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Applications des plasmides

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Applications des plasmides
Les plasmides sont utilisés en génie génétique pour amplifier ou
produire de nombreuses copies de certains gènes.
Dans le clonage moléculaire, un plasmide est un type de vecteur, qui
est une séquence d'ADN qui peut transporter du matériel génétique
étranger d'une cellule à une autre, où les gènes peuvent être
davantage exprimés et répliqués.
Les plasmides peuvent être utilisés pour répliquer des gènes, telles que
celui qui code pour l'insuline, en grandes quantités.
De plus, des plasmides sont étudiés comme moyen de transférer des
gènes dans des cellules humaines dans le cadre de la thérapie génique.
Les cellules peuvent manquer d'une protéine spécifique si le patient a
un trouble héréditaire impliquant une mutation génique. L'insertion
d'un plasmide dans l'ADN permettrait aux cellules d'exprimer une
protéine qui leur manque.
6. Applications du plasmide en écologie
6.1. Détermination de la gamme d'hôtes plasmidiques et coûts et
avantages des plasmides
On pense que la portée de l'hôte d'un plasmide est un paramètre clé
qui décide de l'environnement plasmidique. Alors que généralement
les plasmides ont été pensés ont été terminés par l'accouplement avec
quelques souches bénéficiaires choisies dans des conditions idéales, un
plasmide relatif a été assuré dans la rhizosphère de l'herbe a été tenté.
Dans cet examen, des souches de bienfaiteur d'E. Coli transportant des
plasmides IncP-1 (pTH10, pTH16, RP4), IncQ (pIE639), IncN (pIE1037),
IncW (pIE1056), IncI1 (pIE1040) ou IncFII (pIE1055), tous le transposon
de type Tn7 Tn1826 a été connecté avec une souche bénéficiaire d'E.
coli dans le sol. Les fréquences d'échange les plus remarquables ont
été surveillées pour IncP-1, suivi par IncN et IncW, bien que dans des
conditions similaires, aucun échange n'ait été identifié pour IncI1 et
IncFII. Cinquante jours après la présentation du contributeur d'E. Coli
pTH16 et des bénéficiaires dans des sols non stériles, des microbes de
la rhizosphère qui ont capturé le plasmide d'obstruction de la
nourseothricine ont été déconnectés et distingués par BIOLOG comme
Agrobacterium, Pseudomonas et Flavobacterium. Une méthodologie
comparative a également été utilisée pour distinguer la portée de
l'hôte de IncP-1ε pHH3414 dans des microcosmes de sol plantés
d'Acacia caven. Dans cette enquête, les microbes du sol qui ont obtenu
pHH3414 ont été reconnus par le séquençage de la qualité de l'ARNr
16S comme des gammaproteobacteria (Enterobacter amnigenus,
Plasmids as Genetic Tools and their Applications in Ecology and
Evolution 5
Xanthomonas codiaei) et les bêtaprotéobactéries (Cupriavidus
campinensis, Alcaligenes sp.). Des tests de microcosme de sol ont
également été utilisés pour décider de la portée de l'hôte des
plasmides cataboliques pJP4 et pEMT1, donnant la capacité de
corrompre l'herbicide 2,4-dichlorophénoxyacétique corrosif.
Les bénéficiaires ont été pour la plupart distingués comme des espèces
de Burkholderia lorsqu'aucun supplément supplémentaire n'était
inclus, tandis que la révision des saletés avec des suppléments a
entraîné la création de transconjugants supplémentaires reconnus
comme espèces de Stenotrophomonas. Dans ce sens, là encore, les
hôtes plasmidiques des deux plasmides comprenaient Beta- et
Gammaproteobacteri2a2] [. A la vitesse à laquelle de nouvelles
données de regroupement de plasmides sont déchargées, il n'est plus
concevable de tester expérimentalement la portée de l'hôte de tous les
plasmides récemment représentés. Dans ce sens, des stratégies basées
sur la génomique pourraient être utilisées pour anticiper l'hôte
réalisable et la portée de l'hôte d'un plasmide particulier dépendant de
son groupement d'ADN. Les organismes microscopiques contrastent
indéniablement dans la générosité générale des di-, tri- ou tétranucléotides (également désignés comme leur marque de succession
génomique), et cela donne l'idée que les plasmides qui ont une relation
à long terme avec des hôtes d'une marque comparative obtiendra en
général cette signature.
