LSVT13 THÈME : Des débuts de la génétique aux enjeux actuels des biotechnologies Niveau : Spécialité terminale S TP ENZYMES DE RESTRICTION, OUTILS DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE EXTRAIT DU BO: Notions et contenus : La révolution technologique du début des années 70. L’utilisation des enzymes de restriction ouvre la voie du clonage des gènes et de leur séquençage. En contribuant à une évolution importante du concept de gène et de la perception du polymorphisme, elle fait entrer la génétique dans l’ère des biotechnologies. Activités envisageables : Digestion de l’ADN par des enzymes de restriction et électrophorèse. CADRE PÉDAGOGIQUE : Avant d'étudier la transgenèse et la construction d’organismes génétiquement modifiés (OGM) avec l’insertion d’un gène dans le génome d’une espèce receveuse, on cherche à comprendre la technique d’isolement d’un gène à l’aide de ciseaux moléculaires (les enzymes de restriction) et l’identification de ce dernier après coloration et électrophorèse. Objectifs de méthode: o o Réaliser techniquement en suivant un protocole puis adopter une démarche explicative Objectifs de connaissances : o Les enzymes de restriction permettent de découper l’ADN et de réaliser des manipulations des gènes. Plusieurs possibilités d’organisation de la classe: Possibilité n°1 : 1- Démonstration 2- Présentation résultats préparés à l’avance 3- Travail sur logiciel Possibilité n°2 : 1- Démonstration ou un élève remplit 1 puits soit 6 élèves 2- Pendant le temps de latence due à la migration de 45 min ( maxi) : travail sur logiciel © PIERRON Enzymes de restriction 1 / 10 LSVT13 LSVT13 Coin laboratoire et matériel: Référence : Kit Pierron www.pierron.fr Composition du kit de produits chimiques Ref.13914 - 2 doses pour préparer 2 gels d’agarose - Tampon Tris acétate EDTA ou tampon TAE pour préparer le gel et pour remplir la cuve à électrophorèse - Colorant pour gel d’agarose (à utiliser en fin de manipulation après l’électrophorèse) Réf. 13913 - ADN de phage λ digéré par Hind III pour remplir 6 puits Réf. 00084 - ADN de phage λ digéré par EcoR1 pour remplir 6 puits Réf. 00083 - Bleu de dépô t - Solution de dépôt le matériel de laboratoire indispensable Une alimentation (elle peut alimenter 2 cuves d’où 2 gels) Réf. 13176 cuve à électrophorèse spécifique pour gel d’ADN Réf. 13340 solution tampon Réf. 13114 gel d’agarose Réf. 13914 colorant d’ADN Réf. 13914 colorant pour le suivi de la migration Réf. 13913 boîte de coloration des gels (un récipient quelconque suffit) Réf. 01626 micropipette 100 microlitres avec cônes Réf. 13061 et Réf. 13065 © PIERRON Enzymes de restriction 2/10 LSVT13 LSVT13 PRINCIPE: - L’ADN est une molécule acide, dans un tampon pH elle sera chargée négativement. L’ADN migre dans un gel d’agarose immergé dans un tampon soumis à un courant électrique. Les molécules d’ADN se dirigent vers le pôle positif (anode) plus ou moins vite en fonction de la taille des fragments. Plus les fragments sont petits, plus ils se déplacent rapidement dans le gel. Comment agissent les enzymes de restriction ? Elles digèrent la molécule d’ADN en fonction des séquences nucléotidiques reconnues. On peut l’assimiler à des ciseaux moléculaires. Comment suivre la migration des fragments d’ADN ? Grâce au bleu de dépôt qui est un colorant permettant de suivre visuellement l’avancée de la migration. Il est constitué de deux substances : le bleu de bromophénol et le xylène cyanol : Il alourdit les séquences d’ADN qui coulent mieux au fond du puits. Le bleu de bromophénol marque le front de migration tandis que le xylène cyanol suit les dernières séquences d’ADN qui ont migré. Ainsi le bleu de dépôt permet de repérer l’évolution des séquences dans le gel et de savoir quand stopper la migration. Comment visualiser les fragments d’ADN séparés ? Après migration, l’ADN est coloré en bleu par la solution de dépôt. © PIERRON Enzymes de restriction 3/10 LSVT13 LSVT13 PROTOCOLE EXPERIMENTAL: PREPARATION à J-1 Préparation de 1 litre de tampon TAE Ajouter 900mL