jouault1995

cytom trie en flux:
int r t et applications en h matologie
H. JOUAULT et M. IMBERT *
RESUME SUMMARY
La cytom4trie en flux (CMF) est une technologie permet-
tant l'analyse individuelle de cellules. Les cellules sont
align~es selon le principe du centrage hydrodynamique
avant de passer devant un faisceau laser. Les ph~no-
m~nes optiques engendr~s permettent une analyse des
caract~ristiques physiques (taille, structure) des cellules
ou biologiques apr@s incubation avec des r~actifs le plus
souvent fluorescents. La CMF permet d'analyser rapide-
ment un grand nombre de cellules et offre la possibilit~
d'analyse multiparam~trique. Les applications sont nom-
breuses en h~matologie.
La CMF s'est impos~e comme la technique de choix aussi
bien pour num~rer les cellules sanguines que pour ~tu-
dier diff~rentes caract~ristiques biologiques des ~l~ments
du syst~me h~matopoi~tique : antig~nes cytoplasmiques
ou de membrane, contenu en ARN et en ADN, fonctions
cellulaires diverses. La CMF est le compl~ment indispen-
sable de la morphologie pour le diagnostic et le suivi d'un
certain nombre de pathologies. De plus, les possibilit~s de
tri cellulaire offertes par cette technique d~bouchent sur
des applications de recherche fondamentale.
MOTS-CLg:S
cytom~trie en flux - antig~nes de membrane - immuno-
ph~notypage - acides nucl~iques - h~mopathies.
Flow cytometry (FCM) allows to measure the characteris-
tics of individual cells. Cells in suspension are hydrodyna-
mically focused in a laser beam. The emitted light signals
give information on physical parameters and~or biological
characteristics after the cells have been incubated with
fluorescent reagents. FCM offers the possibility of a
rapid, multiparametric analysis of a large number of
cells. Hematology is one of the major fields of FCM appli-
cations.
FCM is the reference technique for total blood count. It is
essential for immunophenotyping, measurement of DNA
or RNA content and for analysis of cell functions. FCM
and morphology are complementary for diagnosis and
follow-up of hematologic disorders. FCM offers also cell
sorting possibilities which are mainly used in basic
research.
KEY-WORDS
flow cytometry - cell surface antigens - immunopheno-
type - DNA content - cell cycle - hematopathology.
Introduction
La cytom~trie en flux (CMF) permet une mesure indi-
viduelle des caract~ristiques physiques et/ou biolo-
giques de cellules en suspension dans un flux liquide
qui assure l'alignement des ceUules les unes derriere
les autres. Elle fait appel ~ de nombreux concepts et a
b~n~fici~ des progr~s r~alis~s dans des domaines tr~s
divers (m~canique des fluides, quantification des
signaux optiques, technologie des lasers, d~veloppe-
ment de l'informatique...).
Les pr~mices de ia cytom~trie en flux remontent
1934 quand Moldavan essayait de d~nombrer les celo
lules d'une population en utilisant un faisceau lumi-
neux interrompu par le passage des cellules mises en
suspension dans un tube capillaire. En 1953,
Crossland-Taylor utilisait la propri~t~ que poss~dent
deux flux laminaires coaxiaux de ne pas se m~langer
imm~diatement pour aligner les ceUules, et la mesure
de la lumi~re diffract~e pour compter les ~l~ments
sanguins. En 1949, W. Coulter cr~ait un analyseur de
cellules en utilisant des flux constitu~s de liquides
ionis~s, au sein desquels les cellules font varier
l'imp~dance de part et d'autre d'un micro-orifice au
travers duquel elles passent, la variation d'imp~-
dance ~tant proportionnelle au volume des cellules.
Durant les ann~es 50-70, l'apparition des photomulti-
* Service central d'h~matologie biologique
H6pital Henri-Mondor
51, av. du Mal de-Lattre-de-Tassigny
94010 CRETEIL CEDEX
TIRES A PART :
Mme le Dr H. JOUAULT
article regu le 15 d~cernbre 1994, accept~ le 4 janvier 1995.
Revue frangaise des laboratoires, avril/mai 1995, N ° 275 29

FIGURE 1
Representation sch@matique
de la focalisation hydrodynamique
___~S~pe.~O00000 o 0 0 0 0000 0
entrafn@e 0 m 00000 0 000 0 0
0 000"-'0 0
": /~ Liquide d'entrainem 7
O
Le liquide d'entrainement acc@i@re les cellules et permet leur ali-
gnement une & une A la sortie.
