Localisation immunohistochimique dans l`intestin de porc

Article
original
Localisation immunohistochimique dans l’intestin
de porc des composantes cellulaires et humorales
de la réponse immunitaire
M Olivier
2
P Berthon
H Salmon
1
Équipe de «Génétique et Immunité»;
Équipe de «Lymphocytes et Immunité des muqueuses»,
INRA, laboratoire
de pathologie infectieuse et immunologie, centre de Tours, 37380
(Reçu
le 5 mai 1993;
Nouzilly,
France
accepté le 2 décembre 1993)
Résumé ― L’analyse des différentes composantes du système immunitaire, cellulaires et humorales, ainsi que leurs localisations, ont été effectuées sur coupes d’intestin de porc, en utilisant des
anticorps spécifiques des sous-populations leucocytaires porcines. La fixation de ces anticorps a été
révélée à l’aide d’anticorps biotinylés anti-immunoglobulines de souris et d’un complexe révélateur
streptavidine-biotine-péroxydase. Les résultats montrent une distribution spécifique des composantes immunitaires dans les compartiments, épithélial d’une part et lamina propria d’autre part.
Dans l’épithélium, on assiste à une prédominance de lymphocytes T de phénotype cytotoxique (T8),
alors que le tissu conjonctif de la lamina propria est pourvu pour une moitié de lymphocytes T, avec
une légère prédominance des T auxiliaires (T4) sur les T cytotoxiques, et pour l’autre moitié de plasmocytes dont la plupart contiennent des IgA. Les macrophages sont présents seulement dans la lamina propria. Les cellules épithéliales des villosités et des cryptes expriment les antigènes du CMH,
de classe I sur la bordure en brosse, alors que ceux de classe Il sont présents uniquement sur les
cellules épithéliales des villosités. En revanche, de même que pour les IgA, le composant secrétoire
se localise sur les cellules épithéliales du fond des cryptes. Cette répartition suggère la possibilité
d’une réponse immunitaire au niveau même de la muqueuse intestinale.
porc1 lymphocyteI macrophageI intestin 1 immunoglobulines/ entérocytes
Summary ― lmmunohistochemical localization of the humoral and the cellular components
of the immune response in swine gut. By immunohistochemistry, lymphocyte subsets of the
swine gut were localized either in the epithelium or in the lamina propria. In addition, the distributions
of class I and class II antigens were also characterized, using the streptavidin-biotin-peroxidase
complex as the revelator; the endogenous peroxidase activity was distinguished from the specific by
cobalt chloride. The results show a compartmentalization in the distribution of lymphocytes: in the
epithelium, all the cells were T lymphocytes, the majority of the CD8 phenotype; in contrast, in the lamina propria, T and B cells were represented in similar proportions: T cells were constituted of both
CD4 and CD8 cells (with slightly more CD4 than CD8 cells), while majority of B cells harboured the
IgA isotype. Class I MHC was present on epithelium cells of both the villi and crypts. In contrast
MHC class // was only present on epithelial cells of the villi. Both SC and IgA were localized in the
epithelium cells of the crypt. Thus, this compartmentalization suggests the possibility of an immune
response in the gut.
pig / lymphocyte / macrophage / intestine / immunoglobulins / enterocyte
*
Correspondance
et tirés à
part
INTRODUCTION
Quelle que soit l’espèce animale, la
mu-
queuse de l’intestin grêle des Mammifères
est infiltrée par de nombreuses cellules du
système immunitaire, en particulier des
lymphocytes et des plasmocytes.
Les lymphocytes T sont présents dans
l’épithélium et dans la lamina propria.
Dans l’épithélium, la majorité des lymphocytes T sont de phénotype T8 chez
l’homme (Janossy et al, 1980 ; Selby et al,
1983 ; Cerf-Bensussan et al, 1983), la
souris (Ernst et al, 1986) et le porc (Bianchi et al, 1992 ; Vega-Lopez et al, 1993).
Dans la lamina propria, les lymphocytes
T4 sont plus nombreux que les lymphocytes T8 chez l’homme (Selby et al, 1983 ;
Cerf-Bensussan et al, 1983) et le porc
(Vega-Lopez et al, 1993).
Les lymphocytes B et les plasmocytes
sont en majorité de phénotype immunoglobuline A (IgA) dans la lamina propria de
l’intestin de l’homme (Dobbins, 1986), de
la souris (Mc Dermott et al, 1986) et du
porc (Brown and Bourne, 1976 ; Allen and
Porter, 1977 ; Butler et al, 1981).
antigènes du complexe majeur
d’histocompatibilité (CMH) sont présents
sur les cellules de l’épithélium intestinal.
