Immunomonitoring Cyril Fauriat Laboratoire d'Immunologie des Tumeurs Centre INSERM de Recherche en Cancérologie de Marseille, IBiSA Cancer Immunomonitoring platform, Institut Paoli Calmettes, [email protected] Plan Introduction Populations du système immunitaire Médiateurs solubles Pourquoi et quand faut-il monitorer les réponses immunes? Techniques Médiateurs solubles Médiateurs cellulaires Exemples Suivi des cellules T αβ antigène-specifiques Cellules γδ Cellules NK dans la Leucémie Myéloïde Aigüe Cellules NK dans la transplantation de cellules souches hématopoïétiques Les populations d’intérêt du système immunitaire Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules T αβ Immunité adaptative : réarrangements géniques spécificité d’antigène Capacités cytotoxiques (T CD8) Capacités régulatrices (T CD4, Tregs) Fonctions: Cytotoxicité (Granzyme/Perforine, FASL) Cytokines (IFNγ, TNFα, IL-2, IL-10, IL-17, …) Chimiokines (MIP1α/β, Rantes, IL-8, …) Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules T γδ Immunité Innée/adaptative : réarrangements géniques moindres (comparé aux αβ)spécificité d’antigène: Phosphoantigènes Fonctions: Cytotoxicité (Granzyme/Perforine, FASL) Cytokines (IFNγ, TNFα, IL-2, IL-10, …) Chimiokines (MIP1α/β, Rantes, IL-8, …) Fréquence élevée dans la muqueuse intestinale (lymphocytes intra-épithéliaux (IEL). Différents types de γδ avec des localisations tissulaires différentes: Vγ5Vδ1 => peau Vγ6Vδ1 => muqueuse Vγ9Vδ4 => intestin Vγ4Vδ6 => organes lymphoïdes et poumons Vγγ9Vδ δ2 => sang périphérique Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules Natural Killer (NK) Immunité Innée: pas de réarrangements géniquespas de spécificité d’antigène Nombreux récepteurs participant à l’activation cellulaire ou au contrôle de la réponse NK Fonctions: Cytotoxicité (Granzyme/Perforine, FASL) Cytokines (IFNγ, TNFα, IL-2, IL-10, GM-CSF, …) Chimiokines (MIP1α/β, Rantes, IL-8, …) Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules Natural Killer (NK) CD56bright CD16± CD56 CD56dim CD16+ CD56neg CD16+ CD16 Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules Natural Killer (NK) D’après Vivier et al., Science, 2011 Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules Natural Killer (NK) Tolérance au soi Surveillance immunitaire Lyse et production de cytokines Pas de lyse/ Pas de production de cytokines Les cellules NK reconnaissent des signaux de danger : -Perte ou diminution de l’expression du CMH I -Présence de ligands activateurs Introduction Populations immunes Techniques Exemples Les cellules Natural Killer (NK) CIBLE Un des mécanismes d’action des Ac monoclonaux (Congy-Jolivet et al., Crit Rev Oncol Hematol, 2007) Antigène Exemple: Anti-CD20 (Rituximab) Anticorps CD16 ++ NK Introduction Populations immunes Techniques Exemples Cytokines Introduction Médiateurs solubles Techniques Exemples Cytokines Cytokine Source Rôle Immuniténaturelle: IFNγ,TNFα, Phagocytesmononucléaires, -protectioncontre IL-1,IL-6, LT,fibroblastes,cellules infectionsvirales Chimiokines endothéliales,plaquettes -Inflammation Activation lymphocytaire, LT,mastocystes,phagocytes IL-2,IL-4,TGFβ croissanceet mononucléaires différentiation lymphocytaire IFNγ, Lymphotoxin, LT,NK,macrophages Inflammation IL-10,IL-5, IL-12,MIF Cellulesstromales,LT, IL-3,GM-CSF, phagocytesmononucléaires, M-CSF,IL-7, Hématopoïèse cellulesendothéliales, IL-15 fibroblastes IFNγ,TNFβ, Réponseimmune LThelper(CD4)TH1 cellulaire IL-2 IL-4,IL-5, Réponseimmune IL-6,IL-9,IL-10,LThelper(CD4)TH2 humorale, IL-13 Immunitémucosale Introduction Médiateurs solubles Techniques Exemples Chimiokines Introduction Médiateurs solubles Techniques Exemples Immunomonitoring Quand? Essais cliniques (drogues, immunothérapies, transplantation, …) Suivi de pathologies (diagnostique, résistances, rechutes) Pourquoi? Impact des drogues sur le système immunitaire Impact des thérapies par transplantation Impact des essais