FIGURE 2
Sch@ma de fonctionnement d'un cytom~tre en flux
F.A.LS. : forward angle light scatter ou lumi~re diffus@e dans les
petits angles
90 L.S. : 90 ° light scatter ou lumi~re diffus~e & 90 °
FIGURE 3
Comparaison des spectres d'@mission
du FITC et de la PE
0 1
450
FITC PE
530 575
iI
! I
! l
I | !
500 550 600 650
Longueur d'ondes (nm)
FITC : isothiocyanate de fluoresc~ine
PE : phyco@rythrine
plicateurs permettait d'am@liorer la quantification des
signaux optiques. Puis i'av@nement du laser comme
source lumineuse a am@lior~ la focalisation du fais-
ceau. Sa monochromaticit@ et sa puissance ont per-
mis d'exciter des mol@cules fluorescentes sp@cifiqueo
ment fix@es sur des composants cellulaires. Enfin,
l'int@gration de l'informatique a permis de multiplier
ies donn@es analys@es simultan@ment, d'augmenter
leur rapidit@ d'obtention et d'automatiser les appa-
reils.
Les cytom~tres sont ainsi devenus des outils perfor-
mants, fiables, de maniement ais@, m@me pour des
non sp@cialistes, et dont ie cofit a consid@rablement
diminu@. Cet essor se poursuit grace A i'apparition de
r~actifs, anticorps monoclonaux et nouveaux fluoroo
chromes en particulier, de plus en plus nombreux, et
la simplification des techniques de pr@paration des
@chantillons, comme l'utilisation du sang total en
h@matologie par exemple.
Nous aborderons ici les principales applications de la
CMF/~ l'h@matologie sans chercher/l @tre exhaustifs.
En effet, l'@tendue des possibilit@s de la CMF est telle,
qu'en permanence, de nouvelles analyses sont imagi°
n@es et r~alis@es.
I. Rappel sur la cytom@trie en flux
Le principe de la CMF est bas@ sur la focalisation hydrodyna-
mique de l'@chantillon dans un faisceau lumineux excitateur
(28). La suspension cellulaire monodispers@e est inject@e dans
l'axe d'une veine liquide de section assez forte, qui s'@coule
par une buse de plus faible diam@tre. Comme le diam@tre
diminue, si le d@bit est constant, la vitesse d'@coulement aug-
mente et les cellules d@filent & raison de plusieurs millers par
seconde. Avec un diam@tre de buse et une dilution de la sus-
pension ceUulaire appropri@s, on peut faire passer les cellules
une A une et les analyser individuellement (figure 1).
La veine liquide est travers@e par un faisceau lumineux, le plus
souvent de type laser en raison de sa grande brillance, de sa
monochromaticit@ et de sa bonne focalisation. Les cellules
ainsi @clair@es @mettent un certain nombre de signaux
optiques : lumi@re diffus@e ("light scatter") dans l'axe du laser,
repr@sentatrice de la taille des cellules, lumi~re diffus@e & 90 °
donnant des informations sur la structure cellulaire, et fluores-
cence @mise Iorsque les cellules ont @t@ au pr@alable marqu@es
directement ou indirectement par un ou plusieurs fluoro-
chromes (figure 2).
Les fluorochromes sont des substances organiques qui, sous
l'influence d'une radiation de Iongueur d'onde donn@e
(~, d'excitation), @mettent une lumi@re de Iongueur d'onde
sup@rieure (X d'@mission) caract@ristique de la mol@cule. Par
exemple, l'isothiocyanate de fluoresc~'fne (FITC) excit@
490 nm @met une lumi@re de Iongueur d'onde 543 nm.
L'intensit@ de la lumi@re fluorescente est corr@l@e au nombre
de mol@cules de fluorochrqme fix@es sur la cellule. Le choix
des fluorochromes utilis@s devra tenir compte de la ou des Ion-
gueurs d'onde @raises par le laser dont est @quip@ l'appareil.
On peut utiliser simultan@ment plusieurs fluorochromes ayant
le m@me spectre d'excitation et des spectres d%mission diff@-
rents comme le FITC et la phyco@rythrine (PE) (figure 3).
Lorsque les fluorochromes ont des spectres d'excitation diff@-
rents, on peut, dans certaines conditions, les utiliser sous la
forme d'un syst~me coop@ratif de transfert d%nergie, la Ion-
gueur d'onde d%mission du premier fluorochrome servant de
lumi@re excitatrice pour le second, qui @met sa propre Ion-
gueur d'onde d%mission. Le couplage PE et rouge Texas est
un exemple classique de cette compl@mentarit@ (figure 4).
