Localisation immunohistochimique dans l`intestin de porc

Article
original
Localisation
immunohistochimique
dans
l’intestin
de
porc
des
composantes
cellulaires et humorales
de la
réponse
immunitaire
M
Olivier
P
Berthon
H
Salmon
1
Équipe
de
«Génétique
et
Immunité»;
2
Équipe
de
«Lymphocytes
et Immunité des
muqueuses»,
INRA,
laboratoire
de
pathologie
infectieuse et
immunologie,
centre de
Tours,
37380
Nouzilly,
France
(Reçu
le 5 mai
1993;
accepté
le
2
décembre
1993)
Résumé ―
L’analyse
des différentes
composantes
du
système
immunitaire,
cellulaires et humo-
rales,
ainsi
que
leurs
localisations,
ont été effectuées sur
coupes
d’intestin de
porc,
en
utilisant
des
anticorps spécifiques
des
sous-populations leucocytaires porcines.
La fixation de ces
anticorps
a été
révélée à l’aide
d’anticorps biotinylés anti-immunoglobulines
de souris et d’un
complexe
révélateur
streptavidine-biotine-péroxydase.
Les résultats montrent une distribution
spécifique
des
compo-
santes immunitaires dans les
compartiments, épithélial
d’une
part
et
lamina
propria
d’autre
part.
Dans
l’épithélium,
on assiste à une
prédominance
de
lymphocytes
T
de
phénotype cytotoxique (T8),
alors
que
le tissu
conjonctif
de la
lamina
propria
est
pourvu pour
une moitié de
lymphocytes
T,
avec
une
légère prédominance
des T
auxiliaires
(T4)
sur les
T
cytotoxiques,
et
pour
l’autre moitié de
plas-
mocytes
dont
la
plupart
contiennent des
IgA.
Les
macrophages
sont
présents
seulement dans la la-
mina
propria.
Les cellules
épithéliales
des villosités et des
cryptes expriment
les
antigènes
du
CMH,
de
classe
I sur la bordure en
brosse,
alors
que
ceux de classe
Il
sont
présents
uniquement
sur les
cellules
épithéliales
des villosités.
En
revanche,
de même
que pour
les
IgA,
le
composant
secrétoire
se
localise
sur les cellules
épithéliales
du fond des
cryptes.
Cette
répartition suggère
la
possibilité
d’une
réponse
immunitaire au
niveau même de la
muqueuse
intestinale.
porc 1 lymphocyte
I macrophage
I intestin
1
immunoglobulines
/ entérocytes
Summary ―
lmmunohistochemical localization of the humoral and the
cellular
components
of the immune
response
in
swine
gut.
By immunohistochemistry, lymphocyte
subsets of the
swine
gut
were localized either
in
the
epithelium
or in the lamina
propria.
In
addition,
the distributions
of class
I
and class
II
antigens
were also
characterized,
using
the
streptavidin-biotin-peroxidase
complex
as the
revelator;
the
endogenous peroxidase activity
was
distinguished
from the
specific by
cobalt chloride. The results show a
compartmentalization
in the distribution of
lymphocytes:
in the
epithelium,
all the cells were
T
lymphocytes,
the
majority
of the CD8
phenotype;
in
contrast,
in the la-
mina
propria,
T and B cells were
represented
in similar
proportions:
T
cells were constituted of both
CD4 and CD8 cells
(with
slightly
more CD4 than CD8
cells),
while
majority
of B cells harboured the
IgA isotype.
Class
I
MHC was
present
on
epithelium
cells of both the villi and
crypts.
In
contrast
MHC class
//
was
only present
on
epithelial
cells of the villi. Both SC and
IgA
were
localized
in the
epithelium
cells of the
crypt.
Thus,
this
compartmentalization
suggests
the
possibility
of an immune
response
in
the
gut.
pig
/
lymphocyte
/
macrophage
/ intestine /
immunoglobulins
/
enterocyte
*
Corres
p
ondance
et
tirés
à
p
art

INTRODUCTION
Quelle
que
soit
l’espèce
animale,
la mu-
queuse
de
l’intestin
grêle
des Mammifères
est infiltrée
par
de nombreuses
cellules du
système
immunitaire,
en
particulier
des
lymphocytes
et des
plasmocytes.
Les
lymphocytes
T
sont
présents
dans
l’épithélium
et dans la lamina
propria.
