UNIVERSITE HASSAN IICASABLANCA FACULTE DES SCIENCES BEN M’SIK Département de Biologie TRAVAUX PRATIQUES DE GENETIQUE (Semestre 4) TP3 Année universitaire : 2018 - 2019 2 La Drosophile : CARACTERISTIQUES ET TECHNIQUES DE MANIPULATIONS La drosophile, Drosophila melanogaster, ou mouche du vinaigre est un insecte diptère de petite taille (4 mm environ). C’est un insecte cosmopolite, répandu dans le monde entier par l’activité humaine. Vu son chimiotactisme positif vis-à-vis de l’acide acétique, la drosophile utilise comme milieu naturel les fruits en décomposition. I. Morphologie générale de l’adulte : Les caractères morphologiques de l’adulte ont l’avantage d’être précis, simples et relativement faciles à identifier objectivement à l’aide de la loupe binoculaire. En utilisant comme référence la souche sauvage de phénotype connu, on peut déterminer toute variation brusque (mutation) affectant ces caractères chez une souche inconnue. De ce fait, il est important de connaître de façon précise la morphologie de la souche sauvage (Figure 1). Le corps de la drosophile est recouvert de soies (microsoies et macrosoies) et divisé en trois parties : • La tête reliée au thorax par un cou étroit, porte : - Deux gros yeux à facettes de couleur rouge brique, - Trois ocelles dans la région frontale, - Deux antennes courtes, épaisses et tri-articulées : l’article terminal porte un appendice appelé arista - Deux pièces buccales formant une trompe. • Le thorax comprend des métamères ou segments : - Le prothorax, peu développée et invisible dorsalement, porte la première paire de pattes, - Le mésothorax, bien visible dorsalement, porte les ailes et la deuxième paire de pattes, - Le métathorax, invisible dorsalement, porte les balanciers et la troisième paire de pattes • L’abdomen est segmenté et orné de soies, chaque segment présent dorsalement une bande postérieure pigmentée en noir. Les pièces génitales sont visibles ventralement. 3 Tête Thorax Abdomen Figure 1 : Morphologie de la drosophile (Drosophila melanogaster) adulte. Figure 2 : Dimorphisme sexuel : présence de ‘‘peignes sexuels’’ chez le mâle. C : coxa ; TR : trochanter ; F : fémur ; TI : tibia ; TA : tarse. 4 II. Le dimorphisme sexuel : Les mâles et les femelles présentent des différences morphologiques (Figure 1) que l’on peut voir à l’œil nu ou à la loupe binoculaire : 1- Différence de taille : les femelles sont plus grandes que les mâles. 2- Différence dans la forme et la couleur de l’abdomen : vu dorsalement, l’abdomen de la femelle est plus pointu avec des segments terminaux gris assez clairs ; l’abdomen du mâle, plus arrondi, a des segments terminaux gris très foncé, voire noirs. 3- Différence au niveau des organes sexuels : le pénis est très coloré en brun à brun foncé alors que la plaque vaginale ne l’est pas. 4- Présence de ‘‘peignes sexuels’’ chez le mâle seulement (Figure 2) : il s’agit d’une touffe de poils noirs au niveau du métatarse (premier article du tarse de la paire de pattes antérieures). Ce critère est particulièrement utilisé lorsque la différence de coloration ou de forme de l’abdomen entre mâles et femelles n’est pas clairement perceptible (individus à peine éclos, mutants de coloration du corps, mutants plus ou moins déformés). III. Cycle de développement et biologie sexuelle : La phase diploïde est prédominante : la phase haploïde est réduite aux gamètes. Figure 3 : Cycle de développement de Drosophila melanogaster Le temps nécessaire pour que l’œuf fécondé donne un individu adulte (ou imago) varie en fonction de la température d’élevage. A titre d’exemple, les adultes émergent à partir : 5 ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Du 50ème jour à 12°C. Du 33ème jour à 14°C. Du 19ème jour à 19°C. Du 10ème jour au 11ème jour à 25-26°C. Du 8ème jour à 30°C Ces chiffres ne sont pas absolus : il peut y avoir une légère variabilité d’un repiquage à un autre pour une même souche : par ailleurs, un certain nombre de mutations conduisent à un allongement du cycle de développement. Les œufs sont blancs, opaques, avec 2 petites ‘‘cornes’’, les larves sont jaunâtres, translucides, mangent beaucoup