d’immunothérapie Intérêt? Améliorer les thérapies Déterminer l’efficacité des traitements Augmenter nos connaissances Introduction Pourquoi faut-il monitorer? Techniques Exemples Techniques d’immunomonitoring 1- Analyse des facteurs solubles sériques (cytokines et chimiokines) - ELISA - Membranes RayBio - ELISPOT - LUMINEX - Cytométrie en flux - CBA 2- Analyse des effecteurs immuns - Cytometrie en flux - Test fonctionnels Introduction Techniques Exemples ELISA Permet de mesurer la concentration d’une molécule (cytokine ou autre) dans une solution (sérum, surnageant de culture cellulaire) 1- plaque cotée avec un Ac de capture 2- incubation de la solution 3- incubation avec un Ac de détection biotinylé 4- incubation avec de la streptavidin-HRP 5- incubation avec le substrat de la HRP 6- analyse de l’intensité de colorisation (substrat) Les + - très sensible (dosage quantitatif précis) - test simple Les – - consommateur de volume - 1 seule molécule par test Introduction Techniques Médiateurs solubles Exemples Membrane RayBio Permet de mesurer la présence de plusieurs molécules (cytokines ou autres) dans une solution (sérum, surnageant de culture cellulaire) 1- plaque cotée avec plusieurs Ac de capture 2- incubation de la solution 3- incubation avec plusieurs Ac de détection biotinylés 4- incubation avec de la streptavidin-HRP 5- incubation avec le substrat de la HRP 6- analyse de l’intensité de colorisation (substrat) Les + - Simplicité d’utilisation - Intéressant pour screener un large spectre de molécules (jusqu’à 60 molécules/mbne) Introduction Techniques Médiateurs solubles Les – - peu sensible - peu quantitatif Exemples ELISPOT Permet de mesurer la production d’une molécule par les cellules d’intérêt (cytokine ou autre) 1- plaque cotée avec un Ac de capture 2- incubation des cellules triées ou non 3- incubation avec un Ac de détection biotinylé 4- incubation avec de la streptavidin-HRP 5- incubation avec le substrat de la HRP 6- analyse de l’intensité de colorisation et du nombre de spots Les + - très sensible (dosage quantitatif) - test simple Les – - consommateur de cellules - 1 seule molécule par test (max 3) - appareillage spécifique et couteux Introduction Techniques Médiateurs solubles Exemples LUMINEX Permet de mesurer la concentration de plusieurs molécules (cytokines ou autres) dans une solution (sérum, surnageant de culture cellulaire) Molecule Beads Capture Ac Détection Ac 1- Billes cotée avec un Ac de capture 2- incubation de la solution 3- incubation avec un Ac de détection biotinylé 4- incubation avec de la streptavidin-PE 5- analyse des billes Biotine Streptavidine-PE Introduction Substrat Techniques Médiateurs solubles Exemples LUMINEX Permet de mesurer la concentration de plusieurs molécules (cytokines ou autres) dans une solution (sérum, surnageant de culture cellulaire) 1- Billes cotée avec un Ac de capture 2- incubation de la solution 3- incubation avec un Ac de détection biotinylé 4- incubation avec de la streptavidin-HRP 5- incubation avec le substrat de la HRP 6- analyse des billes Les + - sensible (dosage quantitatif) - test simple - faible consommation de volume Les – -moins sensible que l’ELISA Introduction Techniques Médiateurs solubles Exemples Cytométrie en flux Permettant d’analyser des billes ou cellules marquées par des anticorps Possibilité de multimarquages Possibilité de tri Analyse de plusieurs populations Introduction Techniques Médiateurs solubles Exemples Cytokine Bead Array (CBA) Permet de mesurer la concentration de plusieurs molécules (cytokines ou autres) dans une solution (sérum, surnageant de culture cellulaire) 1- billes cotées avec un Ac de capture 2- incubation de la solution 3- incubation avec un Ac de détection (PE) 4- analyse de l’intensité des billes par facs Introduction Techniques Médiateurs solubles Exemples Cytokine Bead Array (CBA) Permet de mesurer la concentration de plusieurs molécules (cytokines ou autres) dans