Applications des plasmides Les plasmides sont utilisés en génie génétique pour amplifier ou produire de nombreuses copies de certains gènes. Dans le clonage moléculaire, un plasmide est un type de vecteur, qui est une séquence d'ADN qui peut transporter du matériel génétique étranger d'une cellule à une autre, où les gènes peuvent être davantage exprimés et répliqués. Les plasmides peuvent être utilisés pour répliquer des gènes, telles que celui qui code pour l'insuline, en grandes quantités. De plus, des plasmides sont étudiés comme moyen de transférer des gènes dans des cellules humaines dans le cadre de la thérapie génique. Les cellules peuvent manquer d'une protéine spécifique si le patient a un trouble héréditaire impliquant une mutation génique. L'insertion d'un plasmide dans l'ADN permettrait aux cellules d'exprimer une protéine qui leur manque. 6. Applications du plasmide en écologie 6.1. Détermination de la gamme d'hôtes plasmidiques et coûts et avantages des plasmides On pense que la portée de l'hôte d'un plasmide est un paramètre clé qui décide de l'environnement plasmidique. Alors que généralement les plasmides ont été pensés ont été terminés par l'accouplement avec quelques souches bénéficiaires choisies dans des conditions idéales, un plasmide relatif a été assuré dans la rhizosphère de l'herbe a été tenté. Dans cet examen, des souches de bienfaiteur d'E. Coli transportant des plasmides IncP-1 (pTH10, pTH16, RP4), IncQ (pIE639), IncN (pIE1037), IncW (pIE1056), IncI1 (pIE1040) ou IncFII (pIE1055), tous le transposon de type Tn7 Tn1826 a été connecté avec une souche bénéficiaire d'E. coli dans le sol. Les fréquences d'échange les plus remarquables ont été surveillées pour IncP-1, suivi par IncN et IncW, bien que dans des conditions similaires, aucun échange n'ait été identifié pour IncI1 et IncFII. Cinquante jours après la présentation du contributeur d'E. Coli pTH16 et des bénéficiaires dans des sols non stériles, des microbes de la rhizosphère qui ont capturé le plasmide d'obstruction de la nourseothricine ont été déconnectés et distingués par BIOLOG comme Agrobacterium, Pseudomonas et Flavobacterium. Une méthodologie comparative a également été utilisée pour distinguer la portée de l'hôte de IncP-1ε pHH3414 dans des microcosmes de sol plantés d'Acacia caven. Dans cette enquête, les microbes du sol qui ont obtenu pHH3414 ont été reconnus par le séquençage de la qualité de l'ARNr 16S comme des gammaproteobacteria (Enterobacter amnigenus, Plasmids as Genetic Tools and their Applications in Ecology and Evolution 5 Xanthomonas codiaei) et les bêtaprotéobactéries (Cupriavidus campinensis, Alcaligenes sp.). Des tests de microcosme de sol ont également été utilisés pour décider de la portée de l'hôte des plasmides cataboliques pJP4 et pEMT1, donnant la capacité de corrompre l'herbicide 2,4-dichlorophénoxyacétique corrosif. Les bénéficiaires ont été pour la plupart distingués comme des espèces de Burkholderia lorsqu'aucun supplément supplémentaire n'était inclus, tandis que la révision des saletés avec des suppléments a entraîné la création de transconjugants supplémentaires reconnus comme espèces de Stenotrophomonas. Dans ce sens, là encore, les hôtes plasmidiques des deux plasmides comprenaient Beta- et Gammaproteobacteri2a2] [. A la vitesse à laquelle de nouvelles données de regroupement de plasmides sont déchargées, il n'est plus concevable de tester expérimentalement la portée de l'hôte de tous les plasmides récemment représentés. Dans ce sens, des stratégies basées sur la génomique pourraient être utilisées pour anticiper l'hôte réalisable et la portée de l'hôte d'un plasmide particulier dépendant de son groupement d'ADN. Les organismes microscopiques contrastent indéniablement dans la générosité générale des di-, tri- ou tétranucléotides (également désignés comme leur marque de succession génomique), et cela donne l'idée que les plasmides qui ont une relation à long terme avec des hôtes d'une marque comparative obtiendra en général cette signature. Il est intéressant de noter que les plasmides expansifs étendus à l'hôte sont plutôt censés se déplacer entre des organismes microscopiques liés à distance, indiquant des marques génomiques particulières. Le long de ces lignes, nous pouvons maintenant regarder sans effort la marque génomique de plasmides non caractérisés et interpréter leur hôte ou leur hôte imaginable. Alors que la stratégie prédit régulièrement avec précision un plasmide présumé en raison de très nombreux plasmides représentés, une approbation plus exploratoire est nécessaire pour certains nouveaux plasmides clés qui sont séquencés en tant que composant des entreprises génomiques et métagénomes [22]. 