cytom trie en flux: int r t et applications en h matologie H. J O U A U L T e t M. I M B E R T * RESUME SUMMARY La cytom4trie en flux (CMF) est une technologie permettant l'analyse individuelle de cellules. Les cellules sont align~es selon le principe du centrage hydrodynamique avant de passer devant un faisceau laser. Les ph~nom~nes optiques engendr~s permettent une analyse des caract~ristiques physiques (taille, structure) des cellules ou biologiques apr@s incubation avec des r~actifs le plus souvent fluorescents. La CMF permet d'analyser rapidement un grand nombre de cellules et offre la possibilit~ d'analyse multiparam~trique. Les applications sont nombreuses en h~matologie. La CMF s'est impos~e comme la technique de choix aussi bien pour num~rer les cellules sanguines que pour ~tudier diff~rentes caract~ristiques biologiques des ~l~ments du syst~me h~matopoi~tique : antig~nes cytoplasmiques ou de membrane, contenu en A R N et en ADN, fonctions cellulaires diverses. La CMF est le compl~ment indispensable de la morphologie pour le diagnostic et le suivi d'un certain nombre de pathologies. De plus, les possibilit~s de tri cellulaire offertes par cette technique d~bouchent sur des applications de recherche fondamentale. Flow cytometry (FCM) allows to measure the characteristics of individual cells. Cells in suspension are hydrodynamically focused in a laser beam. The emitted light signals give information on physical parameters and~or biological characteristics after the cells have been incubated with fluorescent reagents. FCM offers the possibility of a rapid, multiparametric analysis of a large number of cells. Hematology is one of the major fields of FCM applications. FCM is the reference technique for total blood count. It is essential for immunophenotyping, measurement of DNA or R N A content and for analysis of cell functions. FCM and morphology are complementary for diagnosis and follow-up of hematologic disorders. FCM offers also cell sorting possibilities which are mainly used in basic research. MOTS-CLg:S KEY-WORDS cytom~trie en flux - antig~nes de membrane - immunoph~notypage - acides nucl~iques - h~mopathies. flow cytometry - cell surface antigens - immunophenotype - DNA content - cell cycle - hematopathology. Introduction La cytom~trie en flux (CMF) permet une mesure individuelle des caract~ristiques physiques et/ou biologiques de cellules en suspension dans un flux liquide qui assure l'alignement des ceUules les unes derriere les autres. Elle fait appel ~ de nombreux concepts et a b~n~fici~ des progr~s r~alis~s dans des domaines tr~s divers (m~canique des fluides, quantification des signaux optiques, technologie des lasers, d~veloppement de l'informatique...). Les pr~mices de ia cytom~trie en flux remontent 1 9 3 4 quand Moldavan essayait de d~nombrer les celo lules d'une population en utilisant un faisceau lumineux interrompu par le passage des cellules mises en suspension dans un tube capillaire. En 1953, Crossland-Taylor utilisait la propri~t~ que poss~dent Revue frangaise des laboratoires, avril/mai 1995, N ° 275 deux flux laminaires coaxiaux de ne pas se m~langer imm~diatement pour aligner les ceUules, et la mesure de la lumi~re diffract~e pour compter les ~l~ments sanguins. En 1949, W. Coulter cr~ait un analyseur de cellules en utilisant des flux constitu~s de liquides ionis~s, au sein desquels les cellules font varier l'imp~dance de part et d'autre d'un micro-orifice au travers duquel elles passent, la variation d'imp~dance ~tant proportionnelle au volume des cellules. Durant les ann~es 50-70, l'apparition des photomulti* Service central d'h~matologie biologique H6pital Henri-Mondor 51, av. du Mal de-Lattre-de-Tassigny 94010 CRETEIL CEDEX TIRES A PART : Mme le Dr H. JOUAULT article regu le 15 d~cernbre 1994, accept~ le 4 janvier 1995. 29 FIGURE 1 Representation sch@matique de la focalisation hydrodynamique ___~S~pe.