d’eau déminéralisée au 100mL de tampon TAE du kit on obtient 1000mL de tampon TAE prêt à l’emploi. Préparation du gel de migration Mélanger dans un erlenmeyer l’agarose au tampon TAE selon les indications de la notice Passer au micro-ondes puissance 1000W pendant 2 à 3 minutes. Surveiller toutes les 30 secondes l’état du gel, il doit être transparent et sans grumeaux. La réussite du TP réside pour une bonne part dans la qualité du gel. Le couler dans le moule pourvu d’un peigne. Préparation de l’ADN de phage Dans chaque flacon il y a 60 microlitres d’ADN de phage ce qui permet de remplir 3 puits. Prélever 20 microlitres d’ADN auxquels on ajoute 10 microlitres de bleu de dépôt. On obtient une solution de 30 microlitres qui sera déposée dans un puits. Préparation du colorant du gel Ajouter 100 ml d’eau distillée au flacon contenant le colorant et agiter pour homogénéiser. 50 ml sont nécessaires pour colorer un gel. On peut donc colorer 2 gels. QUELQUES REMARQUES PRATIQUES : Conseils et astuce : la conservation des produits Au Réfrigérateur Tampon Colorant du gel Au Congélateur Les 3 « ADN » digérés de phage λ Bleu de dépôt 1- Démouler le gel en enlevant le peigne vers le haut, six puits calibrés sont désormais visibles dans le gel. 2- Placer le portoir à gel dans la cuve © PIERRON Enzymes de restriction 4 / 10 LSVT13 LSVT13 Aligner les puits sur le trait de repère bleu. Ce côté représente le pôle négatif. 3- Remplir la cuve de tampon Verser le tampon jusqu’à ce que le gel soit complètement recouvert. Les puits doivent se remplir de tampon 4- Déposer 20 microlitres d’ADN digéré, préalablement mélangé au bleu de dépôt, dans chaque puits grâce à l’utilisation d’une micropipette © PIERRON Enzymes de restriction 5/10 LSVT13 LSVT13 © PIERRON Effectuer les dépôts en stabilisant le mouvement par calage des coudes sur la paillasse. Ne pas percer le fond des puits ! Déposer 20µL de chaque solution dans les différents puits : Puits 1 : ADN du phage λ digéré par EcoR1 Puits 2 : ADN du phage λ digéré par HindIII Puits 3 : ADN du phage λ digéré par EcoR1 Puits 4 : ADN du phage λ digéré par HindIII Puits 5 : ADN du phage λ digéré par EcoR1 Puits 6 : ADN du phage λ digéré par HindIII Enzymes de restriction 6/10 LSVT13 LSVT13 5- La migration Brancher la cuve. La migration doit avoir lieu juste après les dépôts. Brancher la cuve au générateur. Faire migrer 42 minutes à la tension délivrée par l’alimentation. Le bleu de dépôt permet de suivre la migration et de juger le moment opportun pour stopper la manipulation. On peut arrêter la migration lorsque le bleu de bromophénol est à 1cm de l’extrémité du gel. 6- Sortie du gel et coloration Sortir le gel de la cuve délicatement par glissement (attention aux doigts !). Placer le gel dans le colorant pendant 5 minutes en agitant légèrement. Immerger le gel dans le colorant © PIERRON Enzymes de restriction 7/10 LSVT13 LSVT13 7- Rinçage et décoloration Vider le colorant qui reste réutilisable Eliminer l’excès de colorant de la surface avec quelques ml d’alcool à 70% pendant quelques secondes Eliminer l’alcool puis rincer à l’eau du robinet plusieurs fois pour éliminer totalement le colorant 8- Révélation Puits 1 2 3 4 5 6 Sens de migration des fragments de restriction 2 fragments de restrictions obtenus avec Hind III migration obtenue en 41 minutes + coloration 5 minutes + rinçage à l’eau On voit apparaître les bandes en quelques minutes mais l’intensité maximale de la coloration s’observe au bout de quelques heures. Si le gel a été trop décoloré, procéder à une nouvelle étape de coloration-décoloration. Le gel se conserve ensuite au réfrigérateur pendant deux mois dans un récipient en plastique hermétique avec un petit peu d’eau au fond (pas trop sinon le gel continue à se décolorer). Les gels peuvent être observés sur un rétroprojecteur. © PIERRON Enzymes de restriction 8 / 10 LSVT13 LSVT13 Activité 1 : Suivre un protocole pour réaliser une électrophorèse de l'ADN digéré par des enzymes de restriction 1- Démouler le gel en enlevant le peigne vers le haut, six puits calibrés sont désormais visibles dans le gel 2- Placer le portoir à gel dans la cuve et aligner les puits sur le trait de repère bleu. Ce côté représente le pôle négatif. 