Sommaire. N.B. Se munir du nécessaire de traçage des courbes et dune calculatrice (1)

Institut Supérieur de l’Education et de la Formation Continue
TD de Biochimie
SV-342
342 Enzymologie
Radhouane Chakroun
2013
2013-2014
Sommaire
TD N°1 - Purification et calcul de l’activité enzymatique.................................................................................3
Exercice n°1 - Activité d’une Enzyme ...........................................................................................................3
Exercice n°2 - Purification et activité de la G6-PD .......................................................................................3
Exercice n°3 - Activité de la ß-Galactosidase ...............................................................................................4
TD N°2 - Étude de la cinétique enzymatique ...................................................................................................5
Exercice n°1 : Etude Cinétique d’une enzyme .............................................................................................5
Exercice n°2 - Activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat......................................5
Exercice n°3 - Comparaison cinétique des enzymes de la phosphorylation du glucose .............................6
Exercice n°4 - Réaction enzymatique à 2 substrats (1) ................................................................................6
Exercice n°5 - Réaction enzymatique à 2 substrats (2) ................................................................................7
TD N°3 - Étude de l’inhibition de la catalyse enzymatique ..............................................................................8
Exercice n°1 : ................................................................................................................................................8
Exercice n°2 : ................................................................................................................................................8
Exercice n°3 : ................................................................................................................................................8
TD N°4 - Allostérie ......................................................................................................................................... 10
Exercice n°1 : ............................................................................................................................................. 10
Exercice n°2 : ............................................................................................................................................. 10
N.B. : Se munir du nécessaire de traçage des courbes et dune calculatrice
2
TD N°1 - Purification et calcul de l’activité enzymatique
Exercice n°1 - Activité d’une Enzyme
Une enzyme E est constitué de 2 sous-unités identiques de poids moléculaires voisins de 50 000 Da. La
réaction catalysée est :
S
P
On dispose d'un extrait de E contenant 3 mg de protéines par mL et dans lequel l’enzyme est pure à 80%.
La détermination d'activité est réalisée par spectrophotométrie à 512 nm, longueur d'onde à laquelle le
produit P absorbe mais non le substrat S. Le coefficient d'absorption molaire du produit est égal dans les
-1
-1
conditions de la mesure à 5 000 L. mol .cm . La cuve utilisée a une largeur de 1 cm.
Le milieu réactionnel, tamponné à pH 7 et thermostaté à 30 °C, contient une concentration saturante en
ème
substrat. Son volume est de 3 mL. On utilise pour la détermination 100 µL d'extrait de E diluée au 500 .
On arrête la réaction en ajoutant 2 ml de réactif d'arrêt au milieu réactionnel après 2 minutes de temps de
réaction. La variation d'absorbance lue est égale à 0,6 unité d'absorbance.
1) Calculer la concentration d'activité catalytique dans l'extrait E.
2) Calculer l'activité spécifique de cet extrait
3) En déduire l’activité molaire spécifique à 30 °C et pH 7.
Exercice n°2 - Purification et activité de la G6-PD
La glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6-PD) catalyse la réaction :
3
-1
-1
Le coefficient d’extinction molaire du NADPH, à 340nm, est de 6,22.10 M cm . Les autres composés
n’absorbent pas à cette longueur d’onde. On se propose de purifier la G6-PD de Bacillus subtilis. Pour
tester le degré de pureté de la préparation après chaque étape de purification, on ajoute une partie aliquote
de la préparation à une solution de D-glucose-6-phosphate et de NADP+ qui restent en excès pendant
tout le temps de la mesure dans une cuve de spectrophotomètre de trajet optique = 1 cm. Le volume final
de la solution est 1mL.
1) Après un certain nombre d’étapes de purification, on ajoute 100µg de protéine au mélange
réactionnel. Après 5 minutes, l’absorbance enregistrée à 340 nm est 0,30. Calculer l'activité spécifique
de la préparation de G6-PD à ce stade de purification.