~O00000 o 0 0 0 0 0 0 0 0 entrafn@e 0 m 0 0 0 0 0 0 000 0 000"-'0 0 ": /~ 0 0 O Liquided'entrainem7 Le liquide d'entrainement acc@i@reles cellules et permet leur alignement une &une A la sortie. FIGURE 2 Sch@ma de fonctionnement d'un cytom~tre en flux plicateurs permettait d'am@liorer la quantification des signaux optiques. Puis i'av@nement du laser comme source lumineuse a am@lior~ la focalisation du faisceau. Sa monochromaticit@ et sa puissance ont permis d'exciter des mol@cules fluorescentes sp@cifiqueo ment fix@es sur des composants cellulaires. Enfin, l'int@gration de l'informatique a permis de multiplier ies donn@es analys@es simultan@ment, d'augmenter leur rapidit@ d'obtention et d'automatiser les appareils. Les cytom~tres sont ainsi devenus des outils performants, fiables, de maniement ais@, m@me pour des non sp@cialistes, et dont ie cofit a consid@rablement diminu@. Cet essor se poursuit grace A i'apparition de r~actifs, anticorps monoclonaux et nouveaux fluoroo chromes en particulier, de plus en plus nombreux, et la simplification des techniques de pr@paration des @chantillons, comme l'utilisation du sang total en h@matologie par exemple. Nous aborderons ici les principales applications de la CMF/~ l'h@matologie sans chercher/l @tre exhaustifs. En effet, l'@tendue des possibilit@s de la CMF est telle, qu'en permanence, de nouvelles analyses sont imagi° n@es et r~alis@es. I. Rappel sur la cytom@trie en flux F.A.LS. : forward angle light scatter ou lumi~re diffus@e dans les petits angles 90 L.S. : 90 ° light scatter ou lumi~re diffus~e & 90 ° FIGURE 3 Comparaison des spectres d'@mission du FITC et de la PE FITC PE 530 575 iI ! I ! l I | ! 0 1 450 500 550 600 650 L o n g u e u r d ' o n d e s (nm) FITC : isothiocyanate de fluoresc~ine PE : phyco@rythrine 3() Le principe de la CMF est bas@ sur la focalisation hydrodynamique de l'@chantillon dans un faisceau lumineux excitateur (28). La suspension cellulaire monodispers@e est inject@e dans l'axe d'une veine liquide de section assez forte, qui s'@coule par une buse de plus faible diam@tre. C o m m e le diam@tre diminue, si le d@bit est constant, la vitesse d'@coulement augmente et les cellules d@filent & raison de plusieurs millers par seconde. Avec un diam@tre de buse et une dilution de la suspension ceUulaire appropri@s, on peut faire passer les cellules une A une et les analyser individuellement (figure 1). La veine liquide est travers@e par un faisceau lumineux, le plus souvent de type laser en raison de sa grande brillance, de sa monochromaticit@ et de sa bonne focalisation. Les cellules ainsi @clair@es @mettent un certain nombre de signaux optiques : lumi@re diffus@e ("light scatter") dans l'axe du laser, repr@sentatrice de la taille des cellules, lumi~re diffus@e & 90 ° donnant des informations sur la structure cellulaire, et fluorescence @mise Iorsque les cellules ont @t@au pr@alable marqu@es directement ou indirectement par un ou plusieurs fluorochromes (figure 2). Les fluorochromes sont des substances organiques qui, sous l'influence d'une radiation de Iongueur d'onde donn@e (~, d'excitation), @mettent une lumi@re de Iongueur d'onde sup@rieure (X d'@mission) caract@ristique de la mol@cule. Par exemple, l'isothiocyanate de fluoresc~'fne (FITC) excit@ 4 9 0 nm @met une lumi@re de Iongueur d ' o n d e 543 nm. L'intensit@ de la lumi@re fluorescente est corr@l@e au nombre de mol@cules de fluorochrqme fix@es sur la cellule. Le choix des fluorochromes utilis@s devra tenir compte de la ou des Iongueurs d ' o n d e @raises par le laser dont est @quip@ l'appareil. On peut utiliser simultan@ment plusieurs fluorochromes ayant le m@me spectre d'excitation et des spectres d%mission diff@rents c o m m e le FITC et la phyco@rythrine (PE) (figure 3). Lorsque les fluorochromes ont des spectres d'excitation diff@rents, on peut, dans certaines conditions, les utiliser sous la