une solution (sérum, surnageant de culture cellulaire) Les + - dosage quantitatif - faible consommation de volume Les – - peu sensible - limité à 12 cytokines - test nécessitant de connaître le FACS Introduction Techniques Médiateurs solubles Exemples Techniques d’immunomonitoring 1- Analyse des facteurs solubles sériques (cytokines et chimiokines) - ELISA - Membranes RayBio - ELISPOT - LUMINEX - Cytométrie en flux - CBA 2- Analyse des effecteurs immuns - Cytometrie en flux - Test fonctionnels Introduction Techniques Exemples Cytométrie en flux SSC Ce etechniqueconsisteàfairedéfilertrès rapidementdescellulesensuspension monocellulairedevantunfaisceaulaser. Pourchaquecellule,sontmesuréestrès précisément: °lalumièrediffusée,recueillie dans2direc onsdifférentes(l’ unepeut êtrecorréléeaveclatailleetlaseconde aveclaréfringenceetlagranulositédela cellule). °lafluorescenceémiseàdiverses longueursd’ ondes(de3à18signauxde fluorescenceanalyséssimultanément suivantlesappareils) Fenêtre centrée sur les lymphocytes déterminés par leur taille (SSC) et leur structure (FSC) FSC CD20 PerCP Barres de statistiques qui déterminent les cadrans supérieurs gauche et droit (UL et UR) et inférieurs gauche et droit (LL et LR) CD3 FITC Statistiques indiquant le % de cellules dans chaque cadran par rapport à la population totale Introduction >Analysedescellulesselonplusieursparamètres Techniques Immunité cellulaire Exemples Lymphocytes Tαβ spécifiques d’antigènes La reconnaissance TCR se fait sur un complexe HLA-peptide L’utilisation de tétramères spécifiques permet de cibler les T spécifiques d’un antigène donné Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Lymphocytes Tαβ spécifiques d’antigènes PR1 est un peptide provenant de la proteinase 3 surexprimée dans la LMC Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse multi-paramétrique des fonctions effectrices Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des fonctions cytotoxiques 1- Mort des cellules cibles après interaction avec des Lymphocytes T ou NK - Chrome 51 - Cytométrie en flux: marqueurs de mort cellulaire - Activité du Granzyme B dans les cellules cibles 2- Dégranulation des vésicules cytotoxiques par les Ltαβ ou LTγδ ou NK - Test CD107 Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des fonctions cytotoxiques 1- Mort des cellules cibles après interactions avec des Lymphocytes T ou NK - Chrome 51 51Cr NK Cellule cible Co-culture cellules cibles et effecteurs pendant 4h puis mesure du 51Cr libéré par les cellules cibles Les – - technique longue - marquage des cibles aléatoire Les + - très sensible Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des fonctions cytotoxiques 1- Mort des cellules cibles après interactions avec des Lymphocytes T ou NK - Cytométrie en flux: marqueurs de mort cellulaire Marquage des cellules cibles avec un composé fluorescent qui pénètre dans les cellules mortes Cellules vivantes Cellules mortes Les + - Simplicité d’utilisation - multi-marquage Les – - pas toujours très discriminant Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des fonctions cytotoxiques 1- Mort des cellules cibles après interactions avec des Lymphocytes T ou NK - Activité du Granzyme B dans les cellules cibles 1- Marquage des cibles avec le réactif 2- Incubation avec effecteurs 3- Analyse par cytométrie en flux Les + - Analyse l’interaction efficace effecteurcible - multi-marquage Les – - background ± élevé suivant les cibles Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des fonctions cytotoxiques 2- Dégranulation des vésicules cytotoxiques par les Ltαβ ou LTγδ ou NK - Test CD107 en présence de cellules cibles Marqueur X pas de cellule cible 1- CD107 (LAMP) est un marqueur marquant les vésicules contenant perforine et granzyme 2- Il est retrouvé à la surface des effecteurs après dégranulation 3- la dégranulation est le signe que l’effecteur a essayé de tuer la cible = marqueur corrélé à la cytotoxicité