2) Après de nouvelles étapes de purification, 1 µg de protéine est ajouté au mélange réactionnel. Il
entraîne après une minute, une absorbance de 0,358. Calculer l’activité spécifique de la préparation
de la G6-PD à ce stade de la purification. Par rapport au stade précédent, combien de fois a-t-on
purifié la G6-PD ?
3
3) Après de nouvelles tentatives de purification, on ne parvient pas à obtenir une activité spécifique plus
élevée. Qu’en déduisez-vous ?
4) Sachant que le poids moléculaire de la G6-PD est 80 000 Da, calculer son activité spécifique
moléculaire.
Exercice n°3 - Activité de la ß-Galactosidase
La lactase hydrolyse le lactose en glucose et galactose selon le schéma réactionnel suivant :
On détermine la vitesse d’hydrolyse du lactose par la lactase (β-galactosidase) (E.C. 3.2.1.23) dans les
conditions initiales. Il apparaît 0,672x10-2 moles de glucose en 10 minutes. On a introduit dans le milieu 1
mL de solution enzymatique dont la teneur en protéines est de 2,85 g.L-1.
1)
2)
3)
4)
5)
Que signifie le terme « conditions initiales » ? Préciser les conditions de concentrations en substrat.
Comment exprime-t-on la concentration d’activité catalytique d’une enzyme ?
Calculer la concentration d’activité catalytique de la préparation enzymatique de lactase.
Calculer l’activité spécifique de l’enzyme.
Calculer l’activité molaire spécifique en considérant que l’on est en présence d’une enzyme pure
(PM= 135000 Da).
4
TD N°2 - Étude de la cinétique enzymatique
Exercice n°1 : Etude Cinétique d’une enzyme
On réalise sur une préparation pure en enzyme la mesure de l'apparition du produit en fonction du
-1
temps pour une concentration en substrat de 0,1 mol.L dont voici les résultats :
Temps (min)
-1
[Produit] (µmol.L )
0
0,5
1
2
3
4
5
0
109
205
405
489
534
555
1) Tracer le graphique de la concentration de produit en fonction du temps.
2) Déterminer la vitesse initiale de la réaction enzymatique.
3) On mesure la vitesse initiale Vi pour différentes concentrations de substrat (voir tableau ci-dessous).
Déterminer graphiquement les constantes cinétiques de cette enzyme et déterminer sa vitesse
initiale pour une concentration en substrat égale à 0,1 mol.L-1.
[S] (mol.L-1)
-1
-1
Vi (µmol.L minute )
0,0125
0,025
0,05
0,1
133
167
190
Compléter
Exercice n°2 - Activité enzymatique en fonction de la concentration en substrat
Une enzyme E catalyse la réaction d'hydrolyse:
A + H2O <=====> B + C
On suit la cinétique d'apparition du produit C, pour différentes concentrations en substrat A.
Les valeurs obtenues (en μmoles de C par tube) sont présentées dans le tableau suivant :
Temps (min)
0
2,5
5
7,5
12,5
17,5
10
0
0,9
1,8
2,5
3,7
4,4
[S0] mM
30
100
0
0
1,9
3,2
3,9
6,4
5,6
9,6
7,6
15,2
9,1
18,3
150
0
3,6
7,1
10,7
17,6
1) Représentez les cinétiques et déterminez la vitesse initiale de chacune d'elle.
2) Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on placé pour suivre ces cinétiques?
3) Tracez la courbe de saturation et commentez-la.
Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme.
5
Exercice n°3 - Comparaison cinétique des enzymes de la phosphorylation du glucose
Le glucose est dégradé dans l’organisme par la voie de la glycolyse. La première réaction de cette voie est
une phosphorylation du glucose qui peut être catalysée par deux enzymes différentes : la Glucokinase ou
l' Hexokinase.