forme d'un syst~me coop@ratif de transfert d%nergie, la Iongueur d'onde d%mission du premier fluorochrome servant de lumi@re excitatrice pour le second, qui @met sa propre Iongueur d'onde d%mission. Le couplage PE et rouge Texas est un exemple classique de cette compl@mentarit@ (figure 4). Plusieurs nouveaux fluorochromes de ce type ont @t@ r@cemment d@velopp@s pour la CMF. Ces diff@rents signaux lumineux sont focalis@s, s@par@s en fonction de leur direction et de leur Iongueur d ' o n d e au moyen de filtres et de miroirs puis ils sont achemin@s vers des Revue franqaise des laboratoires, avril/mai 1995, N°275 photod6tecteurs (photodiodes ou photomultiplicateurs) qui les transforment en signaux $1ectriques ; ils ont enfin digitalis6s par un convertisseur analogique/digital qui transcrit l'amplirude de chaque signal en un num~ro de canal, dont la valeur cod6e en bits est utilisable par l'unit6 informatique. Celle-ci peut repr6senter les donn6es re9ues sous forme d'histogrammes de distribution de fr6quence avec en abcisse l'amplitude du param~tre ~tudi~ (en canaux) et en ordonn6e le nombre de cellules par canal (figure 5A). C o m m e chaque cellule peut Smettre plusieurs signaux diff~rents, il est possible de combiner sur une m~me repr6sentation deux param6tres ind6pendants : chaque cellule est alors plac~e, en fonction de la valeur des deux param6tres, sur une case d'un 6chiquier r~alisant un histogramme biparam6trique ou cytogramme. Le hombre de cellules dans chaque case peut ~tre visualis$ sur un troisi6me axe par des courbes de niveaux ou des intensit~s de couleur (contour graphe) (figure 5B). Pour chaque type de repr6sentation, on peut employer une 6chelle lin6aire ou Iogarithmique (3 ou 4 d~cades). Enfin il est possible de conditionner l'acquisition d'un param6tre sur d'autres param~tres, au moyen, en particulier, de zones d'int6r@t (ou cartes de contour ou "bit map"). Ainsi, au sein d'une population h~t6rog6ne, il est possible de cibler les informations provenant de telle ou telle population en tragant ces zones d'int6r~t sur un cytogramme taille/structure. Par exemple, pour l%tude des souspopulations lymphocytaires, tout en utilisant le sang total, il est possible de ne retenir que les informations provenant des lymphocytes m6me si toute la population a 6t6 analys~e Iors du passage devant le laser (figure 6). Les cytom6tres de haut de g a m m e sont ~quipSs d'une option preparative permettant de trier et de purifier des populations cellulaires apr6s leur analyse. Le principe du tri est simple. Le jet liquide contenant les cellules est fractionn~ par la vibration d'un cristal pi6zo-~lectrique puis les gouttelettes sont charg6es ~lectriquement et seront d6vi6es Iors de leur passage dans un champ 61ectrique c r ~ entre les deux plaques d'un condensateur (figure 7). Le choix de la gouttelette ~ charger et le sens de la charge est effectu$ par le syst~me informatique en fonction des souhaits de l'utilisateur et des signaux engendr~s par l'analyse de la cellule contenue dans la gouttelette (4). La mise en oeuvre d'un tri est une op6ration d61icate n6cessitant des comp~tences particuli6res et du temps, et reste r6serv~e aux applications de recherche. En pratique courante, la CMF permet l'analyse rapide d'un grand nombre de cellules, la d~tection de cellules rares, la quantification de plusieurs param6tres pour une m~me cellule. Deux types de param6tres peuvent @tre ~tudi~s : des param~tres intrins6ques, ind6pendants de r6actifs, c o m m e la faille ou la structure cytoplasmique (prSsence de granulations par exemple) et des param~tres extrins6ques qui n6cessitent l'emploi de r6actifs pour leur mise en 6vidence, r~actifs fluorescents le plus souvent. Ce sont par exemple les antig~nes de surface des cellules normales ou des prolif6rations malignes, r6tude des acides nucl~iques (ARN, ADN) ou des param~tres li6s & des fonctions cellulaires