Actinomycètes: Sélection, Isolement & Production d'Antibiotiques

1. Les caractères moléculaires
Hybridation ADN-ADN
G+C
Séquençage de l’ARN 16S
Les souches ont un G+C > 50%, l’hybridation ADN-ADN à 55°C ne permet pas
de regrouper les deux genres et non le séquençage de l’ARN 16S.
2. Les techniques de sélection des actinomycètes
1) Source :
Le sol représente une source appréciable pour l’isolement des
actinomycètes.
Les sols riches en matières organiques (forêts) sont plus favorables
au développement des MO.
Plus ou moins, les actinomycètes peuvent être isolés à partir de
l’eau de mer par exemple.
2) Le milieu d’isolement :
Le milieu utilisé est un milieu nutritif généralement additionné
d’antifongiques (inhibiteurs de levures et moisissures).
3) La sélection :
Repose sur le phénomène d’antagonisme.
Plusieurs espèces de MO peuvent être utilisées :
Pour les bactéries à Gram(+) : Bacillus subtilis (bactérie en forme de
bâtonnet)
Pour les Gram(-) : Staphylococcus aureus (bactérie en forme
coccoïde), E. coli, Pseudomonas aeruginosa
Pour les levures : Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans
Pour les moisissures : Aspergillus niger, Mucor sp
3. Isolement sur boîte (Méthode pratique)
Étapes :
Prélèvement du sol → cellules de spores.
Mélange avec gélose en fusion à 47°C.
Verser dans une boîte stérile.
Après ensemencement, incubation.
On sélectionne les actinomycètes (les souches citées ne poussent
pas).
Objectif : Obtenir une culture pure d’actinomycètes.
4. Test de production d’antibiotique par une souche
d’actinomycète
Afin de tester si une souche d’actinomycète isolée peut produire
un antibiotique, un criblage sur boîte est réalisé comme suit :
La souche à tester est mélangée à une gélose en suspension
(gélose liquéfiée).
Cette gélose est coulée dans des boîtes.
Après solidification, des stries de la solution contenant la souche
à tester sont réalisées en croisant les bactéries tests.
Après incubation :
Les isolats producteurs d’antibiotiques montrent une zone
d’inhibition (pas de croissance de la souche testée).
Inconvénients :
Compatibilité entre les exigences nutritionnelles de la souche
testée et des bactéries tests.
Température de croissance (incubation).

Durée d’incubation.
5. Technique du Cylindre d’Agar
Consiste à mettre un cylindre contenant la souche sur une gélose
ensemencée avec une bactérie cible.
Après incubation, une zone claire autour du cylindre indique la
production d’un antibiotique.
Test en milieu solide (croisement ou stries croisées)
Une souche à tester est cultivée pendant 10 jours sur gélose.
Des cylindres d’agar sont découpés à partir de cette culture.
Ces cylindres sont ensuite déposés sur une boîte ensemencée
préalablement par le germe cible (c’est-à-dire une souche
bactérienne cible).
L'incubation se fait à la température optimale de croissance du
germe cible.
Observation :
Si une zone d'inhibition de croissance apparaît autour du cylindre,
cela indique une production probable d'un antibiotique.
Schéma à comprendre :
Zone d’inhibition = absence de croissance du germe cible.
Cela prouve que la souche produit une substance
antimicrobienne active.
2. Test de croisement sur gélose
Le germe à tester (ex: actinomycète) est cultivé par une strie
droite au centre de la boîte.
Il est incubé pendant 10 jours.
Ensuite, les germes cibles sont ensemencés perpendiculairement
à la strie de l’actinomycète.
Réincubation à la température optimale du germe cible.
Observation :
Apparition d’une zone d’inhibition entre les deux souches =
présence d’un antibiotique produit par la souche testée.
3. Test en milieu liquide
Culture de la souche dans un milieu synthétique (à composition
définie).
Ce milieu permet de détecter et optimiser les besoins
nutritionnels nécessaires à la production d'antibiotiques.