Les antigènes de classe1 sont présents
sur l’ensemble des cellules l’épithéliales
(Mayrhofer et al, 1983; Gorvel et al, 1984).
Les antigènes de classe Il sont présents uniquement sur les cellules de l’épithélium des villosités (Wiman et al, 1978 ;
Scott et al, 1980 ; Mayrhofer et al, 1983 ;
Gorvel et al, 1984).
Bien que l’induction des réponses im-
pourrait s’initier ailleurs qu’au niveau des
plaques de Peyer, peut-être même au niveau de l’épithélium intestinal où les cellules épithéliales pourraient jouer un rôle
dans la présentation de l’antigène (Bland
and Warren, 1986). Ce mode d’induction
de la réponse immune serait plus approprié pour un virus se multipliant dans les
cellules épithéliales tel que le virus de la
gastroentérite transmissible (GET) du
porc.
Afin de montrer la possibilité d’une réponse immunitaire au niveau même de la
muqueuse, nous avons identifié, à l’aide
du
streptavidine-biotinesystème
péroxydase et de différents anticorps
dirigés contre les antigènes de différenciation des leucocytes de porc, les composantes de la réponse immunitaire présentes dans la muqueuse intestinale de
porc. Pour cette étude détaillée, nous
avons considéré d’une part l’épithélium et
la lamina propria des villosités et d’autre
part l’épithélium et la lamina propria des
cryptes.
MATÉRIEL
ET
MÉTHODES
Les
niveau de l’intestin ait été
au niveau des plaques de
Peyer (Spalding et al, 1984), on sait que
leur ablation n’empêche pas la réponse
immunitaire locale (Hamilton et al, 1981).
Ceci laisse supposer que cette réponse
munitaires
démontrée
au
Prélèvement de l’intestin et coupes
a été prélevé immédiatement après
l’abattage par exsanguination totale d’une truie
Large White âgée de 6 mois. Le contenu a été
éliminé par lavage rapide à l’eau courante puis
L’iléum
remplacé par du milieu à base de saccharose
(milieu OCT, Miles, Elkhart). L’ensemble a été
congelé par immersion rapide dans l’azote liquide avant d’être transféré dans un congélateur
à -80°C.
Les coupes de 5 pm d’épaisseur chacune
(cryo-microtome TE, SLEE, Londres) ont été séchées 10 min à température ambiante avant
d’être fixées 20 min à -20°C dans de l’acétone.
Chaque coupe a été par la suite enveloppée
dans du papier d’aluminium et conservée à
- 80°C avant d’être traitée.
Complexe
streptavidine-biotine-péroxydase
Les anticorps
e étape de
Tous les anticorps utilisés dans la F
fixation sur les coupes avaient pour espèce
d’origine la souris, soit sous forme de surnageant de culture d’hybridomes (anticorps monoclonaux), soit sous forme d’alloantisérum (anticorps polyclonaux).
Il s’agissait du complexe streptavidine biotine
péroxydase commercialisé par Amersham (RPN
1051, Amersham, Amersham).
Mélange révélateur
Anticorps monoclonaux
mélange était obtenu après filtration (0,45
pm) d’un mélange à 0,5 mg/ml dans du tampon
phosphate (0,15 M) (PBS), de 3-3’ tétrachlorhydrate de diamine benzidine (réf 18865, Serva
Feinbiochemica, Heidelberg) et de 0,078%
d’eau oxygénée, avec ou sans chlorure de cobalt (0,3 mg/ml, Ega-Chemie, Steinheim/Albuch)
(Adams, 1981).).
Ce
Les différents
anticorps utilisés ainsi que
spécificité ont été reportés dans le tableau I.
leur
Anticorps polyclonaux
Il
s’agissait
d’un allo-sérum de souris anti-la
(ÇL
8701, Cedarlane, Hornby) qui reconnaît par réaction croisée des antigènes de classe Il du
CMH du porc (Shinohara et Sachs, 1982).
Technique de coloration
Anticorps secondaires
Fixation des
L’anticorps secondaire était représenté par des
IgG biotinylées de mouton anti-Ig de souris
(RPN 1061, Amersham, Amersham)
Après sortie
réhydratées
sans
anticorps
du congélateur, les coupes ont été
dans 3 bains successifs de PBS
calcium ni magnésium. Les coupes étaient
alors recouvertes par 100 wl d’anticorps primaire (anticorps monoclonal sous forme de surnageant de culture) ou de milieu de culture d’hybridome comme témoin, pendant 60 min à
température ambiante, en chambre humide.
