Méthodes d’identification de l’hémoglobine DES- 3 Professeur Fatou Diallo Agne Laboratoire de Biochimie Médicale UCAD Rappels sur l’hémoglobine Structure de l’hémoglobine normale de l’ adulte -Hémoglobine : hétéroprotéine (Globine + Hème) -Hème : porphyrine + atome de fer -Porphyrine : 4 noyaux pyrrole unis par des ponts méthényles pour un noyau tétra pyrrole -L’atome de fer de l’hème se lie aux quatre azotes au centre du noyau protoporphyrine Rappels sur l’hémoglobine -Transport de O2 des poumons vers les tissus et du CO2 des tissus vers les poumons - Ligands de l’hémoglobine : O2, CO2, H+, Cl-, 2-3 diphosphoglycérate (2-3 DPG) - Hémoglobine: protéine à régulation Rappels sur l’hémoglobine • Embryon • Hb Gowers I : ζ2 ε2 • Hb Gowers II: α2 ε2 • Hb Portland : ζ2 γ2 • Fœtus • Hb F: α2 γ2 • Adulte • Hb A1 : α2 β2 : 97 98 % • Hb A2: α2 δ2 : 2 – 3 % • Hb F: α2 γ2 : < 1 % Pathologies de l’hémoglobine - Anomalie qualitative (drépanocytose): Anomalie de structure A ce jour: plus de 800 variants de l’Hb - Drépanocytose (hémoglobinose S) - Substitution par Val de Glu, 6ème aminoacide de la chaîne β - Forme homozygote ou SS (grave) - Forme hétérozygote AS (pauci ou asymptomatique) - Forme SS (falciformation, hémolyse source d’anémie, thromboses) - Tests diagnostiques biologiques de routine : test d’Emmel, électrophorèse de l’hémoglobine Pathologies de l’hémoglobine - Anomalie qualitative (drépanocytose): Anomalie de structure • Variants avec substitution d’une seule base au niveau de l’ADN: 95 % • Hb S • Hb C • Hb E • Variants avec substitution de deux bases • Hb C zig • Hb C Harlem Pathologies de l’hémoglobine - Anomalie quantitative (thalassémie) Thalassémies - Synthèse réduite ou nulle de l’une des chaînes de globine - Selon la chaîne concernée : α ou β –thalassémie - Forme homozygote (thalassémie majeure) - Forme hétérozygote (thalassémie mineure) - Anémie héréditaire Renseignements indispensables pour la réalisation de l’étude de l’hémoglobine Origine des 2 parents : Grossesse : Hémolyse Si oui terme de la grossesse : ……………………… Oui Non Splénomégalie Carence martiale : Oui (traitée ? …) Non Non Traitements Transfusion dans les 3 derniers mois : Oui Autres : Oui Non Observations particulières : Oui Nombre de culots : (préciser : ……………………………) Étude familiale en cours : Oui Conseil génétique : Non Oui Non Contrôle dépistage néonatal Oui Non Données hématologiques (numération/formule) : Hb ; VGM ; TCMH Données biochimiques (bilan martial, du statut vitaminique B12 ,dosage G6PD) Electrophorèse pH alcalin ou Isoélectrofocalisation Profil normal Profil anormal Test d’Itano Electrophorèse agar pH= 6 ou CLHP Dosage de la fraction anormale de préférence par CLHP Dosage de l’Hb A2 : microcolonne ou CLHP Dosage de l’Hb F: méthode de Betke ou CLHP Stratégie diagnostique pour la mise en évidence d’une anomalie de l’hémoglobine DIAGNOSTIC DE LA DREPANOCYTOSE Deux techniques quantitatives: Electrophorèse capillaire (EC) et Chromatographie liquide haute performance (CLHP) visent à détecter, identifier et doser précisément l’HbS, les HbA2 et l’HbF - Dosage de l’HbA2 permet l’identification des porteurs de β-thalassémies hétérozygotes chez qui les valeurs sont très élevées mais diminuées dans les α-thalassémies - Chez l’adulte, la quantification de l’HbF (normalement < 1% après l’âge de 2 ans) trouve toute son importance dans le diagnostic : des syndromes drépanocytaires majeurs (SDM), des persistances héréditaires de l’hémoglobine F (PHHF), des δβ-thalassémies et des β-thalassémies suivi du traitement par hydroxycarbamine Une technique plus spécifique comme test de confirmation: (test de solubilité de l’HbS comme le test d’Itano ) Méthodes d’étude Méthodes d’étude Méthodes Séparatives Test de falciformation ou Test d’Emmel Test d’Itano ou Test de solubilité Méthodes chromatographiques Méthodes électrophorétiques