Sommaire. N.B. Se munir du nécessaire de traçage des courbes et dune calculatrice (1)

Institut Supérieur de l’Education et de la Formation Continue
TD de Biochimie
SV-
342 Enzymologie
Radhouane Chakroun
Institut Supérieur de l’Education et de la Formation Continue
2013
TD de Biochimie
342 Enzymologie
Radhouane Chakroun
Institut Supérieur de l’Education et de la Formation Continue
2013
-
2014

2
Sommaire
TD N°1 - Purification et calcul de l’activité enzymatique .................................................................................3
Exercice n°1 - Activité d’une Enzyme ...........................................................................................................3
Exercice n°2 - Purification et activité de la G6-PD .......................................................................................3
Exercice n°3 - Activité de la ß-Galactosidase ...............................................................................................4
TD N°2 - Étude de la cinétique enzymatique ...................................................................................................5
Exercice n°1 : Etude Cinétique d’une enzyme .............................................................................................5
Exercice n°2 - Activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat ......................................5
Exercice n°3 - Comparaison cinétique des enzymes de la phosphorylation du glucose .............................6
Exercice n°4 - Réaction enzymatique à 2 substrats (1) ................................................................................6
Exercice n°5 - Réaction enzymatique à 2 substrats (2) ................................................................................7
TD N°3 - Étude de l’inhibition de la catalyse enzymatique ..............................................................................8
Exercice n°1 : ................................................................................................................................................8
Exercice n°2 : ................................................................................................................................................8
Exercice n°3 : ................................................................................................................................................8
TD N°4 - Allostérie ......................................................................................................................................... 10
Exercice n°1 : ............................................................................................................................................. 10
Exercice n°2 : ............................................................................................................................................. 10
N.B.
: Se munir du nécessaire de traçage des
courbes et dune calculatrice

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TD N°1 - Purification et calcul de l’activité enzymatique
Exercice n°1 - Activité d’une Enzyme
Une enzyme E est constitué de 2 sous-unités identiques de poids moléculaires voisins de 50 000 Da. La
réaction catalysée est :
S P
On dispose d'un extrait de E contenant 3 mg de protéines par mL et dans lequel l’enzyme est pure à 80%.
La détermination d'activité est réalisée par spectrophotométrie à 512 nm, longueur d'onde à laquelle le
produit P absorbe mais non le substrat S. Le coefficient d'absorption molaire du produit est égal dans les
conditions de la mesure à 5 000 L. mol
-1
.cm
-1
. La cuve utilisée a une largeur de 1 cm.
Le milieu réactionnel, tamponné à pH 7 et thermostaté à 30 °C, contient une concentration saturante en
substrat. Son volume est de 3 mL. On utilise pour la détermination 100 µL d'extrait de E diluée au 500
ème
.
On arrête la réaction en ajoutant 2 ml de réactif d'arrêt au milieu réactionnel après 2 minutes de temps de
réaction. La variation d'absorbance lue est égale à 0,6 unité d'absorbance.
1) Calculer la concentration d'activité catalytique dans l'extrait E.
2) Calculer l'activité spécifique de cet extrait
3) En déduire l’activité molaire spécifique à 30 °C et pH 7.
Exercice n°2 - Purification et activité de la G6-PD
La glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6-PD) catalyse la réaction :
Le coefficient d’extinction molaire du NADPH, à 340nm, est de 6,22.10
3
M
-1
cm
-1
. Les autres composés
n’absorbent pas à cette longueur d’onde. On se propose de purifier la G6-PD de Bacillus subtilis. Pour
tester le degré de pureté de la préparation après chaque étape de purification, on ajoute une partie aliquote
de la préparation à une solution de D-glucose-6-phosphate et de NADP+ qui restent en excès pendant
tout le temps de la mesure dans une cuve de spectrophotomètre de trajet optique = 1 cm. Le volume final
de la solution est 1mL.
1) Après un certain nombre d’étapes de purification, on ajoute 100µg de protéine au mélange
réactionnel. Après 5 minutes, l’absorbance enregistrée à 340 nm est 0,30. Calculer l'activité spécifique
de la préparation de G6-PD à ce stade de purification.
2) Après de nouvelles étapes de purification, 1 µg de protéine est ajouté au mélange réactionnel. Il
entraîne après une minute, une absorbance de 0,358. Calculer l’activité spécifique de la préparation
de la G6-PD à ce stade de la purification. Par rapport au stade précédent, combien de fois a-t-on
purifié la G6-PD ?

4
3) Après de nouvelles tentatives de purification, on ne parvient pas à obtenir une activité spécifique plus
élevée. Qu’en déduisez-vous ?
4) Sachant que le poids moléculaire de la G6-PD est 80 000 Da, calculer son activité spécifique
moléculaire.
Exercice n°3 - Activité de la ß-Galactosidase
La lactase hydrolyse le lactose en glucose et galactose selon le schéma réactionnel suivant :
On détermine la vitesse d’hydrolyse du lactose par la lactase (β-galactosidase) (E.C. 3.2.1.23) dans les
conditions initiales. Il apparaît 0,672x10
-2
moles de glucose en 10 minutes. On a introduit dans le milieu 1
mL de solution enzymatique dont la teneur en protéines est de 2,85 g.L
-1
.
1) Que signifie le terme « conditions initiales » ? Préciser les conditions de concentrations en substrat.
2) Comment exprime-t-on la concentration d’activité catalytique d’une enzyme ?
3) Calculer la concentration d’activité catalytique de la préparation enzymatique de lactase.
4) Calculer l’activité spécifique de l’enzyme.
5) Calculer l’activité molaire spécifique en considérant que l’on est en présence d’une enzyme pure
(PM= 135000 Da).

5
TD N°2 - Étude de la cinétique enzymatique
Exercice n°1 : Etude Cinétique d’une enzyme
On réalise sur une préparation pure en enzyme la mesure de l'apparition du produit en fonction du
temps pour une concentration en substrat de 0,1 mol.L
-1
dont voici les résultats :
Temps (min)
0
0,5
1
2
3
4
5
[
Produit
]
(µmol.L
-
1
)
0
109
205
405
489
534
555
1) Tracer le graphique de la concentration de produit en fonction du temps.
2) Déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique.
3) On mesure la vitesse initiale Vi pour différentes concentrations de substrat (voir tableau ci-dessous).
Déterminer graphiquement les constantes cinétiques de cette enzyme et déterminer sa vitesse
initiale pour une concentration en substrat égale à 0,1 mol.L
-1
.
[S]
(mol.L
-
1
)
0
,0125
0,
02
5
0,05
0,1
Vi (µmol
.L
-
1
minute
-
1
)
133
167
190
Compléter
Exercice n°2 - Activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat
Une enzyme E catalyse la réaction d'hydrolyse:
A + H2O <=====> B + C
On suit la cinétique d'apparition du produit C, pour différentes concentrations en substrat A.
Les valeurs obtenues (en μmoles de C par tube) sont présentées dans le tableau suivant :
Temps (min)
[S0] mM
10
30
100
150
0
0
0
0
0
2,5
0,9
1,9
3,2
3,6
5
1,8
3,9
6,4
7,1
7,5
2,5
5,6
9,6
10,7
12,5
3,7
7,6
15,2
17,6
17,5
4,4
9,1
18,3
1) Représentez les cinétiques et déterminez la vitesse initiale de chacune d'elle.
2) Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on placé pour suivre ces cinétiques?
3) Tracez la courbe de saturation et commentez-la.
Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme.