Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein. Facteurs pronostiques, facteurs prédictifs. Quels standards en 2005 ? P.-M. Martin « Toute chose simple est théoriquement fausse, toute chose compliquée est pratiquement inutilisable. » Paul Valéry Le développement des biomarqueurs tissulaires représente le type même de la recherche biologique de transfert. Le but de cette revue est non d’être exhaustive, mais de présenter les buts, la démarche actuellement recommandée pour l’évaluation et la validation des marqueurs biologiques tissulaires et de faire un bilan pour les cancers du sein en 2005. Ces trente dernières années, une étape a été franchie par le développement sur le plan national et international d’une standardisation de l’approche thérapeutique des cancers permettant une évaluation de l’efficacité des protocoles thérapeutiques. Mais, malgré une augmentation régulière du nombre de protocoles thérapeutiques et du coût global des traitements liés notamment au développement de la chimiothérapie, le bénéfice en terme de survie n’est pas à la hauteur de nos espérances (1, 2). Ces succès limités de l’approche clinique actuelle dans les cancers s’expliquent, d’une part, par le fait que les seuls critères anatomo-cliniques classiques standards actuels des protocoles et essais thérapeutiques ne rendent pas assez compte de l’importante hétérogénéité évolutive des tumeurs et sont de très faibles indicateurs potentiels de la sensibilité thérapeutique, et, d’autre part, par le manque de molécules ciblées et adaptées au processus fonctionnel individuel de chaque tumeur. Ces constatations ont transformé en 1998 en challenge pour les directeurs du NIH/NCI l’hypothèse issue de la recherche fondamentale (3, 4), et émise en 1978 par W. L. McGuire : la notion de marqueur tumoral doit évoluer vers la définition d’une analyse tissulaire multiparamétrique permettant l’établissement, l’évaluation et validation d’une classification moléculaire des tumeurs humaines. Les récepteurs hormonaux dans les cancers du sein en étaient la première démonstration. Cette classification serait indispensable pour progresser vers des traitements ciblés et efficaces 84 Cancer du sein (5). L’évolution des connaissances en biologie du cancer, ainsi que les progrès technologiques réalisés à ce jour, permettent d’envisager une meilleure définition moléculaire et fonctionnelle des tumeurs solides, aboutissant au concept de classification moléculaire des tumeurs humaines et au développement de thérapeutiques innovantes mieux adaptées à la spécificité de chaque tumeur. Une classification moléculaire des tumeurs associée aux données cliniques et anatomo-pathologiques devrait contribuer, dès le diagnostic, à l’évaluation du potentiel métastatique du cancer, isolant les patients à haut risque évolutif, échappant de ce fait à un contrôle thérapeutique loco-régional, et contribuant, en outre, à la mise en évidence dans le tissu tumoral de marqueurs associés à l’existence d’une sensibilité ou résistance aux molécules pharmacologiques anticancéreuses. Ce double but doit permettre la sélection des patients selon leur risque évolutif et leur sensibilité potentielle aux drogues, évitant les inconvénients des surtraitements et les effets iatrogènes qui peuvent en découler, orientant précocement vers l’innovation thérapeutique les patients à haut risque évolutif peu ou non sensibles aux traitements conventionnels. Enfin, cette démarche vers une classification moléculaire des tumeurs doit renforcer la notion de standardisation des protocoles en considérant de manière objective des groupes homogènes sur le plan biologique pour l’évaluation de l’efficacité des molécules thérapeutiques. L’étape ultérieure du développement de ce concept analytique moléculaire concerne l’identification potentielle du haut risque individuel constitutif afin d’exercer une politique de prévention. Définition d’un biomarqueur tumoral Un biomarqueur tumoral est une molécule ou une fonction cellulaire caractéristique d’un cancer (ou d’une personne à haut risque de cancer) par rapport à sa contre-partie normale (en termes de tissus ou de population). Un marqueur peut être également une molécule associée à une fonction cellulaire qui caractérise le potentiel évolutif particulier d’un processus tumoral (invasivité, néo-angiogenèse, résistance aux thérapeutiques…). Durant les vingt dernières années, les progrès des connaissances fondamentales et les progrès technologiques ont permis l’identification d’un très grand nombre de marqueurs tumoraux putatifs. En dépit de ces avancées apparentes, dans les tumeurs solides, peu de marqueurs tumoraux ont été promus et recommandés dans une utilisation clinique courante faute de stratégie d’évaluation cohérente. Pour les marqueurs tumoraux, les termes « facteur pronostique » ou « facteur prédictif » sont utilisés dans différents contextes. Spécifiques de la pathologie et du tissu investigués (par exemple marqueur mesuré dans le tissu tumoral, cellules tumorales, sérum, fluides pathologiques...). Ces facteurs ont différents potentiels (ou champs) d’utilisation en clinique parfaitement décrits par G.-S. Ginsburg et J.-J. McCarthy (6) (figure1). Les biomarqueurs tumoraux pronostiques sont évalués chez des patients ne recevant aucune thérapie ou des protocoles standards. Ces biomarqueurs pronostiques Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 85 peuvent être utilisés pour estimer le potentiel évolutif d’un processus tumoral spécifique et sélectionner les patients à haut risque évolutif susceptibles d’être orientés vers des protocoles thérapeutiques adjuvants. Les biomarqueurs tumoraux prédictifs d’une réponse ou non à une thérapie donnée requièrent pour leur évaluation deux groupes de patients, de préférence randomisés, pour un protocole thérapeutique spécifique par opposition, soit à l’absence de toute thérapie, soit à un protocole standard type. La valeur prédictive des biomarqueurs est obtenue par l’analyse de tests statistiques évaluant l’interaction entre le traitement et le statut des biomarqueurs (figure 2). Figure 1 - De la définition d’une prédisposition, du dépistage au monitorage des protocoles thérapeutiques. Figure 2 - Définition des biomarqueurs pronostiques/prédictifs/mixtes. Classification basée sur l’évaluation de l’évolution pronostique des populations de patients classés en fonction de la présence (Fact+) ou de l’absence (Fact-) du biomarqueur dans leur tissu tumoral. Evolution spontanée (A) ou avec un traitement adjuvant ou complémentaire (B). A : évaluation pour une population sans traitement associé. B : évaluation pour une population avec traitement associé. 86 Cancer du sein Les critères finaux d’évaluation clinique des marqueurs pronostiques ou prédictifs peuvent être divers, tels que : la survie globale, la survie spécifique associée à la pathologie, l’intervalle libre de toute évolution pathologique, le temps à progression. L’évaluation de la réponse tumorale à une thérapie donnée pouvant être la modification du volume tumoral ou même la modulation d’un biomarqueur étroitement liée au volume tumoral. L’efficacité d’un protocole thérapeutique peut être exprimée en terme de bénéfice absolu ou relatif. Le bénéfice relatif en termes de survie est souvent exprimé comme un risque relatif (à savoir le risque de décès dans le groupe expertisé divisé par le risque de décès dans le groupe central), ou un « odds ratio » relatif (odds de survie versus de décès dans le groupe expertisé divisé par l’odds de survie versus décès dans le groupe contrôlé. La probabilité ou « hasard ratio » obtenu dans les modèles statistiques de régression multiple est souvent utilisé pour estimer le risque relatif. Les tests statistiques d’évaluation quantitatives et qualitatives des biomarqueurs font appel aux tests statistiques standards habituellement utilisés dans les évaluations cliniques et biologiques. Mais peu à peu s’est établie une nécessité d’une évaluation multifactorielle pour ne retenir que les facteurs et marqueurs biologiques individuellement informatifs, éliminant de ce fait des marqueurs redondants, pour répondre à une question clinique donnée telle la sélection des patients à haut risque ou potentiellement sensibles à une thérapeutique spécifique. La technique la plus généralement adaptée est dérivée d’un modèle d’évaluation de risques développé pour les assurances : le modèle de Cox. Si ce modèle est actuellement un standard, il demande une définition exacte des variables étudiées et ne prend pas en compte la variation de certains paramètres biologiques ou cliniques dans le temps, entre autres au cours de l’évolution du processus tumoral (4 et l’ensemble de la revue Breast Cancer Research and Treatment 1992 (22) : 187-293). Des modèles plus complexes non acceptés comme standards sont utilisés par certaines équipes. Les approches analytiques multiparamétriques font appel également à des techniques de classification descriptives ou de hiérarchisation pour définir les relations possibles entre facteurs, ou pour définir des clusters ou ensembles regroupant des individus proches, si ce n’est pas identiques. Des pathologies tumorales, qui présentent un même profil biologique ou évolutif, se retrouvent ainsi isolées par des techniques analytiques telles les analyses en composantes principales ou analyse factorielle discriminante. Bases objectives de jugement pour l’évaluation et la pertinence des biomarqueurs tumoraux En 1996, devant l’abondance, la dispersion et l’inhomogénéité des travaux et publications évaluant des marqueurs tumoraux potentiels, l’American Society of Clinical Oncology a réuni un panel d’experts dans le but de poser des bases objectives de jugement pour l’évaluation et la pertinence des biomarqueurs tumoraux (7-10). Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 87 Ce groupe d’experts, dans le cadre de l’ASCO, a émis un certain nombre de remarques et recommandations. Ils attirent l’attention sur le fait que les bases méthodologiques pour définir des études correctement évaluables sont communes à toutes les phases de la pratique clinique. Si ces bases sont actuellement bien admises pour l’évaluation des protocoles thérapeutiques et répondent à des règles précises pour le développement d’une molécule thérapeutique, phase 1, phases 2, 3, 4, critère de réponse, toxicité, etc., ces mêmes bases méthodologiques sont en revanche mal connues ou peu utilisées dans le cadre de l’évaluation des biomarqueurs tumoraux. Les experts rappellent dans ce cadre que : – les études d’évaluation, comme pour les études cliniques protocolaires, doivent être basées sur des hypothèses clairement établies, répondre et prendre en compte une définition exacte des populations étudiées, des différentes sous-populations, des analyses, des techniques de dosage, avec mise en évidence de techniques analytiques répondant aux critères d’assurance de qualité et contrôle de qualité ; – les études doivent clairement identifier les problèmes éthiques et légaux associés à l’accès aux échantillons tissulaires individuels, aux informations du dossier médical des patients pour lesquels l’expertise tissulaire est effectuée et permettre une évaluation claire du ratio coût-bénéfice, coût-efficacité. Le travail du groupe d’experts a débouché sur la proposition d’un système d’évaluation des biomarqueurs « Tumor Marker Utility Grading System » (TMUGS), qui repose sur : – des recommandations pour la conduite des phases d’évaluation ; – les deux principes de base suivants : le concept d’utilité et le degré d’évidence. Recommandations pour la conduite des phases d’évaluation d’un paramètre biologique Ceci peut se décomposer en quatre phases : – phase 1 : issue d’une hypothèse ou évidence biologique, une cible moléculaire est définie, une méthode analytique adaptée à la caractérisation et à la mesure de cette cible dans les tissus pathologiques permettant une étude de faisabilité ; – phase 2 : au sein d’un laboratoire maîtrisant la technique analytique, une étude pilote est conduite sur un échantillonnage clinique précis. Le rôle du laboratoire expert est de faire évaluer la standardisation de la méthode analytique et la mise en route de contrôle de qualité pour que cette méthode analytique soit accessible à un réseau de laboratoires, enfin d’établir une étude multifactorielle qui positionne le nouveau biomarqueur par rapport aux facteurs classiques ou déjà évalués, montrant les corrélations possibles et la valeur indépendante de ce facteur ; – phase 3 : cette phase utilise les outils mis au point en phase 2. Un réseau de laboratoires associé aux groupes cliniques ayant constitué des banques tissulaires conduit plusieurs études rétrospectives permettant une méta-analyse sur l’utilité clinique du ou des facteurs prédictifs ou pronostiques ; 88 Cancer du sein – phase 4 : mise en route et analyse d’un essai clinique prospectif dédié, déterminant la valeur pronostique et la valeur prédictive des biomarqueurs tumoraux dans un contexte d’utilisation prospective. Le concept d’utilité Le concept d’utilité définit la puissance relative des biomarqueurs pronostiques et débouche sur une échelle d’utilité clinique. Facteurs pronostiques (figure 3) Figure 3 - Le concept d’utilité pour les facteurs pronostiques. Concept d’utilité basé sur la différence du risque évolutif ∆RR entre deux populations de patientes ayant la présence ou non dans leur tumeur primitive du biomarqueur pronostique. L’évaluation pour chaque population du risque propre RRr (1 et 2) par rapport à une population référente permet de calculer secondairement le ∆RR, RR1-RR2. Il repose plus sur la différence de risque relatif ∆RR, comme nous l’avons précisé, que sur la signification statistique, la « p-value » dépendant, entre autres, de la taille de l’échantillon. Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 89 Dans le cadre de toute pathologie tumorale pour évaluer le concept d’utilité des nouveaux paramètres pronostiques, les patients peuvent être divisés à partir des facteurs cliniques et anatomiques classiques en trois classes d’évaluation pronostique, en l’absence de toute thérapeutique systémique adjuvante. Par exemple, dans le cancer du sein : - classe de très bon pronostic avec moins de 10 % de décès à dix ans ; - classe de pronostic intermédiaire avec entre 10 et 50 % de décès à dix ans ; - classe de très mauvais pronostic avec plus de 50 % de décès à dix ans. La relative puissance d’un biomarqueur pronostique peut être définie comme sa capacité à reclasser les patients définis sur des critères anatomo-pathologiques standards (figure 4). Figure 4 - Définition de la puissance relative des facteurs pronostiques. A : % de survie à dix ans en l’absence de toute thérapeutique. Exemple : un facteur pronostique puissant est celui qui sépare par sa présence ou non deux populations de patientes à pronostic excellent et à pronostic le plus péjoratif. Les classes d’évolution clinique (pronostic excellent, pronostic moyen, pronostic péjoratif) découlent des études anatomo-cliniques historiques. La puissance d’un biomarqueur s’évalue à l’importance de déplacement du pronostic prévu à partir des seuls éléments anatomo-cliniques : - un facteur pronostique puissant déplace les patients à travers les trois classes standards d’un très bon pronostic ou pronostic le plus péjoratif (ou inversement) ; - un facteur pronostique moyen déplace les patients entre deux classes classiques contiguës : de très bon à moyen ou de moyen à très péjoratif ; - enfin, un facteur pronostique faible déplace les patients au sein d’une même classe standard ne modifiant pas le stade pronostique pré-établi. 