Plusieurs nouveaux fluorochromes de ce type ont @t@ r@cem-
ment d@velopp@s pour la CMF.
Ces diff@rents signaux lumineux sont focalis@s, s@par@s en
fonction de leur direction et de leur Iongueur d'onde au
moyen de filtres et de miroirs puis ils sont achemin@s vers des
3() Revue franqaise des laboratoires, avril/mai 1995, N°275

photod6tecteurs (photodiodes ou photomultiplicateurs) qui les
transforment en signaux $1ectriques ; ils ont enfin digitalis6s
par un convertisseur analogique/digital qui transcrit l'ampli-
rude de chaque signal en un num~ro de canal, dont la valeur
cod6e en bits est utilisable par l'unit6 informatique.
Celle-ci peut repr6senter les donn6es re9ues sous forme d'his-
togrammes de distribution de fr6quence avec en abcisse
l'amplitude du param~tre ~tudi~ (en canaux) et en ordonn6e le
nombre de cellules par canal (figure 5A). Comme chaque cel-
lule peut Smettre plusieurs signaux diff~rents, il est possible de
combiner sur une m~me repr6sentation deux param6tres
ind6pendants : chaque cellule est alors plac~e, en fonction de
la valeur des deux param6tres, sur une case d'un 6chiquier
r~alisant un histogramme biparam6trique ou cytogramme. Le
hombre de cellules dans chaque case peut ~tre visualis$ sur un
troisi6me axe par des courbes de niveaux ou des intensit~s de
couleur (contour graphe) (figure 5B). Pour chaque type de
repr6sentation, on peut employer une 6chelle lin6aire ou Ioga-
rithmique (3 ou 4 d~cades). Enfin il est possible de condition-
ner l'acquisition d'un param6tre sur d'autres param~tres, au
moyen, en particulier, de zones d'int6r@t (ou cartes de contour
ou "bit map"). Ainsi, au sein d'une population h~t6rog6ne, il
est possible de cibler les informations provenant de telle ou
telle population en tragant ces zones d'int6r~t sur un cyto-
gramme taille/structure. Par exemple, pour l%tude des sous-
populations lymphocytaires, tout en utilisant le sang total, il
est possible de ne retenir que les informations provenant des
lymphocytes m6me si toute la population a 6t6 analys~e Iors
du passage devant le laser (figure 6).
Les cytom6tres de haut de gamme sont ~quipSs d'une option
preparative permettant de trier et de purifier des populations
cellulaires apr6s leur analyse. Le principe du tri est simple. Le
jet liquide contenant les cellules est fractionn~ par la vibration
d'un cristal pi6zo-~lectrique puis les gouttelettes sont charg6es
~lectriquement et seront d6vi6es Iors de leur passage dans un
champ 61ectrique cr~ entre les deux plaques d'un condensa-
teur (figure 7). Le choix de la gouttelette ~ charger et le sens
de la charge est effectu$ par le syst~me informatique en fonc-
tion des souhaits de l'utilisateur et des signaux engendr~s par
l'analyse de la cellule contenue dans la gouttelette (4). La mise
en oeuvre d'un tri est une op6ration d61icate n6cessitant des
comp~tences particuli6res et du temps, et reste r6serv~e aux
applications de recherche.
En pratique courante, la CMF permet l'analyse rapide d'un
grand nombre de cellules, la d~tection de cellules rares, la
quantification de plusieurs param6tres pour une m~me cellule.
Deux types de param6tres peuvent @tre ~tudi~s : des para-
m~tres intrins6ques, ind6pendants de r6actifs, comme la faille
ou la structure cytoplasmique (prSsence de granulations par
exemple) et des param~tres extrins6ques qui n6cessitent l'em-
ploi de r6actifs pour leur mise en 6vidence, r~actifs fluores-
cents le plus souvent. Ce sont par exemple les antig~nes de
surface des cellules normales ou des prolif6rations malignes,
r6tude des acides nucl~iques (ARN, ADN) ou des param~tres
li6s & des fonctions cellulaires particuli6res comme la mesure
des flux calciques ou celle du pH intracellulaire (29).