CD107 Les + - technique simple - Analyse la fonction des effecteurs Introduction Les – - ne renseigne pas sur la mort des cibles - peu sensible Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des capacités prolifératives 1- Historique de prolifération des effecteurs - KI67 2- Capacité de prolifération in vitro - CFSE ou cell trace Introduction Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des capacités prolifératives 1- Historique de prolifération des effecteurs - KI67 (marquage intracellulaire puis visualisation par cytométrie en flux) Les + - technique simple Introduction Les – - les cellules activées peuvent être positives Techniques Immunité cellulaire Exemples Analyse des capacités prolifératives 2- Capacité de prolifération in vitro - CFSE ou cell trace (chaque division cellulaire résulte en une dilution du marqueur) 1- marquage des cellules au CFSE ou cell trace 2- mise en culture avec cytokines 3- analyse par cytométrie à partir de J4 Les + - technique simple - multi-marquage Introduction Les – - longue incubation (pls jours) - ne corrèle pas avec une expansion ou disparition chez le patient Techniques Immunité cellulaire Exemples Exemples d’immunomonitoring 1- Suivi des populations Tαβ spécifiques d’un antigène 2- Suivi de l’expansion des LTγδ au cours d’un essai clinique 3- Suivi des populations NK au cours du traitement de la LAM 4- Suivi des population NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Introduction Techniques Exemples 1 Suivi des populations Tαβ spécifiques d’un antigène PR1 est un peptide provenant de la proteinase 3 surexprimée dans la LMC Certains traitement thérapeutiques induisent l’expansion de LT spécifiques d’antigènes Introduction Techniques Exemples αβ T cells 1 Suivi des populations Tαβ spécifiques d’un antigène PR1-CTL triées vs. Patient MO PR1-CTL non triées vs. Patient MO PR1-CTL triées vs. donor PBMC PR1-CTL non triées vs. donor PBMC PBMC d’un patient LMC cultivés 20 jours avec le peptide PR1 (+IL-2) puis triées ou non. test de cytotoxicité au Cr51 Les cellules T spécifiques d’antigène tuent efficacement des cellules leucémiques Introduction Techniques Exemples αβ T cells 1 Suivi des populations Tαβ spécifiques d’un antigène Au cours de la maladie du greffon, des populations T spécifiques d’antigènes apparaissent Introduction Techniques Exemples αβ T cells 1 Suivi des populations Tαβ après vaccination L’efficacité d’un vaccin est souvent associé à la génération de populations T multifonctionnelles Introduction Techniques Exemples αβ T cells 2 Suivi des populations Tγδ dans le Lymphome folliculaire IPH1101encombinaisonavecRituximabchezlesFL enrechute:phaseIIIPH1101-202(InnatePharma) RTX 375 mg/kg + I PH1101 750 mg/kg + I L2 (low dose, s.c.) I PH1101 I PH1101 I PH1101 RTX I L2 0 1 I L2 2 3 4 IL2 5 6 7 8 9 10 11 12 (Weeks) 41 Patients : Lymphome Folliculaire en rechute post -RTX 3,6,9,12 18,24,30,36 mois Introduction Activité biologique ex vivo : [RTX] sanguin cytokines sanguines % γδ , NK / PBMC in vitro : ADCC par γδ , par NK prolifération / I PH1101 Techniques Efficacité: réponse tumorale TRG ( RC+ RP) critères temporels biopsie médullaire Exemples γδ T cells 2 Suivi des populations Tγδ dans le Lymphome folliculaire Le phospho-Antigène IPH1101, en association avec l’IL-2, permet l’amplification spécifique des T γδ Introduction Techniques Exemples γδ T cells 2 Suivi des populations Tγδ dans le Lymphome folliculaire Le phospho-Antigène IPH1101, en association avec l’IL-2, permet l’amplification spécifique des T γδ Introduction Techniques Exemples γδ T cells 2 Suivi des populations Tγδ dans le Lymphome folliculaire Exemple d’efficacité: Patient 010701JMB, Rémission Complète Introduction Techniques Exemples γδ T cells 3 Suivi des populations NK au cours de la reconstitution immune après chimiothérapie pour le traitement de la LAM Rappel Introduction Techniques Exemples NK cells 1 Suivi des populations NK au cours