Autres Méthodes Test de stabilité Mesure affinité de l’hémoglobine Méthodes chromatographiques particulières Méthodes spectrophotométriques Biologie moléculaire Métabolomique Conditions d’étude: Etape pré-analytique Prélèvement sur tube ACD (Adénine - citrate – dextrose) +++ ou EDTA ( ) 500 µL à 5 ml nécessaires ( 1/5 ) Conservation à 4°C (délai 8 jours) Pas de congélation , techniquer le plus rapidement possible Préparation de l’hémolysat à partir d’un culot globulaire lavé Le surnageant est éliminé en veillant à aspirer la couche cellulaire supérieure pour éliminer les globules blancs. La préparation des hémolysats doit se faire juste avant la migration électrophorétique. Une fraction du culot globulaire est ajoutée à la solution hémolysante contenant un détergent, selon les indications techniques fournies par le fabricant. Le mélange est agité vigoureusement (Vortex) puis centrifugé à grande vitesse. Préparation de l’hémolysat à partir d’un culot globulaire lavé préparer un hémolysat soigneusement débarrassé des protéines plasmatiques et des stromas globulaires. Les globules rouges sont lavés avec une solution de NaCl à 0,9 % (5 volumes NaCl pour 1 volume de sang total bien homogénéisé). Le mélange est homogénéisé par retournements successifs, centrifugé à environ 3 000 tours/min (10 minutes) à + 4 °C Préparation de l’hémolysat à partir de sang total non lavé Cette technique de préparation des hémolysats est indiquée pour la chromatographie liquide de haute performance (CLHP) en échange d’ions Le mode de préparation de l’hémolysat est précisé par le fabricant, Généralement 5 μL de sang total prélevés sur anticoagulant sont dilués dans 1 mL de la solution hémolysante préconisée par le fabricant. En cas de suspicion d’un pic artéfactuel, il est conseillé de faire un contrôle sur globules rouges lavés. Méthodes Séparatives Test de falciformation ou Test d’Emmel Test d’Itano ou Test de solubilité Méthodes électrophorétiques Méthodes chromatographiques Test d’Emmel - Alternative au test d’Itano - Confrontation à un hémogramme ou à un frottis de sang frais Encore appelé test de falciformation des globules rouges Consiste à mettre les hématies à étudier dans une atmosphère désoxygénée qui provoque la polymérisation et la gélification de l’HbS intraérythrocytaire Mise en (environ 45 minutes). Test d’Itano ou Test de solubilité de l’Hb S - Hb S réduite par action de l’hydrosulfite de sodium dans une solution précipite dans un tampon phosphate - Un trouble apparait à température ambiante - technique permet la mise en évidence in vitro, la polymérisation de l’hémoglobine S et son caractère insoluble - Utilisation d’un témoin HbA et Hb AS - Elimination du stroma globulaire pour éviter l’apparition de trouble - Faux négativité: hémolysat trop dilué ( % HbS < 20 ) pourcentage important de méthémoglobine - Qualité des réactifs: saponine et hydrosulfite de sodium sous dessicateur, respect des températures de travail Remarques: - La pratique d’une seule technique (CLHP seule ou électrophorèse à pH alcalin seule) n’est pas recommandable et, de plus, un profil normal, quel que soit le système utilisé, ne permet pas d’éliminer un mutant de l’hémoglobine. - Les hémoglobines S et D ont la même migration en électrophorèse sur acétate de cellulose mais sont séparées dans d’autres systèmes - En CLHP plusieurs mutants sont coélués avec l’Hb A, l’HbA2 ou l’HbF - Avant l’âge de 3 mois, la présence majoritaire d’HbF diminue fortement la sensibilité de l’électrophorèse à pH alcalin (isoélectrofocalisation) Remarques: - Il est recommandé de ne faire l’analyse qu’à distance de transfusions (3 mois minimum), sauf indications particulières, et de confronter les résultats aux données cliniques, hématologiques et ethniques - Les techniques de quantification des fractions HbA2 et HbF par densitométrie des bandes d’électrophorèse sont à proscrire. - Quelle que soit la technique utilisée, il faut toujours s’entourer d’échantillons témoins (A, F, S, C) à raison minimale de 1/bande d’électrophorèse t 1/20 échantillons pour les analyses en série, et tenir compte des valeurs de références recommandées dans la trousse utilisée. Méthodes électrophorétiques • Méthode de séparation de particules chargées électriquement par migration différentielle sous l'action d'un champ électrique (E).