2. Analyse des param tres physiques
"~-~'
L'analyse des param~tres physiques des cellules, qui ne n6ces-
site pas d'adjonction de r$actifs, est l'une des applications les
plus simples de la CFM. On peut ainsi au sein d'une suspen-
sion h6t6rog~ne individualiser diff6rentes populations• La pre-
mi6re application clinique en h6matologie a ~t6 la numeration
des h~maties et des globules blancs principalement parce que
le sang est ~ l'~tat naturel une suspension monodispers~e (21).
Actuellement, la CMF est la m6thode de r6f6rence pour
numSrer les ~l~ments cellulaires circulants. De m@me la for-
mule leucocytaire est maintenant 6tablie dans un grand
nombre de cas par des automates compte-globules selon les
principes de la CMF. lls utilisent deux technologies : la mesure
de l'imp~dance ~lectrique (principe ,, Coulter ,,) ou la mesure
de la diffusion de la lumi~re (2).
FIGURE 4
Principe du transfert d'6nergie
PHYCOERYTHRINE
"] , 575
k:
/il
1 i I L1
Longueur d'ondes
: excitation laser
~I:~ : ~mission de fluorescence
ROUGE TEXAS
579 ~ 604
:' ~1
/"
o 5o~ 6oo 700
Longueur d'ondes (nm)
_~-- : spectre d'excitation
• : spectre d'~mission
La lumi6re ~mise par la phyco6rythrine sert de lumi~re d'excita-
tion pour le rouge Texas, qui ~met alors sa fluorescence.
FIGURE 5
Repr6sentation sch~matique des r6sultats
E
,_o
7
A- Histogramme de distribution de fr6quence
hl
3 " • . r
N ° de canal
B- Histogramme biparam~trique
/•
i / ~,'l~
LC>e' / .f ..t / ! ,/ /~
O 1 2 3 a 5 g
PARAMETRE 1
]
~, /-'~-"~ .':,..~,
'~1 ;6f"~J9 __,c"
I ,~i~'~'-, ~ --'-
5J
Le principe ,, Coulter ,, permet le comptage et la mesure du
volume des ~16ments & partir des impulsions g6n6r~es par le
passage des cellules & travers un micro-orifice de part et
d'autre duquel est appliqu~ un courant ~lectrique continu. Une
approche de la formule leucocytaire peut @tre r6alis~e grace
l'histogramme de distribution du volume leucocytaire, les lym-
phocytes 6tant Iocalis6s entre 35 et 90 femtolitres (fl), les
monocytes entre 90 et 160 fl et les granulocytes au-del& de
160 fl (33). La diff6rentielle leucocytaire compl~te est obte-
nue, sur ce type d'appareil, par rint~gration de trois mesures
ind@endantes et simultan~es : le volume d6termin6 par la
variation d'imp~dance, la taille et la densit6 nucl6aires par la
conductivit6 d'une onde ~lectro-magn6tique et la granularit6
cellulaire par la diffraction d'un faisceau laser (technologie
VCS~). Une autre cat~gorie d'appareils (Technicon ~, Ortho ~)
utilisent pour la num6ration une mesure de diffraction de la
Revue frangaise des laboratoires, avril/rnai 1995, N ° 275 31

tent, en association avec les donn~es cytologiques, une sous-
classification en leuc~mie lympho'fde chronique B, leuc~mie
prolymphocytaire, leuc~mie & tricholeucocytes, lymphome
spl~nique & ly villeux, etc.
Les HL T expriment de fagon variable les antig~nes CD3,
CD7, CD2, CD5, CD4, CD8, les marqueurs de cellules natu-
ral killer. Dans certaines pathologies on retrouvera l'expres-
sion de mol~cules d'activation. L& encore, la confrontation des
donn~es cliniques, morphologiques et immunologiques est
indispensable pour le diagnostic : leuc~mie lympho'fde chro-
nique et leuc~mie prolymphocytaire & cellules T, leuc~mie-
lymphome T de l'adulte associ~e au r~trovirus HTLV-1, syn-
drome de S~zary (35).
2.2. Leuc~mies aigu~s
Le principe de l'immunoph~notypage des leuc~mies aigu~s
repose sur la notion que les cellules leuc~miques constituent
une proliferation fig~e & un stade donn~ de diff~renciation. Le
profil immunologique analys~ est compar~ aux diff~rents
stades connus des lign~es normales. L'apport de l'immuno-
ph~notypage a ~t~ particuli~rement important pour les leuc~-
mies aigu~s lymphoblastiques (LAL) puisque c'est le seul ~I~-
ment positif permettant de rattacher les blastes & une origine
lympho'fde B ou T puis de d~finir des sous-groupes de matura-
tion.