et se déplacent activement. Les mâles n’ont pas d’activité sexuelle pendant à peu près 9 heures après leur émergence. Par ailleurs, l’éthérisation les inactive pendant environ un jour. Les femelles, elles, ne peuvent être fécondées pendant les 4 premières heures qui suivent leur émergence (présence d’un ‘‘bouchon vaginal”). Elles ne commencent à pondre qu’un jour après leur émergence avec une période de ponte maximale se situant à peu près au 4ème jour. Après copulation, les spermatozoïdes peuvent être stockés dans le réceptacle séminal et les spermathéques de la femelle : les œufs sont fécondés à leur passage dans l’utérus avant la ponte. De ce fait, il est impératif d’utiliser les femelles vierges lors de croisement entre souches de génotypes différents. Une seule femelle peut donner une descendance de 200 individus. Une femelle vierge pond des œufs en chapelet qui ne se développent pas. IV. Garniture chromosomique : Drosophila melanogaster possède 4 paires de chromosomes répertoriés comme suit : • • Une paire de chromosomes sexuels X (ou I) et Y (mâle : XY ; femelle : XX) Trois paires d’autosomes : II, III et IV De très nombreux gènes sont localisés sur le chromosome X, II et III. Sur le chromosome IV, très petit, de très rares gènes sont localisés. Quelques gènes (situés dans des régions proches du centromère) sont communs aux chromosomes X et Y. Il n’y a pas de crossing-over chez le mâle, quelle que soit la paire de chromosomes. 6 V. Techniques de laboratoire : a) Milieux et conditions d’élevage : Les drosophiles sont cultivées en bouteilles ou en tube, sur un milieu gélosé composé de sucre, de semoule de maïs, de levure de bière et additionné d’un antifongique : l’acide propionique (ou le moldex). La température d’élevage est comprise entre 10 et 30°C : au-dessous de 10°C, les femelles ne pondent pas et au-dessus de 30°C, les mâles sont stériles. Les élevages peuvent être infectés par différents organismes : • Moisissures, essentiellement Aspergillus et Penicillium ; pour les éviter, il faut repiquer les souches tous les 10 à 11 jours. • Bactéries : elles provoquent la liquéfaction du milieu. Pour s’en débarrasser ne pas garder les bouteilles trop longtemps. • Acariens : parasites des drosophiles de très petite taille. b) Ethérisation : Pour pouvoir les manipuler, il faut endormir les mouches à l’éther. Transférer les mouches par l’entonnoir dans un tube puis fermer avec du coton imbibé par quelques gouttes d’éther. Les mouches doivent être retirées dès qu’elles ne bougent plus : leur immobilité durera alors 5 min environ. Attention : une anesthésie prolongée est mortelle pour les mouches ! Les individus morts sont reconnus à la position redressée de leurs ailes et à leurs pattes crispées. Vider l’éthériseur après chaque manipulation et vérifier qu’il est vide avant chaque utilisation. L’examen des mouches s’effectue à l’aide d’une loupe binoculaire. Utiliser une petite pince pour manipuler les mouches toujours délicatement. c) Obtention des femelles vierges : Pour les croisements faisant intervenir deux souches différentes (par exemple, mutant par sauvage ou F1 par parent,…) ou lorsque coexistent plusieurs classes phénotypiques dans une même population, il est indispensable d’utiliser des femelles vierges. Pour les obtenir, les bouteilles d’élevage sont soigneusement vidées de tous les individus adultes le matin puis remises à 26°C. 5 à 6 heures plus tard, les individus éclos durant ce laps de temps sont triés et les femelles isolées soit pour être immédiatement croisées, soit pour être stockées dans des tubes contenant du milieu nutritif. 