Dans
l’épithélium,
la
majorité
des
lympho-
cytes
T sont de
phénotype
T8 chez
l’homme
(Janossy
et al, 1980 ;
Selby
et al,
1983 ;
Cerf-Bensussan
et
al,
1983),
la
souris
(Ernst
et
al,
1986)
et le
porc
(Bian-
chi et
al, 1992 ;
Vega-Lopez
et
al,
1993).
Dans
la lamina
propria,
les
lymphocytes
T4
sont
plus
nombreux
que
les
lympho-
cytes
T8
chez
l’homme
(Selby
et
al, 1983 ;
Cerf-Bensussan
et
al,
1983)
et
le
porc
(Vega-Lopez
et
al,
1993).
Les
lymphocytes
B et les
plasmocytes
sont en
majorité
de
phénotype immunoglo-
buline
A
(IgA)
dans la lamina
propria
de
l’intestin de l’homme
(Dobbins,
1986),
de
la souris
(Mc
Dermott et
al,
1986)
et du
porc
(Brown
and
Bourne,
1976 ;
Allen and
Porter, 1977 ;
Butler
et al,
1981 ).
Les
antigènes
du
complexe
majeur
d’histocompatibilité
(CMH)
sont
présents
sur les cellules de
l’épithélium
intestinal.
Les
antigènes
de classe 1 sont
présents
sur l’ensemble
des cellules
l’épithéliales
(Mayrhofer
et al, 1983;
Gorvel
et al,
1984).
Les
antigènes
de classe
Il sont
pré-
sents
uniquement
sur
les cellules de
l’épi-
thélium
des villosités
(Wiman
et
al, 1978 ;
Scott et
al, 1980 ;
Mayrhofer
et
al,
1983 ;
Gorvel
et al,
1984).
Bien
que
l’induction
des
réponses
im-
munitaires
au niveau de l’intestin ait été
démontrée
au niveau des
plaques
de
Peyer (Spalding
et
al,
1984),
on sait
que
leur ablation
n’empêche pas
la
réponse
immunitaire
locale
(Hamilton
et al,
1981 ).
Ceci laisse
supposer que
cette
réponse
pourrait
s’initier ailleurs
qu’au
niveau des
plaques
de
Peyer, peut-être
même
au ni-
veau
de
l’épithélium
intestinal
où les cel-
lules
épithéliales
pourraient
jouer
un rôle
dans la
présentation
de
l’antigène
(Bland
and
Warren,
1986).
Ce mode
d’induction
de la
réponse
immune serait
plus
appro-
prié pour
un virus se
multipliant
dans les
cellules
épithéliales
tel
que
le virus de
la
gastroentérite
transmissible
(GET)
du
porc.
Afin de montrer la
possibilité
d’une ré-
ponse
immunitaire au
niveau même de
la
muqueuse,
nous avons
identifié,
à l’aide
du
système
streptavidine-biotine-
péroxydase
et de différents
anticorps
dirigés
contre
les
antigènes
de
différencia-
tion des
leucocytes
de
porc,
les
compo-
santes de
la
réponse
immunitaire
pré-
sentes dans
la
muqueuse
intestinale
de
porc.
Pour cette
étude
détaillée,
nous
avons considéré
d’une
part
l’épithélium
et
la lamina
propria
des villosités
et d’autre
part l’épithélium
et la lamina
propria
des
cryptes.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Prélèvement
de l’intestin et
coupes
L’iléum a été
prélevé
immédiatement
après
l’abattage par exsanguination
totale d’une
truie
Large
White
âgée
de 6 mois. Le contenu a
été
éliminé
par lavage rapide
à l’eau courante
puis
remplacé par
du milieu à base de saccharose
(milieu
OCT, Miles,
Elkhart).
L’ensemble a été
congelé par
immersion
rapide
dans l’azote
li-
quide
avant d’être transféré
dans un
congélateur
à -80°C.
Les
coupes
de 5
pm d’épaisseur
chacune
(cryo-microtome
TE, SLEE,
Londres)
ont été sé-
chées 10
min à
température
ambiante avant
d’être fixées 20
min à -20°C dans de l’acétone.
Chaque
coupe
a été
par
la
suite
enveloppée
dans du
papier
d’aluminium
et conservée à
- 80°C
avant d’être traitée.

Les anticorps
Tous les
anticorps
utilisés dans la
Fe
étape
de
fixation sur les
coupes
avaient
pour espèce
d’origine
la
souris,
soit sous
forme de surna-
geant
de culture
d’hybridomes (anticorps
mono-
clonaux),
soit sous forme d’alloantisérum
(anti-
corps polyclonaux).