particuli6res comme la mesure des flux calciques ou celle du pH intracellulaire (29). FIGURE 4 Principe du transfert d'6nergie ROUGE TEXAS PHYCOERYTHRINE "] , 575 579 ~ 604 :' ~ 1 k: /il i I 1 L1 /" o Longueur d'ondes : excitation laser ~I:~ 5o~ 6oo 700 Longueurd'ondes (nm) _ ~ - - : spectre d'excitation : ~mission de fluorescence • : spectre d'~mission La lumi6re ~mise par la phyco6rythrine sert de lumi~re d'excitation pour le rouge Texas, qui ~met alors sa fluorescence. FIGURE 5 Repr6sentation sch~matique des r6sultats A- Histogramme de distribution de fr6quence hl 3 E 7 " ,_o N ° • . r de canal B- Histogramme biparam~trique / • i LC>e' / . f ..t / ! / ~,'l~ ,/ / ~ ] ~, /-'~-"~.':,..~, '~1I ;, ~6i ~f "' ~~' -J, 9~ 5J O 1 PARAMETRE 2 3 a 5 g 1 2. Analyse des param tres physiques "~-~' L'analyse des param~tres physiques des cellules, qui ne n6cessite pas d'adjonction de r$actifs, est l'une des applications les plus simples de la CFM. On peut ainsi au sein d'une suspension h6t6rog~ne individualiser diff6rentes populations• La premi6re application clinique en h6matologie a ~t6 la numeration des h~maties et des globules blancs principalement parce que le sang est ~ l'~tat naturel une suspension monodispers~e (21). Actuellement, la CMF est la m6thode de r6f6rence pour numSrer les ~l~ments cellulaires circulants. De m@me la formule leucocytaire est maintenant 6tablie dans un grand nombre de cas par des automates compte-globules selon les principes de la CMF. lls utilisent deux technologies : la mesure de l'imp~dance ~lectrique (principe ,, Coulter ,,) ou la mesure de la diffusion de la lumi~re (2). Revue frangaise des laboratoires, avril/rnai 1995, N ° 275 Le principe ,, Coulter ,, permet le comptage et la mesure du volume des ~16ments & partir des impulsions g6n6r~es par le passage des cellules & travers un micro-orifice de part et d'autre duquel est appliqu~ un courant ~lectrique continu. Une approche de la formule leucocytaire peut @tre r6alis~e grace l'histogramme de distribution du volume leucocytaire, les lymphocytes 6tant Iocalis6s entre 35 et 90 femtolitres (fl), les monocytes entre 90 et 160 fl et les granulocytes au-del& de 160 fl (33). La diff6rentielle leucocytaire compl~te est obtenue, sur ce type d'appareil, par rint~gration de trois mesures ind@endantes et simultan~es : le volume d6termin6 par la variation d'imp~dance, la taille et la densit6 nucl6aires par la conductivit6 d'une onde ~lectro-magn6tique et la granularit6 cellulaire par la diffraction d'un faisceau laser (technologie VCS~). Une autre cat~gorie d'appareils (Technicon ~, Ortho ~) utilisent pour la num6ration une mesure de diffraction de la 31 __,c" --'- tent, en association avec les donn~es cytologiques, une sousclassification en leuc~mie lympho'fde chronique B, leuc~mie prolymphocytaire, leuc~mie & tricholeucocytes, lymphome spl~nique & ly villeux, etc. Les HL T expriment de fagon variable les antig~nes CD3, CD7, CD2, CD5, CD4, CD8, les marqueurs de cellules natural killer. Dans certaines pathologies on retrouvera l'expression de mol~cules d'activation. L& encore, la confrontation des donn~es cliniques, morphologiques et immunologiques est indispensable pour le diagnostic : leuc~mie lympho'fde chronique et leuc~mie prolymphocytaire & cellules T, leuc~mielymphome T de l'adulte associ~e au r~trovirus HTLV-1, syndrome de S~zary (35). croissance (30). Elles sont ensuite r~inject~es au malade le moment voulu et permettent une reconstitution h~matologique plus rapide que celle obtenue iors des allogreffes de moelle. La qualit~ du greffon est classiquement contrSl~e par culture avec d~compte des prog~niteurs (CFU-GM en particulied. Mais cette m~thodologie n~cessite un d~lai de 14 & 18 jours pour l'obtention des r~sultats. II est possible de num~rer rapidement et facilement les prog~niteurs h~matopo'i~tiques en num~rant les cellules CD34+ dans les produits de cytaph~r~se avec des r~sultats satisfaisants (18). 