Les LAL & pr~curseurs lympho'fdes B, qui repr~sentent 75
80 % des LAL, expriment dans la plupart des cas les anti-
g~nes HLA-DR, CDI9, CD 22 cytoplasmique ou de surface,
CD10 et moins souvent l'antig~ne CD20. L'antig~ne CD34
est present dans 60 & 70 % des cas. L'expression des
cha~nes I~. d'immunoglobulines intracytoplasmiques caract~rise
les LAL I~:B. Les LAL B, qui ne repr~sentent que 2 & 3 %
des LAL,-~kpriment des cha~nes I~ ~ la surface des blastes et
correspondent dans une tr~s grande majorit~ des cas & un
aspect cyto~'.gique de LAL 3 (LAL de type Burkitt) de la classi-
fication du ~i'oupe coop~ratif franco-am~ricano-britannique
(FAB) ........
Les LAL T sont identifi~es par la presence des antig~nes
CD7, CD5, CD2, CD3 de surface ou surtout intracytoplas-
mique, diversement associ~s (13). Les antig~nes CD1, CD4
ou CD8 ne sont exprim~s que dans un nombre restreint de
cas repr~sentant des formes plus matures.
Parmi les leuc~mies aigu~s ne pr~sentant pas de signes cytolo-
giques et cytochimiques de diff~renciation my~Io'fde (absence
de granulations azurophiles dans le cytoplasme, de corps
d'Auer, de my~Ioperoxydase ou d'est~rases monocytaires),
l'immunoph~notypage a permis d'identifier un faible pourcen-
tage (1 & 2 %) de leuc~mies aigu~s n'exprimant que des anti-
g~nes associ~s aux lign~es my~Io'fdes et class~es leuc~mies
aigu~s my~Ioides tr~s peu diff~renci~es (LAM O dans la classi-
fication FAB) (6).
En ce qui concerne les autres leuc~mies aigu~s my~Io'fdes, le
diagnostic est d~j~ pos~ apr~s l'analyse cytologique et cytochi-
mique du sang et de la mcelle (17). L'immunoph~notypage
permet de conforter la classification en sous-groupes malgr~
l'absence de recoupement exact entre l'immunoph~notypage
et la classification morphologique. Les principaux antig~nes
exprim~s par les blastes my~Io'ides sont les CD33, CD13,
CD15 pour les blastes granuleux, les CD36 et CD14 Iorsqu'un
contingent monocytaire est present. Dans les leuc~mies avec
diff~renciation m~gacaryocytaire, on recherchera les CD41,
CD42, CD61, CD36 et pour les proliferations avec diff~ren-
ciation ~rythro'fde, le CD36 et diff~rentes antiglycophorines.
La presence de l'antig~ne CD34 dans environ 40 & 50 % des
LAMest en g~n~ral inversement corr~l~e au degr~ de matura-
tion des blastes, t~moignant du fait que le CD 34 est un~anti-
g~ne qui n'est present que Iors des premiers stades de diff,-
renciation de chaque lign~e.
3. Numeration des cellules souches circulantes
La presence de prog~niteurs h~matopo'f~tiques dans le sang
circulant, leur recirculation importante apr~s chimioth~rapie
permettent la constitution d'un greffon utilisable pour ]a r~ali-
sation d'autogreffe de moelle (3). Les cellules souches du sang
p~riph~rique sont collect~es chez les patients par cytaph~r~se,
apr~s une mobilisation par chimioth~rapie et/ou facteurs de
croissance (30). Elles sont ensuite r~inject~es au malade le
moment voulu et permettent une reconstitution h~matolo-
gique plus rapide que celle obtenue iors des allogreffes de
moelle. La qualit~ du greffon est classiquement contrSl~e par
culture avec d~compte des prog~niteurs (CFU-GM en particu-
lied. Mais cette m~thodologie n~cessite un d~lai de 14 & 18
jours pour l'obtention des r~sultats. II est possible de num~rer
rapidement et facilement les prog~niteurs h~matopo'i~tiques
en num~rant les cellules CD34+ dans les produits de cytaph~-
r~se avec des r~sultats satisfaisants (18).
4. Mise en ~vidence de modifications
des antig~nes de surface
Des modifications d'antig~nes membranaires peuvent ~tre
observ~es en pathologie et ~tre facilement analys~es en CMF.
C'est le cas de rh~moglobinurie paroxystique nocturne (HPN).