de la reconstitution immune après chimiothérapie pour le traitement de la LAM CelluleNK Récepteurs ac vateurs Rappel Récepteurs inhibiteurs 3 Introduction Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Techniques Exemples NK cells 1 3 Suivi des populations NK au cours de la reconstitution immune après chimiothérapie pour le traitement de la LAM Rappel Testdecytotoxicitédirecte Testdecytotoxicitéredirigée + — Evaluation de la cytotoxicité naturelle non spécifique d’un récepteur Introduction Evalua onduniveaud’ac va ondes cellulesNKdefaçonrécepteur-dépendante Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Reconstitution lymphocytaire Chimiothérapie Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 Expression de NKp30 HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Récepteurs activateurs L’expression de NKp30 est réduite au diagnostique, puis se restaure dans le temps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 Expression de NKp46 HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Récepteurs activateurs L’expression de NKp46 est réduite au diagnostique, puis se restaure dans le temps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 Expression de NKG2C HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Récepteurs activateurs L’expression de NKG2C est forte au diagnostique et se maintient dans le temps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 Expression de KIRL (CD158a) HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Récepteurs inhibiteurs L’expression de CD158a est réduite au diagnostique, et se maintient dans le temps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 Expression de NKG2A HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Récepteurs inhibiteurs L’expression de NKG2A se maintient dans le temps au niveau normal Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 Expression de ILT-2 HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Récepteurs inhibiteurs L’expression de ILT2 est forte au diagnostique, puis se restaure dans le temps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Les cellules NK ont un phénotype altéré au diagnostique de la LAM mais leur phénotype se restaure au cours de la reconstitution immune Qu’en est-il de la fonction des cellules NK? Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie La cytotoxicité NK est réduite au diagnostique, mais se restaure au cours de la reconstitution Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie La production d’IFNγ est réduite au diagnostique, et reste faible très longtemps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 3 Cellules NK post-chimiothérapie Récepteurs inhibiteurs Récepteurs ac vateurs CelluleNK Cellulecible NKp30 B7-H6,BAT3 NKp46 ? NKG2D MICA/B,ULBPs DNAM-1 Nec n2,PVR 2B4 CD48 KIRs HLA-C KIRL NKG2A ILT2 HLA-A,-B,-C HLA-E HLA-A,-B,-C,-G Le phénotype et la fonction des cellules NK sont altérés au diagnostique de la LAM la restauration vers « la normalité » est différente pour chaque récepteur Les fonctions NK se restaurent plus ou moins vite dans le temps Introduction Techniques Exemples NK cells 1 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Les cellules NK ont généralement une puissante activité cytolytique contre les malignités myéloïdes les cellules NK alloréactives du greffon permettent une forte réaction contre la leucémie (GVL) après transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) le nombre de cellules NK après HSCT est corrélé avec une meilleure prise de greffe et moins de rechute Les cellules sont les premiers effecteurs cytotoxiques à être reconstitués après transplantation de CSH Les cellules NK ne conduisent pas la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD) Introduction Techniques Exemples NK cells 2 Caracterization of NK cells after HSCT Objectif premier de l’étude: Obtenir une meilleur connaissance de la reconstitution NK après transplantation de CSH Objectif