(protéines, peptides, Acides nucléiques, Nucléotides…) • Ionophorèse est utilisé dans le cas d'ions de petite taille • Elle permet dans certaines conditions (emploi de micelles de détergents ioniques) de séparer des molécules non ioniques( hormones stéroïdes...) La migration dépend de plusieurs facteurs • Mobilité électrophorétique U= f ( charge et géométrie particule.) • U=v/E cm2.s-1.volt-1 • Une particule de charge électrique Q, dans un champ électrique E, est soumise à une force F qui l'entraîne vers l'électrode de signe opposé : La migration dépend de plusieurs facteurs • Des forces de frottement f, dues à la viscosité du milieu , s'opposent à la migration de la particule, et ce d'autant plus que la particule est grosse (r = rayon) et que la vitesse de migration (v) est grande : N.B. Le coefficient de viscosité n dépend de la température Equilibre de force U=v/E=Q/6IInr La migration dépend de plusieurs facteurs On définit pour chaque particule sa mobilité µ, de manière indépendante du champ électrique, par la relation : • La mobilité est une caractéristique de chaque particule; il est donc possible d'effectuer une séparation en se basant sur cette propriété La migration dépend de plusieurs facteurs • Force ionique μ =½ i= valence • U=U0 1 ci2 c= concentration ionique ; U= mobilité ds tampon; U0=tampon dilué. 1 + rk Vμ Μ Ni trop faible , ni trop élevé (0,05 et 0,10) La migration dépend de plusieurs facteurs • Constante diélectrique D. • Z= potentiel électrochimique = Q • Dr r = rayon molécule Q= Z.Dr U= Q = ZD 6 IInr 6 IIn La mobilité est proportionnelle à D La migration dépend de plusieurs facteurs • Effet du pH • Q= f(pHi). • Q = f( pH du solvant). • pHi ou Pi= le pH pour lequel une particule ne migre pas dans un champ électrique. • pH –pHi détermine signe de Q Ainsi • pH –pHi détermine signe de Q • si pH > pHi charge nette négative (anion) migration vers l'anode • si pH < pHi charge nette positive (cation) migration vers la cathode • si pH = pHi charge nette nulle pas de migration La migration dépend de plusieurs facteurs • le courant d'électro-endosmose : Dans les conditions expérimentales, le support se charge négativement; une couche mobile de charges positives se forme dans le solvant, au contact du support et entraîne globalement la phase liquide vers la cathode. • le courant d'électro-endosmose : • le courant d'électro-endosmose : Ce courant accélère ou ralentit la migration des molécules, suivant qu'elles migrent vers la cathode ou vers l'anode. Il peut dans certains cas être plus puissant que les forces électriques, ce qui fait que des protéines chargées négativement peuvent globalement migrer vers la cathode : c'est particulièrement vrai avec les gels d'agarose (Ex capillaire.) cas de l’électrophorèse La migration dépend de plusieurs facteurs • Courant d’évaporation: effet de la T° le passage du courant s'accompagne d'un échauffement du support (par effet Joule), ce qui entraîne l'évaporation de l'eau de la phase liquide; cet effet est maximal au milieu de la bande; il s'établit ainsi un courant liquidien depuis chaque extrémité vers le centre de la bande. Pour limiter ce phénomène, la cuve est fermée par un couvercle; on utilise aussi des cuves réfrigérées. La migration dépend de plusieurs facteurs • Durée de migration influe sur la distance de migration • d=v.t • (d = distance, v = vitesse , t = temps de passage du courant) • Cette