Increased SCF/c-kit by Hypoxia Promotes Autophagy of Human Placental Chorionic Plate-Derived Mesenchymal Stem Cells Via Regulating the Phosphorylation of mTOR Youjin Lee,1 Jieun Jung,1 Kyung Jin Cho,2 Seoung-Kwan Lee,2 Jong-Wan Park,3 IL-Hoan Oh,4 and Gi Jin Kim1* 1Department of Biomedical Science, CHA University, 606-16 Yeoksam1-dong, Kangnam-Gu, Seoul 135-097, Republic of Korea 2Department of Biomedical Science, College of Health Science, Korea University, 1 JeongReung-Dong, SungBuk-Gu, Seoul 136-703, Republic of Korea 3Department of Pharmacology, Ischemic/Hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, 28 Yongon-dong, Chongno-gu, Seoul 110-799, Republic of Korea 4Department of Medical Lifescience, Catholic High Performance Cell Therapy Center, The Catholic University of Korea, 505, Banpo-dong, Seocho-Ku, Seoul 137-701, Republic of Korea Rôle de l’autophagie dans la Biologie des CS But de la recherche : Etude de l’autophagie dans les cellules souches mesenchymateuses: SCF/c-kit par l’hypoxie via la phosphorylation de mTor Voies de signalisation de l’autophagie wtm 3MA CQ Baf PCR (Polymerase Chain Reaction) Objectif: Amplification in vitro d'un fragment d'ADN (matrice). Principe et étapes: Nécessite deux amorces (sens et antisens), des dNTP, une ADN polymerase thermostable (Taq). La PCR comporte 20 à 40 cycles successifs de 3 étapes : dénaturation, hybridation puis élongation. Résultat et interprétation: Les fragments d’ADN amplifiés sont séparés en fonction de leur taille par électrophorèse sur gel d’agarose ou polyacrylamide, et visualisés avec un intercalant (BET) fluorescent sous UV. REVERSE TRANSCRIPTION Objectif: Effectuer la reverse transcription des ARN messagers en ADN complémentaires (ADNc, plus stable et plus maniable que l’ARN). Reverse Transcriptase Principe: Elongation (polymérisation) in vitro des ARNm par une enzyme, la Reverse Transcriptase (RT) d’origine rétrovirale. - ARN extraits des cellules à étudier - Enzyme : Reverse Transcriptase (RT) d’origine rétrovirale, fait la synthèse d’ADN à partir - Amorces hexamériques random (oligonucléotides de 6pb de séquence aléatoire) ou amorces oligo(dT) (complémentaires de la queue PolyA) cDNA Par la suite, l’ADNc peut être utilisé pour réaliser une PCR classique ou une PCR quantitative. (qRT-PCR). PCR QUANTITATIVE (Q-PCR et Q-RT-PCR) Objectif de la Q-PCR ou Q-RT-PCR: Mesurer la quantité d’ADN ou de transcrit présente dans un échantillon. Principe: Plusieurs techniques peuvent être employées. Elles reposent sur l’émission d’une fluorescence lors de l’amplification grâce à une sonde marquée ou à un fluorochrome qui se lie à l’ADN. La fluorescence détectée est proportionnelle au nombre d’amplicons produits, lui-même fonction de la quantité d’ADN initialement présente. La technique peut être employée sur de l’ADN génomique ou de l’ADNc issu d’une réverse transcription. Interprétation: Plus la quantité d’ADN ou de transcrit initialement présents dans l’échantillon est élevée, plus la courbe d’amplification « décolle » tôt. Ceci est mesuré par le Ct, qui correspond au nombre de cycles de PCR nécessaire pour que la courbe franchisse un certain seuil (« threshold »). La quantification est faite par rapport à une gamme ou par rapport à la quantité d’un transcrit de référence (exprimé de façon stable dans toutes les cellules). Applications: La Q-RT-PCR est très largement utilisée pour étudier l’expression des gènes, ou dans d’autres applications telles que la détermination de la charge virale. Cytométrie en flux (CMF) But: Etude de l’expression de protéines à l’échelle cellulaire Initialement, surtout utilisée pour le typage immunologique (expression des marqueurs de surface CD) 10000 41 Etapes: - Marquage des cellules en suspension par un fluorochrome, par des anticorps couplés à des fluorochromes - Passage dans le cytomètre en flux, avec lecture de la fluorescence des cellules une par une Mouse BM at the onset of 2 leukemia Analyse fluos Variante: - Possibilité de perméabiliser les cellules avant marquage pour étudier des protéines intra-cytoplasmiques - Possibilité de trier les cellules marquées (cellules marquées dispatchées une par une dans tubes collecteurs) 92 6 PTEN-KD - En même temps, mesure de la taille et de la granulométrie