2.2. Leuc~mies aigu~s Des modifications d'antig~nes membranaires peuvent ~tre observ~es en pathologie et ~tre facilement analys~es en CMF. C'est le cas de rh~moglobinurie paroxystique nocturne (HPN). II s'agit d'une maladie clonale des cellules souches my~Io'fdes, dont la traduction clinique la plus caract~ristique est une an~mie h~molytique r~sultant d'une sensibilit~ accrue des h~maties au compl~ment. Cette particularit~ est h la base du test classique de Ham Dacie. On sait maintenant que rh~molyse est secondaire h une perte des glycoprot~ines membranaires CD55 (decay-accelerating factor ou DAF) et CD59 (membrane inhibitor of reactive lysis ou MIRL), prot~ines qui contr61ent la d~sactivation du compl~ment. Le d~faut de ces deux prot~ines & la surface de la membrane ~rythrocytaire r~sulte d'un d~ficit de leur mol~cule d'ancrage, le glycosylphophatidyl-inositol (GPI) (25). A l'aide d'anticorps monoclonaux, on peut mettre en ~vidence l'absence des prot~ines li~es & la membrane cellulaire par des liaisons GPI que ce soit les glycoprot~ines CD55, CD59, CD58 pour les h~maties mais aussi CD16 pour les polynucl~aires ou CD14 pour les monocytes. Cette m~thode en CMF, gr&ce fl l'analyse des diff~rentes lign~es my61o'fdes, permet de porter un diagnostic d'HPN m~me apr~s des transfusions de culots ~rythrocytaires (10). Une grande vari~t6 de mol~cules glycoprot~iques (gp) est pr~sente & la surface des plaquettes. Ces mol~cules ont ~t~ identifi~es d'abord par des techniques de biologie cellulaire et sont maintenant reconnues par des anticorps monoclonaux, ce qui donne lieu & une double appellation (5). L'expression de certaines mol~cules est secondaire au ph~nom~ne d'activation plaquettaire (par exemple, les CD62p, CD63, CD107) tandis que d'autres mol~cules sont exprim~es m~me sur les plaquettes au repos, comme les CD9, CD31 ou gp lla, CD36 ou gp IV, le complexe CD41/CD61 ou gp llb/llla et les 4 mol~cules du CD42 (CD42a ou gp IX, CD42b ou gplb c~, CD42c ou gp Ib if, CD42d ou gp V). Ces mol~cules jouent un rSle important dans les processus d'adh~sion et d'agr~gation plaquettaire qui initient la formation du thombus h~mostatique. Des anomalies quantitatives et/ou qualitatives, acquises ou cong~nitales, de ces gp peuvent ~tre & rorigine de la survenue de syndromes h~morragiques. Le diagnostic de ces thombopathies peut ~tre approch~ de fagon rapide et simple en quantifiant ces gp par CMF & l'aide d'anticorps monoclonaux sp~cifiques (34). Ainsi dans la thombasth~nie de Glanzman, on observe, dans les sous-types Iet II, un d~ficit plus ou moins important des mol~cules CD41/CD61 (< 5 % pour le type I, entre 5 et 25 % pour le type II). Dans les rares types III ou variants, off ranomalie du complexe CD41/CD61 est qualitative, la fluorescence peut ~tre normale (34). Dans la maladie de Bernard-Soulier, c'est l'absence de gp Ib (CD42 b e t c) qui sera facilement raise en ~vidence par CMF. Certaines de ces mol~cules plaquettaires pr~sentent des variations antig~niques, constituant des syst~mes allotypiques de groupes plaquettaires. Dans la classification internationale HPA (human platelet alloantigens), cinq syst~mes sont identifies, dont le syst~me HPA 1 (anciennement d~nomm~ PLA1/PLA2) qui consiste en un polymorphisme de la mol~cule CD61. Ce syst~me est fr~quemment impliqu~ dans les thrombop~nies alloimmunes, post-transfusionnelles ou n~o-natales. La CMF peut @tre utilis~e comme m~thode de d~pistage de ces anticorps anti-plaquettes (7). Apr~s incubation du s~rum ~ tester avec des plaquettes-cibles, on r~v~le l'~ventueUe fixation d'un anticorps sur les plaquettes par une anti-globuline fluorescente. Cette technique de d~pistage doit @tre suivie d'autres techniques permettant l'identification precise de rallo-anticorps. Le principe de l'immunoph~notypage des leuc~mies aigu~s repose sur la notion que les