II s'agit d'une maladie clonale des cellules souches my~Io'fdes,
dont la traduction clinique la plus caract~ristique est une an~-
mie h~molytique r~sultant d'une sensibilit~ accrue des h~ma-
ties au compl~ment. Cette particularit~ est h la base du test
classique de Ham Dacie. On sait maintenant que rh~molyse
est secondaire h une perte des glycoprot~ines membranaires
CD55 (decay-accelerating factor ou DAF) et CD59 (mem-
brane inhibitor of reactive lysis ou MIRL), prot~ines qui
contr61ent la d~sactivation du compl~ment. Le d~faut de ces
deux prot~ines & la surface de la membrane ~rythrocytaire
r~sulte d'un d~ficit de leur mol~cule d'ancrage, le glycosylpho-
phatidyl-inositol (GPI) (25). A l'aide d'anticorps monoclonaux,
on peut mettre en ~vidence l'absence des prot~ines li~es & la
membrane cellulaire par des liaisons GPI que ce soit les glyco-
prot~ines CD55, CD59, CD58 pour les h~maties mais aussi
CD16 pour les polynucl~aires ou CD14 pour les monocytes.
Cette m~thode en CMF, gr&ce fl l'analyse des diff~rentes
lign~es my61o'fdes, permet de porter un diagnostic d'HPN
m~me apr~s des transfusions de culots ~rythrocytaires (10).
Une grande vari~t6 de mol~cules glycoprot~iques (gp) est pr~-
sente & la surface des plaquettes. Ces mol~cules ont ~t~ identi-
fi~es d'abord par des techniques de biologie cellulaire et sont
maintenant reconnues par des anticorps monoclonaux, ce qui
donne lieu & une double appellation (5). L'expression de cer-
taines mol~cules est secondaire au ph~nom~ne d'activation
plaquettaire (par exemple, les CD62p, CD63, CD107) tandis
que d'autres mol~cules sont exprim~es m~me sur les pla-
quettes au repos, comme les CD9, CD31 ou gp lla, CD36 ou
gp IV, le complexe CD41/CD61 ou gp llb/llla et les 4 mol~-
cules du CD42 (CD42a ou gp IX, CD42b ou gplb c~, CD42c
ou gp Ib if, CD42d ou gp V). Ces mol~cules jouent un rSle
important dans les processus d'adh~sion et d'agr~gation pla-
quettaire qui initient la formation du thombus h~mostatique.
Des anomalies quantitatives et/ou qualitatives, acquises ou
cong~nitales, de ces gp peuvent ~tre & rorigine de la survenue
de syndromes h~morragiques.
Le diagnostic de ces thombopathies peut ~tre approch~ de
fagon rapide et simple en quantifiant ces gp par CMF & l'aide
d'anticorps monoclonaux sp~cifiques (34). Ainsi dans la thom-
basth~nie de Glanzman, on observe, dans les sous-types Iet II,
un d~ficit plus ou moins important des mol~cules
CD41/CD61 (< 5 % pour le type I, entre 5 et 25 % pour le
type II). Dans les rares types III ou variants, off ranomalie du
complexe CD41/CD61 est qualitative, la fluorescence peut
~tre normale (34). Dans la maladie de Bernard-Soulier, c'est
l'absence de gp Ib (CD42 bet c) qui sera facilement raise en
~vidence par CMF. Certaines de ces mol~cules plaquettaires
pr~sentent des variations antig~niques, constituant des
syst~mes allotypiques de groupes plaquettaires. Dans la classi-
fication internationale HPA (human platelet alloantigens), cinq
syst~mes sont identifies, dont le syst~me HPA 1 (ancienne-
ment d~nomm~ PLA1/PLA2) qui consiste en un polymor-
phisme de la mol~cule CD61. Ce syst~me est fr~quemment
impliqu~ dans les thrombop~nies alloimmunes, post-transfu-
sionnelles ou n~o-natales. La CMF peut @tre utilis~e comme
m~thode de d~pistage de ces anticorps anti-plaquettes (7).
Apr~s incubation du s~rum ~ tester avec des plaquettes-cibles,
on r~v~le l'~ventueUe fixation d'un anticorps sur les plaquettes
par une anti-globuline fluorescente. Cette technique de d~pis-
tage doit @tre suivie d'autres techniques permettant l'identifica-
tion precise de rallo-anticorps.