6.2. Environnement des plasmides La capacité des microbes à survivre, à s'établir et à se développer ainsi que leur recombinaison génétique dans les habitats naturels sont toutes influencées par divers facteurs écologiques. La capacité de survie, en cours d'établissement et de croissance, dépend largement de la constitution génétique propre aux microbes ainsi que de la physique (température, pression, relations spatiales, surfaces et rayonnement électromagnétique), chimique (facteurs de croissance, substrats carbonés, nutriments inorganiques. , les substances toxiques, l'eau disponible, la composition ionique, le pH, la composition gazeuse et le potentiel d'oxydoréduction) et les facteurs biologiques (caractéristiques des interactions microbiennes positives et négatives) associés aux différents habitats. Tous ces facteurs ont un impact sur l'écologie des microorganismes 2 [ 3]. Chacun de ces facteurs écologiques individuels exerce une influence par rapport à l'environnement naturel récepteur. Souvent, un tel impact est plus important sur les microbes introduits que sur les microbes indigènes. En outre, tous ces facteurs ne fonctionnent pas individuellement mais plutôt collectivement avec divers facteurs supplémentaires. Même si certains facteurs peuvent être plus dominants dans un certain habitat, ils peuvent exercer des effets indirects et en cascade sur d'autres caractères. Par la suite, la modification d'un facteur environnemental peut entraîner des modifications simultanées d'autres facteurs et, éventuellement, de l'habitat. Cela altère la capacité de survie des microbes introduits et de certaines parties du microbiote indigène. La plupart des permutations probables d'interactions entre ces facteurs environnementaux sont fondamentalement illimitées, et il est difficile de prédire les niveaux de succès de survie des microbes contenant de nouvelles informations génétiques ainsi que leur capacité à s'établir et à se développer dans ces habitats naturels [23]. L'intérêt accru pour la technologie de l'ADN recombinant augmente la probabilité d'introduction accidentelle ou délibérée de ces microbes génétiquement modifiés dans les habitats naturels. Des exemples de tels habitats sont les sols, les eaux et les sédiments, qui sont les principales sources de tous les microbes. Ces microbes contiendront de nouvelles séquences d'ADN, certaines insérées involontairement, comprenant également des séquences souhaitées et apparemment inoffensives. Cela peut constituer une menace potentielle pour la santé des plantes et les animaux, y compris les humains, et à d'autres caractéristiques de la biosphère, en particulier s'ils présentent une meilleure croissance dans l'environnement récepteur par rapport au microbiote indigène ou aux souches parentales expérimentales. Étant donné que, même des modifications mineures dans une seule capacité de biosynthèse peuvent augmenter considérablement les taux de croissance et, par conséquent, entraîner une plus grande survie et une plus grande colonisation par les microbes introduits. Par exemple, les bactéries possédant une capacité de fixation du N2 acquise combinée à une croissance rapide existante, un métabolisme efficace et une valeur de survie élevée dans les habitats naturels peuvent-elles réduire la teneur atmosphérique en N2, les eaux souterraines polluées par le NO3 et appauvrir la couche d'ozone en raison de production de NOx, à partir de NO3? Les organismes conçus pour éliminer les déversements d'hydrocarbures peuvent-ils rester confinés à de tels déversements ou vont-ils s'étendre à d'autres zones et provoquer la dégradation des produits pétroliers dans la station-service et la raffinerie, en particulier si des gènes, qui augmentent considérablement leur capacité de survie dans ces habitats, ont également été acquis? La capacité des microbes manipulés à survivre dans les habitats naturels est apparemment faible, ce qui