LSVT-13-Enzymes de restriction

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EXTRAIT DU BO :
Notions et contenus :
La révolution technologique du début des années 70.
L’utilisation des enzymes de restriction ouvre la voie du clonage des gènes et de leur séquençage. En
contribuant à une évolution importante du concept de gène et de la perception du polymorphisme, elle
fait entrer la génétique dans l’ère des biotechnologies.
Activités envisageables :
Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction et électrophorèse.
CADRE PÉDAGOGIQUE :
Avant d'étudier la transgenèse et la construction d’organismes génétiquement modifiés (OGM) avec
l’insertion d’un gène dans le génome d’une espèce receveuse, on cherche à comprendre la technique
d’isolement d’un gène à l’aide de ciseaux moléculaires (les enzymes de restriction) et l’identification de
ce dernier après coloration et électrophorèse.
Objectifs de méthode :
o Réaliser techniquement en suivant un protocole
o puis adopter une démarche explicative
Objectifs de connaissances :
o Les enzymes de restriction permettent de découper l’ADN et de réaliser des manipulations des gènes.
Plusieurs possibilités d’organisation de la classe:
 Possibilité n°1 :
1- Démonstration
2- Présentation résultats préparés à l’avance
3- Travail sur logiciel
 Possibilité n°2 :
1- Démonstration ou un élève remplit 1 puits soit 6 élèves
2- Pendant le temps de latence due à la migration de 45 min ( maxi) : travail sur logiciel
THÈME : Des débuts de la génétique aux enjeux actuels des biotechnologies Niveau : Spécialité terminale S
TP ENZYMES DE RESTRICTION, OUTILS DE LA BIOLOGIE
MOLECULAIRE

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Enzymes de restriction
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Coin laboratoire et matériel :
 Référence : Kit Pierron www.pierron.fr
Composition du kit de produits
chimiques Ref.13914
- 2 doses pour préparer 2 gels
d’agarose
- Tampon Tris acétate EDTA ou
tampon TAE
pour préparer le gel et pour remplir la
cuve à électrophorèse
- Colorant pour gel d’agarose (à
utiliser en fin de manipulation après
l’électrophorèse)
Réf. 13913
- ADN de phage λ digéré par Hind III pour
remplir 6 puits Réf. 00084
- ADN de phage λ digéré par EcoR1 pour remplir
6 puits Réf. 00083
- Bleu de dépô t
- Solution de dépôt
 le matériel de laboratoire indispensable
Une alimentation (elle peut alimenter 2 cuves d’où 2 gels) Réf. 13176
cuve à électrophorèse spécifique pour gel d’ADN Réf. 13340
solution tampon Réf. 13114
gel d’agarose Réf. 13914
colorant d’ADN Réf. 13914
colorant pour le suivi de la migration Réf. 13913
boîte de coloration des gels (un récipient quelconque suffit) Réf. 01626
micropipette 100 microlitres avec cônes Réf. 13061 et Réf. 13065

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PRINCIPE :
- L’ADN est une molécule acide, dans un tampon pH elle sera chargée négativement.
- L’ADN migre dans un gel d’agarose immergé dans un tampon soumis à un courant électrique.
- Les molécules d’ADN se dirigent vers le pôle positif (anode) plus ou moins vite en fonction de la taille
des fragments. Plus les fragments sont petits, plus ils se déplacent rapidement dans le gel.
Comment agissent les enzymes de restriction ?
Elles digèrent la molécule d’ADN en fonction des séquences nucléotidiques reconnues. On peut l’assimiler à
des ciseaux moléculaires.
Comment suivre la migration des fragments d’ADN ?
Grâce au bleu de dépôt qui est un colorant permettant de suivre visuellement l’avancée de la migration.
Il est constitué de deux substances : le bleu de bromophénol et le xylène cyanol :
Il alourdit les séquences d’ADN qui coulent mieux au fond du puits.
Le bleu de bromophénol marque le front de migration tandis que le xylène cyanol suit les dernières
séquences d’ADN qui ont migré.
Ainsi le bleu de dépôt permet de repérer l’évolution des séquences dans le gel et de savoir quand stopper la
migration.
Comment visualiser les fragments d’ADN séparés ?
Après migration, l’ADN est coloré en bleu par la solution de dépôt.

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PROTOCOLE EXPERIMENTAL :
PREPARATION à J-1
 Préparation de 1 litre de tampon TAE
Ajouter 900mL d’eau déminéralisée au 100mL de tampon TAE du kit on obtient 1000mL de tampon TAE prêt
à l’emploi.
 Préparation du gel de migration
Mélanger dans un erlenmeyer l’agarose au tampon TAE
selon les indications de la notice
Passer au micro-ondes puissance 1000W pendant 2 à 3
minutes. Surveiller toutes les 30 secondes l’état du gel, il
doit être transparent et sans grumeaux.
La réussite du TP réside pour une bonne part dans la
qualité du gel.
Le couler dans le moule pourvu d’un peigne.
 Préparation de l’ADN de phage
Dans chaque flacon il y a 60 microlitres d’ADN de phage ce qui permet de remplir 3 puits.
Prélever 20 microlitres d’ADN auxquels on ajoute 10 microlitres de bleu de dépôt. On obtient une solution de
30 microlitres qui sera déposée dans un puits.
 Préparation du colorant du gel
Ajouter 100 ml d’eau distillée au flacon contenant le colorant et agiter pour homogénéiser. 50 ml sont
nécessaires pour colorer un gel. On peut donc colorer 2 gels.
QUELQUES REMARQUES PRATIQUES :
Conseils et astuce : la conservation des produits
Au Réfrigérateur
Au Congélateur
 Tampon
 Colorant du gel
 Les 3 « ADN » digérés de phage λ
 Bleu de dépôt
1- Démouler le gel en enlevant le peigne vers le haut, six puits calibrés sont désormais visibles dans le gel.
2- Placer le portoir à gel dans la cuve

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Aligner les puits sur le trait de repère bleu.
Ce côté représente le pôle négatif.
3- Remplir la cuve de tampon
 Verser le tampon jusqu’à ce que le gel soit complètement
recouvert.
 Les puits doivent se remplir de tampon
4- Déposer 20 microlitres d’ADN digéré, préalablement mélangé au bleu de dépôt, dans chaque puits grâce
à l’utilisation d’une micropipette