On se propose d’étudier les caractères cinétiques de ces deux enzymes vis à vis de leur substrat commun :
le glucose.
La vitesse initiale de la réaction a été mesurée pour des concentrations différentes en substrat à 20°C et à
pH=7. Les résultats expérimentaux sont reproduits dans le tableau suivant :
Sachant que la concentration en enzyme utilisée pour les deux séries d’expériences est la même :
[Glucose]i en mol.L
-3
5,0.10
-3
6,7.10
-3
10,0.10
-3
20,0.10
-3
50,0.10
-1
Vi avec la glucokinase
-1
-1
en µmol.L .min
1,61
2,00
2,67
2,93
4,17
[Glucose]i en mol.L
-3
5,0.10
-3
6,7.10
-3
10,0.10
-3
20,0.10
-3
50,0.10
-1
Vi avec l’hexokinase
-1
-1
en µmol.L .min
0,490
0,575
0,607
0,806
0,893
1)
2)
3)
4)
Déterminer les valeurs de KM et de Vm pour ces deux enzymes.
Comparer les deux KM. Conclure.
Comparer les deux Vm. Conclure.
-1
Sachant que la glycémie normale est d'environ 5 mmol.L , indiquer si chacune de ces deux enzymes
agit dans les conditions d’obtention de la vitesse maximum.
5) Quelle serait l’influence d’une augmentation importante de la glycémie?
Exercice n°4 - Réaction enzymatique à 2 substrats (1)
La phospholipase A2 catalyse l'hydrolyse de
l'acide gras estérifié en position 2 des 1-2diacylphosphoglycérides en présence d'ion
calcium.
On mesure les vitesses initiales d'hydrolyse de la
dibutyryl-lécithine
(DBL),
à
différentes
concentrations de ce substrat et de calcium.
-1
-1
La réaction est suivie en titrant l'acide libéré par la soude et les résultats en µmoles d'acide libéré.min .mg de
phospholipase sont les suivantes :
[DBL] (mM)
11,4
22,7
34
45,4
25
0,60
1,07
1,45
1,75
[Ca2+]x10-6 (M)
50
100
0,83
1,00
1,40
1,70
1,85
2,15
2,20
2,50
200
1,15
1,85
2,35
2,70
Déterminez le mécanisme et les paramètres cinétiques de la réaction.
6
Exercice n°5 - Réaction enzymatique à 2 substrats (2)
On étudie le mécanisme catalytique de la glycogène phosphorylase en mesurant les vitesses initiales de la
réaction pour différentes concentrations des 2 substrats (le glycogène et le phosphate).
-1
-1
Les résultats, en µmoles de glucose 1-phosphate.min .mg glycogène phosphorylase, sont les suivants :
[Glycogène] (mg.mL-1)
-3
[Phosphate]x10 (M)
6
3,2
12
8
18
16
21
24
23
48
25
15
24
35,5
43
46
49
30
35,5
53
64
68,5
74
45
43
64
77
82
88
60
47,5
71
85
91,5
98,5
Déterminez le mécanisme et les paramètres cinétiques de cette réaction.
7
TD N°3 - Étude de l’inhibition de la catalyse enzymatique
Exercice n°1 :
L’activité d’une enzyme est mesurée en fonction de la concentration en substrat en absence et en
-3
présence d’un inhibiteur à une concentration de 2.10 M. On trouve les résultats suivants :
[S] x 10-5 (M)
0,3
0,5
1
3
9
Vitesses (µmoles.min-1)
Sans Inhibiteur
Avec Inhibiteur
10,4
4,1
14,5
6,4
22,5
11,3
33,8
22,6
40,5
33,8
1) Déterminez Vm et KM en absence et en présence de l'inhibiteur.
Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition KI.
Exercice n°2 :
On suit la réaction enzymatique, en absence et en présence de l’inhibiteur I, en mesurant l’absorbance du
produit. Pour différentes concentrations initiales en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes (U.A.