Il est intéressant de noter que les plasmides expansifs étendus à l'hôte
sont plutôt censés se déplacer entre des organismes microscopiques
liés à distance, indiquant des marques génomiques particulières. Le
long de ces lignes, nous pouvons maintenant regarder sans effort la
marque génomique de plasmides non caractérisés et interpréter leur
hôte ou leur hôte imaginable. Alors que la stratégie prédit
régulièrement avec précision un plasmide présumé en raison de très
nombreux plasmides représentés, une approbation plus exploratoire
est nécessaire pour certains nouveaux plasmides clés qui sont
séquencés en tant que composant des entreprises génomiques et
métagénomes [22].
6.2. Environnement des plasmides
La capacité des microbes à survivre, à s'établir et à se développer ainsi
que leur recombinaison génétique dans les habitats naturels sont
toutes influencées par divers facteurs écologiques. La capacité de
survie, en cours d'établissement et de croissance, dépend largement
de la constitution génétique propre aux microbes ainsi que de la
physique (température, pression, relations spatiales, surfaces et
rayonnement électromagnétique), chimique (facteurs de croissance,
substrats carbonés, nutriments inorganiques. , les substances toxiques,
l'eau disponible, la composition ionique, le pH, la composition gazeuse
et le potentiel d'oxydoréduction) et les facteurs biologiques
(caractéristiques des interactions microbiennes positives et négatives)
associés aux différents habitats. Tous ces facteurs ont un impact sur
l'écologie des microorganismes 2 [ 3].
Chacun de ces facteurs écologiques individuels exerce une influence
par rapport à l'environnement naturel récepteur. Souvent, un tel
impact est plus important sur les microbes introduits que sur les
microbes indigènes. En outre, tous ces facteurs ne fonctionnent pas
individuellement mais plutôt collectivement avec divers facteurs
supplémentaires. Même si certains facteurs peuvent être plus
dominants dans un certain habitat, ils peuvent exercer des effets
indirects et en cascade sur d'autres caractères. Par la suite, la
modification d'un facteur environnemental peut entraîner des
modifications simultanées d'autres facteurs et, éventuellement, de
l'habitat. Cela altère la capacité de survie des microbes introduits et de
certaines parties du microbiote indigène. La plupart des permutations
probables d'interactions entre ces facteurs environnementaux sont
fondamentalement illimitées, et il est difficile de prédire les niveaux de
succès de survie des microbes contenant de nouvelles informations
génétiques ainsi que leur capacité à s'établir et à se développer dans
ces habitats naturels [23].
L'intérêt accru pour la technologie de l'ADN recombinant augmente la
probabilité d'introduction accidentelle ou délibérée de ces microbes
génétiquement modifiés dans les habitats naturels. Des exemples de
tels habitats sont les sols, les eaux et les sédiments, qui sont les
principales sources de tous les microbes. Ces microbes contiendront de
nouvelles séquences d'ADN, certaines insérées involontairement,
comprenant également des séquences souhaitées et apparemment
inoffensives. Cela peut constituer une menace potentielle pour la santé
des plantes et les animaux, y compris les humains, et à d'autres
caractéristiques de la biosphère, en particulier s'ils présentent une
meilleure croissance dans l'environnement récepteur par rapport au
microbiote indigène ou aux souches parentales expérimentales. Étant
donné que, même des modifications mineures dans une seule capacité
de biosynthèse peuvent augmenter considérablement les taux de
croissance et, par conséquent, entraîner une plus grande survie et une
plus grande colonisation par les microbes introduits. Par exemple, les
bactéries possédant une capacité de fixation du N2 acquise combinée à
une croissance rapide existante, un métabolisme efficace et une valeur
de survie élevée dans les habitats naturels peuvent-elles réduire la
teneur atmosphérique en N2, les eaux souterraines polluées par le
NO3 et appauvrir la couche d'ozone en raison de production de NOx, à
partir de NO3? Les organismes conçus pour éliminer les déversements
d'hydrocarbures peuvent-ils rester confinés à de tels déversements ou
vont-ils s'étendre à d'autres zones et provoquer la dégradation des
produits pétroliers dans la station-service et la raffinerie, en particulier
si des gènes, qui augmentent considérablement leur capacité de survie
dans ces habitats, ont également été acquis? La capacité des microbes
manipulés à survivre dans les habitats naturels est apparemment
faible, ce qui minimise le danger qu’ils représentent une fois établis et
commencent à proliférer dans les habitats naturels.