Revue frangaise des laborateires, avril/mai 1995, N ° 275 33

4. Etude des acides nucl iques 5. Analyse
des fonctions cellulaires
1. Analyse de I'ARN
D'assez nombre~Lx fluorochromes peuvent colorer I'ADN
et/ou I'ARN (24). La mise en ~vidence d'ARN ribosomal dans
les ~rythrocytes permet de distinguer les r~ticulocytes des
h~maties mQres, qui ne contiennent plus d'ARN. La num~ra-
tion des r~ticulocytes, qui est un examen primordial pour la
classification et le diagnostic d'une an~mie, ~tait jusqu'& main-
tenant effectu~e par une m~thode manuelle utilisant des colo-
rants vitaux comme le bleu de m~thyl~ne ou le bleu de cr~syl.
Apr~s incubation du sang avec le bleu et ~talement d'un frot-
tis, le d~compte ~tait effectu~ au microscope optique. On
comptait sur 1 000 h~maties le nombre de cellules pr~sentant
un pr~cipit~ granulo-filamenteux, plus ou moins dense, carac-
t~ristique des r~ticulocytes. Cette m~thode est tr~s chrono-
phage et peu precise (27). Les facteurs d'impr~cision sont
nombreux : difficult~ d'identification des r~ticulocytes, en par-
ticulier ceux ne pr~sentant que quelques grains, h~t~rog~n~it~
de la distribution des cellules sur le frottis, erreur li~e & l'~chan-
tillonnage relativement restreint des ~l~ments analys~s.
La CMF et l'emploi de fluorochromes adapt~s comme le thia-
zole orange permettent un d~compte plus rapide, plus precis
et plus reproductible des r~ticulocytes. Cette m~thode donne
de plus des informations sur le degr~ de maturit~ des r~ticulo-
cytes (20) et devrait permettre un meilleur suivi de certaines
th~rapeutiques (traitement de l'an~mie de l'insuffisance r~nale
par l'~rythropoY~tine par exemple) ou de la reconstitution
h~matopo'~'~tique apr~s chimioth~rapie ou greffe de moelle
osseuse.
2. Analyse de I'ADN
Parmi les fluorochromes qui se fixent sur I'ADN, l'iodure de
propidium (IP) est tr~s utilis~ pour ~tudier le contenu cellulaire
en ADN. Apr~s hydrolyse de I'ARN, il se fixe sur I'ADN et
donne une fluorescence proportionnelle & la quantit~ d'ADN
intracellulaire. Avant de se diviser les cellules synth~tisent de
I'ADN (phase S) et fluorescent davantage que les cellules au
repos. On peut ainsi calculer au sein d'une population cellu-
laire la r~partition des cellules selon les diff~rentes phases du
cycle cellulaire (phase G0/G1, phase S, phase G2+M). Ces
calculs n~cessitent rutilisation de Iogiciels sp~cifiques, qui font
appel & diverses m~thodes de calcul (19). De plus, cette ~tude
de I'ADN peut @tre coupl~e & d'autres analyses dans le cadre
d'une ~tude multiparam~trique (double marquage ARN/ADN,
prot~ines/ADN, antig~nes de surface/ADN, antig~nes nu-
cl~aires comme Ki67 ou PCNA/ADN, BrdU/ADN...).
Les applications cliniques de ranalyse de I'ADN sont de trois
ordres : ~tude du degr~ de proliferation d'une population
tumorale avec, en particulier calcul du pourcentage de cellules
en phase S, ~tude de l'ADN-plo~'die avec recherche d'une
population aneuplo'~'de, ~tude de raction d'agents anti-n~opla-
siques.
Une revue g~n~rale r~cente a red~fini rapport de l'~tude de
I'ADN dans diff~rentes pathologies h~matologiques (11).
Comme dans les tumeurs solides, l'index de proliferation des
lymphomes est un param~tre corr~l~ au pronostic, les lym-
phomes ayant les plus forts pourcentages de cellules en phase
S pr~sentant les plus hauts grades de malignit~ (36).
Un contenu anormal en ADN est fr~quemment observ~ dans
les LAL, en particulier chez l'enfant. Une hyperdiplo'~'die, qui
peut @ire d~tect~e par CMF, est associ~e chez renfant & une
dur~e plus Iongue de r~mission (31). Cette anomalie a ~t~ pro-
posse comme moyen de d~tection de la maladie r~siduelle en
association avec ranalyse des antig~nes membranaires (9).
La CMF est une technique de choix pour ~tudier l'action des
drogues agissant sur la synth~se d'ADN, particuli~rement en
h~matologie parce que les cellules tumorales sont d~j& en sus-
pension monocellulaire, que de nombreuses lign~es cellulaires
servant de modules sont disponibles et que certaines de ces
drogues comme les anthracyclines sont spontan~ment fluores-
centes, ce qui permet de suivre leur incorporation dans les cel-
lules.