cellules leuc~miques constituent une proliferation fig~e & un stade donn~ de diff~renciation. Le profil immunologique analys~ est compar~ aux diff~rents stades connus des lign~es normales. L'apport de l'immunoph~notypage a ~t~ particuli~rement important pour les leuc~mies aigu~s lymphoblastiques (LAL) puisque c'est le seul ~I~ment positif permettant de rattacher les blastes & une origine lympho'fde B ou T puis de d~finir des sous-groupes de maturation. Les LAL & pr~curseurs lympho'fdes B, qui repr~sentent 75 80 % des LAL, expriment dans la plupart des cas les antig~nes HLA-DR, CDI9, CD 22 cytoplasmique ou de surface, CD10 et moins souvent l'antig~ne CD20. L'antig~ne CD34 est present dans 60 & 70 % des cas. L'expression des cha~nes I~.d'immunoglobulines intracytoplasmiques caract~rise les LAL I ~ : B . Les LAL B, qui ne repr~sentent que 2 & 3 % des LAL,-~kpriment des cha~nes I~ ~ la surface des blastes et correspondent dans une tr~s grande majorit~ des cas & un aspect cyto~'.gique de LAL 3 (LAL de type Burkitt) de la classification du ~i'oupe coop~ratif franco-am~ricano-britannique (FAB). . . . . . . . Les LAL T sont identifi~es par la presence des antig~nes CD7, CD5, CD2, CD3 de surface ou surtout intracytoplasmique, diversement associ~s (13). Les antig~nes CD1, CD4 ou CD8 ne sont exprim~s que dans un nombre restreint de cas repr~sentant des formes plus matures. Parmi les leuc~mies aigu~s ne pr~sentant pas de signes cytologiques et cytochimiques de diff~renciation my~Io'fde (absence de granulations azurophiles dans le cytoplasme, de corps d'Auer, de my~Ioperoxydase ou d'est~rases monocytaires), l'immunoph~notypage a permis d'identifier un faible pourcentage (1 & 2 %) de leuc~mies aigu~s n'exprimant que des antig~nes associ~s aux lign~es my~Io'fdes et class~es leuc~mies aigu~s my~Ioides tr~s peu diff~renci~es (LAM O dans la classification FAB) (6). En ce qui concerne les autres leuc~mies aigu~s my~Io'fdes, le diagnostic est d~j~ pos~ apr~s l'analyse cytologique et cytochimique du sang et de la mcelle (17). L'immunoph~notypage permet de conforter la classification en sous-groupes malgr~ l'absence de recoupement exact entre l'immunoph~notypage et la classification morphologique. Les principaux antig~nes exprim~s par les blastes my~Io'ides sont les CD33, CD13, CD15 pour les blastes granuleux, les CD36 et CD14 Iorsqu'un contingent monocytaire est present. Dans les leuc~mies avec diff~renciation m~gacaryocytaire, on recherchera les CD41, CD42, CD61, CD36 et pour les proliferations avec diff~renciation ~rythro'fde, le CD36 et diff~rentes antiglycophorines. La presence de l'antig~ne CD34 dans environ 40 & 50 % des LAMest en g~n~ral inversement corr~l~e au degr~ de maturation des blastes, t~moignant du fait que le CD 34 est un~antig~ne qui n'est present que Iors des premiers stades de diff,renciation de chaque lign~e. 3. Numeration des cellules souches circulantes La presence de prog~niteurs h~matopo'f~tiques dans le sang circulant, leur recirculation importante apr~s chimioth~rapie permettent la constitution d'un greffon utilisable pour ]a r~alisation d'autogreffe de moelle (3). Les cellules souches du sang p~riph~rique sont collect~es chez les patients par cytaph~r~se, apr~s une mobilisation par chimioth~rapie et/ou facteurs de Revue frangaise des laborateires, avril/mai 1995, N ° 275 4. Mise en ~vidence de modifications des antig~nes de surface 33 4. Etude des acides nucl iques 5. Analyse des fonctions cellulaires 1. Analyse de I'ARN D'assez nombre~Lx fluorochromes peuvent colorer I'ADN et/ou I'ARN (24). La mise en ~vidence d'ARN ribosomal dans les ~rythrocytes permet de distinguer les r~ticulocytes des h~maties mQres, qui ne contiennent plus d'ARN. La num~ration des r~ticulocytes, qui est un examen primordial pour la classification et le diagnostic d'une an~mie, ~tait jusqu'& maintenant effectu~e par une m~thode manuelle utilisant des