3- Remplir la cuve de tampon Verser le tampon dans la cuve à électrophorèse, le gel doit être complètement recouvert ainsi que les puits. 4- Placer les solutions d’ADN digéré dans chacun des 6 puits grâce à une micropipette Entraînement à l’utilisation de la micropipette par prélèvement d’eau : 20 microlitres. Déposer 20µL de chaque solution dans les 6 puits : Puits 1 : ADN du phage λ digéré par EcoR1 Puits 2 : ADN du phage λ digéré par HindIII Puits 3 : ADN du phage λ digéré par EcoR1 Puits 4 : ADN du phage λ digéré par HindIII Puits 5 : ADN du phage λ digéré par EcoR1 Puits 6 : ADN du phage λ digéré par HindIII Précautions : Effectuer les dépôts en stabilisant le mouvement par calage des coudes sur la paillasse. Ne pas percer le fond des puits ! 5- La migration Brancher la cuve La migration doit avoir lieu juste après les dépôts. Brancher la cuve au générateur Faire migrer 30 à 45 minutes en fonction de l’avancée du front de migration. Le bleu de dépôt permet de suivre la migration et de juger le moment opportun pour stopper la manipulation. On peut arrêter la migration lorsque le bleu de bromophénol est à 1cm de l’extrémité du gel. 6- Sortie du gel et coloration Sortir le gel de la cuve délicatement par glissement (attention : mettre éventuellement des gants). Immerger le gel dans le colorant bleu pendant 5 minutes en agitant légèrement. 7- Rinçage et décoloration Vider le colorant qui reste réutilisable Eliminer l’excès de colorant de la surface avec quelques ml d’alcool à 70% pendant quelques secondes Eliminer l’alcool puis rincer à l’eau du robinet plusieurs fois pour éliminer totalement le colorant. 8- Révélation On voit apparaître les bandes en quelques minutes mais l’intensité maximale de la coloration s’observe au bout de quelques heures. © PIERRON Enzymes de restriction 9 / 10 LSVT13 LSVT13 Activité 2 : Rechercher à l'aide du logiciel ANAGENE comment les enzymes de restriction ECOR1 et HINDIII coupent l'ADN du phage lambda Précaution avant le TP : Avoir chargé au préalable au niveau de chaque poste le fichier « Adnphage.edi » dans Anagène extrait du CD capacités expérimentales. 1- Donner la séquence de bases reconnue par chacune des 2 enzymes, elle apparaît en rouge à l’écran. 2- Quelle est la taille de l’ADN du phage en nombre de nucléotides ? 3- Schématiser une carte de restriction qui intègre un site de coupure. Ce dernier apparaît sous la forme d’une barre verticale rouge. 4- Consigner dans un tableau à construire : a. le nombre de sites de coupures, b. les n°s de site de coupure (compter à partir du nucléotide coupé), c. le nombre de fragments obtenus, d. Calculer la taille des fragments. 5- Connaissant le principe de l’électrophorèse qui consiste à séparer des molécules d’un mélange d’après leur taille grâce à une migration dans un champ électrique du pôle négatif vers le pôle positif, anticiper la séparation des fragments issus de la digestion par ECOR1 en schématisant les résultats. 6- Confronter au terme de la migration (manipulation de l’activité 1) les résultats réels à ceux traduits par votre schéma. Extrait de la fiche technique d’Anagène Lancer Anagène Fichier ouvrir cliquer sur « Adnphage.edi » ok Sélectionner les 5 séquences du phage en cliquant sur leur gauche l’ADN du phage est donné par séquences de 10 000 nucléotides inscrites comme : « lam 1-10 », puis les 10 000 suivants : « lam10-20 », « lam20-30 », etc… Traiter (dans le bandeau supérieur) action enzymatique Représentation : cocher « graphique » et « tableau » Choisir : sites à 6 bases sélectionner parmi toutes les enzymes disponibles : « EcoR 1 » et « Hind III » Ajouter Ok Choisir : Fenêtre « en mosaïque » Sélectionner ensuite (grâce à l’ascenseur) chacune une séquence de l’ADN du phage comme par exemple la 1ère séquoence «lam 1-10 ». © PIERRON Enzymes de restriction 10/10 LSVT13