minimise le danger qu’ils représentent une fois établis et commencent à proliférer dans les habitats naturels. De plus, certains organismes hôtes «construits» peuvent être auxotrophes et affaiblis dans la mesure où ils subissent une autodestruction en dehors des conditions enrichies du laboratoire. Cependant, peu d'études ont étudié la survie de ces microbes dans les milieux naturels. Leur survie peut être grandement améliorée par une capacité des receveurs affaiblis à obtenir les gènes présents dans l'habitat naturel dans lequel ils sont placés, ce qui réduit leur intensité d'auxotrophie. À ce jour, il n'existe aucune étude portant sur l'influence des caractéristiques physico-chimiques de l'environnement receveur sur la capacité microbienne à survivre et à acquérir des gènes. Ces caractéristiques jouent un rôle majeur dans la conclusion de la survie, de l'établissement et de la croissance des micro-organismes indigènes et introduits dans les habitats naturels [23]. Les études de recombinaison génétique chez les bactéries sont pour la plupart réalisées in vitro, et il existe peu de données prouvant une forme in situ de transfert de gène. Quelques études ont été menées in vivo en utilisant des animaux axéniques ou des animaux dont le biote normal, généralement du tractus intestinal, est significativement diminué ou complètement éliminé par prétraitement avec un antibiotique. Ces études se sont concentrées sur la conjugaison, principalement le transfert de facteur R, comme mécanisme de transfert de gène2 [3]. Une démonstration du transfert de gènes du facteur R par transduction est observée chez Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa. Certaines bactéries du sol (par exemple, les espèces d'Arthrobacter Pseudomonas et Acinetobacter) et certaines bactéries non polluantes par exemple, les espèces de Klebsiella et Serratia) semblent évoluer en termes de compétence génétique, par transfert de plasmide, pour l'utilisation d'une gamme d'hydrocarbures aromatiques éventuellement récalcitrants toxiques pour ces organismes. De plus, une démonstration de la conjugaison dans des bactéries du sol in vitro telles que les pseudomonades est observée [23]. L'augmentation des infections nosocomiales par des bactéries résistantes aux médicaments est une preuve empirique, ce qui implique que le transfert de gène responsable de la résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds se produit dans les habitats naturels. Cependant, il existe peu de soutien expérimental pour tirer une conclusion solide, car la plupart de ces études se sont limitées à l'utilisation de bactéries résistantes isolées à partir de plasmides naturels comme outils génétiques et leurs applications dans les habitats écologie et évolution 7 ou à la réalisation du transfert et de l'expression de ces matériaux dans des conditions de laboratoire soigneusement mesurées. Pour l'essentiel, aucune étude n'a tenté de relier ces extrêmes expérimentaux, probablement en raison du manque de techniques spécifiques à l'étude de la recombinaison génétique survenant dans les habitats naturels et du manque de scientifiques formés en génétique microbienne [23]. La capacité de survie, de multiplication et de conjugaison dans les sols stériles est démontrée dans les deux souches d'E. Coli K12, à savoir les souches auxotrophes et prototrophes. Les minéraux argileux présents, en particulier la montmorillonite, ont augmenté la fréquence de recombinaison, très probablement en raison de l'amélioration de la capacité de croissance bactérienne que l'argile possède. Cette amélioration est en partie le résultat de la capacité de l’argile à agir comme un tampon pour le pH des sols, qui est fonction de la capacité d’échange cationique de l’argile. De nombreux mécanismes, qui clarifient la manière dont les minéraux argileux influencent la survie, la croissance, l'établissement et les activités métaboliques des microbes dans les habitats naturels, ont été décrits. Des études initiales sur la conjugaison survenant dans les sols non stériles ont suggéré que la fréquence de recombinaison est significativement plus faible que dans les sols stériles [23]. La diminution de l'occurrence de recombinaison survenant dans les sols non stériles confirme les résultats obtenus avec le transfert des plasmides de résistance