De plus, certains organismes hôtes «construits» peuvent être
auxotrophes et affaiblis dans la mesure où ils subissent une
autodestruction en dehors des conditions enrichies du laboratoire.
Cependant, peu d'études ont étudié la survie de ces microbes dans les
milieux naturels. Leur survie peut être grandement améliorée par une
capacité des receveurs affaiblis à obtenir les gènes présents dans
l'habitat naturel dans lequel ils sont placés, ce qui réduit leur intensité
d'auxotrophie. À ce jour, il n'existe aucune étude portant sur
l'influence des caractéristiques physico-chimiques de l'environnement
receveur sur la capacité microbienne à survivre et à acquérir des gènes.
Ces caractéristiques jouent un rôle majeur dans la conclusion de la
survie, de l'établissement et de la croissance des micro-organismes
indigènes et introduits dans les habitats naturels [23]. Les études de
recombinaison génétique chez les bactéries sont pour la plupart
réalisées in vitro, et il existe peu de données prouvant une forme in
situ de transfert de gène. Quelques études ont été menées in vivo en
utilisant des animaux axéniques ou des animaux dont le biote normal,
généralement du tractus intestinal, est significativement diminué ou
complètement éliminé par prétraitement avec un antibiotique. Ces
études se sont concentrées sur la conjugaison, principalement le
transfert de facteur R, comme mécanisme de transfert de gène2 [3].
Une démonstration du transfert de gènes du facteur R par transduction
est observée chez Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa.
Certaines bactéries du sol (par exemple, les espèces d'Arthrobacter
Pseudomonas et Acinetobacter) et certaines bactéries non polluantes
par exemple, les espèces de Klebsiella et Serratia) semblent évoluer en
termes de compétence génétique, par transfert de plasmide, pour
l'utilisation d'une gamme d'hydrocarbures aromatiques
éventuellement récalcitrants toxiques pour ces organismes. De plus,
une démonstration de la conjugaison dans des bactéries du sol in vitro
telles que les pseudomonades est observée [23].
L'augmentation des infections nosocomiales par des bactéries
résistantes aux médicaments est une preuve empirique, ce qui
implique que le transfert de gène responsable de la résistance aux
antibiotiques et aux métaux lourds se produit dans les habitats
naturels. Cependant, il existe peu de soutien expérimental pour tirer
une conclusion solide, car la plupart de ces études se sont limitées à
l'utilisation de bactéries résistantes isolées à partir de plasmides
naturels comme outils génétiques et leurs applications dans les
habitats écologie et évolution 7 ou à la réalisation du transfert et de
l'expression de ces matériaux dans des conditions de laboratoire
soigneusement mesurées. Pour l'essentiel, aucune étude n'a tenté de
relier ces extrêmes expérimentaux, probablement en raison du
manque de techniques spécifiques à l'étude de la recombinaison
génétique survenant dans les habitats naturels et du manque de
scientifiques formés en génétique microbienne [23].
La capacité de survie, de multiplication et de conjugaison dans les sols
stériles est démontrée dans les deux souches d'E. Coli K12, à savoir les
souches auxotrophes et prototrophes. Les minéraux argileux présents,
en particulier la montmorillonite, ont augmenté la fréquence de
recombinaison, très probablement en raison de l'amélioration de la
capacité de croissance bactérienne que l'argile possède. Cette
amélioration est en partie le résultat de la capacité de l’argile à agir
comme un tampon pour le pH des sols, qui est fonction de la capacité
d’échange cationique de l’argile. De nombreux mécanismes, qui
clarifient la manière dont les minéraux argileux influencent la survie, la
croissance, l'établissement et les activités métaboliques des microbes
dans les habitats naturels, ont été décrits. Des études initiales sur la
conjugaison survenant dans les sols non stériles ont suggéré que la
fréquence de recombinaison est significativement plus faible que dans
les sols stériles [23].