Après 3 lavages de 10 min dans du PBS sans
Ca ni Mg, elles étaient recouvertes par 100 pl
d’IgG biotinylées de mouton anti-Ig de souris
aux dilutions
1/20, 1/40 ou 1/80 en PBScalcium (9 mM), magnésium (5 mM), sérum albumine bovine (SAB) (1 %) durant 60 min à température ambiante. Les coupes ont été de nouveau lavées 3 fois comme ci-dessus.
Déshydratation
et
montage
La déshydratation des coupes a été effectuée
par trempages successifs dans des bains
d’éthanol de concentrations croissantes (un bain
à 70°, un à 90°, deux à 100°, 3 min chacun) puis
dans du toluène (2 bains, 3 min). Les coupes
ont été ensuite montées en baume artificiel (Eu-
kitt, Kindler, Freiburg).
Interprétation
et
expression
des résultats
Révélation de l’activité
péroxydasique
La révélation de la péroxydase endogène a été
effectuée en présence de 100 wl de révélateur
avec du chlorure de cobalt. Les coupes ont été
incubées (20 min, température ambiante) puis
lavées (3 fois, 10 min, PBS sans calcium ni
magnésium). Ensuite, chaque coupe a été recouverte avec 100 (ii de complexe streptavi-
dine-biotine-péroxydase (RPN1051, Amersham,
Amersham) dilué au 1/400 en PBS calciummagnésium, 1% SAB puis incubée (30 min,
température ambiante, chambre humide) et
lavée (3 fois, 10 min, PBS sans calcium ni magnésium).
La révélation de la péroxydase liée à la fixation du complexe a été effectuée par recouvrement de chaque coupe avec 100 pl de révélateur sans chlorure de cobalt puis incubation (20
min, température ambiante) et lavage (3 fois 2
min, eau du robinet).
Intensification de la coloration
Chaque coupe était incubée 5 min dans un bain
d’acide osmique (0,3 %) puis lavée (6 fois, 2
min, eau du robinet).
Contre coloration
Après chaque étape, les contrôles de la coloration ont été effectués à l’oeil nu et au microscope. Après coloration, les observations ont
été faites au grossissement 625, à l’aide d’un
microscope optique (Dialux, Leitz, Wetzlar) en
distinguant 2 zones : l’épithélium et la lamina
propria. Les cellules colorées ont été dénombrées parmi 3 fois 100 cellules épithéliales et
parmi 3 fois 100 champs microscopiques de
2 chacun de la lamina propria. Les ré0,004 mm
sultats sont exprimés en nombre moyen de cellules pour 100 cellules épithéliales ou pour 100
champs microscopiques (± SEM). Le diamètre
moyen de chaque cellule colorée a été évalué à
l’aide d’un micromètre oculaire.
L’activité péroxydasique endogène se révélait
la forme de granules cytoplasmiques colorés en bleu-noir par la diaminobenzidine en présence de chlorure de cobalt. La coloration obtenue après marquage avec les anticorps et
fixation
du
complexe streptavidine-biotinepéroxydase était d’une teinte brune uniforme soit
membranaire pour les lymphocytes et les macrophages, soit cytoplasmique pour les plasmocytes.
sous
RÉSULTATS
Composantes cellulaires
réponse immunitaire
de la
Chaque coupe a été recouverte avec 100 wl
d’hématoxyline de Harris (réactifs RAL, Pointet
Girard, Villeneuve-la-Garenne) pendant 15 s
puis lavée (3 min à l’eau courante). Après incubation de 3 min dans de l’acide acétique (2%) et
lavage (3 min, eau du robinet), chaque coupe a
été recouverte de carbonate de lithium saturé (3
min) et lavée (3 min, eau du robinet).
Non
lymphocytaires
Macrophages
macrophages dépourvus d’activité péroxydasique endogène ont été révélés par
Les
la
présence d’un liseré brun cytoplasmique
l’anticorps monoclonal 74.22.15.
Dans l’épithélium, ces macrophages ne
avec
se
retrouvaient
qu’au niveau des cryptes.
Dans le tissu conjonctif des villosités,
les macrophages d’un diamètre de 7 à 155
pm étaient 7 fois moins fréquents que
dans le tissu conjonctif des cryptes (tableau 11).
Lymphocytes
Dans l’épithélium, les lymphocytes se distribuaient entre les cellules épithéliales et
étaient plus nombreux dans l’épithélium
des villosités que dans celui des cryptes.
D’un diamètre de 7 à 10 0 pm, ils révélaient
le phénotype T et étaient dans l’épithélium
des villosités, en majorité constitués par
des lymphocytes T cytotoxiques (T8).