90 Cancer du sein Facteurs prédictifs (figure 5) Il prend en compte la valeur prédictive (VPR) qui différencie le risque relatif (RR) dans un groupe homogène de patients sans ou avec traitement spécifique, les groupes homogènes étant isolés sur la présence ou l’absence du facteur prédictif évalué. La puissance du concept d’utilité clinique du facteur prédictif est établie entre une très forte VPR > 4 et une faible VPR entre 1 et 2. Le concept d’utilité des facteurs pronostiques et prédictifs débouche sur une échelle d’utilité clinique, échelle évoluant pour les facteurs présentant une utilité potentielle de + à +++. Figure 5 - Le concept d’utilité pour les facteurs prédictifs. Deux populations de patientes sont caractérisées par la présence (m+) ou l’absence (m-) d’un marqueur prédictif dans leurs tumeurs primitives. La différence d’évolution ∆RR d’une même population avec ou sans traitement ∆RR m+, ∆RR m- permet de calculer le coefficient d’utilité de marqueur prédictif VPR. + Le biomarqueur a une signification biologique dans le processus tumoral, mais ne peut être utilisé dans une décision clinique pour trois raisons : - le biomarqueur proposé est corrélé à un marqueur dont le test est déjà établi et l’avantage du nouveau biomarqueur n’est pas démontré ; - le biomarqueur apporte une information indépendante, mais n’apporte pas la preuve d’une utilité quelconque pour une décision clinique ; - les résultats préliminaires sont encourageants, mais ne sont pas informatifs concernant le niveau d’évidence d’utilité clinique. Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 91 ++ Le biomarqueur apporte une information indépendante et nouvelle, utile dans la décision clinique, mais, s’il ne peut être utilisé isolément, il peut et doit être pris en considération dans des conditions spécifiques. +++ Le biomarqueur peut être utilisé comme un critère spécifique dans la décision clinique et doit être introduit comme standard dans la pratique clinique. Le concept de niveau d’évidence Le degré d’évidence (Level Of Evidence, LOE) découle d’une analyse des différentes expertises disponibles pour un marqueur donné et, de ce fait, doit être réévalué régulièrement (6-9). À terme, la conduite d’expertises selon les phases décrites permet l’évaluation du niveau d’évidence d’utilité clinique des biomarqueurs tumoraux (cf. D. F. Hayes) (Level Of Evidence = LOE) (figure 6). Figure 6 - Déroulement d’une expertise des biomarqueurs prédictifs ou pronostiques. Niveau III / LOE III – niveau le plus bas d’évidence : confirmation d’une hypothèse biologique par une large étude rétrospective. Les propositions thérapeutiques et le suivi des patients peuvent être ou non déterminés de façon prospective. Mais l’analyse statistique d’évaluation des marqueurs qui se fait de façon rétrospective ne répond pas à des critères pris en compte de façon prospective lors du descriptif du ou des protocoles thérapeutiques (objectif principal ou secondaire de l’étude). 92 Cancer du sein Niveau II / LOE II : utilisation d’une technique analytique répondant au critère d’assurance qualité et contrôle de qualité. Analyse de protocoles cliniques prospectifs où l’étude du marqueur est un objectif secondaire tant sur le plan du descriptif du protocole que de l’étude statistique. Niveau I / LOE I – niveau le plus élevé d’évidence : l’évaluation de l’activité clinique du biomarqueur tumoral fait l’objet d’une importante méta-analyse positive ou compilation positive et concordante des études de niveaux II et III. Validation par un protocole clinique prospectif « ad hoc » ou l’évaluation du biomarqueur tumoral est l’objectif principal de l’étude dans son descriptif et analyse statistique. Protocole incluant des groupes homogènes de patients sur les plans cliniques et thérapeutiques, ou, de façon idéale, un protocole clinique prospectif idéal pour l’évaluation des biomarqueurs. Protocole prospectif randomisé dans lequel le diagnostic et les décisions cliniques thérapeutiques sont déterminés dans un bras en partant sur les bases des résultats d’analyse des biomarqueurs. Dans le bras contrôle, le diagnostic et les décisions thérapeutiques sont, en revanche, indépendants des résultats de l’analyse des biomarqueurs. L’enjeu pour le développement d’un panel de biomarqueurs est clairement démontré par l’analyse de l’ensemble des conférences de consensus sur la prise en charge des cancers du sein, notamment sans envahissement ganglionnaire (No) (11-15). Une classification idéale reflèterait parfaitement les données épidémiologiques et cliniques qui montrent que seuls 30 % des cancers No évoluent à dix ans, nécessitant de ce fait un traitement systémique adjuvant. La conférence de consensus de Saint-Gallen (14-15), établie uniquement sur des critères cliniques et anatomiques, préjuge des indications justifiées de traitement systémique pour 90 % des patientes No entraînant, de ce fait, un sur-traitement et l’exposition à des effets iatrogènes liés à celui-ci (figure 7). Il en est de même pour les autres conférences de consensus établies à ce jour. Figure 7 - Reconnaissance et isolement des populations de patientes présentant un cancer du sein No classé en maladie locale ou maladie systémique selon une classification idéale en accord parfait avec l’évolution clinique (A) et selon les critères de la Conférence de consensus de Saint-Gallen (B). Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 93 Bilan 2005 des biomarqueurs pronostiques ou prédictifs dans les cancers du sein Dans les cancers du sein, durant ces vingt dernières années, un très grand nombre de biomarqueurs tumoraux tissulaires ont été étudiés par des techniques biochimiques, ELISA ou immuno-histochimiques (tableau 1) (16-18). Cependant, un très petit nombre de ceux-ci ont été retenus dans les recommandations (figure 8) (10, 18, 19). Parmi les marqueurs évalués comme ayant un niveau d’évidence I, les récepteurs hormonaux RO_ et RP, ainsi que HER2, se retrouvent plutôt comme facteurs prédictifs. Les biomarqueurs pronostiques de niveau LOE I+++ sont UPA et PAI1, qui n’avaient pas été pris en compte dans l’analyse du panel d’experts de l’ASCO (2000, update). Ce, entre autres, du fait d’une série importante de publications entre 20002003 (figure 8). Niveau d’évidence Paramètres Pronostiques (échelle d’utilité) I ROα/RP HER 2 UPA + PAI I +++ +/+++ +++ +++ ? II Prolifération (Phase S) ++ ++ TK ++ +++ + transcriptome Mutations P53 MdR (induction) TS Topo II Cyclin D1 Angiogenèse ROβ Bcl2/Bax IGF1/AKT Transcriptome (L. Vant’Veer) + ++ + ? + ? ? ? ? ++ + ++ + ? ? ? + ? III Prédictifs (échelle d’utilité) Tt endocriniens (AE) Herceptin® AE/Chimiothérapie Antimétabolites Anthracyclines Anthracyclines Taxane Antimétabolites Antracyclines Tt. endocriniens Figure 8 - Marqueurs biologiques dans les cancers du sein LOE et échelle d’utilité/Niveau d’évidence (évaluation 2002). Tableau publié par le GETNA (OSMO) Magdelenat H., van t’Veer L. Classification réactualisée en 2003 d’après les références 10 et 18. 94 Cancer du sein Biomarqueurs pronostiques LOE I/+++ dans le cancer du sein UPA/PAI1 (8) : Les facteurs de risque de dissémination métastatique infraclinique (tableau 1) les plus étudiés sont les protéases et inhibiteurs. Les plus performants dans les analyses multiparamétriques sont l’activateur du plasminogène type urokinase (uPA) et les inhibiteurs des activateurs du plasminogène (PAI1 et PAI2). À titre d’exemple, dans le cancer du sein, la population No représente globalement une classe de faible risque dans laquelle cependant 20 % des patientes ont une évolutivité à six ans, 30 % à dix ans. Les taux tissulaires élevés d’UPA et PAI1 se sont révélés, dans des études conduites sur le plan européen, comme les paramètres les plus efficaces pour sélectionner cette sous-population à évolution rapide au sein d’une population de malades à risque classique clinique faible (20-24) (figure 9). Figure 9 - Évolution des marqueurs pronostiques de LOE I +++ des cancers du sein (19912002). Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 95 Tableau 1 - liste des biomarqueurs pronostiques et prédictifs étudiés dans le cancer du sein. Tumor characteristics 1. Histological features : type, grade, number of blood vessels, vascular invasion, necrosis. 2. Stage (tumor, node, metastasis), bone marrow micrometastases. 3. Steroid receptors : ER, PgR, AR, vitamin-D receptor ; steroid receptor coactivators and coinhibitors. 4. Membrane receptors for hormones and growth factors. LHRH Prolactin receptor IGF1 – IGFII Insulin receptor EGFR – herceptin family receptors (HER2/HER3/HER4) TGFβ – family receptors SSR family receptors VEGF – family receptors FGF – family receptors Urokinase receptors 5. Enzymes, proteins and other cytoplasmatic factors Plasminogen activator expression, (urokinase and tissular types). Plasminogen activator inhibitors (PAI1,PAI2). Cathepsin D, B, and L Metalloproteases/collagenases (MMP4-9-8..), tissue inhibitor metalloprotease (TIMP1,2) PSA (kallicrein) Thymidine kinase activity Thymidine Synthase activity Growth factor content (EGF, TGF_ and _, IGF1, Amphiregulin) Tyrosine kinase activities Heat shock proteins (MSP 27-70-90). Aromatase activity (CYP 19) Haptoglobin-related protein (Hpr) epitope expression Adhesion factors (integrin, E cadherin) Glutathione –S-transferase 3 Human milk fat globule antigens (HMFG-1) Prostaglandin levels Cox2 activity Hypoxia-inducible factor-1_ Breast cancer resistance protein Multidrug-resistance-associated protein Bcar1/p130 as protein 6. Chromosomal abnormalities Cytogenetic Ploidy Amplification, (over)expression of oncogenes (c-myc, HER2/neu/c-erbB2, int2, ras) Deletion or mutation of suppressor genes (P53, RB, nm23) BRCA1/2 mutations 7. Cell proliferation indices Labeling index S-phase fraction Ki-67 antigen (RB1) 8. Clonogenicity 9. Immunological phenotypes (revue réactualisée 2003 d’après J. A. Foekens et J.G. M. Klijn (16-18). 96 Cancer du sein À l’inverse, dans des populations de cancer du sein avec envahissement ganglionnaire (N+), les taux tissulaires faibles de ces mêmes paramètres (UPA, PAI1) définissent une sous-population représentant des cancers à évolution lente, répondant parfaitement aux thérapeutiques. Cette sous-population représente, en fait, des cancers à évolution lente, mais diagnostiqués après un délai d’évolution important. La démarche analytique mise en place dans le cadre de réseaux européens pour les cancers du sein (EORTC, Biomed I) a permis une évaluation dans le cadre d’analyses multiparamétriques et une validation dans des essais prospectifs permettant d’atteindre le LOE I+++, uPA et PAI 1 (figure 10) où ils sont actuellement pris en compte comme facteurs de sélection des patientes pour des essais thérapeutiques en cours (25-29) (figures 11 et 12). Figure 10 - Etude du RBG/EORTC : méta-analyse des dosages des récepteurs UPA/PAI1 dans les tumeurs primitives de 8 377 regroupant 15 laboratoires – équipes cliniques européennes ayant permis avec le suivi des patientes sur dix ans (RFS : survie sans évolution clinique) dans des études rétrospectives de calculer le risque relatif dans chaque population. Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 97 Essai prospectif de niveau 1 permettant d'évaluer la valeur pronostique et prédictive de uPA/PAI 1 (Chemo NO) (Thomssen C et Jänicke F, Eur. J. Cancer (2000) 36 : 293-306, Jänicke et al., JNCI (2001) 93 : 913-20 pre-and Postmenopausal receptor-positive uPA and PAI-1 low ca. 55 % of all patients ca. 45 % of pts. uPA and/or PAI-1 high Randomisation Inclusion criteria : node-negative, MO 1 cm, 5 cm Stratification Study design Observation (A) Observation (B 1) CMF x 6 (B 2) Figure 11 - Cancer du sein NO. Protocole européen Biomed I. Promoteurs : Pr F. Janicke, Pr M. Schmidt, université de Munich, 1995. Figure 12 - Résultat du protocole Biomed I versus l’étude Pilot ayant justifié la mise en route du protocole Biomed I. Arrêt à la demande du comité d’éthique à la cinquième année devant la confirmation du risque déterminé par la mesure de UPA PAI1, ce qui rendait inéthique le bras randomisé non traité. 