Anticorps
monoclonaux
Les
différents
anticorps
utilisés ainsi
que
leur
spécificité
ont été
reportés
dans
le tableau I.
Anticorps polyclonaux
Il
s’agissait
d’un allo-sérum
de souris anti-la
(ÇL
8701, Cedarlane,
Hornby) qui
reconnaît
par
ré-
action croisée des
antigènes
de
classe
Il du
CMH du
porc (Shinohara
et
Sachs,
1982).
Anticorps
secondaires
L’anticorps
secondaire était
représenté par
des
IgG biotinylées
de mouton
anti-Ig
de souris
(RPN
1061, Amersham,
Amersham)
Complexe
streptavidine-biotine-péroxydase
Il
s’agissait
du
complexe streptavidine
biotine
péroxydase
commercialisé
par
Amersham
(RPN
1051,
Amersham,
Amersham).
Mélange
révélateur
Ce
mélange
était obtenu
après
filtration
(0,45
pm)
d’un
mélange
à
0,5
mg/ml
dans du
tampon
phosphate
(0,15 M) (PBS),
de 3-3’
tétrachlorhy-
drate
de diamine benzidine
(réf
18865,
Serva
Feinbiochemica,
Heidelberg)
et de
0,078%
d’eau
oxygénée,
avec ou sans chlorure de
co-
balt
(0,3 mg/ml, Ega-Chemie,
Steinheim/Albuch)
(Adams, 1981). ).
Technique
de coloration
Fixation des
anticorps
Après
sortie du
congélateur,
les
coupes
ont été
réhydratées
dans 3 bains successifs de
PBS
sans calcium
ni
magnésium.
Les
coupes
étaient

alors
recouvertes
par
100
wl d’anticorps pri-
maire
(anticorps
monoclonal sous forme de sur-
nageant
de
culture)
ou de milieu de culture
d’hy-
bridome comme
témoin,
pendant
60 min
à
température
ambiante,
en chambre humide.
Après
3
lavages
de 10 min dans du PBS sans
Ca ni
Mg,
elles étaient recouvertes
par
100
pl
d’IgG biotinylées
de mouton
anti-Ig
de souris
aux
dilutions
1/20,
1/40 ou 1/80 en PBS-
calcium
(9 mM),
magnésium (5 mM),
sérum al-
bumine bovine
(SAB) (1 %)
durant 60
min
à tem-
pérature
ambiante. Les
coupes
ont été de nou-
veau lavées 3 fois comme ci-dessus.
Révélation de l’activité
péroxydasique
La révélation de la
péroxydase
endogène
a été
effectuée en
présence
de 100
wl
de révélateur
avec du chlorure de cobalt. Les
coupes
ont été
incubées
(20
min,
température ambiante)
puis
lavées
(3
fois,
10
min,
PBS sans calcium
ni
magnésium).
Ensuite,
chaque coupe
a été re-
couverte avec 100
(ii
de
complexe streptavi-
dine-biotine-péroxydase
(RPN1051,
Amersham,
Amersham)
dilué au 1/400 en PBS calcium-
magnésium,
1%
SAB
puis
incubée
(30
min,
température
ambiante,
chambre
humide)
et
lavée
(3
fois,
10
min,
PBS sans calcium ni ma-
gnésium).
La révélation de la
péroxydase
liée à la fixa-
tion du
complexe
a été effectuée
par
recouvre-
ment de
chaque coupe
avec 100
pl
de révéla-
teur sans chlorure de cobalt
puis
incubation
(20
min,
température
ambiante)
et
lavage (3
fois
2
min,
eau du
robinet).
Intensification de la coloration
Chaque coupe
était incubée 5 min dans un bain
d’acide
osmique (0,3 %) puis
lavée
(6
fois,
2
min,
eau du
robinet).
Contre coloration
Chaque coupe
a été recouverte avec 100
wl
d’hématoxyline
de Harris
(réactifs
RAL,
Pointet
Girard,
Villeneuve-la-Garenne)
pendant
15 s
puis
lavée
(3
min
à l’eau
courante).
Après
incu-
bation
de 3 min dans de l’acide
acétique
(2%)
et
lavage (3
min,
eau du
robinet), chaque coupe
a
été recouverte de carbonate de lithium saturé
(3
min)
et
lavée
(3
min,
eau
du
robinet).