7 d) Technique de croisement : ✓ Isoler des femelles vierges si nécessaire. ✓ Prélever le nombre de mâles et de femelles nécessaires pour le croisement, après les avoir anesthésiés. Habituellement, on croise : • 10 à 12 femelles avec 8 à 10 mâles dans une bouteille, • 2 à 3 femelles avec 2 à 3 mâles dans un tube. Dans le cas de croisements peu fertiles, il faut augmenter le nombre d’individus par bouteille. Les croisements individuels, c’est-à-dire où l’on veut déterminer la descendance d’un seul individu se font en tube : • Une femelle est croisée avec 2 à 3 mâles. • Un mâle est croisé avec 3 à 4 femelles. ✓ Les mettre dans une bouteille vide de réanimation. Ne jamais mettre des mouches dans une bouteille humide ou froide : à cause de la condensation, les mouches se collent les ailes aux parois et meurent. ✓ Quand toutes les mouches sont réveillées, les transvaser dans la bouteille ou le tube de croisement. Ne jamais jeter les mouches endormies sur le milieu. Prendre soin de boucher les bouteilles hermétiquement et éviter de laisser les mouches s’échapper. ✓ Mettre à l’étuve à la température choisie. ✓ Généralement, 4 jours après la réalisation du croisement, ne pas oublier de vider les parents et ce, pour éviter d’une part d’obtenir des bouteilles surpeuplées et d’autre part de compter les parents dans la descendance. En cas de croisement peu fertile, laisser les parents 1 ou 2 jours de plus jusqu’à l’apparition de larves suffisamment nombreuses. 8 e) Observation et comptage des descendants : ▪ Lorsque la descendance est nombreuse, n’éthériser qu’un petit nombre d’individus à la fois : ne pas oublier que les mouches ne restent endormies que 5 min environ. Si possible, séparer à l’œil nu les différentes classes phénotypiques de façon dichotomique à l’aide d’un pinceau, sinon utiliser la loupe binoculaire. ▪ Si les mouches se réveillent pendant l’observation, introduire un morceau de coton imbibé d’éther dans la boite de Pétri et refermer. ▪ Toujours compter la totalité de la descendance, c’est-à-dire l’ensemble des individus nés entre le 10ème et environ le 17ème jour après la réalisation du croisement : les femelles éclosent statiquement plus tôt que les mâles et les différentes classes phénotypiques peuvent apparaître à des temps différents. Attention : au-delà du 20ème jour, on a affaire à la génération suivante ! VI. Manipulations : a) But des manipulations : ❖ Initiation à la génétique de la drosophile. ✓ Illustration de certaines lois de Mendel. ✓ Etude de certaines exceptions aux lois de Mendel : cas de gènes liés et les gènes portés par le chromosome X. b) Description des mutations étudiées : 1. Yeux : ▪ White (w) : œil blanc ou incolore. ▪ Sepia (se) : œil de couleur marron foncé, presque noir 2. Ailes : ▪ Curly (cu) : extrémités des ailes recourbées vers le haut ▪ Dumpy (Dp) : ailes tronquées 3. Corps : ▪ Yellow (y) : corps jaune ▪ Ebony (e) : corps noir 4. Soies : ▪ Forked (f) : soies courtes et frisées ▪ Stubble (sb) : soies plus épaisses et plus courtes Les croisements à réaliser seront proposés par les enseignants lors de chaque séance. 9 Chromosome I (X) 0 1.5 yellow white Chromosome II 0 57 0 26 sepia 44 scarlet black forked Bar 67 vestigial 70.7 104 eyeless dumpy vermilion 48.5 56.5 0 Chromosome IV 0.2 13 33 Chromosome III brown ebony Yellow (y) : corps jaune White (w) : yeux blancs Vermilion (v) : yeux vermillon Forked (f) : soies fourchues Bar (B) : yeux réduits Dumpy (dp) : ailes courtes Black (b) : corps noir Vestigial (vg) : ailes très réduites Brown (bw) : yeux bruns Sepia (se) : yeux très foncés Scarlet (st) : yeux écarlate Ebony (e) : corps noir Eyeless (ey) : yeux très réduits Localisation de quelques gènes sur la carte génétique de Drosophila melanogaster 10 Le Test de Conformité de χ2 Ce test permet de vérifier si les résultats expérimentaux sont conformes à des résultats théoriques. Exemple expérimental : On croise 2 souches pures de drosophile, l’une aux ailes longues et l’autre aux ailes courtes. Les mouches de la descendance F1, toutes sauvages aux ailes longues, croisées entre elles donnent la descendance F2 suivante : - 315 drosophiles aux ailes longues [c+] - 84 drosophiles aux ailes courtes[c] Interpréter les résultats : L’hypothèse la plus simple est celle d’un caractère déterminé par un seul couple d’allèles autosomale, avec dominance de l’allèle sauvage. Dans le cadre de cette hypothèse, quelles seraient théoriquement les proportions des deux classes phénotypiques ? F2 : F1 x F1, donc les proportions théoriques seraient : - ¾ aux ailes longues, soit 300 drosophiles [c+] - ¼ aux ailes courtes, soit 100 drosophiles [c] Les résultats