98 Cancer du sein Figure 13 - Positionnement de la classification biologique associée à la mesure UPA/PAI1 par rapport à la classification idéale (A) et les critères de Saint-Gallen (B) (figure 7). Dans le cancer du sein, l’utilisation des paramètres tissulaires UPA PAI1 permet une sélection biologique des patientes No d’un groupe ne nécessitant pas de thérapeutique systémique (60 %), et d’une population nécessitant une thérapeutique adjuvante (40 %), ces pourcentages étant proches de la réalité clinique (70 % -30 %) (figure 13). Le rôle majeur pronostique de UPA/PAI 1 peut s’expliquer par leur activité physio-pathologique. Dans le phénomène cancéreux, les activités protéolytiques mises en jeu sont la conséquence d’un réseau complexe et interactif de plusieurs systèmes protéolytiques. Les systèmes impliqués incluent les métalloprotéases, les sérines protéases, dont la plasmine générée à partir du plasminogène par un système d’activation spécifique, les cystines protéases, ainsi que d’autres enzymes extracellulaires (30-34). Ces différents systèmes enzymatiques interagissent non seulement dans le but d’activation de « pro-enzymes » et enzymes actifs, mais également certains enzymes partagent les mêmes substrats (35-39) et interagissent dans le processus d’invasivité, de migration et de néo-angiogenèse. Le système d’activation du plasminogène est un système protéolytique complexe capable de produire de grandes quantités de plasmine (enzymes actifs à partir de son précurseur, le plasminogène). Le plasminogène est une prosérine protéase de 90kDa produite par le foie et sécrétée dans le système vasculaire à très haute concen- Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 99 tration (1,5 à 2 mM). Le plasminogène peut également être trouvé dans les compartiments extra-vasculaires (30, 40). De ce fait, cette pro-enzyme plasmatique et tissulaire est disponible de façon importante pour une activation par des systèmes spécifiques (le système d’activation du plasminogène PA). La plasmine est une protéase relativement non spécifique qui peut, directement ou à travers sa capacité d’activer des prométallo-protéases, dégrader la plupart des constituants de la matrice cellulaire (41-44). De plus, la plasmine active divers systèmes tels que les facteurs de croissance (à titre d’exemple, le TGFβ) (45-46), qui peuvent secondairement moduler les interactions intervenant entre tumeur et environnement, et, entre autres, le développement des phénomènes de néo-angiogenèse et de migration cellulaire (47-50). Récemment, il a été mis en évidence que la néoangiogenèse peut par ailleurs être fortement inhibée par un fragment du plasminogène (l’angiotensine) (51-52). L’activation du plasminogène est catalysée par deux types d’activateurs différents, les activateurs de type urokinase (uPA) et de type tissulaire (tPA). Récemment, il a également été montré que le facteur XIIa était également un activateur physiologique du plasminogène (53). De très nombreux arguments suggèrent un rôle majeur de l’activation du plasminogène par uPA durant l’invasivité tumorale. De nombreuses études utilisant l’immuno-histochimie et l’hybridation in situ ont montré que l’uPA et uPAR sont surtout exprimés dans les foyers tumoraux invasifs, que ce soient des tumeurs expérimentales ou des cancers humains. Certains modèles cellulaires sont connus pour exprimer à la fois uPA et uPAR. Dans d’autres cas, les cellules cancéreuses aux foyers d’invasivité tumorale n’expriment que uPAR et ce sont les cellules stromales adjacentes aux cellules tumorales invasives qui produisent l’uPA (ce qui a été démontré, entre autres, dans les adénocarcinomes du côlon) (54-55). Par ailleurs, plusieurs modèles expérimentaux ont montré un retard à la croissance, que ce soient des tumeurs primitives ou des métastases, lorsque l’activité uPA est inhibée (56-64). Dans un modèle de souris transgénique uPA-/-, il a été montré que la transformation maligne et la croissance des tumeurs mélaniques chimiquement induites étaient réduites (65). Le rôle de PAI1 dans le développement tumoral n’est, à ce jour, pas clairement élucidé. Il joue probablement des rôles différents et variables selon le type de cancer. Quatre hypothèses différentes peuvent être proposées quant au rôle de PAI1 dans la progression tumorale : - PAI1 protège l’ensemble du stroma tumoral de l’autodégradation secondaire à la plasmine activée par l’uPA ; - PAI1 joue un rôle dans l’établissement de l’invasivité et la dissémination des cellules tumorales, en réduisant l’adhésion cellulaire par un déplacement de l’uPAR ou des intégrines de leur interaction avec la vitronectine ; - PAI1 est lié à la néo-angiogenèse. Exprimé dans les capillaires borgnes, il est de ce fait un marqueur de l’intensité de la pénétration de la néo-vascularisation dans la tumeur ; - PAI1 ne serait qu’un marqueur d’une phase aiguë inflammatoire associé à certaines croissances tumorales. 100 Cancer du sein Biomarqueurs prédictifs LOE.I +++ dans les cancers du sein/Récepteurs hormonaux HER2 Récepteurs hormonaux (figures 8 et 14) Biomarqueur facteur préditif LOE / Niveau d'évidence I Récepteurs d'hormones ROα + RP Pronostic (I/II) Prédictif (I/II) + +++ (hormonothérapie)* • NSABP • SWOG • ·FNCLCC • RBG/EORTC • EBCTCG • DBCG Figure 14- Etudes cliniques majeures ayant permis d’évaluer la valeur prédictive ou pronostique de la mesure des récepteurs hormonaux Roα RP. Les premiers dosages des récepteurs ont été développés en 1972 (66) pour sélectionner les patientes susceptibles de répondre à une endocrinothérapie de castration qui était alors la seule thérapeutique accessible avec l'hormonothérapie à dose pharmacologique dans le cadre d'un traitement palliatif (67-70). De très nombreuses études, réalisées sur des séries importantes de patientes, ont mis en évidence, depuis, l'étroite corrélation entre la présence de récepteurs hormonaux et la réponse à l'hormonothérapie anti-estrogénique et/ou à des protocoles de chimiothérapie type CMF. Par ailleurs, la durée de réponse est corrélée aux taux des récepteurs (71-72). L'utilisation systématique de ces dosages et l'étude de la survie des patientes à la fin des années soixante-dix ont ensuite permis au groupe de W L McGuire de montrer leur valeur pronostique. Cependant, l'interférence des protocoles de thérapeutique adjuvante n'avait pas été prise en compte dans cette analyse princeps. L'utilisation des R.Oα. seuls permet une prédiction de la réponse au traitement dans environ 75 % des cas. Le manque de précision de la prédiction de la réponse est principalement dû à l'absence de réponse de certaines tumeurs R.Oα.+. Ceci peut provenir de l'hétérogénéité d'expression des R.Oα. dans les cellules tumorales ou à la présence d'un R.Oα. dépourvu d'action biologique. Le récepteur de progestérone (RP) (71-73), ou PS2 (74) dont la synthèse est induite par le R.Oα., ont été proposés secondairement pour améliorer la valeur prédictive des R.Oα. Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 101 La détection des récepteurs hormonaux a été dans un premier temps réalisée par des méthodes biochimiques (75-78) dont la fiabilité a été largement validée. Dans le bilan, il est précisé que seule cette technique a fait l’objet d’une évolution et une validation, avec mise en place de protocoles méthodologiques standardisés et de contrôles de qualité (76-90). Cette approche a permis l'établissement de seuils spécifiques précis au-delà desquels on peut escompter une réponse clinique ou établir un pronostic (67-69, 91-94). Les méthodes biochimiques-biologiques impliquent la préparation d'un extrait tissulaire après homogénéisation du tissu. La production d'anticorps anti-récepteurs a ouvert de nouvelles perspectives techniques, dosages immuno-enzymatiques ou détection sur des coupes histologiques. Une bonne corrélation en terme de positivité est généralement rapportée entre les techniques biochimiques et immuno-histochimiques. L’insuffisance majeure de l’immuno-histochimie réside dans le manque d’une expression quantitative objective du contenu en récepteur. Or une efficacité supérieure des thérapeutiques endocriniennes a été démontrée lorsque les taux en récepteurs sont plus élevés (67-68, 95-96). Les deux approches méthodologiques sont en fait complémentaires, chacune ayant ses avantages relatifs (97-99). L'importance clinique des récepteurs a été établie à une époque où seuls les dosages biochimiques traditionnels étaient disponibles. On a ainsi montré l'évolution péjorative des patientes dont les tumeurs étaient dépourvues de récepteurs (100-101). Il est cependant difficile, d'après les études initiales incluant des patientes ayant reçu divers protocoles thérapeutiques, de distinguer leur valeur pronostique propre de leur valeur d'indicateur thérapeutique (10, 67-72). Dans les études univariées, les estimations de risque relatif sont de l'ordre de 1,5 à 2, et elles sont souvent inférieures dans les études multivariées. Un apparent paradoxe a été décrit concernant les tumeurs en post-ménopause ayant des taux très élevés de ROα. Ces tumeurs évoluent spontanément relativement rapidement, mais répondent extrêmement bien aux protocoles d'hormonothérapie, suggérant une stimulation de ces tumeurs par des facteurs endocriniens endogènes, associés à une activité aromatase tissulaire péritumorale (102-104). En 1996, un deuxième récepteur (ROβ), situé sur le chromosome 14, a été isolé (Kuiper et al. 1996). Le premier, localisé sur le chromosome 6, a donc été rebaptisé ROα. Ils se distinguent par un faible degré d’homologie dans le domaine A/B et dans le domaine de liaison aux estrogènes (régions DEF). Une étude récente par RTPCR montre que les deux types peuvent coexister dans les cancers du sein (105). La détection classique des RO dans le cytosol des tumeurs par radio-ligand permettait d’évaluer les présences des deux types de récepteurs dans la tumeur. Par contre, il est possible que le dosage immuno-enzymatique, fait avec les anticorps commercialisés, ne permette pas d’évaluer la quantité des deux RO avec la même sensibilité. Ce dosage mis au point pour quantifier la concentration du ROα est considéré comme un facteur de bon pronostic et de sensibilité au traitement hormonal. Les récepteurs continuent à jouer un rôle central dans la décision d'un traitement hormonal. Le consensus actuel dans le cancer du sein est donc que les récepteurs hormonaux sont des paramètres corrélés en premier lieu à la réponse thérapeutique et ne sont liés à l'évolutivité des patientes que secondairement, à savoir que 102 Cancer du sein leur évolutivité est influencée par la mise ou non en route de protocoles thérapeutiques. De ce fait, les récepteurs hormonaux sont plutôt des facteurs prédictifs que pronostiques (paramètres de sélection et de réponse et liés à la réponse aux thérapeutiques). La limite de prédictivité parfaite d’hormono-sensibilité liée à la seule détermination des récepteurs hormonaux telle que nous l’avons décrite a conduit depuis 1992 a proposé plusieurs hypothèses et expertises complémentaires, afin de mieux cerner le pourcentage de tumeurs primitives ROα+, certes, mais répondant mal aux protocoles d'hormonothérapie. Dans ce cadre, il a été suggéré : - RO+, certes, mais une hétérogénéité cellulaire avec ROα- secondaire à un temps de doublement rapide associé à cette fraction cellulaire tumorale. Ceci nécessite, pour certains auteurs, la détermination séquentielle des RH au niveau de la tumeur primitive, mais également des métastases, pour mieux ajuster les protocoles thérapeutiques à la biologie réelle des récidives et métastases (105-106) ; - la détection des mutations des ROα ont été recherchées telles celles décrites dans des lignées cellulaires, mais les tumeurs exprimant des ARNm mutés, codants pour une protéine tronquée, sont rares (107) ; - une meilleure compréhension de la biochimie moléculaire des récepteurs prenant en compte l’expression des facteurs de régulation : co-activateurs, co-inhibiteurs, associés à l’évaluation des différentes isoformes des récepteurs estrogéniques (ROα et ROβ entre autres) devrait fournir des éclaircissements sur leurs mécanismes de régulation et leur réponse aux thérapies (107-112). Une revue générale récente a été faite au Congrès de la Société française de sénologie (« 25 ans d’évolution ». Récepteurs hormonaux et pathologie mammaire, Marseille, 1980. Hormones et sein, Paris, 1990. Sein, hormones et anti-hormones, Nancy, 2004. 26es Journées de la Société française de sénologie et de pathologie mammaire, Nancy, novembre 2004, p. 22-45). La liaison des estrogènes à leurs récepteurs induit une modification conformationnelle caractéristique amenant la dimérisation du récepteur, sa liaison à l’ADN au niveau de régions spécifiques, appelées élément de réponse aux estrogènes (ERE), situées dans la région promotrice de gènes dont ils vont moduler l’expression (108). L’action transcriptionnelle du RO nécessite sa liaison à d’autres protéines nucléaires, appelées adapteurs ou co-activateurs, qui vont servir de facteurs transcriptionnels intermédiaires (109). Le rôle de ces protéines en tant que modulateurs de l’activité transcriptionnelle des récepteurs nucléaires a pu être mis en évidence sur des gènes témoins, soit par transfection transitoire de cellules de mammifères, soit dans le système de la levure. Le développement récent de travaux expérimentaux et cliniques suggèrent que, dans une cellule donnée, la balance entre co-activateurs et co-répresseurs pourrait rendre compte de la capacité de certains anti-estrogènes à bloquer ou non l’action des estrogènes. Deux études ont montré que la surexpression du co-facteur SRC-1, capable de lier l’extrémité carboxyl terminal du RO, entraîne une stimulation de l’activité agoniste du 4-OHTam, mais est incapable d’inhiber l’action antagoniste de l’anti-estro- Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 103 gène (110). Par contre, les mêmes auteurs ont montré que SMRT était capable de diminuer l’activité agoniste du 4-OHTam sans affecter l’activité en présence d’estradiol. Un travail récemment publié (111) présente, dans le cadre d’une cohorte des patientes ménopausées traitées par tamoxifène, l’expertise rétrospective de 27 corégulateurs de ROα dans les tumeurs primitives du sein RH+. Cette étude montre que l’expression forte du co-répresseur NCOR1 est un facteur prédictif de la réponse à l’hormonothérapie et devrait, de ce fait, être plus largement expertisé. La prise en compte du taux des ROβ dans les cancers du sein, et non de son variant ROβcx, serait un élément complémentaire pour mieux prédire la résistance au tamoxifène (113). Par ailleurs, une étude récente confirme que la mise en évidence de la phosphorylation du ROα sur la sérine 118 serait associée à une meilleure sensibilité au tamoxifène, confirmant les résultats obtenus sur des modèles pré-cliniques (114). Enfin, d’autres études des voies de résistance aux anti-estrogènes font appel à l’activation de voie signalitique des facteurs de croissance, à la famille des herégulines, aux voies métaboliques de la biosynthèse des bases pyrimidiques (TK entre autres) et de contrôle du cycle cellulaire (cyclines et protéine kinase associée dont la cycline D1, P53…). Mais ces facteurs n’ont pas franchi toutes les étapes d’évaluation et de validation pour une utilisation clinique, à l’exception de HER2. HER2 – cerbB2/neu L’oncogène HER2 est l’un des marqueurs moléculaires les plus étudiés ces dernières années. c-erbB-2 code pour une glycoprotéine transmembranaire de 185 KDa (p185) qui est un récepteur de facteur de croissance avec une activité tyrosine kinase et dont la partie extra-cellulaire présente une homologie avec celle du récepteur de l’epidermal growth factor (EGFR). La surexpression de HER2 conduit à une activation de la transcription de gènes régulant la progression dans le cycle cellulaire. L’évaluation et la validation de la détermination de HER2 comme facteur LOE I+++ (prédictif > pronostique) est exemplaire (figure 15) depuis la description princeps faite par D. Salmon en 1987, reliant la surexpression de HER2 à une amplification, un nombre très important de travaux, tant sur le plan fondamental que sur l’évaluation clinique, portant sur l’amplification et surexpression de HER2, est parfaitement présenté dans l’ouvrage édité par Y. Yarden (115). Une application des travaux de recherche fondamentale portant sur HER2 a débouché sur la mise au point d’un anticorps bloquant efficacement en clinique humaine le trastuzumab (Herceptine). 