colorants vitaux comme le bleu de m~thyl~ne ou le bleu de cr~syl. Apr~s incubation du sang avec le bleu et ~talement d'un frottis, le d~compte ~tait effectu~ au microscope optique. On comptait sur 1 000 h~maties le nombre de cellules pr~sentant un pr~cipit~ granulo-filamenteux, plus ou moins dense, caract~ristique des r~ticulocytes. Cette m~thode est tr~s chronophage et peu precise (27). Les facteurs d'impr~cision sont nombreux : difficult~ d'identification des r~ticulocytes, en particulier ceux ne pr~sentant que quelques grains, h~t~rog~n~it~ de la distribution des cellules sur le frottis, erreur li~e & l'~chantillonnage relativement restreint des ~l~ments analys~s. La CMF et l'emploi de fluorochromes adapt~s comme le thiazole orange permettent un d~compte plus rapide, plus precis et plus reproductible des r~ticulocytes. Cette m~thode donne de plus des informations sur le degr~ de maturit~ des r~ticulocytes (20) et devrait permettre un meilleur suivi de certaines th~rapeutiques (traitement de l'an~mie de l'insuffisance r~nale par l'~rythropoY~tine par exemple) ou de la reconstitution h~matopo'~'~tique apr~s chimioth~rapie ou greffe de moelle osseuse. 2. Analyse de I'ADN Parmi les fluorochromes qui se fixent sur I'ADN, l'iodure de propidium (IP) est tr~s utilis~ pour ~tudier le contenu cellulaire en ADN. Apr~s hydrolyse de I'ARN, il se fixe sur I'ADN et donne une fluorescence proportionnelle & la quantit~ d'ADN intracellulaire. Avant de se diviser les cellules synth~tisent de I'ADN (phase S) et fluorescent davantage que les cellules au repos. On peut ainsi calculer au sein d'une population cellulaire la r~partition des cellules selon les diff~rentes phases du cycle cellulaire (phase G0/G1, phase S, phase G2+M). Ces calculs n~cessitent rutilisation de Iogiciels sp~cifiques, qui font appel & diverses m~thodes de calcul (19). De plus, cette ~tude de I'ADN peut @tre coupl~e & d'autres analyses dans le cadre d'une ~tude multiparam~trique (double marquage ARN/ADN, prot~ines/ADN, antig~nes de surface/ADN, antig~nes nucl~aires comme Ki67 ou PCNA/ADN, BrdU/ADN...). Les applications cliniques de ranalyse de I'ADN sont de trois ordres : ~tude du degr~ de proliferation d'une population tumorale avec, en particulier calcul du pourcentage de cellules en phase S, ~tude de l'ADN-plo~'die avec recherche d'une population aneuplo'~'de, ~tude de raction d'agents anti-n~oplasiques. Une revue g~n~rale r~cente a red~fini rapport de l'~tude de I'ADN dans diff~rentes pathologies h~matologiques (11). Comme dans les tumeurs solides, l'index de proliferation des lymphomes est un param~tre corr~l~ au pronostic, les lymphomes ayant les plus forts pourcentages de cellules en phase S pr~sentant les plus hauts grades de malignit~ (36). Un contenu anormal en ADN est fr~quemment observ~ dans les LAL, en particulier chez l'enfant. Une hyperdiplo'~'die, qui peut @ire d~tect~e par CMF, est associ~e chez renfant & une dur~e plus Iongue de r~mission (31). Cette anomalie a ~t~ proposse comme moyen de d~tection de la maladie r~siduelle en association avec ranalyse des antig~nes membranaires (9). La CMF est une technique de choix pour ~tudier l'action des drogues agissant sur la synth~se d'ADN, particuli~rement en h~matologie parce que les cellules tumorales sont d~j& en suspension monocellulaire, que de nombreuses lign~es cellulaires servant de modules sont disponibles et que certaines de ces drogues comme les anthracyclines sont spontan~ment fluorescentes, ce qui permet de suivre leur incorporation dans les cellules. 