= unité d'absorbance) :
[S]0 (mM)
0,032
0,048
0,076
0,096
0,136
0,232
0,348
vi (U.A.min-1)
Sans inhibiteur
0,18
0,25
0,35
0,42
0,50
0,68
0,78
vi (U.A.min-1)
[I] = 9 mM
0,070
0,097
0,137
0,164
0,195
0,270
0,312
1) Déterminez les paramètres cinétiques (Vm exprimée en molarité et KM) et les paramètres cinétiques
en présence de l'inhibiteur.
2) Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition KI.
Données : [E]0 = 27 nM ; εM produit = 2600 M-1.cm-1 et l = 1 cm.
Exercice n°3 :
L’acide 1-anilino-8-naphtalène sulfonate (ANS) est un inhibiteur de l’acétylcholine estérase. Pour
déterminer la nature de l’inhibition, on a mesuré les vitesses initiales d’hydrolyse de l’acétylcholine, à
différentes concentrations de ce substrat, en absence d’ANS (expérience A), en présence d’ANS (2,05x10
4
-4
M) (expérience B) et 1,07x10 M d’ANS (expérience C). Le tableau suivant exprime ces expériences. Les
vitesses sont exprimées en µM d’acétylcholine hydrolysé par minute et par mg de protéine.
8
[Acétylcholine]
(mM)
0,165
0,220
0,330
0,450
0,550
0,660
A
66
82
107
130
143
156
Vitesses de la réaction
B
40
45
52
56,5
59
61
C
35
39
44
47,5
49,5
51
Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition KI.
9
TD N°4 - Allostérie
Exercice n°1 :
On étudie la cinétique de deux enzymes A et B. A partir des données suivantes, distinguez le type
d’enzyme (c'est-à-dire s’il s’agit d’une enzyme ordinaire ou allostérique) et expliquez l’allure des courbes
représentant la vitesse en fonction de la concentration du substrat.
[S] x 10-3 (M)
V enzyme A
(µmol.min-1)
0,00
8,80
14,00
19,00
21,50
22,80
22,30
23,50
23,60
0,00
0,50
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
8,00
V enzyme B
(µmol.min-1)
0,00
0,30
1,00
4,70
12,40
19,00
21,80
22,80
23,30
Exercice n°2 :
L’acide aspartique est à l’origine de la biosynthèse de 4 autres acides aminés chez E. Coli : la lysine, la
méthionine, la thréonine et l’isoleucine.
L’aspartokinase I (sous forme de complexe multienzymatique) intervient au cours de la première étape de
la biosynthèse. Dans certaines conditions, sa cinétique peut être michaélienne. Son activité est régulée par
quelques effecteurs, notamment la thréonine.
Le tableau suivant donne les mesures de la vitesse initiale (en unités arbitraires) obtenues en l’absence et
-1
en présence de thréonine à une concentration de 40 µmol.L .
-1
[S] mol.L
Vi
Sans thréonine
Vi
avec thréonine
0,0
1,0 x 10-3
2,5 x 10-3
5,0 x 10-3
7,5 x 10-3
10,0 x 10-3
15 x 10-3
20 x 10-3
25 x 10-3
0,000
0,343
0,567
0,727
0,800
0,843
0,890
0,917
0,933
0,000
0,000
0,015
0,122
0,331
0,549
0,813
0,915
0,956
1) Représentez les courbes vi=f(S) en l’absence et en présence de thréonine. Conclure.
2) Effectuez la représentation en double inverse en l’absence de thréonine. En déduire la valeur de la
constante de Michaelis et celle de la vitesse initiale maximale.
3) Effectuez la représentation de Hill en l’absence et en présence de thréonine. En déduire la valeur de
la constante de Michaelis (à comparer avec celle obtenue à la question n°2), ainsi que l’indice de
coopérativité en présence de thréonine.
10
11