secondaire de l’étude: préparer les bases de futurs protocoles cliniques impliquant: 1) l’injection de cellules NK du donneur après greffe 2) l’amélioration de l’efficacité de reconnaissance NK-Blastes leucémiques pour améliorer l’effet GvL des cellules NK Cohorte: 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Développement NK STADE 1 STADE 2 STADE 3 STADE 4 STADE 5 CD34 CD117 CD122 NKG2A CD56 CD16 KIR Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Développement NK Stade 4 CD56bright CelluleNK Stade 5 CD56dim Stade 5 CD56dim CelluleNK NKG2A Prolifération +++ Cytokine +++ Cytotoxicité +/- Introduction Pen5 KIR NKG2A CelluleNK Pen5 Prolifération + Cytokine ++ Cytotoxicité +++ Stade 5 CD56dim KIR CelluleNK Pen5 KIR CD57 Prolifération Cytokine + Cytotoxicité +++ Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Développement NK HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Forte expansion des cellules NK après transplantation Pourcentage de CD56bright beaucoup plus élevé immaturité? Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Fort pourcentage de cellules CD56dim NKG2A+ immaturité? HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques faible pourcentage de cellules CD56dim CD57+ immaturité? HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling CD56bright CD56dim NKG2A+ CD56dim CD57+ MATURITE Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Expression normale des KIR (sauf pour CD158a) CD158a,h CD158b,j CD158e1 HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Expression normale des KIR (sauf pour CD158a) HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Sampling CD56bright CD56dim NKG2A+ CD56dim CD57+ KIR MATURITE Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Fonctions NK Resting NK Activated NK co-culture 4hrs avec K562 Analyse par cytométrie en flux de la dégranulation (CD107) Cellules NK au repos ou bien pré-activée par des cytokines (IL-2+15) Introduction Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Forte dégranulation des cellules NK comparé aux volontaires sains Normalisation au cours du temps HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Introduction Sampling Techniques Exemples NK cells 2 4 * 30 Les cellules CD56dim sont responsables de la forte réactivité face aux cellules cibles 20 Normalisation au cours du temps 10 C LP La te Ve ry la te 0 Ea In rly te rm ed ia te % CD56dim CD107a + cells Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Introduction Sampling Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques Analyse des cellules NK répondeuses (CD107a+) * Les cellules NKG2A+ sont responsables de la forte réactivité face aux cellules cibles Normalisation au cours du temps bien que très tardive HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Sampling Sampling Introduction Sampling Techniques Exemples NK cells 2 4 Suivi des populations NK après transplantation de cellules souches hématopoïétiques HSCT 30d(4w) 60d(8w) Early 90d(13w) Intermediate 145d(21w) Late Verylate me Sampling Réactivité NK CD56dim NKG2A+ CD56dim KIR+ Introduction Sampling< < < < < < < < < < < Techniques < < Sampling < < < < < < < < < Sampling Exemples NK cells 2 Conclusion Générale Introduction Populations du système immunitaire Médiateurs solubles Pourquoi et quand faut-il monitorer les réponses immunes? Techniques Médiateurs solubles Médiateurs cellulaires Exemples Suivi des cellules T αβ antigène-specifiques Cellules γδ Cellules NK dans la Leucémie Myéloïde Aigüe Cellules NK dans la transplantation de cellules souches hématopoïétiques Conclusion Générale Quand? Essais cliniques (drogues, immunothérapies, transplantation, …) Suivi de pathologies (diagnostique, résistances, rechutes) Pourquoi? Impact des drogues sur le système immunitaire Impact des essais d’immunothérapie Impact des thérapies par transplantation Intérêt? Améliorer les thérapies Déterminer l’efficacité des traitements Augmenter nos connaissances