aux médicaments vers un système animal. La fréquence de transfert d'un plasmide multi-résistant de Salmonella typhosa à E. coli dans la vessie de lapin en bonne santé était aussi élevée que dans les systèmes in vitro avec de l'urine stérilisée ou des milieux d'accouplement synthétiques. Cependant, une fréquence de transfert significativement plus faible a été observée en présence d'autres bactéries, à savoir des exogènes tels que Proteus mirabilis et E. coli non conjugatif. Cette réduction observée n'était pas une conséquence de l'interférence physique des exogènes (c'est-à-dire stérique) dans le processus de conjugaison. Ceci est démontré par des particules de latex de polystyrène de même taille et concentration que celles des exogènes n'affectant pas la fréquence de transfert de plasmide, suggérant une interférence chimique sur la conjugaison causée par les exogènes. On ne sait pas si les fréquences plus basses de conjugaison dans les sols non stériles par rapport aux sols stériles sont attribuées à une telle interférence, mais cette interférence pourrait être possible puisque diverses espèces peuvent être à proximité adjacente dans différents habitats microbiens naturels [23]. Des études impliquant la conjugaison dans un sol stérile ont également signifié qu'au lieu de subir une recombinaison génétique, l'alimentation croisée (syntrophisme) permet à des bactéries auxotrophes pour divers nutriments de coexister, à la fois dans le sol et dans des milieux de gélose répliques. Cette observation accentue la nécessité d'étudier prudemment les suggestions de recombinaison génétique apparente se produisant dans les habitats naturels et la capacité des auxotrophes à survivre dans les habitats naturels comme une possibilité viable, en dépit de leur fragilité apparente et de leur affaiblissement, dans le risque que d'autres microbes se présentent dans le même habitat agissent comme des commensaux fournissant des nutriments qui ne peuvent être synthétisés par les auxotrophes. Sagik et Sorber ont montré que ces auxotrophes (par exemple, l'hôte EK2 et le DP50supF) sont capables de survivre dans un environnement riche en nutriments comme, par exemple, une station d'épuration modèle. La fraction solide du flux de déchets semble être associée à cette survie, démontrant une fois de plus que les particules et les augmentations de surface qui en résultent améliorent la survie et la croissance des bactéries. De plus, le cométabolisme ou détoxification «partagée» des inhibiteurs peut participer à la survie de microbes sensibles aux toxines sans aucune recombinaison génétique [23]. La documentation est insuffisante pour éclairer la transformation, qui se produit dans les habitats microbiens naturels. La rareté des études sur la transformation in situ peut être attribuée à ce manque d'information, mais en plus, cela peut aussi refléter une notion non confirmée qui est que l'ADN «nu» est extrêmement sensible à la dégradation enzymatique dans les habitats naturels. Greaves et Wilson ont cependant démontré que les acides nucléiques deviennent adsorbés sur les minéraux argileux du sol, en particulier sur la montmorillonite, et que l'adsorption protège les acides nucléiques de la dégradation par les enzymes. De même, les virus, protéines, peptides et acides aminés adsorbés par l'argile sont protégés à différents degrés contre la dégradation microbienne. En conséquence, les deux ADN nus (participant à la transduction) peuvent perdurer dans les habitats naturels malgré l'absence d'un hôte approprié [23]. Cette adsorption aux minéraux argileux protégeant les substances organiques solubles et les virus de la dégradation est essentielle à prendre en compte dans tout échange éventuel de gènes se produisant dans des habitats contenant de l'argile et d'autres particules tensioactives. On peut s'attendre à une incapacité de transformer l'ADN et de transduire les virus pour survivre longtemps dans les habitats naturels dépourvus d'hôtes. De plus, étant le meilleur, le substrat pour les microbes non hôtes (c'est-à-dire qu'ils contiennent du C, N et P ainsi que du S en cas de virus) signifie qu'ils seraient rapidement dégradés par le microbiote indigène. Cependant, il est de plus en plus prouvé que l'ADN et les virus persistent dans les habitats naturels en raison du