formule n'est pas applicable dans le cas de l'électrophorèse sur support, car les molécules effectuent un trajet non linéaire dans les micro canaux du support poreux. La migration dépend de plusieurs facteurs • Facteurs liés à la nature du support : • Gel ( effet de tamissage) • Phénomène d’adsorption… Electrophorèse de l’hémoglobine + Hb A Hb S - Hb C Dépôt Hb A : Ac glutamique (–) Hb S: valine (0) Hb C: Lysine (+) Electrophorèse à pH alcalin Les hémoglobines sont chargées négativement à pH alcalin (pH = 8,6) et migrent vers l’anode. Le variant de l’hémoglobine est séparé de HbA lorsqu’il possède un résidu acide aminé qui modifie sa charge (mutant rapide est plus chargé négativement que HbA tandis que le mutant lent est moins chargé négativement que HbA). Electrophorèse à pH alcalin • PH : 8,2 – 8,6 • Acétate de cellulose • 5 positions Electrophorèse à pH acide L’électrophorèse sur support d’agar présente l’avantage de séparer les HbS et C des autres variants migrant au même niveau qu’elles à pH alcalin. Il s’agit de HbD et G pour l’HbS et A, E, O-Arab pour l’HbC. Isoélectrofocalisation Cette technique consiste à faire migrer l’hémolysat de globules rouges sur un gradient allant de 5 à 8 grâce à des ampholines en gel d’agarose ou de polyacrylamide dans un champ électrique jusqu’au niveau d’un pH correspondant à leur point isoélectrique. A ce niveau, les protéines s’immobilisent et alors il y’a séparation des différentes fractions de l’hémoglobine. Elle est réalisable sur de faibles quantités de prélèvement (dépistage néonatal) mais n’est pas quantitative et demande un coût élevé et une expertise dans la pratique. Chez le nouveau-né de préférence parce que l’HbF est difficilement séparée de HbS et de HbA Electrophorèse Capillaire Technique reproductible et quantitative dans laquelle la migration de l’hémoglobine s’éffectue dans un capillaire de silice avec un tampon alcalin sous l’action d’un haut voltage. Les fractions d’hémoglobines, séparées en fonction du courant d’électroendosmose (charge/masse) et de leurs mobilités électrophorétiques (équivalent à celui de l’électrophorèse sur gel à pH alcalin) sont détectées par spectrophotométrie à 415 nm PROFIL AA – Si hémogramme normal: Sujet normal – Si microcytose sans trouble du métabolisme du fer: AA + α thalassémie PROFIL AF – F entre 2 et 5% • Microcytose et A2 augmenté: β thalassémie mineure • Absence de microcytose: Augmentation secondaire de l’Hb F – F entre 6 et 15% • Βδ thalassémie: microcytose avec A2 normal ou diminué • Augmentation secondaire de l’Hb F: absence de microcytose F entre 20-50 % • β thalassémie intermédiaire: microcytose sans anomalies du métabolisme du fer • PHHF: Hémogramme normal – F > 60% • β thalassémie majeure: microcytose sans anomalies du métabolisme du fer • PHHF dans sa forme homozygote: Hémogramme normal PROFIL AS – S > 35 % • Test d’emmel positif: Drépanocytose hétérozygote • Test d’emmel négatif: IEF – S : 12-14%: Hb Lepore ou malade transfusé – S : 25-34%: • Test d’emmel positif : AS+ alpha thal • Test d’emmel négatif: IEF PROFIL SS – Confirmer par pH acide – Drépanocytose homozygote: pas de microcytose – Profil SFA2 avec microcytose et taux d’Hb élevé: S β0 thalassémie PROFIL AC – C entre 2 et 8% : Hb A2 Faire Ph acide • Position C = Hb C • Position entre A et S= O Arab ou Tchad • Position A = Hb E • Position S= C Ziguinchor PROFIL CC: Homozygotie C PROFIL SC: Double hétérozygotie SC S=C=50%(+/- 2%) Méthodes chromatographiques Technique analytique qui permet la séparation des constituants d'un mélange en phase homogène liquide ou gazeuse Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre la phase stationnaire fixe et la phase mobile qui se déplace. Les méthodes chromatographiques sont aussi utilisées dans le diagnostic à travers la chromatographie liquide à haute performance qui représente avec