Déshydratation
et
montage
La
déshydratation
des
coupes
a été effectuée
par trempages
successifs dans des bains
d’éthanol de concentrations croissantes
(un
bain
à
70°,
un à
90°,
deux
à
100°,
3 min
chacun)
puis
dans du toluène
(2
bains,
3
min).
Les
coupes
ont été ensuite
montées en baume artificiel
(Eu-
kitt, Kindler,
Freiburg).
Interprétation
et
expression
des résultats
Après chaque étape,
les contrôles de la colora-
tion ont été effectués à l’oeil
nu et au micro-
scope. Après
coloration,
les observations ont
été faites au
grossissement
625,
à l’aide d’un
microscope optique
(Dialux,
Leitz,
Wetzlar)
en
distinguant
2
zones :
l’épithélium
et
la lamina
propria.
Les cellules colorées ont été dénom-
brées
parmi
3 fois 100 cellules
épithéliales
et
parmi
3 fois 100
champs
microscopiques
de
0,004
mm 2 chacun de la lamina
propria.
Les ré-
sultats sont
exprimés
en nombre
moyen
de cel-
lules
pour
100 cellules
épithéliales
ou
pour
100
champs microscopiques (± SEM).
Le diamètre
moyen
de
chaque
cellule colorée a été évalué à
l’aide d’un micromètre oculaire.
L’activité
péroxydasique endogène
se révélait
sous
la forme de
granules cytoplasmiques
colo-
rés en bleu-noir
par
la diaminobenzidine en
pré-
sence de chlorure de cobalt. La coloration obte-
nue
après marquage
avec les
anticorps
et
fixation du
complexe
streptavidine-biotine-
péroxydase
était d’une teinte brune uniforme soit
membranaire
pour
les
lymphocytes
et les macro-
phages,
soit
cytoplasmique
pour
les
plasmocytes.
RÉSULTATS
Composantes
cellulaires
de la
réponse
immunitaire
Non
lymphocytaires
Macrophages
Les
macrophages dépourvus
d’activité
pé-
roxydasique endogène
ont été révélés
par

la
présence
d’un
liseré
brun
cytoplasmique
avec
l’anticorps
monoclonal 74.22.15.
Dans
l’épithélium,
ces
macrophages
ne
se
retrouvaient
qu’au
niveau des
cryptes.
Dans le tissu
conjonctif
des
villosités,
les
macrophages
d’un diamètre de
7
à 15 5
pm
étaient
7
fois moins
fréquents que
dans le tissu
conjonctif
des
cryptes
(ta-
bleau
11).
Lymphocytes
Dans
l’épithélium,
les
lymphocytes
se
dis-
tribuaient entre les cellules
épithéliales
et
étaient
plus
nombreux dans
l’épithélium
des villosités
que
dans celui des
cryptes.
D’un diamètre de
7
à 10
0 pm,
ils révélaient
le
phénotype
T
et étaient dans
l’épithélium
des
villosités,
en
majorité
constitués
par
des
lymphocytes
T
cytotoxiques
(T8).
Dans
l’épithélium
des
cryptes
des
lympho-
cytes
T4 et T8 se distribuaient
avec
une
fréquence identique
(tableau 11).
Dans le tissu
conjonctif
de la lamina
propria,
on a observé la
présence
de
lym-
phocytes
T et de
lymphocytes
de la
lignée
B.
Les
lymphocytes
T
avaient un diamètre
de 6 à 10
0 pm
comme
ceux de
l’épithélium.
Le nombre de
lymphocytes
auxiliaires était
en
moyenne
supérieur
à celui des
lympho-
cytes
cytotoxiques
que
ce soit dans les
villosités ou dans les
cryptes
(tableau
11).
La somme des
lymphocytes
T
auxiliaires
et
suppresseurs
redonne le nombre de
lymphocytes
T,
montrant ainsi
que
tous les
lymphocytes
T
ont bien été
marqués.
Les cellules de la
lignée
B
présentaient
un
marquage
soit
membranaire,
soit
cyto-
plasmique.
Elles étaient
présentes unique-
ment dans la lamina
propria,
de
préférence
sous les
cryptes.
Les cellules à
immunoglobulines
mem-
branaires
(14-18
8 pm) représentaient
55%
des cellules à
immunoglobulines.
Le reste
était constitué
par
des cellules à immuno-
globulines
cytoplasmiques
d’un diamètre