104 Cancer du sein Figure 15 - Données actuelles sur la valeur prédictive ou pronostique des techniques de caractérisation de HER2. Une revue générale en 1997 (116) des études séparées portant sur 22 616 patients montre que, dans les cancers du sein, la présence de c-erbB2 est en moyenne retrouvée dans 26 % des cancers (avec une échelle de 5 % à 55 %). Cette revue générale associée à d’autres bilans (18-116) montre qu’une majorité des études publiées sur le sujet conclue à une signification pronostique péjorative de la sur-expression (Allred, 1992) ou de l’amplification de c-erbB-2, essentiellement dans les cancers du sein avec envahissement ganglionnaire (Tandon, 1989). Plusieurs études ont montré qu’une amplification ou qu’une sur-expression de c-erbB-2 est également corrélée à une résistance à une hormonothérapie par tamoxifène, en phase adjuvante ou métastatique (Borg, 1994 ; Carlomagno, 1996 ; Wright, 1992). Elledge (1998), dans une série rétrospective de patientes RE positives, n'a pas retrouvé cette tendance. Cependant, la plupart de ces études ont utilisé des méthodes immuno-histochimiques, avec des conditions techniques et des anticorps différents, ce qui rend les comparaisons difficiles (Press 1994, Têtu, 1994). Plusieurs points sont cependant importants à rappeler dont, entre autres, la relation claire entre amplification de HER2 et perte ou dissociation de l’expression des récepteurs hormonaux (RO, RP). Dans les cancers du sein de patientes ménopausées (117), les tumeurs négatives (RO- et RP) ont le taux de HER2 amplifié le plus élevé (47 %) ; a contrario, les tumeurs très fortement positives RO++ (≥ 200 fentomole) et RP++ (> 100 fentomole) ont le pourcentage HER2 amplifié le plus faible (6 %). Entre ces deux Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 105 extrêmes, les tumeurs RO+ et RP+ ont un pourcentage HER2 amplifié moyen de 22 %. Par contre, les tumeurs dissociées (RO-RP+ et RO+RP-) ont un taux d’amplification de HER2 proche des tumeurs négatives, soit 40 %. Les cancers du sein canalaires infiltrants ont une fréquence de positivité à HER2 supérieure aux cancers in situ et les pourcentages de HER2 les plus élevés sont associés au grade histopronostique et nucléaire III, à l’aneuploïdie et au taux de prolifération intratumorale le plus élevé (quelle que soit la méthode de détermination). Le développement d’un dosage analytique quantitatif pour l’expression de HER2 permet de définir une répartition de la sur-expression non homogène avec une répartition, en fait, bimodale. Ceci permet d’isoler 12 % des tumeurs sur-exprimant très fortement HER2 et qui sont RO- (ou RO très faible ou associé à RP-) et présente, par ailleurs, un taux très important de HER2 phosphonylé (Y-1248-P) ; ce sont enfin les tumeurs les plus résistantes aux thérapeutiques anti-estrogéniques ou chimiothérapiques (CMF entre autres) (118). En 1998, un travail de S. Koscielny attire l’attention sur une signification péjorative associée à certains taux très faibles d’expression de HER2. Ceci a fait l’objet d’une controverse argumentée car ce fait paradoxal n’a pas été retrouvé par d’autres auteurs (116-119). Par contre, le groupe de D F Hayes et I C Henderson en 2001 (120) démontre la signification péjorative d’un sous-groupe de patients sur-exprimant HER2, mais dont on peut détecter dans le sérum la présence du domaine extracellulaire (ECD) de HER2. Cette forme circulante du ECD/ HER2 ou S HER2 peut être due au relargage après protéolyse par des métallo-protéases spécifiques. Ce clivage du domaine extracellulaire, bloqué, entre autres, par l’anticorps Herceptin®, a pour conséquence la libération et l’activation du domaine intracellulaire. L’ensemble de ces raisons, associé à un mauvais pronostic avec l’activation de HER2 et la facilité de détermination de ces paramètres sériques, devrait prendre une place précise dans l’évaluation des patientes. L’évaluation rapide des degrés d’évidence LOE I associée à la détermination de HER2 (cf. figure 15) est liée au développement des essais protocolaires thérapeutiques, qui démontrent l’efficacité de la détermination d’une amplification de HER2 comme test prédictif de sensibilité à une thérapeutique spécifique utilisant un anticorps anti-HER2 (trastazumab). Dans ce cadre, les résultats des protocoles MO 648 g-MO 649 g-MO 650 g sont exemplaires (ASCO 2001). Dans le protocole MO 648 g incluant 469 patientes, une augmentation du bénéfice clinique liée au trastuzumab chez les patientes traitées par chimiothérapie ou chimiothérapie et trastuzumab est démontrée chez les patientes sélectionnées par FISH où le bénéfice se traduit par un RR = 0,71. Dans les études MO 649 g/MO 650 g (336 patientes incluses dans les deux études IHC Dako 2+/3+). Le taux de réponse au trastuzumab (en ce qui concerne les réponses complètes, partielles ou stabilisation > huit mois) en fonction de la détermination de l’amplification de HER2 par technique FISH, est dans le protocole MO 649 g pour les patientes FISH + de 24 %, alors que les patientes FISH ne présentent aucune 106 Cancer du sein réponse ; dans le protocole MO 650 g, les patientes FISH + ont un taux de réponse de 48 % ; en revanche, les patientes FISH- présentent un taux de réponse de 10 %. Un intérêt particulier supplémentaire à la détermination HER2 dans ces tumeurs a été soulevé par la publication à l’ASCO 2000 d’une étude démontrant une réponse favorable des patientes HER2 aux protocoles de chimiothérapie comportant des anthracyclines. En fait, l’amplification de HER2 dans le bras long du chromosome 17 fait partie d’un Amplicon associant ou non l’amplification de la topoï-isomérase II, et une étude (2002) démontre la sensibilité aux protocoles comportant des anthracyclines chez les patientes HER2+ amplifiées si celle-ci est associée à une amplification de la topoïsomérase II (121). Mais ce résultat reste à confirmer. Les résultats présentés à l’ASCO 2005 concernant les protocoles associant chimiothérapie/Herceptin® dans les cancers du sein confirment le niveau LOEI/I prédictifs du statut HER2. Une étude récente du Southwest Oncology Group Study (Clin, vol. 10, n° 17 5670) met en évidence, dans les tumeurs du sein évoluées RO_ positives proposées pour une thérapeutique par tamoxifère, l’intérêt de la prise en compte de l’expression de HER2 pour être associé à une amplification et de l’expression de HER1 pour prédire l’évolution clinique et la sensibilité à la thérapeutique. Biomarqueurs de niveau LOEII et LOEIII (figure 8) Le récepteur de l’EGF (LOEIII) Le récepteur de l’EGF (EGFR/HER1) est une glycoprotéine transmembranaire de 170 kD exprimée dans une grande variété de types cellulaires. La surexpression de EGFR a été mise en évidence dans les tumeurs mammaires humaines. Elle est corrélée positivement au grade histo-prognostique de Scarff Bloom Richardson et à l’absence des récepteurs stéroïdiens. La valeur pronostique de EGFR dans les cancers du sein est l’objet de controverses. Cependant, une méta-analyse compilant quarante études séparées et regroupant 5 232 patients montre que le pourcentage de positivité à l’EGF-R est en moyenne de 45 %, avec une variabilité très grande (de 14 à 91 %) en fonction des techniques utilisées (122). Neuf des quinze études montrent une association négative entre le taux d’EGF-R et les courbes de survie actuarielles en analyse univariée. Deux autres études montrent une tendance non significative dans le même sens. Sept études ont utilisé une approche analytique multivariée. Deux démontrent clairement la valeur pronostique indépendante de l’EGF-R comme facteur péjoratif (123, 124). Les autres études montrent la même tendance, mais avec une valeur statistique plus faible. Par contre, toutes les études ayant pris en compte un traitement hormonal montrent une association importante de l’EGFR avec l’hormono-résistance (125, 126). Cependant, dans chaque étude, la surexpression d’EGF-R est associée négativement avec le taux des récepteurs hormonaux. Le faible taux de ceux-ci doit être pris en compte dans l’analyse de l’hormono-résistance (127). Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 107 La signification pronostique est plus controversée selon les études et aucune série d’études d’importance comparable à celles conduites pour HER2 n’a été publiée à ce jour concernant le bénéfice possible lié aux blocage de l’activité tyrosine kinase associée à HER1. Des protocoles d’évaluation sont actuellement en cours dans d’autres pathologies tumorales, peu dans les cancers du sein. La thymidine kinase (LOEII) (figure 8) La thymidine kinase (TK) a un rôle majeur dans la synthèse de l’ADN. Elle recycle la thymidine issue du catabolisme de l'ADN cellulaire. Ce rôle de sauvetage est particulièrement augmenté dans les cellules tumorales mammaires. La conversion de la thymidine (dT) en déoxythymidine monophosphate (dTMP) met en jeu une enzyme spécifique, la déoxythymidine kinase (TK). Deux iso-enzymes ont été décrites pour la TK : la TK1, la TK2. La TK2 mitochondriale est une activité constante non régulée par le cycle cellulaire. La TK1 est une iso-enzyme cytosolique initialement décrite dans le foie fœtal, puis mise en évidence dans les tissus à prolifération rapide (128). Dans les cellules eucaryotes, les taux de TK1 sont extrêmement élevés en phase G1-S, mais ils sont à la limite de la détection dans les autres phases du cycle. Dans les cancers du sein, l'activité de la TK1 est liée à la composante tumorale, et les taux élevés ont une valeur pronostique péjorative (129-137). La TK1 est un facteur pronostique indépendant chez les patientes pré-ou post-ménopausées, chez les patientes N- sans traitement adjuvant et chez les patientes N+ ayant reçu des protocoles de thérapie incluant le protocole de chimiothérapie adjuvante CMF et FAC (138-139). Une corrélation inverse a été rapportée entre les taux de TK et la durée de survie sans récurrence chez ces patientes. Des travaux réalisés par notre groupe montrent que des taux tumoraux élevés de TK sont associés à une non-réponse au tamoxifène (140). Il n’existe actuellement aucun inhibiteur direct spécifique de la TK1. Marqueurs associés à la néo-angiogenèse (LOEII/LOEIII) Depuis une dizaine d’années, sur les plans fondamental et expérimental, mais également clinique, une notion importante a pris corps : la relation entre la tumeur et son micro-environnement. Dans ces interactions complexes, de multiples facteurs paracrines entrent en jeu et sous-tendent le développement tumoral, mais également le processus d’invasion de métastases (141). Au centre de ces interactions, nous retrouvons les protéases et facteurs de croissance qui concourent au développement et à l’organisation de la néo-angiogenèse tumorale indispensable à la croissance tumorale et facteur indispensable au processus métastatique. Le VEGF a été un des facteurs biologiques les plus étudiés à ce jour pour sa valeur pronostique, entre autres dans les tumeurs sans envahissement ganglionnaire N0 (142-146). L’analyse d’une approche histo-pathologique avec comptage des néocapillaires apporte également une valeur pronostique, mais avec une réelle dispersion entre les différentes études liées au problème technique (comptage direct ou immuno-histochimie, large du champ d’observation, localisation de ce champ…) (147). 108 Cancer du sein La prise en compte de la néo-angiogenèse tumorale apporte, en fait, un éclairage important dans le profil biologique des tumeurs et a permis d’argumenter l’hétérogénéité d’évolution et d’agressivité de certaines tumeurs versus d’autres. L’ensemble des facteurs biologiques permettant de mieux cerner la dynamique propre de chaque tumeur, isolant de ce fait à un stade clinique identique des tumeurs très agressives prises précocement de tumeurs plus lentement évolutives de pronostic évolutif plus favorable pris à un stade plus tardif de leur évolution chronologique (146-149). D’autres facteurs associés à l’angiogenèse font l’objet d’études récentes : expression HIF1α, CD31, CD105, TGFβ… Ceux-ci semblent être des facteurs intéressants, mais sont loin d’être totalement évalués et validés. Tyrosines kinases (LOEIII) La prolifération cellulaire normale ou maligne est associée à la stimulation de cascades de transmission du signal impliquant la phosphorylation/déphosphorylation de résidus tyrosine de certaines protéines cibles, et ceci en réponse à la stimulation par les facteurs de croissance (150) de certains récepteurs spécifiques portés par la cellule, ou comme expression de certains oncogènes (151). Sur l’ensemble des tyrosines-kinases décrites à ce jour, la dérégulation d’une trentaine environ est associée au processus tumoral (« oncogénique », tyrosine-kinase = OKT) (152). Les activités tyrosines-kinases (PTK) impliquées dans les cascades de transmission du signal sont, soit cytosoliques, soit associées à la membrane plasmique, en particulier sous la forme de domaines catalytiques de protéines trans-membranaires, tels EGFR, IGFR et c-erbB2 dont la présence a été rapportée dans les cancers du sein. De nombreux oncogènes codent pour des PTK ou pour des protéines intervenant dans la régulation de leur activité. Les mutations et les amplifications affectant ces oncogènes aboutissent à une augmentation et à une dérégulation des activités PTK membranaires ou cystoliques. Si, dans les lames du sein, la mesure spécifique des facteurs de croissance, de leurs récepteurs et de l’activité tyrosine-kinase associés peuvent être utilisés dans le ciblage thérapeutique spécifique, en revanche, la valeur pronostique de ces paramètres fait l’objet de controverses (153-158). Cycline D1 (LOE.III) Les cyclines jouent un rôle important dans les différentes phases du cycle cellulaire. La cycline D1 joue un rôle capital dans le passage du point de restriction de la phase G1. La perte de l’expression de P16 (159, 160) et la perte de fonctionnalité de la protéine Rb sont associées à une progression tumorale incontrôlée. Par contre, l’amplification et la sur-expression de la cycline D1, également associée à la sur-expression de CDK4, sont un facteur de non-contrôle du cycle cellulaire lié à la progression tumorale. Récemment, l’amplification de la cycline D1 a été associée à une insensibilité aux molécules anti-estrogéniques (161). Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 109 Oncogènes – gènes suppresseurs de tumeur (LOE III), hyperméthylation des promoteurs Depuis 1985, l’altération de plusieurs oncogènes, dont cMyc-Int2-cerbB2, fait l’objet de multiples travaux pour en évaluer la valeur pronostique de façon isolée ou concomitante (162). CMyc (chromosome 8) : l’amplification de cMyc est diversement reportée : 1-56 % des cancers du sein, avec une moyenne de 20 % (163). La valeur pronostique associée à l’amplification de cMyc a été reportée dès 1992 (164-165). Une méta-analyse publiée en 2000 confirme l’amplification de cMyc dans 15,7 % en moyenne des cancers du sein et une valeur pronostique associée à l’amplification avec un risque de récidive (RR = 2,05) et d’évolutivité péjorative (RR = 1,74) de décès par cancer. Ce paramètre semble significatif en lui-même car il présente une très faible association avec l’envahissement ganglionnaire et le statut négatif des récepteurs hormonaux (165-166). Int2 : l’amplification de cet oncogène est associée à un amplicon situé en 11 q 13 comprenant Int2/FGF3 ; hst-2/FGF4 ; bcl-1 ; PRAD1, cycline D EMS-1, GST-pi. Cette amplification a été reportée de façon diverse (9 à 23 % des cancers du sein) (167). Une association forte existe entre amplification Int2 et statut des récepteurs hormonaux positifs. La signification pronostique de Int2 est controversée car souvent associée à d’autres facteurs et, quoi qu’il en soit, inférieure à l’amplification de cMyc ou c-erbB2. CerbB2 : nous avons déjà reporté les résultats concernant cet oncogène dans le chapitre des facteurs prédictifs LOEI+++. p53 : ce gène code pour une protéine facteur de transcription. Dans les cellules normales non stressées, p53 est inactive ; elle est maintenue à un faible niveau par son association avec MDM2, qui provoque son transport du noyau vers le cytoplasme et sa dégradation par la voie dépendante de l’ubiquitine. Les stress génotoxiques déclenchent des voies de signalisation qui aboutissent à la stabilisation de la protéine p53, causant son accumulation dans le noyau et son activation comme facteur de transcription. Cette activation conduit à l’arrêt du cycle cellulaire et à l’induction de l’apoptose en cas d’altération génomique non réparable, p53 apparaît comme un gène capital dans le contrôle du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, l’apoptose, la différenciation cellulaire, la sénescence et l’angiogenèse. De ce fait, son altération dans les cancers a justifié un très grand nombre d’études sur la valeur pronostique de ce facteur. Une revue générale de plus cinquante études montre des résultats identiques à ceux reportés dans la référence 18, à savoir une très grande dispersion de la signification pronostique liée en grande partie aux techniques analytiques. Les techniques liées à la mise en évidence et à l’accumulation de la protéine sont peu fiables sur le plan pronostique, tant par technique immuno-histochimie (18) que par technique ELISA (168-169). Cependant, 110 Cancer du sein les études de recherche directe de mutation par séquençage sont plus rares ou concordantes (170-174) tant sur le plan pronostique que sur celui d’une mauvaise réponse à la chimiothérapie (anthracycline) ou à l’hormonothérapie (tamoxifène) (175). Une revue récente fait un lien possible entre angiogenèse, hypoxie de la tumeur et altérations des oncogènes dont nous venons de voir la valeur pronostique comme biomarqueurs tissulaires pronostiques ou prédictifs (176-177). Une étude récente démontre que l’expression de p53 pourrait être un facteur pronostique pour les cancers du sein inflammatoires (178). BCAR1 : une étude récente du groupe de Rotterdam a évalué la valeur pronostique de BCAR1 dans les cancers primitifs du sein (179). Hyperméthylation des promoteurs de gènes spécifiques : une nouvelle approche analytique permet de comprendre la perte de fonction de certains gènes par blocage de leur transcription et hyperméthylation de leur promoteur. L’étude systématique de l’hyperméthylation de promoteur de gène sensible permet de mettre en évidence un ciblage sélectif non randomisé dans les cancers du sein (180). Par ailleurs, l’hyperméthylation des promoteurs sensibles définit des patterns de perte d’expression associés à des classes distinctes de cancers du sein (181). Enfin, une approche technique permettrait d’étudier l’hyperméthylation des promoteurs de certains gènes suppresseurs dans le sérum de patientes porteuses de cancers du sein (182). L’approche analytique de l’hyperméthylation des promoteurs semble être une voie de très haut intérêt pour déterminer un diagnostic moléculaire précoce du cancer du sein, entre autres dans les lésions frontières, et permettre de mieux définir certaines classes de cancers du sein. Réflexion-bilan 2005 sur le transfert et la pratique clinique La biochimie analytique, la biologie moléculaire, la biologie expérimentale et la génétique ont apporté des contributions importantes à la connaissance précise des mécanismes moléculaires de la cancérogenèse. Cependant, à ce jour, l’utilisation des données biologiques qui considèrent l’évolutivité moléculaire fonctionnelle des tumeurs n’est pas suffisamment prise en compte. Dans l’approche clinique actuelle, cette situation est essentiellement due à un défaut de standardisation dans l’évaluation des marqueurs tumoraux biologiques et à une confrontation clinico-biologique insuffisante, alors que depuis plus de trente ans le concept de marqueur tumoral existe et a fait l’objet d’un nombre très important de travaux et de publications. Il a fallu vingt ans (1969-1989) pour que le concept de récepteurs hormonaux (ROα RP) mis en évidence soit progressivement utilisé, validé et devienne un gold standard LOEI avec utilisation de sa détermination dans la stratégie thérapeutique de façon systématique. Des progrès sont actuellement possibles et à faire pour incrémenter et affiner la seule classification plus ou moins utilisée actuellement en termes de facteurs prédictifs. Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 111 Il a fallu dix ans (1987-1997) pour faire de HER2 un marqueur prédictif LOEI associé à une thérapeutique spécifique ciblée. Il en est de même du délai pour UPA PAI1 entre la publication princeps de Duffy (1987) et le premier essai européen BIOMED 2 NNBC2 promu par le groupe AGO (Dr Thomssen, Dr Jänicke) prenant en compte leur utilisation dans la stratification des patientes atteintes d’un cancer du sein No qui se poursuit actuellement par le protocole NNBC3. Ceci est dû à la nécessité d’obtenir le niveau d’évidence I entraînant la valorisation de toutes les étapes de ce processus, avec obtention d’un outil diagnostique robuste, fiable, reproductible, validé, faisant l’objet de contrôles de qualité. Il s’agit d’un outil complémentaire de ceux disponibles actuellement, utilisé dans des conditions optimales, ainsi qu’une motivation des équipes cliniques pour bousculer leurs habitudes en introduisant l’innovation dans le cadre d’essais thérapeutiques, puis dans leur pratique courante. Le changement dans la pratique clinique ne doit pas se faire au détriment des patients et cela explique la lenteur de la mise en place et de l’utilisation des marqueurs, lenteur relative qui est un juste milieu entre frilosité et pari risqué dû à l’impatience ou l’enthousiasme des innovants prêts « à accélérer » les étapes de validation. Le procédé d’évaluation-validation est multidisciplinaire (biologique-technique) et fait également appel à des méthodes spécifiques de bio-informatique et statistique. Ce dernier point particulièrement important a fait l’objet de multiples travaux et publications et, entre autres, d’une mise au point quant aux étapes et études nécessaires pour l’application de méthodes statistiques de validation non critiquables (183). L’introduction des marqueurs biologiques dans les essais thérapeutiques est une nécessité pour leur validation, mais également pour mieux analyser l’efficacité ou non de protocoles thérapeutiques à partir de groupes de patients biologiquement et cliniquement homogènes. Enfin, la nécessité d’une approche analytique ciblée et innovante peut se révéler plus complexe qu’une autre déjà validée dans un domaine proche, comme il est apparu entre détermination de la sur-expression, amplification HER2 pour l’efficacité du trastazumab (Herceptine®) et analyse du REGF pour l’efficacité du gefritinib (Iressa®), où l’analyse doit prendre en compte, non seulement la sur-expression, mais également la présence de mutation spécifique. Seule une coordination motivée entre groupes clinique et biologiste de transfert permet, en fait, une avancée coordonnée et régulière. En 2005, des outils sont disponibles et utilisables dans le cadre d’essais thérapeutiques et en pratique clinique quotidienne. Évolution des biotechnologies analytiques. Approches futures Les méthodes biochimiques Les méthodes biochimiques d'étude des protéines ont été les premières utilisées pour l'analyse des facteurs pronostiques et de réponse thérapeutique. Elles impli- 112 Cancer du sein quent la préparation d'un extrait tissulaire après homogénéisation du tissu. Elles peuvent mettre en évidence une fonction de ou des protéines étudiées (liaison, métabolisme…), de leur statut d’activation (phosphorylation..), de la coopérativité entre différentes structures macromoléculaires. Avantages Elles font, entre autres, pour les récepteurs hormonaux, l'objet de contrôles de qualité européens dans le cadre de l'EORTC depuis plus de quinze ans. Elles ont l’avantage d’être réellement quantitatives. Limites Les méthodes biochimiques actuelles, de part la quantité de tissus qu'elles exigent, ne permettent qu’une approche parciparamétrique dans tous les cas et sont parfois même impossibles pour de très faibles cellularités. Évolution future Amélioration de la sensibilité et spécificité de la direction par utilisation de la spectrométrie de masse, isolement des macromolécules informatives au sein de milieux complexes (cytosol, fluides biologiques…) par technique de capture, désorption laser, puis identification par analyse par spectrométrie de masse (technique MALDI-TOF/ SELDI-TOF) : elles sont en cours d’évaluation, mais semblent être une voie analytique sensible, robuste, applicable à la clinique. Elles rendent possibles des études réellement multiparamétriques dans le cadre des évaluations post-génomiques du protéome. Elles peuvent prendre en compte tous les marqueurs biologiques protéiques déjà évalués et validés, mais également participer à la caractérisation et l’isolement de nouveaux marqueurs, tant sur le plan pronostique ou prédictif qu’en tant que cible thérapeutique. L’isolement des nouveaux marqueurs se fait à partir de profils globaux, avec une caractérisation tant sur le plan bio-informatique, avec des techniques comparatives et de hiérarchisation, que par l’association de multiples techniques d’isolement plus lourdes (micro-séquençage). L’approche protéomique analytique cerne au plus près la réalité biologique et bio-pathologique du processus tumoral par un accès direct aux structures macromoléculaires fonctionnelles. La sensibilité des techniques biochimiques permet de les associer avec la microdissection tissulaire (type laser microcapture) (177) elle permet aussi de mieux cibler les compartiments cellulaires d’intérêt au sein d’un tissu hétérogène, normal ou pathologique. Ces techniques analytiques (MALDI-TOF/SELDI-TOF) sont applicables au fluide biologique avec efficacité telles les aspirations-lavages des sécrétions ductales mammaires (184). L’accessibilité des techniques analytiques protéomiques multifactorielles est en décalage par rapport aux techniques de biologie moléculaire, mais ce décalage, du moins dans le cadre de la biologie de transfert, se réduit rapidement par l’établisse- Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 113 ment de laboratoires experts et par la mise en place de réseaux coopératifs sur ce type de technologies. Les méthodes de biologie moléculaire Parmi les méthodes de biologie moléculaire, à l’heure actuelle, pour une analyse multiparamétrique, l'étude de l'expression des ARN messagers (ARNm) est une alternative rendue possible par un développement technologique rapide. Parmi les techniques de biologie moléculaire permettant l'analyse de transcriptome, le développement technologique analytique à grande échelle et informatique appliqué a rendu possible, d’une part, le séquençage complet du génome humain, d’autre part, la mise au point d’une approche analytique globale, entre autres, dans l’expression des gènes (transcriptome), et ce dans des situations particulières et comparatives dont font partie le cancer et son micro-environnement tissulaire. Pour ce faire, il existe deux approches majeures : - Les puces ARN/ADN - La technique de PCR quantitative en temps réel Puces ARN/ ADN Les puces ADN/ARN constituent des outils d’analyse moléculaire parallèle capables de fournir une information biologique sur un temps et un espace considérablement réduits par rapport aux méthodes conventionnelles de biologie moléculaire. On distingue deux types d’applications principales : – les profils d’expression génique ; – l’analyse d’altérations structurales (SNP, mutations). Puces d’expression Des systèmes se développent dans ce domaine pour permettre l’analyse simultanée de l’expression (ARNm) d’un très grand nombre de gènes. On peut distinguer deux types de puces : – les systèmes généralistes, pièces à haute densité de type Affymetrix (puces silicium) ou Clontech (membrane), qui proposent l’analyse d’un très grand nombre de gènes ou EST prédéterminés : 5 000, 10 000, 25 000. Le coût unitaire d’analyse est actuellement très élevé pour une application médicale individuelle. L’analyse peut être, soit quantitative absolue, soit, le plus souvent, quantitative relative, c’est-à-dire que le résultat consiste en un niveau d’expression par rapport à une référence « normale ». La sensibilité reste très moyenne (20 d’ARN total, de très bonne qualité) et la technique elle-même demande toute une série de contrôles de qualité tant de la puce elle-même que du système de détection. L’exploitation des données obtenues à demander le développement d’outils statistiques et de bioinformatique, outils de classification, association et hiérarchisation entre autres, permettant de gérer l’ensemble des informations obtenues. Les problèmes réels 114 Cancer du sein liés au développement et à l’exploitation de telles technologies ont fait l’objet d’une série de recommandations (185), sur le plan du développement technique, que des publications issues des travaux utilisant ces techniques en développement dans le cadre de programmes de recherche fondamentale ou de transfert avec nécessité d’information minimale concernant les données expérimentales (MIAME, minimal information about a micro-arrays experiment) (186). Par ailleurs, sur un exemple précis, des équipes coopérant au projet du NIH font un bilan et également des recommandations sur la faisabilité et l’application des techniques utilisant les puces ARN pour l’expertise de tissus pathologiques avec l’association de microdissections, pour capture des plages de tissus d’intérêt, l’expertise des variations des gènes par technique single nucleotide polymorphism (SNPS), mais également étudiant la transcription alternative au splicéome (187-189) ; – les puces « façonnables » avec spotters à pointe sèche ou piège électrique permettent l’analyse d’un nombre limité de gènes sélectionnés par l’utilisateur. Il s’agit d’une technologie encore en développement, avec de nombreux problèmes de préparation des sondes de capture, de reproductibilité, ce qui la situe encore dans le domaine de la recherche