l’électrophorèse capillaire, les techniques de référence pour beaucoup de laboratoires. Elles présentent l’avantage de fournir un dosage et une identification précise des différentes fractions de l’hémoglobine Il est capital de toujours confirmer le diagnostic de la drépanocytose par une technique spécifique La chromatographie est une technique qui sépare les différentes fractions d’hémoglobines en fonction de leurs interactions ioniques avec une colonne échangeuse de cations. L’obtention des pics en fonction du temps de rétention (temps d’élution des différentes fractions d’hémoglobine) est caractéristique de chaque variant d’hémoglobines. La détection est faite par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 415 nm. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) tient compte de l’aire totale du pic, de la base droite, du temps de rétention attendu, de la symétrie des pics et l’absence de contamination (extra-pics) pour la validation du profil obtenu Principaux paramètres de l’analyse chromatographique • Coefficient de distribution entre les 2 phases. K = Cs/CM Cs= Concentration dans la phase stationnaire. CM = Concentration dans la phase mobile. • Caractéristiques de rétention du soluté. Rf (CCM). tR= temps de rétention (Chromatographie sur colonne). VR= Volume de rétention= volume phase mobile utilisé pour éluer le soluté. = VM + KVS Principaux paramètres de l’analyse chromatographique • Facteur de capacité k’. Rapport quantité de soluté dans la phase stationnaire et dans la phase mobile. k’=CS.VS = K Vs CM.VM VM k’=tr-t0 t0 tr=tps rétention soluté et t0= tps rétention par la colonne • Résolution entre 2 pics. Expression qualité séparation. Rs= 2 (tR2-tR1) u2 +u1 Rs<0,8 non satisfaisant. Rs >= 1 satisfaisant. composé non retenu Principaux paramètres de l’analyse chromatographique • Sélectivité d’une colonne. A= K2 = tR2 –t0 =k’2 K1 tR1-t0 k’1 Si A=1 il n’ya pas de séparation. A doit être élevé pour qu’il y ait une bonne séparation. • Efficacité d’une colonne. Aptitude à donner des pics moins étalés ie étroits. N= nombre de plateaux théoriques( nbre couches de hauteur uniforme superposables). N= L L= Longueur de la colonne. h h = hauteur d’un plateau. h N .Colonne efficacité. Principaux paramètres de l’analyse chromatographique Calcul théorique de N. N= 16(tR/u)2 =5,54(tR/∆)2 (meilleure formule) ∆= Largeur pic à mi hauteur. Comparaison des colonnes différentes: HEPT=hauteur équivalentes à un plateau théorique h=L/N. N varie pour une même colonne en fonction du soluté. NB: La séparation de deux solutés en chromatographie dépend de: Facteur de capacité k’ Facteurs de sélectivité a Du nombre de plateaux théoriques N. La résolution peut s’exprimer ainsi: Rs = 1 a-1 k’2 (N2)1,5 4 a 1+k’2 Chromatographie Liquide Haute Performance ( HPLC) La Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP ou HPLC en anglais) est une amélioration de la CL. La phase mobile est utilisée sous haute pression. L'utilisation de la haute pression améliore l'efficacité des séparations et réduit fortement les temps d'analyse. L'échantillon à analyser est poussé par la phase mobile dans une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulométrie. Le débit d'écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression dans le système. Chromatographie Liquide Haute Performance ( HPLC) Les pics plus étroits Résolution améliorée (les pics sont bien séparés, ) Seuil de détection plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas). La combinaison : rapidité et résolution élevées - conduit à l'appellation « haute performance » Autres méthodes Test de stabilité Les forces de cohésion internes de la molécule d’hémoglobine diminuent dans un milieu apolaire le test à l’isopropanol est le test de référence. Il doit être pratiqué sur un échantillon frais ou conservé à + 4 °C depuis moins de 6 heures