La diminution de l'occurrence de recombinaison survenant dans les
sols non stériles confirme les résultats obtenus avec le transfert des
plasmides de résistance aux médicaments vers un système animal. La
fréquence de transfert d'un plasmide multi-résistant de Salmonella
typhosa à E. coli dans la vessie de lapin en bonne santé était aussi
élevée que dans les systèmes in vitro avec de l'urine stérilisée ou des
milieux d'accouplement synthétiques. Cependant, une fréquence de
transfert significativement plus faible a été observée en présence
d'autres bactéries, à savoir des exogènes tels que Proteus mirabilis et
E. coli non conjugatif. Cette réduction observée n'était pas une
conséquence de l'interférence physique des exogènes (c'est-à-dire
stérique) dans le processus de conjugaison. Ceci est démontré par des
particules de latex de polystyrène de même taille et concentration que
celles des exogènes n'affectant pas la fréquence de transfert de
plasmide, suggérant une interférence chimique sur la conjugaison
causée par les exogènes. On ne sait pas si les fréquences plus basses de
conjugaison dans les sols non stériles par rapport aux sols stériles sont
attribuées à une telle interférence, mais cette interférence pourrait
être possible puisque diverses espèces peuvent être à proximité
adjacente dans différents habitats microbiens naturels [23]. Des études
impliquant la conjugaison dans un sol stérile ont également signifié
qu'au lieu de subir une recombinaison génétique, l'alimentation
croisée (syntrophisme) permet à des bactéries auxotrophes pour divers
nutriments de coexister, à la fois dans le sol et dans des milieux de
gélose répliques. Cette observation accentue la nécessité d'étudier
prudemment les suggestions de recombinaison génétique apparente
se produisant dans les habitats naturels et la capacité des auxotrophes
à survivre dans les habitats naturels comme une possibilité viable, en
dépit de leur fragilité apparente et de leur affaiblissement, dans le
risque que d'autres microbes se présentent dans le même habitat
agissent comme des commensaux fournissant des nutriments qui ne
peuvent être synthétisés par les auxotrophes.
Sagik et Sorber ont montré que ces auxotrophes (par exemple, l'hôte
EK2 et le DP50supF) sont capables de survivre dans un environnement
riche en nutriments comme, par exemple, une station d'épuration
modèle. La fraction solide du flux de déchets semble être associée à
cette survie, démontrant une fois de plus que les particules et les
augmentations de surface qui en résultent améliorent la survie et la
croissance des bactéries. De plus, le cométabolisme ou détoxification
«partagée» des inhibiteurs peut participer à la survie de microbes
sensibles aux toxines sans aucune recombinaison génétique [23].
La documentation est insuffisante pour éclairer la transformation, qui
se produit dans les habitats microbiens naturels. La rareté des études
sur la transformation in situ peut être attribuée à ce manque
d'information, mais en plus, cela peut aussi refléter une notion non
confirmée qui est que l'ADN «nu» est extrêmement sensible à la
dégradation enzymatique dans les habitats naturels. Greaves et Wilson
ont cependant démontré que les acides nucléiques deviennent
adsorbés sur les minéraux argileux du sol, en particulier sur la
montmorillonite, et que l'adsorption protège les acides nucléiques de
la dégradation par les enzymes. De même, les virus, protéines,
peptides et acides aminés adsorbés par l'argile sont protégés à
différents degrés contre la dégradation microbienne. En conséquence,
les deux ADN nus (participant à la transduction) peuvent perdurer dans
les habitats naturels malgré l'absence d'un hôte approprié [23]. Cette
adsorption aux minéraux argileux protégeant les substances
organiques solubles et les virus de la dégradation est essentielle à
prendre en compte dans tout échange éventuel de gènes se produisant
dans des habitats contenant de l'argile et d'autres particules
tensioactives. On peut s'attendre à une incapacité de transformer
l'ADN et de transduire les virus pour survivre longtemps dans les
habitats naturels dépourvus d'hôtes. De plus, étant le meilleur, le
substrat pour les microbes non hôtes (c'est-à-dire qu'ils contiennent du
C, N et P ainsi que du S en cas de virus) signifie qu'ils seraient
rapidement dégradés par le microbiote indigène. Cependant, il est de
plus en plus prouvé que l'ADN et les virus persistent dans les habitats
naturels en raison du processus d'adsorption des minéraux argileux,
qui protège à la fois contre l'inactivation biologique et physicochimique. De plus, cette adsorption ne diminue pas l’activité des
enzymes en ce qui concerne ses capacités de catalyse, mais peut en fait
l’augmenter; ou la capacité du virus à infecter les hôtes. Ainsi, si la
transformation de l'ADN et des virus (aucune étude n'a étudié la
capacité de l'ADN adsorbé à se transformer) sont capables de persister
dans les habitats naturels, il est possible que ce soit par transmission
de leur information génétique à tout hôte approprié introduit dans ces
habitats par inadvertance ou délibérément. Il existe des études
sporadiques sur la survie et l'établissement microbien consécutif de
microbes, qui n'habitent pas un habitat particulier. Ceci est illustré par
la capacité de survie des bactéries entériques (y compris E. coli,
Salmonella sp. Et Shigella sp.) Introduites dans les sols et les eaux au
moyen des eaux usées ou des boues et de Listeria monocytogenes et
Clostridium botulinum [23].