34 La CMF permet une analyse in situ de fonctions cellulaires tr~s vari~es : activit~s enzymatiques, int~grit~ membranaire, flux calciques, pH intracellulaire, activit~ mitochondriale, gr&ce & l'apparition de nouveaux fluorochromes sp~cifiques. Certaines applications int~ressent plus particuli~rement les h~matologistes. Ainsi les capacit~s de phagocytose des polynucl~aires et des macrophages peuvent-elles ~tre ~tudi~es par CMF en compl~ment des r~actions d'oxydo-r~duction. La CMF offre de plus la possibilit~ de travailler sur sang total (12). La phagocytose est facilement analys~e en utilisant diff~rents types de particules solides rendues fluorescentes (levures, bact~ries, particules de zymosan, microbilles de latex), qui, une fois ing~r~es par les cellules, leur conf~rent une fluorescence (23). Apr~s stimulation des polynucl~aires, le ph~nom~ne de l'explosion oxydative aboutit & la formation de formes activ~es de l'oxyg~ne, produites & partir de l'oxyg~ne ambiant et du NADPH en presence de NADPH oxydase (15). Ce ph~nom~ne peut @tre ~tudi~ par la r~duction de r~actifs d~riv~s des sels de t~trazonium cornme le nitro bleu de t~trazonium (NBT), qui, incolores dans leur forme oxyd~e, forment un pr~cipit~ granuleux bleu-noir de di-formazan quand ils sont r~duits. La formation de ce pr~cipit~ entra~ne une augmentation de la diffusion de la lumi~re & 90 ° et une diminution de la lumi~re diffus~e dans les petits angles, modifications analysables sur un simple cytogramme "taille/structure". Des substrats fluorescents peuvent @tre utilis~s pour ~tudier cette activit~ d'oxydo-r~duction comme la 2-3 dichlorofluoresc~ine diac~tate (DCFH-DA) et la dihydrorhodamine 123 (DHR123). lls sont dits fluorog~nes, c'est-&-dire qu'ils acqui~rent leur propri~t~ de fluorescence apr~s un ou plusieurs clivages enzymatiques r~sultant de l'activit~ oxydative de la cellule. L'utilisation des bact~ries directement coupl~es avec du DCFH-DA ou de la DHR 123 devrait dans un avenir proche am~liorer l'intensit~ et la sp~cificit~ de la r~action (23). Les possibilit~s d'~tudier les flux calciques par CMF ont permis de d~velopper de nombreuses applications dont beaucoup concernent le syst~me h~matopo'~'~tique. Le calcium joue en effet un r61e important de m~diateur de transduction de signaux de la membrane cytoplasmique et l'on sait que la fixation de ligands sur des r~cepteurs membranaires peut initier des influx calciques. Les substances d~velopp~es pour mesurer les flux calciques sont des d~riv~s ac~tom~thoxyester, non charges et non fluorescents (quin-2, indo-1, fura-2, fluo-3, rhoda-2). Apr~s leur incorporation dans les cellules, des est,rases les clivent en produits t~traioniques fluorescents qui restent pi~g~s dans les cellules vivantes. Le fluo-3, qui ~met une fluorescence verte & 488 nm, permet une ~tude simultan~e d'autres fluorescences, par exemple celle d'anticorps coupl~s la phyco~rythrine. Conclusion La cytom~trie en flux est devenue en quelques ann~es un outil performant, qui permet une analyse multiparam~trique rapide de chaque ceilule individuellement. L'h~matologie a particuli~rement b~n~fici~ de cette technologie & la fois dans le domaine de la physiologie cellulaire et darts celui de la pathologie. La CMF intervient & plusieurs ~tapes en h~matologie aussi bien pour le diagnostic (d~tection des anomalies de rh~mogramme, identification des proliferations) que pour ia recherche de param~tres pronostiques ou le suivi des traitements. Elle est le compl~ment indispensable de la morphologie et trouve maintenant sa place dans tous les laboratoires. Revue frangaise des laboratoires, avril/rnai 1995, N ° 275 1. ANDRE, C. - Cytom~trie en flux : application aux ph~notypages lymphocytaires dans la pathologie associ~e au VIH et dans les h~mopathies lymphoi'des chroniques. Rev. Fr. Lab., 1991, 2 1 8 : 59-68. 2. BAIN B.J. - Blood cells - A practical guide. Lippincott Company, Philadelphie, 1989, 322 p. 3. B E A U J E A N F., FLESCH M., G A N E M G., HERVE, P., KUENTZ M., PULIK M. - Autogreffe de moelle osseuse. In : H~matologie, B. Dreyfus, Flammarion, Paris, 1992, 1474 p. 4. BELLOC F. - Les principes de la cytom~trie en flux. Rev. Fr. Lab., 1991, 2 1 8 : 21-27. 5. 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