La CMF permet une analyse in situ de fonctions cellulaires
tr~s vari~es : activit~s enzymatiques, int~grit~ membranaire,
flux calciques, pH intracellulaire, activit~ mitochondriale,
gr&ce & l'apparition de nouveaux fluorochromes sp~cifiques.
Certaines applications int~ressent plus particuli~rement les
h~matologistes. Ainsi les capacit~s de phagocytose des poly-
nucl~aires et des macrophages peuvent-elles ~tre ~tudi~es par
CMF en compl~ment des r~actions d'oxydo-r~duction. La
CMF offre de plus la possibilit~ de travailler sur sang total (12).
La phagocytose est facilement analys~e en utilisant diff~rents
types de particules solides rendues fluorescentes (levures, bac-
t~ries, particules de zymosan, microbilles de latex), qui, une
fois ing~r~es par les cellules, leur conf~rent une fluorescence
(23). Apr~s stimulation des polynucl~aires, le ph~nom~ne de
l'explosion oxydative aboutit & la formation de formes activ~es
de l'oxyg~ne, produites & partir de l'oxyg~ne ambiant et du
NADPH en presence de NADPH oxydase (15). Ce ph~no-
m~ne peut @tre ~tudi~ par la r~duction de r~actifs d~riv~s des
sels de t~trazonium cornme le nitro bleu de t~trazonium
(NBT), qui, incolores dans leur forme oxyd~e, forment un pr~-
cipit~ granuleux bleu-noir de di-formazan quand ils sont
r~duits. La formation de ce pr~cipit~ entra~ne une augmenta-
tion de la diffusion de la lumi~re & 90 ° et une diminution de la
lumi~re diffus~e dans les petits angles, modifications analy-
sables sur un simple cytogramme "taille/structure". Des sub-
strats fluorescents peuvent @tre utilis~s pour ~tudier cette acti-
vit~ d'oxydo-r~duction comme la 2-3 dichlorofluoresc~ine
diac~tate (DCFH-DA) et la dihydrorhodamine 123 (DHR123).
lls sont dits fluorog~nes, c'est-&-dire qu'ils acqui~rent leur pro-
pri~t~ de fluorescence apr~s un ou plusieurs clivages enzyma-
tiques r~sultant de l'activit~ oxydative de la cellule. L'utilisation
des bact~ries directement coupl~es avec du DCFH-DA ou de
la DHR 123 devrait dans un avenir proche am~liorer l'inten-
sit~ et la sp~cificit~ de la r~action (23).
Les possibilit~s d'~tudier les flux calciques par CMF ont permis
de d~velopper de nombreuses applications dont beaucoup
concernent le syst~me h~matopo'~'~tique. Le calcium joue en
effet un r61e important de m~diateur de transduction de
signaux de la membrane cytoplasmique et l'on sait que la fixa-
tion de ligands sur des r~cepteurs membranaires peut initier
des influx calciques. Les substances d~velopp~es pour mesurer
les flux calciques sont des d~riv~s ac~tom~thoxyester, non
charges et non fluorescents (quin-2, indo-1, fura-2, fluo-3,
rhoda-2). Apr~s leur incorporation dans les cellules, des est,-
rases les clivent en produits t~traioniques fluorescents qui res-
tent pi~g~s dans les cellules vivantes. Le fluo-3, qui ~met une
fluorescence verte & 488 nm, permet une ~tude simultan~e
d'autres fluorescences, par exemple celle d'anticorps coupl~s
la phyco~rythrine.
Conclusion
La cytom~trie en flux est devenue en quelques ann~es
un outil performant, qui permet une analyse multipa-
ram~trique rapide de chaque ceilule individuellement.
L'h~matologie a particuli~rement b~n~fici~ de cette
technologie & la fois dans le domaine de la physiolo-
gie cellulaire et darts celui de la pathologie.
La CMF intervient & plusieurs ~tapes en h~matologie
aussi bien pour le diagnostic (d~tection des anomalies
de rh~mogramme, identification des proliferations)
que pour ia recherche de param~tres pronostiques ou
le suivi des traitements. Elle est le compl~ment indis-
pensable de la morphologie et trouve maintenant sa
place dans tous les laboratoires.
34 Revue frangaise des laboratoires, avril/rnai 1995, N ° 275