10. Utilisations des plasmides
Les plasmides sont utilisés en biotechnologie (le plus largement utilisés
pour la manipulation, le transfert et l'expression génique de l'ADN dans
une variété de micro-organismes et de cellules animales [49] et la
biotechnologie pharmaceutique).
Dans ce dernier domaine, les plasmides sont cruciaux dans la
production de protéines hétérologues, qui se substituent aux protéines
défectueuses présentes chez le patient ou fournissent une fonction
perdue en raison du manque de protéine active naturelle.
La thérapie génique et la vaccination ADN nécessitent l'identification
du ou des gènes liés à une maladie particulière (héréditaire / acquise),
la fabrication d'un gène thérapeutique, la conception d'un vecteur
moléculaire (et sa formulation) et l'introduction du gène chez le
patient. Une fois que le gène est exprimé chez le patient, on s'attend à
ce que la bonne protéine soit formée et fonctionne.
Cependant les problèmes liés à la production de protéines
recombinantes, par exemple: la glycosylation complexe est éliminée. Il
existe des vecteurs apparentés possibles pour introduire des
informations génétiques dans les cellules humaines.
Les plus pertinents sont le virus (adénovirus / rétrovirus) et l'ADN
plasmidique (ADNp): tous deux peuvent être utilisés en solution
aqueuse ou inclus dans des lipides ou d'autres formulations.
Récemment, plus de 1500 essais cliniques de thérapie génique
humaine avec plus de 220 gènes dans près de 30 pays ont été menés
depuis le premier essai de thérapie génique: plus de 60% des essais ont
été réalisés aux États-Unis et environ 30% en Europe . L'ADNp joue un
rôle essentiel en tant que vecteur de thérapie génique et de
vaccination ADN. Environ 20% des essais de thérapie génique humaine
étaient basés sur l'ADNp nu, tandis que la lipofection (nécessitant la
production d'ADNp) compte pour 6,6% des essais. Ensemble, les deux
approches représentent près de 25% des techniques utilisées dans les
essais cliniques [51].
Abstrait
Les plasmides sont des vecteurs d'acide désoxyribonucléique (ADN)
circulaires qui peuvent être utilisés comme vaccins pour prévenir divers
types de maladies. Ces plasmides sont des plateformes d'ADN qui sont
généralement composées d'un gène promoteur viral, d'un gène codant
la résistance aux antibiotiques, d'un gène d'origine bactérienne de
réplication et d'un site de clonage multiple (MCS) pour une région
transgénique, où un ou plusieurs gènes d'intérêt antigénique peuvent
être inséré. L'immunisation avec ces vecteurs recombinants permet
l'expression intracellulaire des antigènes codés par la machinerie
moléculaire et cellulaire des cellules transfectées, stimulant une
réponse immunitaire spécifique de l'antigène.
Ce processus offre une protection efficace contre divers types
d'agents pathogènes, les cellules tumorales et même les allergies et les
maladies auto-immunes. L'efficacité protectrice est obtenue par
l'induction d'une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire
dépendante des cellules B et T.
L'immunité induite par ces vaccins à ADN, ajoutée à la facilité de
production, d'administration, de stabilité génétique et de sécurité, a
transformé l'immunisation à base de plasmide en une stratégie sûre de
prévention de diverses maladies.
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