-ci peuvent
également être terminales, subterminales, ou centrales en fonction de leur position dans la bactérie.
Les endospores peuvent rester en dormance durant des millénaires. Et pour preuve, des spores de la bactérie
thermophile Thermoactinomyces vulgaris ont été retrouvées au sein de la vase d’un lac glacial datée de 7500
ans, et déposées sur milieu adapté, sur lequel elles ont redonné naissance à des bactéries fonctionnelles.
La spore contient :
•
•
•
•
•
•
De l’ADN
Une petite quantité d’ARN
Des ribosomes
Des enzymes
Des protéines Small Acid Soluble Protein SASP permettant la conversion de l’ADN en une forme
résistante aux UV, à la chaleur et à la dessiccation. En plus de leur rôle de protection, celles-ci
constituent lors de la germination une source de carbone permettant le redémarrage du métabolisme.
De l’acide dipicolinique qui, complexé avec le calcium, joue un rôle d’« éponge à eau » permettant la
déshydratation de la spore. Elle protège également l’ADN de la dénaturation par la chaleur.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 33
Sous forme spore, l’eau étant éliminée à hauteur de 90%, les réactions métaboliques sont pratiquement toutes
arrêtées. Lors de la germination, la tunique sporale est lésée, les couches protectrices sont dégradées par les
enzymes de l’endospore, aboutissant à l’entrée d’eau et la reprise du métabolisme.
LSV – Semestre 3 – Microbiologie générale - 34