expérimentaux (315[c+] et 85 [c]) sont-ils conformes à l’hypothèse avancée ? Les écarts obtenus entre les effectifs théoriques et les effectifs expérimentaux sontils significatifs ? Le test de χ2 va permettre de répondre à cette question. Principe du test : 1- On admet que l’hypothèse est correcte 2- On calcule la probabilité d’obtenir par le seul hasard, dans le cadre de l’hypothèse, un écart supérieur ou égale à celui observé. - Si cette probabilité est trop faible, significative et on rejette l’hypothèse. on conclut que la différence est - Si cette probabilité est supérieure à 0.05, la différence n’est pas significative et les résultats expérimentaux sont conformes à l’hypothèse 11 Calcul de χ2 : χ2=∑ (T-E)2 T [c+] Effectifs expérimentaux E 315 Effectifs théoriques T 300 [c] 85 100 Classes phénotypiques T-E (T-E)2 T -15 0.75 15 2.25 χ2= 0.75 + 2.5 = 3.00 Degré de liberté : Il faut déterminer le degré de liberté. En générale, le nombre de degré de liberté (d.d.l) est égal au nombre de classes moins 1. Dans l’exemple expérimental, 2 classes phénotypiques [c+] et [c] sont obtenues en F2. d.d.l = 2-1 = 1 Utilisation de la table du χ2 : α= 0.05 χ2 seuil = 3.84 χ2 = 3.00 χ2 = 3.00< χ2 seuil = 3.84 La probabilité que ces écarts soient dus au seul hasard est donc supérieure à 0.05. Ces écarts ne sont donc pas significatifs et on admet que l’hypothèse est valable. Si χ2 calculé est supérieur au χ2 seuil, on peut conclure que la probabilité pour que les écarts obtenus soient dus au seul hasard est inferieure à 0.05 (donc trop faible) ; ces écarts sont donc significatifs et on rejette l’hypothèse avancée. Table de χ2 α ddl 1 2 3 4 5 0.500 0.45 1.39 2.37 3.36 4.35 0.250 1.32 2.77 4.11 5.39 6.63 0.100 2.71 4.61 6.25 7.75 9.24 0.050 3.84 5.99 7.81 9.49 11.07 0.025 5.02 7.38 9.35 11.14 12.83 0.010 6.63 9.21 11.34 13.28 15.09 0.005 7.88 10.60 12.84 14.86 16.75 12 Compte rendu TP3 Analyse des résultats de quelques croisements chez la drosophile : Nom et prénom : Groupe : Croisement 1 Date : ✓ ✓ ✓ ✓ Question 1: Tirer des conclusions des résultats de la F1 des deux croisements : Citer les caractères étudiés à travers ces deux croisements : ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Déterminer les deux allèles de chaque caractère : ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Déterminer l’allèle dominant de chaque caractère : ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………. Ces caractères sont-ils liés au sexe ou portés par des autosomes? Justifier votre réponse. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………. Question 2: Analyser les résultats de F2 obtenus pour le croisement F1 X F1 ✓ Ranger les différentes classes phénotypiques ✓ Compter le nombre de chaque classe ✓ Reporter les résultats sur le tableau suivant: Classes phénotypiques Nombres [dp+, se+] [dp+, se] [dp, se+] [dp, se] ✓ Selon les proportions des classes phénotypiques obtenues que pouvez-vous déduire ? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Analyser statistiquement les résultats caractère par caractère en utilisant le test de conformité χ2 si nécessaire. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………. Question 3: Prévoir les résultats de F2 (génotypes et phénotypes) obtenus pour le croisement F1 X F1 : Phénotypes Proportions prévues Génotypes [dp+, se+] [dp+, se] [dp, se+] [dp, se] Question 4: Analyser statistiquement les résultats expérimentaux pour l’ensemble des deux caractères en utilisant le test de conformité χ2 si nécessaire. Classes Résultats expérimentaux (E) Résultats théorique (T) T-E (T-E)²/T [dp+, se+] [dp+, se] [dp, se+] [dp, se] Χ2 exp = Σ (T-E) /T 2 Χ2 exp = ……………….. ddl = …………….. α : 0,05 Χ2 seuil = …………….. ✓ Comparer Χ2 exp et Χ2 seuil : ……………………………………………………… ✓ Conclusion : ………………………………………………………………………………………….. ………………………………………………………………………………………………………… Question 5: Analyser les résultats de F2 obtenus pour le croisement test ✓ Ranger les différentes classes phénotypiques ✓ Compter le nombre de chaque classe ✓ Reporter les résultats sur le tableau suivant: Classes phénotypiques Nombres [dp+, se+] [dp+, se] [dp, se+] [dp, se] ✓ Selon les proportions des classes phénotypiques obtenues que pouvez-vous déduire ? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Analyser statistiquement les résultats caractère par caractère en utilisant le test de conformité χ2 si nécessaire. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Question 6: Sachant que la mutation « ailes courtes » est la mutation « dumpy », déterminer la nature de la mutation « yeux bruns » en utilisant la carte génétique de la drosophile. Croisement 2 Question 1: Tirer des conclusions des résultats de la F1 des deux croisements. ✓ Combien de caractères étudiés dans ces deux croisements? Le ou lesquels? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Quelles mutations sont étudiées? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Les allèles mutants sont dominants ou récessifs? Justifier. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Ces mutations sont-elles liées au sexe ou portées par des autosomes? Justifier votre réponse. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Combien de gènes sont impliqués? Y a-t-il une liaison ou une indépendance physique entre les gènes impliqués ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………. Question 2: Ecrire les génotypes des parents et des descendants F1 du croisement white X sepia Génotypes des parents [White] [sepia] Génotypes des descendants F1 [Sauvage] [White] Question 3: A l’aide des données sur la chaine de biosynthèse des pigments des yeux de la drosophile ci-dessous, prévoir les résultats (phénotypes et proportions) de F2: F1 X F1 en utilisant le diagramme à branche Voies de biosynthèse des pigments des yeux de la drosophile Proportions et phénotypes …… […..] …….. [……….] …… […..] …….. [………..] .….. […..] …….. [………..] .….. [..…] …….. [………..] ….. […..] ….. […..] ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… Question 4: Analyser statistiquement les résultats expérimentaux de F2 obtenus pour le croisement F1 X F1 ✓ Ranger les différentes classes phénotypiques ✓ Compter le nombre de chaque classe ✓ Reporter les résultats sur le tableau suivant: Classes phénotypiques Nombres Proportions [rouge sombre] [sepia] [white] ✓ Selon les proportions des classes phénotypiques obtenues que pouvez-vous déduire? ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………. ✓ Analyser statistiquement les résultats en utilisant le test de conformité χ2 si nécessaire. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Question 5: De quelle type d’intéraction s’agit-il? Epistasique ou non épistasique? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………. Croisement 3 Question 1: Tirer des conclusions des résultats de la F1. ✓ Combien de caractères étudiés dans ces deux croisements? Le ou lesquels? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Quelles mutations sont étudiées? ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Les allèles mutants sont dominants ou récessifs? Justifier. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Ces mutations sont-elles liées au sexe ou portées par des autosomes? Justifier votre réponse. ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Combien de gènes sont impliqués? Y a-t-il une liaison ou une indépendance physique entre les gènes impliqués ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Question 2: Est-il nécessaire de réaliser un test cross? Justifier ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Question 3: ✓ Séparer les classes phénotypiques de la descendance F2 ✓ Compter le nombre de chaque classe ✓ Déterminer les classes parentales des classes recombinées Classes phénotypiques Total Types de classe ✓ Comparer entre les classes parentales et les classes recombinées ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ✓ Déduire la liaison ou l’indépendance génique ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Question 4: Démontrer que chaque caractère est déterminé par un seul gène en séparant les caractères: ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… Question 5: Calculer le pourcentage de recombinaison et déduire la distance entre les gènes ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………