Cela permet aussi de déterminer la cinétique de production.
Deux types de tests possibles :
a. Test des disques :
Utilisation de disques de papier (6 mm de diamètre).
On dépose 25 à 50 µL de surnageant de culture sur chaque
disque.
Les disques sont ensuite placés sur une boîte contenant le germe
cible.
Après incubation, la zone d’inhibition est observée.
b. Test des puits :
Utilisation d’une boîte où l’on fait des puits dans la gélose.
On dépose le surnageant dans ces puits.
Après incubation, si une zone claire apparaît autour du puits, cela
confirme une activité antibiotique.
4. Méthode de test après centrifugation du milieu liquide
Le surnageant est récupéré après centrifugation du milieu de
culture.
On peut utiliser soit des puits, soit des disques pour tester
l’activité antibiotique.
Procédure :
Les germes cibles sont ensemencés sur la gélose.
On place soit les disques imbibés de surnageant, soit on remplit
les puits avec le surnageant.
Après incubation à T° optimale :
Si une zone d’inhibition apparaît autour, cela prouve que le
surnageant contient un antibiotique actif.
Conclusion générale :
Les actinomycètes sont producteurs d’antibiotiques naturels.
Les tests décrits permettent de :
Détecter la production d’antibiotiques.
Quantifier leur efficacité.

Optimiser les conditions de production (milieu, temps, T°, etc.).
Isoler et caractériser les antibiotiques actifs.
# Techniques de test pour la production d'antibiotiques par des
actinomycètes
## Test sur gélose
1. Test des stries croisées :
- La souche à tester est inoculée en strie sur une gélose avec le
germe cible.
- Après incubation, la présence d'une zone d'inhibition autour de
la strie indique la production probable d'un antibiotique.
2. Test sur disques :
- Le surnageant de culture de la souche est déposé sur des
disques de papier qui sont ensuite déposés sur une gélose
ensemencée avec le germe cible.
- Après incubation, le diamètre des zones d'inhibition autour des
disques est mesuré.
3. Test sur puits :
- Des puits sont creusés dans une gélose ensemencée avec le
germe cible.
- Le surnageant de culture est déposé dans ces puits.
- Après incubation, la diffusion de l'antibiotique dans la gélose
se traduit par une zone d'inhibition autour des puits.
## Extraction et purification des antibiotiques
1. Extraction à partir du surnageant :
- Le surnageant de culture est centrifugé pour récupérer les
antibiotiques.
- L'extraction se fait par solvants (méthanol, butanol, etc.).
- La phase organique contenant les antibiotiques est récupérée.
2. Extraction à partir du mycélium :
- Le mycélium est mis en suspension dans l'éthanol pour
récupérer les antibiotiques adsorbés.
- Une centrifugation permet de séparer le mycélium de l'extrait
éthanolique contenant les antibiotiques.
3. Purification par chromatographie sur couche mince (CCM) :
- La CCM permet de séparer et d'identifier les différentes
molécules présentes dans l'extrait.
- La CCM préparative permet de purifier les molécules d'intérêt.
4. Purification par HPLC :
- La chromatographie liquide haute performance (HPLC) permet
de séparer et de purifier les molécules avec une haute résolution.
- L'HPLC peut être couplée à des techniques d'identification
comme la spectrométrie de masse ou la RMN.
# Milieux de culture
Les milieux de culture industriels peuvent être divisés en 3

grands groupes :
1. Milieux pour la production de levures et protéines
d'organismes unicellulaires (P.O.U.)
2. Milieux pour la production de métabolites secondaires comme
les antibiotiques
3. Milieux pour la production de biomasse microbienne
La composition et le coût des éléments du milieu sont des
éléments cruciaux pour la production à l'échelle industrielle.14:10
# Milieux de culture industriels
Les milieux de culture industriels peuvent être divisés en 3
grands groupes :
1. Groupe 1 : Milieux pour la production de levures et protéines
d'organismes unicellulaires (P.O.U.)
- Production à très grande échelle
- Éléments du milieu ne doivent pas être trop coûteux
2. Groupe 2 : Milieux pour la production de métabolites
secondaires comme les antibiotiques
- Cultures réalisées dans des fermenteurs de taille moyenne
- Composition du milieu doit permettre la production des
métabolites désirés
3. Groupe 3 : Milieux pour la production de biomasse
microbienne
- Cultures réalisées à petite échelle
- Produits généralement destinés au domaine médical ou de la
recherche
## Éléments essentiels des milieux de culture industriels
1. Source de carbone :
- Le saccharose (sucrose) est la principale source de carbone
- Peut également utiliser des mélasses, résidus industriels de la
fabrication du sucre
2. Source d'azote :
- Azote organique (urée, glutamate) ou inorganique (NH4+)
- Apporté sous forme de complexes (sels minéraux, peptones,
etc.)
3. Oligoéléments et vitamines :
- Nécessaires à la croissance et la production des métabolites
- Doivent être présents en quantités suffisantes
## Procédés de fermentation industrielle
1. Fermentation en batch (discontinue) :
- Système fermé sans ajout ni soutirage de milieu
- Permet de récupérer les produits à tout moment de la culture
- Présente une phase de latence et une phase stationnaire