avec un témoin prélevé dans les mêmes conditions. - faux positifs : HbF, metHb, chaînes libres (HbH ou Bart’s), précipitation des protéines non héminiques chez des patients ayant une forte réticulocytose, - faux négatifs : hémoglobines hyperinstables, hémolysats extraits par des solvants, échantillons non conformes. Il existe des variants légèrement instables in vitro, sans retentissement hématologique ou clinique. Mesure de l’affinité pour l’oxygène La recherche d’une hémoglobine à affinité modifiée est à effectuer dans le cadre soit d’une polyglobulie vérifiée par la mesure de la masse sanguine, soit d’une anémie chronique inexpliquée Une étude de l’hémoglobine comportant isoélectrofocalisation, électrophorèse de globine en présence d’urée/triton, et une étude de l’hémolysat par CLHP échangeuse de cations et CLHP en phase inverse permettent habituellement de mettre en évidence la fraction d’hémoglobine anormale quand elle existe . Cette étude doit être précédée par un calcul de la P50 par co-oxymétrie sur sang veineux et par un dosage du 2-3 DPG. L’étude fonctionnelle de l’hémoglobine est à réserver aux cas déjà bien documentés. Les causes d’erreurs sur prélèvements de sang total sont multiples (pH anormal, taux de 2-3DPG diminué lors de la conservation, HbCO chez les fumeurs ou pour d’autres expositions chroniques au CO, oxydation (metHb) due aux conditions de conservation ou à des problèmes toxiques). Analyse spectrophotométrique Mise en évidence de la methémoglobine Lorsque le fer de l’hémoglobine passe sous forme oxydée (Fe+++ ), il y a formation de methémoglobine impropre au transport de l’oxygène, détectable par l’étude spectrophotométrique à 630 nm avec et sans KCN sur un prélèvement frais. Cette détection au cours des intoxications comporte un caractère d’urgence en vue de la mise en place d’un traitement adéquat. Certains appareils de gazométrie sanguine permettent la mise en évidence de methémoglobine. L’étude spectrale dans le visible et l’UV proche permet l’identification des HbM. Place de la biologie moléculaire La transmission des principales hémoglobinopathies se fait selon un mode autosomique récessif. Le but ultime du dépistage de porteurs sains est d’identifier, non pas des porteurs sains isolés, mais des couples dont les deux membres sont porteurs et qui présentent donc un risque sur quatre à chaque grossesse de donner naissance à un enfant Place de la biologie moléculaire proposer à un couple un conseil génétique qui précisera les risques génétiques en fonction de l’anomalie dépistée et, le cas échéant, un diagnostic prénatal. Le diagnostic prénatal des hémoglobinopathies est réalisé par des méthodes classiques de biologie moléculaire à partir de l’ADN foetal isolé des cellules amniotiques, de biopsies de placenta ou de biopsies de villosités choriales. Ces dernières permettent d’obtenir des quantités d’ADN plus importantes et sont réalisées plus précocement (10 ou 11e semaine). On voit que l’identification du risque doit être précoce et fiable. La Métabolomique Le travail met en évidence et pour la première fois des métabolites nouvellement associés chez l’homme à la crise vaso-occlusive (sérotonine, DOPA, hexoses H1, alpha-aminoadipate, phénylalanine et hydroxyproline) et aussi chez le modèle murin des métabolites (NO, arginine, ornithine, ADMA, polyamines, glutamate, aspartate, glycine, taurine, alpha-aminoadipate, kynurénine et sérotonine) révélateurs de la maladie. La Métabolomique Références sur la métabolomique Metabolomic Profiling of Plasma and Erythrocytes in Sickle Mice Points to Altered Nociceptive Pathways Klétigui Casimir Dembélé et al , Cells 2020, 9, 1334; doi:10.3390/cells9061334 Sickle Cell Disease: Metabolomic Profiles of Vaso-Occlusive Crisis in Plasma and Erythrocytes Klétigui Casimir Dembélé, J. Clin. Med. 2020, 9, 1092; doi:10.3390/jcm9041092 et al