Dans l’épithélium des cryptes des lymphocytes T4 et T8 se distribuaient avec une
fréquence identique (tableau 11).
Dans le tissu conjonctif de la lamina
propria, on a observé la présence de lymphocytes T et de lymphocytes de la lignée
B. Les lymphocytes T avaient un diamètre
de 6 à 10 0 pm comme ceux de l’épithélium.
Le nombre de lymphocytes auxiliaires était
en moyenne supérieur à celui des lymphocytes cytotoxiques que ce soit dans les
villosités ou dans les cryptes (tableau 11).
La somme des lymphocytes T auxiliaires
et suppresseurs redonne le nombre de
lymphocytes T, montrant ainsi que tous les
lymphocytes T ont bien été marqués.
Les cellules de la lignée B présentaient
marquage soit membranaire, soit cytoplasmique. Elles étaient présentes uniquement dans la lamina propria, de préférence
sous les cryptes.
un
Les cellules à immunoglobulines membranaires (14-18 8 pm) représentaient 55%
des cellules à immunoglobulines. Le reste
était constitué par des cellules à immunoglobulines cytoplasmiques d’un diamètre
élevé (18-23 wm). Les cellules contenant des immunoglobulines étaient pres-
plus
que exclusivement d’isotype IgA, que ce
soit dans les villosités ou les cryptes (tableau 11).
Là encore, la
somme
des différents iso-
types redonne bien le nombre de cellules
contenant des immuglobulines, indiquant
que toutes les cellules ont été marquées.
Cellules
épithéliales
antigènes de classe 1 du CMH étaient
présents sur la bordure en brosse des cellules épithéliales, que ce soit au niveau
des villosités ou des cryptes. En revanche,
les antigènes de classe Il du CMH étaient
Les
localisés uniquement sur la bordure en
brosse des cellules épithéliales des villosités.
Composantes humorales
Composant secrétoire
Ce
composant n’a été trouvé que sur la
apicale des cellules épithéliales du
fond des cryptes.
zone
Immuglobulines A de l’épithélium
La présence de cet isotype se signalait sur
la bordure en brosse et sur la membrane
basolatérale des cellules épithéliales, par
un liseré brunâtre plus intense au niveau
des cryptes que des villosités.
DISCUSSION
Les techniques immunohistochimiques utilisant la péroxydase sont souvent utilisées
pour la caractérisation antigénique des
cellules dans les tissus. Ces techniques
permettent d’utiliser
un système d’amplifisignal. D’autre part, et contrairement aux techniques utilisant la fluorescence, le signal obtenu est stable dans le
temps, ce qui permet d’effectuer une observation plus détaillée des coupes de
tissu. Cependant dans les tissus infiltrés
par des cellules à péroxydase endogène
comme les granulocytes et les monocytes,
leur coloration gêne l’observation des cellules spécifiquement marquées par un anti-
cation du
corps. Pour faciliter cette observation, la
péroxydase endogène peut être inhibée.
Cependant, les techniques d’inhibition de
la péroxydase endogène risquent d’empêcher tout marquage spécifique ultérieur
(Malorny et al, 1988). Pour éliminer ce risque nous avons mis au point une technique au cours de laquelle les cellules à péroxydase endogène ont été différenciées
des cellules marquées par la révélation de
la péroxydase endogène (avec chlorure de
cobalt) avant la fixation du système révéla-
teur, tout
en préservant ce marquage.
Cette technique de coloration nous a
permis de différencier très facilement les
cellules reconnues par les anticorps des
cellules à péroxydase endogène, lesquelles sont présentes en grand nombre
dans la lamina propria.
Nos résultats montrent que, chez un
porc sain, les cellules infiltrant la muqueuse intestinale ne sont pas distribuées
au hasard. Certaines cellules sont situées
plutôt dans l’épithélium des villosités (lymphocytes T8) alors que d’autres se situent
dans la lamina propria des cryptes (lymphocytes T4, cellules B, macrophages).
Le nombre de lymphocytes intraépithéliaux que nous avons observé est en accord
avec les observations de Chu chez le porc
(Chu et al, 1979) qui trouve 27,3 lymphocytes pour 100 cellules épithéliales. Ces
lymphocytes intraépithéliaux, déjà observés
chez l’homme (Fergusson, 1977 ; CerfBensussan et_a!, 1.!983 ; Dofjbins, 1986), la
souris (Glaister, 1973) et le porc (Vega-
Lopez et al, 1993), étaient supérieurs en
nombre à ceux observés dans l’épithélium
des cryptes. Cette différence pourrait être
due à un rôle particulier que pourraient
jouer ces lymphocytes dans les villosités.
Parmi les cellules B, la forte proportion
de cellules à IgA a déjà été observée chez
l’homme (Dobbins, 1986), la souris (Mc
Dermott et al, 1986) et le porc (Allen and
Porter, 1977 ; Butler et al, 1981).
Les lymphocytes intraépithéliaux sont
des lymphocytes T. L’épithélium des villosités est enrichi en lymphocytes T8 comme
chez l’homme (Janossy et al, 1980 ; Selby
et al, 1981, 1983 ; Cerf-Bensussan et al,
1983), la souris (Mc Dermott et al, 1986 ;
Ernst et al, 1986), le rat (Lyscom et al,
1982) et le porc (Bianchi et al, 1992 ;
La lamina propria des cryptes est plus
riche en cellules B que celle des villosités,
ce qui pourrait être en relation avec la présence d’IgA et de composant sécrétoire au
niveau des cellules épithéliales des
cryptes dont la présence a déjà été démontrée chez l’homme (Scott et al, 1981
).
Vega-Lopez et al, 1993).
La différence de répartition des lymphocytes T4 et T8 intraépithéliaux dans les
villosités et les cryptes correspond à une
augmentation des lymphocytes T8 dans
l’épithélium des villosités, augmentation
qui pourrait être due soit à une prolifération
des lymphocytes T8 sous l’effet de stimulations antigéniques à ce niveau de l’épithélium, soit à une voie de passage particulière à partir du tissu conjonctif sousjacent.
Les lymphocytes T sont également présents dans l’ensemble de la lamina propria
comme chez l’homme (Janossy et al,
1980 ; Selby et al, 1981 ; Cerf-Bensussan
et al, 1983), le rat (Lyscom et al, 1982) et
le porc (Vega-Lopez et al, 1993). Ces lymphocytes T sont enrichis en lymphocytes
T4 de même que chez l’homme (CerfBensussan et al, 1983) et le porc (VegaLopez et al, 1993). La présence des cellules de type T4 à ce niveau suggère une
possibilité de reconnaissance locale de
l’antigène. Cette reconnaissance nécessite
la présence de cellules présentatrices
d’antigène. Chez le porc, la présence dans
l’intestin de telles cellules présentant des
antigènes de classe Il du CMH a déjà été
démontrée (Vega-Lopez et al, 1993) et
notre étude montre que des macrophages
sont présents dans la lamina propria. Leur
gènes d’histocompatibilité de classeI et de
classe Il au niveau de l’épithélium est identique à celle observée chez l’homme (Scott
et al, 1980 ; Gorvel et al, 1984), le cobaye
(Wiman et al, 1978) et le rat (Mayrhofer et
nombre semble être
des cellules B.
en
relation
avec
celui
D’autre
part, la localisation des anti-
al, 1983 ; Bland and Warren, 1986).
En conclusion, nos résultats
sont
conformes à ceux déjà observés dans
d’autres espèces par différents auteurs utilisant des techniques différentes.
Cependant nous démontrons que l’épithélium des villosités se caractérise par la
présence quasi exclusive de lymphocytes
T8 alors que, dans celui des cryptes, les
lymphocytes T8 et T4 se distribuent avec
la même fréquence. D’autre part nous démontrons que la lamina propria des
cryptes, bien que présentant la même densité en lymphocytes T4 et T8 que la lamina
propria des villosités, est 12 fois plus riche
en cellules B et présente 8 fois plus de macrophages.
D’autre part les résultats
de notre étude,
établis sur coupe d’iléum, sont proches de
ceux décrits pour des suspensions de lymphocytes isolés, soit de l’épithélium, soit de
la lamina propria du duodénum (Salmon,
1987 ; Salmon
et
al, 1990).
Toutes les composantes de la réponse
immunitaire sont donc présentes dans la
muqueuse intestinale. Cependant, étant
donné la localisation particulière des cellules T8, il apparaît nécessaire de procé-
der à des études fonctionnelles de ces cellules. D’autre part, il serait intéressant de
refaire ce même travail sur des animaux
infectés par le virus de la GET du porc afin
d’observer une éventuelle modification
dans la répartition des différentes populations cellulaires de l’ileum, lieu des lésions
dues à ce virus (Savey et Laude, 1979).
La GET du porc représente donc un modèle intéressant pour l’étude de la réponse
immunitaire au niveau de la muqueuse intestinale en dehors des plaques de Peyer,
plus particulièrement au niveau de l’épithélium.
REMERCIEMENTS
Les auteurs tiennent à remercier C Le louedec
pour l’aide à la rédaction et M Dixneuf pour la
frappe du manuscrit.
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