préclinique. Les puces sont intéressantes si l’on souhaite avoir des profils d’expression comportant de nombreux gènes (> 80-100), mais demandent la mise au point synchrone au développement des puces d’un outil informatique analytique de gestion et d’évaluation. Dans ce domaine, certaines compagnies proposent des puces, faites à la demande, soit dédiées à une application clinique avec un nombre de gènes limités (100 à 250), mais avec des techniques de détection originales augmentant la sensibilité et une assurance qualité dans la préparation. Mais les recommandations et guide-lines déjà évoqués pour les puces généralistes sont également nécessaires. Des expertises comparatives ont été menées entre puces généralistes et façonnables, ainsi qu’entre les différents types de puces pour une même pathologie, afin d’apprécier leurs valeurs réciproques. Évaluation actuelle des approches analytiques moléculaires De nombreuses publications (190-201) présentent le travail actuel effectué dans le cadre du cancer du sein. Partant d’une analyse par puce d’expression haute densité, les études pour une évaluation et une classification pronostiques retiennent entre 25 et 75 gènes décisionnels. Il est à noter par ailleurs que les gènes exprimés à fort pouvoir discriminatoire et, de ce fait, retenus, ne recouvrent aucun des biomarqueurs tumoraux macromoléculaires UPA PAI1 déjà évalués comme de niveau d’évidence I à l’exception des RO. Cependant, si la sélection par ce type d’analyse semble prometteuse, toute la démarche d’évaluation et validation que nous avons précédemment décrite reste à faire. La méthodologie de l’expertise bio-informatique et statistique associée au développement des techniques analytiques multifactorielles est en pleine expansion. Une approche critique des résultats actuels a été faite récemment et attire l’attention sur l’importance d’une conduite raisonnée des utilisations et développements pour Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 115 obtenir des résultats comparables, si ce n’est identiques, à travers différentes techniques analytiques du transcriptome (202-204). Puces ADN Pour l’analyse d’altération structurale, les puces ADN sont des outils qui peuvent fonctionner dès maintenant dans les laboratoires de biologie médicale de transfert. Le système Affymetrix est déjà utilisé (Aarhus University Hospital, Danemark) pour l’analyse des mutations p53 et la polymorphisme individuel des enzymes du métabolisme oxydatif CYP. Toutefois, l’investissement est extrêmement lourd, la sensibilité absolue est moyenne, la sensibilité relative est faible, le contingent tumoral ne devant pas représenter moins de 50 % de la cellularité du prélèvement. Comme les autres méthodes, sa précision n’est pas absolue (des faux positifs ont été détectés dans l’évaluation actuelle). Cependant, des progrès technologiques d’automatisation et de détection font que plusieurs compagnies concurrentes entrent dans ce champ d’expertise à visée clinique. Technologie de PCR en temps réel La technologie de PCR en temps réel présente, par rapport aux méthodes standards de PCR, les avantages scientifiques et techniques suivants : – elle permet l'enregistrement de la cinétique d'amplification en temps réel. La quantification est réalisée au seuil initial de l'amplification et présente une excellente reproductibilité. Dans les méthodes standards de PCR, la quantification se fait à des temps extrapolés à partir d'études préliminaires, ce qui peut être à l'origine d'erreurs importantes et imprévisibles, car on préjuge d’une réaction enzymatique que l’on ne maîtrise pas ; – la spécificité de la sonde pour la séquence amplifiée entre les deux amorces choisies informe sur la spécificité du produit amplifié et permet d'éviter les étapes fastidieuses de séparation des produits de réaction (électrophorèse en gel, transfert sur membrane) et de marquage radioactif des produits ; – le développement de toutes ces techniques ayant une visée d’évaluation et de validation pour une application clinique diagnostique doit être fait dans le cadre des pratiques et notions de qualité du Guide de bonne exécution des analyses (GBEA) et faire appel à un appareillage compatible avec celles-ci. Dans le cadre d’une utilisation fréquente et multi-manipulateurs, la PCR quantitative en temps réel est la technique de PCR qui met à l’abri d’un minimum de contaminations accidentelles du fait de son développement, jusqu’à la phase analytique en milieu clos et peut faire, de ce fait, l’objet d’une certification CE IVD (In Vitro Diagnostic). De nombreuses publications ont évalué le potentiel technique et les limites de la PCR quantitative et ont établi des recommandations pour une utilisation fiable et reproductible (188). Cette technique, contrairement aux puces ARN, pourrait éventuellement être utilisée non seulement pour des échantillons cryopréservés, mais également pour du matériel archivé en paraffine. Cependant, cette utilisation doit être encadrée par de multiples contrôles et assurances qualité pour être réel- 116 Cancer du sein lement évaluée. Enfin, dans les prélèvements pauci-cellulaires, inférieurs à 5 000 cellules, la PCR quantitative se révèle la seule technique utilisable. Conclusion Dans l’évolution potentielle à partir de tests LOEI « gold standards » actuels vers des tests pluriparamétriques, soit protéomiques, soit de biologie moléculaire, il est important de rappeler que toutes les étapes d’évaluation et validation que nous vous avons exposées en début de cette revue générale sont, en fait, à franchir en ce qui concerne la validation de ces nouvelles approches analytiques. En effet, les résultats obtenus par techniques biochimiques/protéomiques que nous avons exposés en partie ne sont pas transposables pour préjuger ou sélectionner des marqueurs de biologie moléculaire. Si les protéines sont effectivement les acteurs directs des fonctions cellulaires normales ou pathologiques, les taux d’ARN ne sont pas corrélés linéairement au taux de protéines dans un très grand nombre de cas, ceci étant dû au temps de turn-over spécifique de chaque ARN, au rendement de traduction, de processus de maturation, de sauvegarde de stockage intermédiaire de certains ARN. Références 1. Early Breast Trialist’s Collaborative Group (1998) Polychemotherapy for early breast cancer : an overview of the randomized trials. Lancet 352: 930-42 2. Early Breast Trialist’s Collaborative Group (1998) Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomized trials. Lancet 351: 1451-67 3. Mc Guire WL (1991) Breast Cancer Prognostic Factors: evaluation guidelines. JNCI (83): 154-5 4. Clark GM (1992) Integrating Prognostic Factors. Breast Cancer Research and Treatment (22): 187-91 5. Swan N (1998) NIH Panel urges Technology Transfer Reforms. Nature Biotechnology 16-710 6. Ginsburg GS, Mc Carthy JJ (2001) Personalized medicine: revolutionizing drug discovery and patient care. Trends Biotechnology 19 (12): 491-6 7. Hayes DF, Bast RC, Desch CE et al. (1996) Tumor Marker Utility Grading System: a Framework to evaluate Clinical Utility of Tumor Markers. JNCI (88): 1456-66 8. Hayes DF, Tock B, Harris AL et al. (1998) Assessing the Clinical Impact of Prognostic Factors = When is « Statistically significant » clincally useful? Breast Cancer Research and Treatment (52): 305-19 9. Ellis MJ, Hayes DF (1999) Refining Breast Cancer Risk Assessment with Molecular Marker = the Next Step? JNCI (91): 2067-8 10. Bast RC, Raudin P, Hayes DF et al. (2001) Update of Recommendations for the use of Tumor Markers in Breast and Colorectal Cancer = Clinical Practice Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 117 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Guidelines of the American Society of Clinical Oncology. T Clin Oncol (19): 1865-78 Davidson NE (2002) Breast Cancer Consensus Meetings. Vivre la différence. J Clin Oncol (20): 1719-20 Marlan LC, Abrams J, Warren JL et al. (2002) Adjuvant Therapy for Breast Cancer: Practrice Patterns of Community Physicians. J Clin Oncol (20): 1809-17 National Institutes of Health Consensus Development Panel (2001) National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement, Adjuvant Therapy for Breast Cancer. Nov 1-3 2000. JNCI (93): 979-89 Goldhrish A, Glick JH, Gether RD et al. (2001) Meeting Highlights: International Consensus Panel on the Treatment of Primary Breast Cancer. J Clin Oncol (19): 3817-27 ESMO (2001) Minimum Clinical Recommendations for Diagnosis, Adjuvant Treatment and follow up of primary breast cancer. Annals of Oncology (12): 1047-8 Foekens JA, Berns EMJJ, Look MP et al. (1996), Dr Daniel den Hoed Cancer Center, Rotterdam, The Netherlands. Prognostic Factors in Node-Negative Breast Cancer. In “Hormone-Dependent Cancer”, edited by Jorge R Pasqualini and Benita S Katzenellenbogen, Marcel Dekker, inc, 217-53 Klijn JGM, Berns EMJJ, Foekens JA (1999) Prognostic and Predictive Factors in Breast Cancer. In “Contemporary Endocrinology: Endocrinology of Breast Cancer”, edited by A. Manni, Humana Press, inc, 205-20 Klijn JGM, Berns EMJJ, Foekens JA (2002) Prognostic and Predictive Factors and Targets for Therapy in Breast Cancer. Dr Daniel den Hoed Cancer Center and Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands. In ‘Breast Cancer: Prognostic Treatment and Prevention, edited by Jorge R. Pasqualini, Marcel Dekker, inc, 93-124 Clark GM (2000) Prognostic and Predictive Factors. In “Disease of the Breast”, 2nd edition, edited by Jay R. Harris, Lippincott Williams & Wilkins: 489-514 Spyratos F, Martin PM, Hacène K et al. (1992) Multiparametric prognostic evaluation of biological factors in primary breast cancer. JNCI (84): 1266-71 Grondahl Hansen J, Kristensen P, Rosenquist C et al. (1993) High levels of urokinase-type plasminogen activtor and its inhibitor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res 53: 2513-21 Foekens JA, Schmitt M, van Putten WLJ et al. (1994) Plasminogen Activator Inhibitor –1 and Prognosis in Primary Breast Cancer. J Clin. Oncol (12): 1648-58 Look MP, van Putten WLJ, Duffy MJ et al. (2002) Pooled Analysis of Prognostic Impact of Urokinase - type Plasminogen Activator and its Inhibitor PAI 1 in 8377 Breats Cancer Patients. JNCI (94): 116-28 118 Cancer du sein 24. Bouchet C, Hacène K, Martin PM et al. (1999) A dissemination risk index based on plasminogen activator system components in primary brest cancer. J Clin Oncol: 3048-57 25. Thomssen C, Janicke F, Kaufmann et al. (2000) Current Controversies in Cancer Do we need better prognostic factors in node-negative breast cancer? European Journal of Cancer (36): 293-306 26. Jänicke F, Prechtl A, Thomssen C et al. (2001) Randomized adjuvant chemotherapy trial in high-risk, lymph Node-Negative Breast Cancer Patients Identified by urokinase-type plasminogen Activator and Plasminogen Activator Inhibitor type 1. JNCI (93): 913-20 27. Stephenson J (2001) Study indicates Utility for New Breast Cancer Prognostic Marker. JAMA 285 (24) 3077-8 28. Harbeck N, Kates RE, Schmitt M (2002) Clinical Relevance of Invasion factors urokinase type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type 1 for individualized therapy decisions in primary breast cancer is greatest when used in combination. J Clin Oncol (20): 1000-7 29. Harbeck N, Kates RE, Look MP et al. (2002) Enchanced Benefit from adjuvant chemotherapy in Breast Cancer Patients classified high-risk according to urokinase-type plasminogen activator (uPA) and plasminogene activator inhibitor type 1 (n = 3424). Cancer Research (62): 4617-22 30. Dano K, Andreasen PA, Grondahl Hansen J et al. (1985) Plasminogen activators,tissue degradation and cancer. Adv Cancer Res 44: 139-266 31. Pyke C, Kristensen P, Ralfkiaer E et al. (1991) The plasminogen activtion system in human colon cancer: messenger RNA for inhibitor PAI-1 is located in endothelial cells in the tumor stroma. Cancer Res 51: 4067-71 32. Liotta LA, Stetler Stevenson WG, Steeg PS (1991) Cancer invasion and metastasis: positive and negative regulatory elements. Cancer Invest 9: 543-51 33. Kirschke H (1998) Lysosomal cysteine peptidases and malignant tumours. Adv Exp Med Biol 421: 253-57 34. Mignatti P, Rifkin DB (1993) Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion. Physiol Rev 73: 161-95 35. Knauper V, Will H, Lopez Otin C et al. (1996) Cellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation. Evidence that MT1-MMP (MMP-14) and gelatinase a (MMP-2) are able to generate active enzyme. J Biol Chem 271: 17124-31 36. Mazzieri R, Masiero L, Zanetta L et al. (1997) Control of type IV collegenase activity by components of the urokinase-plasmin system - a regulatory mechanism with cell-bound reactants. EMBO Journal 16: 2319-32 37. Okimira Y, Sato H, Seiki M et al. (1997) Proteolytic activation of the precursor of membrane type 1 matrix metalloproteinase by human plasmin - a possible cell surface activator. FEBS Letters 402: 181-4 38. Murphy G, Ward R, Gavrilovic J et al. (1992) Physiological mechanisms for metalloproteinase activation (Matrix Suppl) I: 224-30 39. Egeblad M, Werb Z (2002) New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nature Reviews (2): 161-73 Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 119 40. Collen D (1980) On the regulation and control of fibrinolysis. Edward Kowalski Memorial Lecture. Thromb Haemost 43: 77-89 41. Murphy G, Atkinson S, Ward R et al. (1992) The role of plasminogen activators in the regulation of connective tissue metalloproteinases. Ann. NY Acad Sci 667: 1-12 42. Ellis V, Pyke C, Eriksen J et al. (1992) The urokinase receptor: involvement in cell surface proteolysis and cancer invasion. Ann NY Acad Sci 667: 13-31 43. HE CS, Wilhelm SM, Pentland AP et al. (1989) Tissue cooperation in a proteolytic cascade activating human interstitial collagenase. Proc Natl Acad Sci USA, 2632-6 44. Baramova EN, Bajou K, Remacle A et al. (1997) Involvement of pa/plasmin system in the processing of pro-mmp-9 and the second step of pro-mmp-2 activation. FEBS Letters 405: 157-62 45. Lyons RM, Gentry LE, Purchio AF et al. (1990) Mechanism of activation of latent recombinant transforming growth factor beta 1 by plasmin. J Cell Biol 110: 1361-7 46. Sato Y, Rifkin DB (1989) Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factorbeta1-like molecule by plasmin during co-culture. J Cell Biol 109: 309-15 47. Ossowski L, Quigley JP, Kellerman GM et al. (1973) Fibrinolysis associated with oncogenic transformation. Requirement of plasminogen for correlated changes in cellular morphology, colony formation in agar and cell migration. J Exp Med 138: 1056-64 48. Vavani J, Orr W, Ward PA (1979) Cell-associated proteases affect tumour cell migration in vitro. J Cell Sci 26: 241-52 49. Mawatari M, Okamura K, Matsuda T et al. (1991) Tumor necrosis factor and epidermal growth factor modulate migration of human microvascular endothelial cells and production of tissue-type plasminogen activator and its inhibitor. Exp Cell Res 192: 574-80 50. Morimoto K, Mishima H, Nishida T et al. (1993) Role of urokinase type plasminogen activator (u-PA) in corneal epithelial migration. Thromb Haemost 69: 387-91 51. O’Reilly MS, Holmgren L, Shing Y et al. (1994) Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma (see comments). Cell 79: 315-28 52. O’Reilly MS, Holmgren L, Chen C et al. (1996) Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice. Nature Medicine 2: 68992 53. Schousboe I, Feddersen K, Rojkjaer R (1999) Factor XIIa is a kinetically favorable plasminogen activator (in process citation). Thromb Haemost 82: 1041-6 54. Grondahl-Hansen J, Ralkiaer E, Kirkeby LT et al. (1991) Localization of urokinase-type plasminogen activator in stromal cells in adenocarcinomas of the colon in humans. Am J Pathol 138: 111-7 120 Cancer du sein 55. Pyke C, Kristensen P, Ralfkiaer E et al. (1991) Urokinase-type plasminogen activator is expressed in stromal cells and its receptor in cancer cells at invasive foci in human colon adenocarcinomas. Am J Pathol 138: 1059-67 56. Ossowski L, Reich E (1983) Antibodies to plasminogen activator inhibit human tumor metastasis. Cell 35: 611-9 57. Konkle BA, Ginsburg D (1988) The addition of endothelial cell growth factor and heparin to human umbilical vein endothelial cell cultures decreases plasminogen activator inhibitor-1 expression. J Clin Inves 82: 579-85 58. Mignatti P, Robbins E, Rifkin DB (1986) Tumor invasion through the human amniotic membrane l requirement for a proteinase cascade. Cell 47: 487-98 59. Axelrod JH, Reich R, Miskin R (1989) Expression of human recombinant plasminogen activators enhances invasion and experimental metastasis of Hras-transformed NIH 3T3 cells. Mol Cell Biol 9: 2133-41 60. Cajot JF, Barnat J, Bergonzelli GE. et al. Plasminogen-activator inhibitor type 1 is a potent natural inhibitor of extracellular matrix degradation by fibrosarcoma and colon carcinomal cells. Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6939-43. 61. Hollas W, Blasi F, Boyd D (1991) Role of the urokinase receptor in facilitating extracellular matrix invasion by cultured colon cancer. Cancer Res 51: 3690-5 62. Kobayashi H, Ohi H, Sugimura M et al. (1992) Inhibition of in vitro ovarian cancer cell invasion by modulation of urokinase-type plasminogen activator and cathepsin B Cancer 52: 3610-4 63. Wilhelm O, Schmitt M, Hohl S et al. (1995) Antisens inhibiion of urokinase reduces spread of human ovarian cancer in mice. Clin Exp Metastasis 13: 296-302 64. Holst-Hansen C, Johannessen B, Hoyer-Hansen G et al. (1996) Urokinasetype plasminogen activation in three human breast cancer cell lines correlates with their in vitro invasiveness. Clin Exp Metastasis 14: 297-307 65. Shapiro RL, Duquette JG, Roses DF et al. (1996) Induction of primary cutaneous melanocytic neoplasms in urokinase-type plasminogen activato (upa)-deficient and wild - type mice - cellular blue nevi invade but do not progress to malignant melanoma in upa-deficient animals. Cancer Res 56: 3597-604 66. Jensen EV, Jacobson HI, Smith S et al. (1972) The use of estrogen antagonists in hormone receptor studies. Hormones and antagonists. Gynec Invest 3: 108-23 67. McGuire WL (1980) Stéroid hormone receptors in breast cancer treatment strategy. In: Recent progress in hormone research, Ed RO Greep, Academic Press, New York 30: 135-58 68. Heusson JC, Mattheiem WH, Longeval E et al. (1976) Clinical significance of the quantitative assessment of estrogen receptors in breast cancer. In: Hormones and breast cancer. M. Namer, CM Lalanne ed, INSERM Pub, Paris 55: 57-70 69. McGuire WL (1978) Hormone receptors ; their role in predicting prognosis and response to endocrine therapy. Semin Oncol 5: 428-33 Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 121 70. Nomura Y, Miura S, Koyama H et al. (1992) Relative effect of steroïd hormone receptors on the prognosis of patients with operable breast cancer. Cancer 69: 153-64 71. Raemaekers JMM, Beex IVAM, Pieters GFFM et al. (1987), the Breast Cancer Study Group. Progesterone receptor acstivity and relapse-free survival in patients with primary breast cancer: the role of adjuvant chemotherapy. Breast Cancer Res Treat 9: 191-9 72. Spyratos F, Hacene K, Tubiana-Hulin M et al. (1989) Prognostic value of estrogen and progesterone receptors in primary infiltrating ductal beast cancer. A sequential multivariate analysis of 1262 patients. Eur J Cancer Clin Oncol 25: 1233-40 73. Ravdin PM, Green S, Dorr TM et al. (1992) Prognostic significance of progesterone receptor levels in estrogen receptor positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: results of prospective. Southwest oncology group study. J Clin Oncol 10: 1284-91 74. Gion M, Mione R, Pappagallo GL et al. (1993) PS2 in breast cancer – alternative or complementary tool to steroïd receptor statut? Evaluation of 446 cases. Br J Cancer 68: 374-9 75. EORTC XIII (1995) Steroïd receptor distribution in 47892 breast cancers. A collaborative study of 7 european laboratories. Romain S Lainé-Bidron C, Martin PM., Magdelenat H, on behalf of the EORTC Receptor Study group. Europ J Cancer 31A, 411-7 76. EORTC XIV (1996) Improvement of quality control for steroïd receptor measurements: analysis of distribution in more than 40 000 primary breast cancers. Romain S, Spyratos F, Goussard J, Formento JL, Magdelenat H, on behalf of French Study Group on Tissue and Molecular Biopathology. Breast Cancer Treat (in press) 77. Martin PM, Rolland PH, Jacquemier J et al. (1979) Multiple steroïd receptors in human breast cancer. II/Estrogen and progestin receptors of 672 primary tumors. Cancer Chemother Pharmacol 2: 107-13 78. Martin PM, Rolland PH, Jacquemier J et al. (1979) Multiple steroïd receptors in human breast cancer. III/Relationships between steroîd receptors and the state of differenciation and the activity of carcinomas throughout the pathologic features. Cancer Chemother Pharmacol 2: 115-20 79. EORTC I (1973) Standards for the assessment of estrogen receptors. Report of e workshop on september 29, 1972, at the Antoni Van Leeuwenhoek-Huis, Amsterdam. Europ J Cancer 2: 379-81 80. EORTC II (1980) Revision of the standards for the assessments of hormone receptors in human breast cancser ; report of the second EORTC Workshop, Hels on 16-17 march, 1979, in the Netherlands Cancer Institute. Europ J Cancer 81. EORTC III (1983) Standardisation of steroïd receptor assays in human breast cancer. I) Reproductibility of estradiol and progesterone receptor assays. Koenders A, Thorpe SM (on behalf of the EORTC Receptor Group). Eur J Cancer Clin Oncol 19: 1221-9 122 Cancer du sein 82. EORTC IV (1983) Standardisation of steroïd receptor assays in human breast cancer. II) Samples with low receptor content. Thorpe S.M. (on behalf of the EORTC Receptor Group). Eur J Cancer Clin Oncol 19: 1467-72 83. EORTC V (1986) Standardisation of steroïd receptor assays in human breast cancer. III) Selection of reference material for intra- and inter- laboratory quality control. Thorpe SM, Koenders A (on behalf of the EORTC Receptor Group). Eur J Cancer Clin Oncol 22: 939-44 84. EORTC VI (1986) Standardisation of steroïd receptor assays in human breast cancer. IV) Long-term within- and between-laboratory variation of estrogen and progesterone receptor assays. Koenders A, Thorpe SM (on behalf of the EORTC Receptor Group). Eur J Cancer Clin Oncol 22: 945-52 85. EORTC VII (1988) Impact of standardization of estrogen and progesterone receptor assays of breast cancer biopsies in Denmark. Thorpe SM, Pousen HS, Pedersen KO, Rose C, Eur J Cancer Clin Oncol 24: 1263-9 86. EORTC VIII (1990) Comparison of ligand binding assay (LBA) and enzyme immunoassay (EIA) for assessment of the oestrogen receptor content of human breast cancer cytosols. Experience of the EORTC Receptor Group. Blackenstein M.A. (on behalf of the EORTC Receptor Group). Br Cancer Res Treatm 17: 91-8 87. EORTC IX (1991) Determination of estrogen receptors: application of the passing-bablock linear. Regression technique for comparison of enzyme immunoassay and radioligand binding assay in 1841 breast cancer tumours. Romain S, Dussert C, Martin PM, Eur J Cancer 27: 715-20 88. EORTC X (1992) Quality control of cathepsin-D measurement by the EORTC receptors study group. Benraad TJ, Geurts-Moespot A, Sala M, Piffanelli A, Ross A, Foekens JA (on behalf of the EORTC Receptor Group). Eur J Cancer 28: 72-5 89. EORTC XI (1992) Multilaboratory assessment of tissue prognostic factors in breast cancer: the EORTC receptor study group experience. Blankenstein MA, Benraad TJH, Breast Cancer 1992, Proceedings of the Ist International Breast Conference, London Regional Cancer Centre (18-19 sept. 1992, London, Ontario), KS Tonkin and AM Smith (eds) Rodard Publis, Montreal: 58-64 90. EORTC XII (1994) Interlaboratory comparison of estrogen receptor data. Thorpe SM Eur J Cancer 30A: 730-2 91. Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (1992) Systemic Treatment involving 31 000 recurrences and 24 000 deaths among 75 000 women. The Lancet 339, 1-15: 71-85 92. Brown M (1994) Estrogen receptor molecular biology. Breast Cancer 8: 10112 93. Clarcke R, Dickson RB, Lippman ME (1992) Hormonal aspects of breast cancer. Crit Rev Oncol Hematol 12: 1-23 94. Osborne CK (1991) Receptors. In “Breast Diseases” Harris JR (eds), Lippincott JB. Philadelphia: 301-25 Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 123 95. Ravclin PM, Green S, Dorr TM et al. (1992) Prognostic significance of progesterone levels in estrogen receptor-positive patients with metastatic breast cancer treated with tamoxifen: results of a prospective Southwest Oncology group study. J Clin Oncol (10): 1284-92 96. Leclercq G, Bojar M, Goussard J et al. (1986) Abbott monoclonal enzyme immunoassay measurement of estrogen receptors in human breast cancer: a European multicenter study. Cancer Res (46): 42335-405 97. Allred DC (1993) Should immunohistochemical examination replace biochemical hormone receptor assays in breast cancer? Am J Clin Pathol 99: 1-2 98. McClelland RA, Wilson D, Leake R et al. (1991) A multicentre study into the reliability of steroïd receptor immunocytochemical assay quantification. Eur J Cancer 6: 711-5 99. Charpin C, Martin PM, De Victor B et al. (1998) Multiparametric study (SAMBA 200) of estrogen receptor immunocytochemical assay in 400 human breast carcinomas: analysis of estrogen receptor distribution heterogeneity in tissues and correlations with dextran coated charcoal assays and morphological data. Cancer Res (48): 1578-86 100. Blanco G, Holli K, Heikkinen M et al. (1990 Jul) Prognostic factors in recurrent breast cancer: relationship to site of recurrence, disease-free interval, female sex steroïd receptors, ploïdy and histological malignancy grading. Br J Cancer 62 (1): 142-6 101. Sheikh MS, Garcia M, Pujol P et al. (1994) Why are estrogen receptor negative cancers more aggressive than the estrogen receptor positive breast cancer ? Invasion Metastasis 14: 329-36 102. Romain S, Chinot O, Guirou O et al. (1994) Biological heterogeneity of ERpositive breast cancers in the post-menopausal population Int J Cancer 59: 17-9 103. Rose C, Thorpe SM, Andersen KW (on behalf the Danish Breast Cancer Cooperative Group) (1985) Beneficial effect of adjuvant tamoxifen therapy in primary breast cancer patients with high oestrogen receptor values. Lancet 1: 16-20 104. Thorpe SM, Christensen IbJ, Rasmussen BB et al. (1993) Short recurrencefree survival associated with high estrogen receptor levels in the natural history of postmenopausal, primary breast cancer. Eur J Cancer 29A: 971-7 105. Dotzlaw H, Leyghe E, Watson PH, Murphy LC (1996) Expression of estrogen receptor-beta in human breast tumors. J Clin Endocrinol Metab 82: 2371-4 106. Sparato VS, Price K, Glodhirsh A et al. (1992) For the International Breast Cancer Study Group. Sequential estrogen receptor determinations from primary breast cancer ant at relapse: prognostic and therapeutic relevance. Ann Oncol 3: 733-40 107. Elledge RM, Fuqua SAW (2000) Estrogen and Progesterone Receptors. In “Disease of the Breast”, 2nd edition, edited by Jay R Harris, Lippincott Williams & Wilkins, 471-88 108. Kraus WL, McInerney EM, Katzennellenbogen BS (1995) Ligand –dependent transcriptionnally productive association of the amino-and carboxy-ter- 124 Cancer du sein 109. 110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. minal regions of a steroid hormone nuclear receptor. Proc Natl Acad Sci USA 92: 12314-8 Horwitz KB, Jackson TA, Bain DL et al. (1996) Nuclear receptor coactivators and corepressors. Mol Endocrin 10: 1167-77 Smith CL, Nawaz Z, O’Malley BW (1997) Coactivator and corepressor regulation of the agonist/antagonist activity of the mixed antiestrogen, 4hydroxytamoxifen. Mol Endocrinol 11: 657-66 Girault I, Lerebours F, Amarir S et al. (2003) Expression analysis of estrogen receptor alpha coregulators in breast carcinoma: evidence that NCORI expression is predictive of the response to tamoxifen. Clin Cancer Res (4): 1259-66 Cheung KL, Nicholson RI, Blamey RW et al. (2001) Selection of primary breast cancer patients for adjuvant endocrine therapy – is estrogen receptor alone adequate? Breast Cancer Res Treat 65 (2) 155-62 Esslimani-Sahla M, Simony-Lafontaine J, Krama A et al. (2004) Estrogen Receptor ß (ERß) Level but Not Its ERßcx Variant Helps to Predict Tamoxifen Resistance in Breast Cancer. Clin Cancer Res 10 (17): 5769-76 Yoshinaga K, Inoue H, Utsunomiya T et al. (2004). N-Cadherin Is Regulated by Activin A and Associated with Tumor Aggressiveness in Esophageal Carcinoma. Clin Cancer Res 10 (17): 5702-7 Yarden Y, HER2 (2000) Basis Research, Prognosis and Therapy. In “Breast Disease back edition”, IOS Press: 1-152 Révillion F, Bonneterre J, Peyrat JP (1998) ERBB2 Oncogene in Human Breast Cancer and its Clinical Significance. European Journal of Cancer 34 (6) 791-808 Roux-Dosseto M, Romain S, Dussault N et al. (1989) Correlation of erbB-2 gene amplification with low levels of estrogen and/or progesterone receptors in primary breat cancer. Do erbB-2 products delineate hormone-independent tumors? Growth Factors and Oncogenes. Colloque Inserm/John Libbey Eurotext Ltd; 190: 143-54 Eppenberger-Castori S, Kueng W, Benz C et al. (2001) Prognostic and Predictive Significance of ErbB-2 Breast Tumor Levels Measured by Enzyme Immunoassay. Journal of Clinical Oncology 19 (3): 645-56 Ferrero-Paüs M, Hacène K, Tubiana-Hulin M et al. (1999) Re: prognostic importance of low cerbB2 expression. JNCI (91): 1584-85 Hayes DF, Yamauchi H, Broadwater G et al. (2001) Circulating HER-2/erbB2/c-neu (HER-2) Extracellular Domian as a Prognostic Factor in Patients with Metastatic Breast Cancer: Cancer and Leukomia Group B Study 8662. Clinical Cancer Research (7): 2703-11 Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D et al. (2002) HER-2 Amplification and Topoisomerase Iiα Gene Aberrations as Predictive Markers in Node-positive Breast Cancer Patients Randomly Treated Either with an Anthracycline-based Therapy or with Cyclophosphamide, Methotrexate, and 5-Fluorouracil. Clinical Cancer Research (8) 1107-16 Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 125 122. Klijn JG, Berns EM, Schmitz PIM et al. (1992) The clinical significance of epidermal growth factor receptor (EGF-R) in human breast cancer: a review on 5 232 patients. Endoc Rev 13: 3-17 123. Sainsbury JRC, Needham GK, Farndon JR et al. (1987) Epidermal-growth factor receptor status as predictpor of early recurrence and death from breast cancer. Lancet 1: 1398-402 124. Klijn JGM, Look PM, Portengen H et al. (1994) The pronostic value of epidermal growth factor receptor (EGF-R) in primary breast cancer: results of a 10 years follow-up study. Breast Cancer Res Treat 29: 73-83 125. Klijn JGM, Berns EMJJ, Schmitz PIM et al. (1993) Epidermal growth factor receptor (EGF-R) inclinical breast cancer: update 1993. Endocrine Rev Monogr 1: 171-4 126. Nicholson S, Wright C, Sainsbury JRC et al. (1990) Epidermal growth factor receptor (EGFr) as a marker for poor prognosis in node-negative breast cancer patients: neu and tamoxifen failure. J Steroid Biochem Mol Biol 37: 811-4 127. Klijn JMG (1999) Pronostic and predictive factors in breast cancer. Contemporary Endocrinology if Breast Cancer. Edited by: A Manni Humana Press Inc, Totowa NJ: 205-20 128. Kit S (1976) Thymidine kinase, DNA synthesis and cancer. Mol Cell Biochem 11: 161-82 129. Galloux H, Javre JL, Guerin D et al. (1998) Intérêt pronostique de l’activité thymidine kinase fœtale dans les cancers du sein. CR Acad Sci 306: 89-92 130. Javre JL, Hannocuhe N, Samperez S et al. (1986) Mise en évidence de thymidine kinase de type fœtal dans les cancers du sein. Bull Cancer 73: 8-16 131. O’Neill KL, Hoper M, Odling-Smee GW (1992) Can thymidine kinase levels in breast tumors predict disease recurrence. JNCI 84: 1825-8 132. Romain S, Javre JL, Samperez S et al. (1990) Valeur pronostique de la thymidine kinase dans le cancer du sein. Bull. Cancer 77: 973-83 133. Romain S, Spyratos F, Guirou O et al. (1994) Technical evaluation of thymidine kinase assay in cytosols from breast cancer. Eur J Cancer 30A: 2163-5 134. Romain S, Christensen Ibj, Chinot O et al. (1995) Prognostic value of cytosolic thymidine kinase activity as a maker of proliferation in breast cancer. Int J Cancer 614: 7-12 135. Sakamoto S, Iwama T, Ebucchi M et al. (1986) Increased activities of thymidine kinase isoenzymes in human mammary tumours. Br J Surgery 73: 272-3 136. Sakamoto S, Ebucchi M, Iwama T (1993) Relative acstivities of thymidylate synthetase and thymidine kinase in human mammary tumors. Anticancer Res 13: 205-8 137. Romain S, Bendahl PO, Guirou O et al. (2001) DNA-Synthetizing enzymes in breast cancer (Thymidilate Synthase and thymidylate kinase): association with flow cytometric S-phase fraction and relative prognostic importance in node negative premenopausal patients. Int J Cancer (95): 56-61 126 Cancer du sein 138. Romain S, Martin PM, Klijn JGM et al. (1997) DNA Synthesis enzyme activity: a biological tool useful for predicting anti-metabolic drug sensitivity in breast cancer. Int. J. Cancer. (Pred Oncol) (74): 156-61 139. Broët P, Romain S, Daver A et al. (2001) Thymidine Kinase as a proliferate marker: clinical relevance in 1692 primary breast cancer patients. J Clin Oncol 19 (11): 2278-87 140. Foekens JA, Romain S, Look MP et al. (2001) Thymidine Kinase and Thymidilate Eynthetase in advanced breast cancer: response to tamoxifen and chemotherapy. Cancer Research (61): 1421-5 141. Folkman J (1990) What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? JNCI (82): 4-6 142. Eppenberger U, Kueng M, Lueschen K et al. (1998) Markers of tumor angiogenesis and protealysis independently define high and low-risk subsets of node-negative breast cancer patients. J Clin Oncol 16: 3129-36 143. Gasparini G, Toi M, Gion M et al. (1997) Prognostic significance of vascular endothelial growth factor in node-negative breast carcinoma. JNCI 89: 13947 144. Foekens JA, Peters HA, Grebentchikov N et al. (2001) High Tumor Levels of Vascular Endothelial Growth Factor Predict Poor Response to Systemic Therapy in advanced Breast Cancer. Cancer Research (61): 5407-14 145. Manders P, Beex LV, Tjan-Heijen VL et al. (2002) The Prognostic Value of Vascular Endothelial Growth Factor in 574 Node-Negative Breast Cancer Patients who did not receive adjuvant Systemic Therapy. Br J Cancer 87 (7): 772-8 146. Berns EMJJ, Klijn JGM, Look PM et al. (2003) Combined vascular endothelial growth factor and TP53 status predicts poor response to tamoxifen therapy un estrogen receptor-positive advanced breast cancer. Clin Cancer Res 9: 1253-8 147. Obernair A, Kurz C, Czerwenka K et al. (1995) Microvessel density and vessel invasion in lymph node-negative breast cancer: effect on recurrence-free survival. Int J Cancer 62: 126-31 148. Mittra I, Mac Rae KD (1991) A metaanalysis of reported correlations between prognostic factors in breast cancer: does axillary lymph node metartasis represent biology or chronology. Eur J Cancer 27: 1574-83 149. Tubiana-Hulin M, Hacène K, Martin PM et al. (1995) Prognostic factor clustering in breast cancer: biology or chronology. Eur J Cancer 31: 282-3 150. Fisher EH, Charbonneau H, Tonks NK (1991) Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Science 253: 401-6 151. Cantley LC, Auger KR, Carpenter C (1991) Oncogenes and signal transduction. Cell 64: 281-302 152. Skorki T (2002) Oncogenic Tyrosine Kinases and the DNA Damage response. Nature Reviews Cancer (2) 1-10 153. Bolla M, Rostaing-Puissant B, Chedin M et al. (1993) Protein tyrosine kinase activity as a pronostic parameter in humain breast cancer. Breast Cancer Res Treat 26: 283-7 Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 127 154. Durocher Y, Chevalier S (1990) Protein tyrosine kinases in human breast cancer: kinetic properties and evidence for the presence of two forms of native enzyme. Breast Cancer Res Treat 17: 99-107 155. Hennipman A, Van Oirschot BA, Smits J et al. (1989) Tyrosine kinase activity in breast cancer, benign breast disease and normal breast tissue. Cancer Res 490: 516-21 156. Lower EE, Williams L (1992) Phosphotyriosine expression in breast cancer specimens is associated with worse prognosis. Proc Amer Assoc Cancer Res 33: 373 157. Lower EE, Franco RS, Miller MA et al. (1993) Enzymatic and immunohistochemical evaluation of tyrosine phosphorylation in breast cancer specimens. Breast Cancer Res Treat 26: 217-24 158. Ottenhoff-Kalff AE, Rijksen G, Van Beuden AACM et al. (1992) Characterization of protein tyrosine kinases from human breast cancer: Involvement of the c-src oncogene product. Cancer Res 52: 4773-8 159. Lloyd AC (2000) P53: only ARF story. Nature Cell Biology 2: E45-E50 160. Carnero A, Hudson JD, Price M, Beach DH (2000) P16INK4A and p19ARF act in overlapping pathways in cellular immortalization. Nature Cell Biology 2: 148-9 161. Robert L, Sutherland P (2000) ER signaling onto the cyclin/CDK/Rb pathway. 23rd Annual San Antonio Breast Cancer Symposium. December 6-9 162. Roux-Dosseto M, Martin PM (1989) A paradigm for oncogene complementation in human breast cancer. Research in Virology 140: 571-91 163. Berns PMJJ, Klijn JGM, van Staveren IL et al. (1992). Prevalence of amplification of the oncogene c-myc, HER2/neu and int2 in one thousand human breast tumors: correlation with steroid receptors. Eur J Cancer 28: 697-700 164. Roux-Dosseto M, Romain S, Dussault N et al. (1992) C-Myc gene amplification in selected node-negative breast cancer patients correlates with high rate of early relapse. Europ J Cancer 28 A: 1800-4 165. Berns PMJJ, Klijn JGM, van Putten WLJ et al. (1992) C-myc amplification is a better prognostic factor than HER2/neu amplification in primary breast cancer. Cancer Res 52: 1107-13 166. Deming SL, Nass SJ, Dickson RB et al. (2000) C-myc amplification in breast cancer: a metaanalysis of its occurrence and prognostic relevance. Br J Cancer 83: 1688-95 167. Borg A (1992) Gene alterations in human breast cancer. In ”A Spandidas Edition – Current perspectives on molecular oncology” Vol I, Part B. Cancer genes and their clinical implications. London JAI Press: 21-79 168. Berns PMJJ, Foekens JA, van Staveren IL et al. (1995) Oncogene amplification and prognosis in breast cancer: relationship with systemic treatment. Gene 159: 11-8 169. Berns PMJJ, Klijn JGM, Foekens JA (1997) Prognostic and predictive significance of P53 protein accumulation in human primary breast cancer analysed with a luminometric immunoassay (LIA) on tumor cytosal. In “Klijn JGM 128 Cancer du sein 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. (ed) Prognostic and predictive value of P53 ESO Scientific updates. Vol. I Amsterdam. Elsevier Science BV: 51-63 Broët P, Spyratos F, Romain S et al. (1999) Prognostic value of uPA and p53 accumulation measured by quantitative biochemical assays in 1245 primary breast cancer patients: a multicentre study. Br J Cancer 80: 536-45 Elledge RM, Allred DC (1997) P53 status: impact on Breast tumor biology and response to therapy. In ‘Klijn JGM ed Prognostic and predictive value of P53 ESO Scientific updates. Vol. I Amsterdam. Elsevier Science BV: 63-76 Börresen-Dale AL (1997) Subgroup of P53 mutations may predict the clinical behaviour of cancers in the breast and colon and contribute to therapy response. In ‘Klijn JGM ed Prognostic and predictive value of P53 ESO Scientific updates. Vol. I Amsterdam. Elsevier Science BV: 23-33 Berns PMJJ, van Staveren IL, Look MP et al. (1998) Mutations in residues of P53 that directly contact DNA predict poor outcome in human primary breast cancer. Br J Cancer 77: 1130-6 Berns PMJJ, Foekens JA, Vossen R et al. (2000) Complete Sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer. Cancer Res 60: 2155-62 Geisler S, Lönning PE, Aas T et al. (2001) Influence of TP53 gene alterations and cerbB2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer. Cancer Res 61: 2505-12 Rak J, Yu JL, Kerbel RS et al. (2002) What do Oncogenic Mutations Have to do with Angiogenesis / vascular dependence of tumors. Cancer Res 62: 1931-4 Simone NL, Remaley AT, Charboneau L et al. (2000) Sensitive Immunoassay of tissue cell proteins procured by laser capture microdissection Am J Pathol 156 (2): 445-52 Gonzalez-Angulo AM, Sneige N, Buzdar AU et al. (2004) p53 Expression as a Prognostic Marker in Inflammatory Breast Cancer. Clin Cancer Res 10: 6215-21 Dorssers LCJ, Grebenchtchikov N, Brinkman A et al. (2004) The Prognostic Value of BCAR1 in Patients with Primary Breast Cancer. Clin Cancer Res10: 6194-202 Parrella P, Poeta ML, Gallo AP et al. (2004) Nonrandom Distribution of Aberrant Promoter Methylation of Cancer-Related Genes in Sporadic Breast Tumors. Clin Cancer Res 10: 5349-54 Bae YK, Brown A, Garrett E et al. (2004) Hypermethylation in Histologically Distinct Classes of Breast Cancer. Clin Cancer Res 10: 5998-6005 Dulaimi E, Hillinck J, Ibanez de Caceres I et al. (2004) Tumor Suppressor Gene Promoter Hypermethylation in Serum of Breast Cancer Patients. Clin Cancer Res10: 6189-93 Taube SE, Gion M, Schilsky L (2004) 3rd EORTC-NCI International Meeting on Cancer Molecular Markers: From Discovery to Clinical Practice. Expert Rev Mol Diagn 4 (4): 11-3 Biomarqueurs tissulaires tumoraux. Cancer du sein … 129 184. Kuerer HM, Coombs KR et al. (2004) Association between ductal fluid proteomic expression profiles and the presence of lymph node metastase in women with breast. Cancer Surgery 136: 1061-9 185. Bustin SA, Dorudi S (2002) The value of microarray techniques for quantitative gene profiling in molecular diagnostics. TRENDS in Molecular Medicine 8 (6): 269-71 186. Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J et al. (2001) Minimum information about a microarray experiement (MIAME) – toward standards for microarray data. Nature Genetics 29: 365-73 187. Emmert-Buck MR, Strausberg RL, Krizman DB et al. (2000) Molecular profiling of clinical tissue specimens. Feasibility and Applications. Am J Path 156: 1109-15 188. Bustin SA (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse tranbscription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol End 29: 23-39 189. Yanai I, Benjamin H, Shmoish M et al. (2004) Genome-wide midrange transcription profiles reveal expression level relationships in human tissue specification. Bioinformatics doi: 10-1093 190. Weigelt B, Peterse JL, Van’t Veer LJ (2005) Breast Cancer Metartasis Markers and Models. Nature Reviews Cancer 5: 591-602 191. Ahr A, Holtrich U, Solbach C et al. (2001) Molecular classification of breast cancer patients by gene expression profiling. J Pathol 195: 312-20 192. Van‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415: 530-6 193. Caldas C, Aparicio SAJ (2002) The molecular outlook. Nature 415: 484-5 194. Ahr A, Karn T, Solbach C et al. (2002) Identification of high-risk breastcancer patients by gene expression profiling. The Lancet 359: 131-2 195. Palmieri C, Vigushin D et al. (2002) Gene-expression profiling and identification of patients at high risk of breast cancer. The Lancet 360: 173-4 196. Ahr A, Karn T, Solbach C et al. (2002) Identification of high-risk breastcancer patients by gene expression profiling. The Lancet 359: 131-2 197. Palmieri C, Vigushin D et al. (2002) Gene-expression profiling and identification of patients at high risk of breast cancer. The Lancet 360:173-4 198. Bertucci F, Viens P, Hingamp P et al. (2003) Breats cancer revisited using DNA array-based gene expression profiling. Int J Cancer 103: 565-71 199. Bertucci F, Viens P, Tagett R (2003) DNA arrays in clinical oncology: promises and challenges. Lab Invest 83: 305-16 200. Kang YJ, Dolled-Filhart M, Ocal IT et al. (2003) Tissue microarray analysis of hepatocyte growth factor/met pathway components reveals a role for met, matriptase, and hepatocyte growth factor activator inhibitor 1 in the progression of node-negative breast cancer. Cancer Res 63: 1101-5 201. Bertucci F, Borie N, Ginestier C et al. (2004) Identification and validation of an ERBB2 gene expression signature in breast cancers Oncogene 23: 2564-75 202. Ein-Dor L, Kela I, Getz G (2004) Outcome signature genes in breast cancer: is there a unique set? Bioinformatics doi: 10-1093 130 Cancer du sein 203. Biganzoli E, Boracchi P (2004) Old and new markers for breast cancer prognosis: the need for integrated research on quantitative issues. Eur J Cancer 40: 1803-6 204. Edén P, Ritz C, Rose C et al. (2004) « Good old » clinical markers have similar power in breast cancer prognosis as microarray gene expression profilers. Eur J Cancer 40: 1837-41