processus d'adsorption des minéraux argileux, qui protège à la fois contre l'inactivation biologique et physicochimique. De plus, cette adsorption ne diminue pas l’activité des enzymes en ce qui concerne ses capacités de catalyse, mais peut en fait l’augmenter; ou la capacité du virus à infecter les hôtes. Ainsi, si la transformation de l'ADN et des virus (aucune étude n'a étudié la capacité de l'ADN adsorbé à se transformer) sont capables de persister dans les habitats naturels, il est possible que ce soit par transmission de leur information génétique à tout hôte approprié introduit dans ces habitats par inadvertance ou délibérément. Il existe des études sporadiques sur la survie et l'établissement microbien consécutif de microbes, qui n'habitent pas un habitat particulier. Ceci est illustré par la capacité de survie des bactéries entériques (y compris E. coli, Salmonella sp. Et Shigella sp.) Introduites dans les sols et les eaux au moyen des eaux usées ou des boues et de Listeria monocytogenes et Clostridium botulinum [23]. 10. Utilisations des plasmides Les plasmides sont utilisés en biotechnologie (le plus largement utilisés pour la manipulation, le transfert et l'expression génique de l'ADN dans une variété de micro-organismes et de cellules animales [49] et la biotechnologie pharmaceutique). Dans ce dernier domaine, les plasmides sont cruciaux dans la production de protéines hétérologues, qui se substituent aux protéines défectueuses présentes chez le patient ou fournissent une fonction perdue en raison du manque de protéine active naturelle. La thérapie génique et la vaccination ADN nécessitent l'identification du ou des gènes liés à une maladie particulière (héréditaire / acquise), la fabrication d'un gène thérapeutique, la conception d'un vecteur moléculaire (et sa formulation) et l'introduction du gène chez le patient. Une fois que le gène est exprimé chez le patient, on s'attend à ce que la bonne protéine soit formée et fonctionne. Cependant les problèmes liés à la production de protéines recombinantes, par exemple: la glycosylation complexe est éliminée. Il existe des vecteurs apparentés possibles pour introduire des informations génétiques dans les cellules humaines. Les plus pertinents sont le virus (adénovirus / rétrovirus) et l'ADN plasmidique (ADNp): tous deux peuvent être utilisés en solution aqueuse ou inclus dans des lipides ou d'autres formulations. Récemment, plus de 1500 essais cliniques de thérapie génique humaine avec plus de 220 gènes dans près de 30 pays ont été menés depuis le premier essai de thérapie génique: plus de 60% des essais ont été réalisés aux États-Unis et environ 30% en Europe . L'ADNp joue un rôle essentiel en tant que vecteur de thérapie génique et de vaccination ADN. Environ 20% des essais de thérapie génique humaine étaient basés sur l'ADNp nu, tandis que la lipofection (nécessitant la production d'ADNp) compte pour 6,6% des essais. Ensemble, les deux approches représentent près de 25% des techniques utilisées dans les essais cliniques [51]. Abstrait Les plasmides sont des vecteurs d'acide désoxyribonucléique (ADN) circulaires qui peuvent être utilisés comme vaccins pour prévenir divers types de maladies. Ces plasmides sont des plateformes d'ADN qui sont généralement composées d'un gène promoteur viral, d'un gène codant la résistance aux antibiotiques, d'un gène d'origine bactérienne de réplication et d'un site de clonage multiple (MCS) pour une région transgénique, où un ou plusieurs gènes d'intérêt antigénique peuvent être inséré. L'immunisation avec ces vecteurs recombinants permet l'expression intracellulaire des antigènes codés par la machinerie moléculaire et cellulaire des cellules transfectées, stimulant une réponse immunitaire spécifique de l'antigène. Ce processus offre une protection efficace contre divers types d'agents pathogènes, les cellules tumorales et même les allergies et les maladies auto-immunes. L'efficacité protectrice est obtenue par l'induction d'une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire dépendante des cellules B et T. L'immunité induite par ces vaccins à ADN, ajoutée à la facilité de production, d'administration, de stabilité génétique et de sécurité, a transformé l'immunisation à base de plasmide en une stratégie sûre de prévention de diverses maladies.