des cellules (identifier différents types cellulaires d’un échantillon) - Co-marquages permettent d’étudier simultanément plusieurs protéines avec fluorochromes différents FITC Interprétation: - Comptage des cellules fluorescentes, et % cellules positives par rapport à la population cellulaire totale - Quantification de l’intensité de fluorescence, corrélée au taux d’expression de la protéine Ratio PTEN-KD / CTL 42 1000 100 10 1 0,1 PE CTLAnalyse taille-structure 5x In Immunofluorescence (IF) /Immunohistochimie (IHC) But: Détection in situ d’ un antigène protéique au sein d’une cellule ou d’un tissu Etapes: -Préparation des cellules ou de la coupe (perméabilsation, saturation) -Incubation avec un anticorps spécifique de l’antigène à détecter = anticorps primaire qui peut être directement couplé à une molécule de détection (fluorochrome ou peroxydase) --> marquage direct -Lavage puis incubation avec un anticorps reconnaissant l’anticorps primaire = anticorps secondaire couplé à une molécule de détection (fluorochrome ou peroxydase) --> marquage indirect - Lavage puis observation au microscope à fluorescence (IF) ou classique (IHC) Résultat et interprétation: • présence/absence d’un marqueur protéique (IF-IHC) • localisation sub-cellulaire (IF-IHC) • colocalisation avec des partenaires (IF) SDS-PAGE/Western blot But: SDS-PAGE: séparation des protéines totales de cellules ou de tissus en fonction de leur poids moléculaire Western Blot: détection d’une protéine spécifique au milieu du mélange de protéines totales Préparation des échantillons: - extraction des protéines - Addition de SDS + agent réducteur (DTT ou bME) et chauffage à 100°C Electrophorèse sur gel Poly-Acrylamide Transfert sur membrane de nitrocellulose Incubation anticorps spécifique Détection de la protéine d’intérêt Dépôt des protéines sur gel Grands PM + Résultat et interprétation: •Présence/absence d’une protéine d’intérêt •Modifications post-traductionnelles • Ex: phospho-protéine Phospho-prot X (Thr75) Phospho-prot X (Thr34) Prot X non phosphorylée Petits PM Chromatographie / Immunoprécipitation (IP) But: Purification d’une molécule selon ses interactions moléculaires Etapes: Préparation de l ’échantillon, + anticorps spécifique de la protéine à purifier + billes de gel affines pour l’anticorps Immunoprécipitation protéine partenaire Centrifugation de ce complexe alourdi, lavages, décrochage du complexe par un tampon d’élution. Analyse de l’efficacité de purification de la protéine ciblée et identification / quantification des molécules partenaires: protéines (par western blot), ADN (par PCR). Résultat et interprétation: Si en purifiant la protéine A, on détecte la protéine B, alors les 2 protéines sont partenaires. RNA interferant L’autophagie : description Microscopie à fluorescence Autophagosomes marqués par un anticorps dirigé contre la protéine LC3 Western Blot L’expression de LC3-II est révélatrice de la quantité d’autophagosomes Un traitement avec des inhibiteurs de l’acidification lysosomale permet de bloquer le flux autophagique et de déterminer le taux de dégradation autophagique. Inhibiteurs LC3-I - + LC3-II 8µm La protéine p62 est dégradée sélectivement par autophagie. L’accumulation de son expression en présence d’inhibiteurs de l’acidification lysosomale correspond à la quantité dégradé par autophagie Inhibiteurs - p62 Klionsky DJ, Cuervo AM, Seglen PO. Methods for monitoring autophagy from yeast to human. Autophagy. 2007 May-Jun;3(3):181-206 + Cdk1,5 NEDD4 EGFR AKT VPS34/ PI3KIII ENCART 2 P U Bcl2 INACTIVE COMPLEX Bcl2 P Mst1 ACTIVE COMPLEX PKD KAP1 P SUMO P VPS34/ PI3KIII PKD KAP1 VPS1 5/p1 50 AMBRA 1 beclin1 P P SUMO VPS34/ PI3KIII P VPS1 5/p15 0 AMBRA1 beclin1 P TRAF 6 P ULK1 AMPK DAPK, ROCK ULK1 AMPK Bcl2 JNK DAPK, ROCK TRAF 6 P Bcl2 JNK RNF2 AUTOPHAGIE 3MA Chloroquine Cystatin B Bafilomycin A1 Rubinsztein DC, Codogno P, Levine B. Nat. Rev. Drug. Disc. 2012 Death receptor pathway Mitochondrial pathway Death Ligand pm Apoptotic stimuli (UV, DNA Damage…) Death Receptor FADD DISC Bcl-2 Bid Procaspase -8, -10 c-FLIP t-Bid Bax/ Bak Activated caspase -3, (-7) Activated caspase -8, -10 Apaf-1 Cyt C procaspase -9 Apoptosome Pro-effector caspase –3 (-7) Cytoplasm Cleavage of Death Substrates Endo G APOPTOSIS Nucleus
