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ED Techniques immunologiques

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TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
Thomas Hoffmann
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
But :
- Mise en évidence des antigènes
- Mise en évidence des anticorps
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
Mise en évidence des antigènes (Ag)
• Où :
- dans les cellules
- dans les tissus
- dans les liquides biologiques
(sérum, LCR, urines…)
• Comment : au moyen d ’anticorps
- polyclonaux
- monoclonaux
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
Mise en évidence des anticorps (Ac)
• Où ? : - essentiellement dans le serum
- plus rarement dans les autres
liquides biologiques (LCR, salive…)
• Comment ? : au moyen d ’antigènes
- le germe lui-même
- les antigènes
- les tissus...
Anticorps
5 isotypes :
. IgG, IgM
. IgA
. IgE, IgD
Réaction Ag-Ac : complexe immun
• Interaction épitope-paratope
Antigène soluble = élément moléculaire étranger à l’organisme
⇒ complexe Ag-Ac forme un précipité
Antigène particulaire = élément cellulaire étranger ou non à l’organisme, souvent
issu de pathogènes
⇒ complexe Ag-Ac forme un agglutinat
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
ATTENTION : un Ac peut lui aussi être un
Ag, vis à vis d’un Ac anti-Ac
→ un couple Ac/Ac anti-Ac peut être utilisé
pour la mise en évidence Ag ou Ac
Production d’un anticorps
monoclonal
Anticorps monoclonaux utilisés en
thérapies anti-tumorales
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
Choix de la technique :
- Concentration de l’antigène ou de l’anticorps
pg → µg → mg
- Forme de l ’antigène (soluble ou particulaire)
- Localisation de l ’antigène ou de l’anticorps
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
PRECIPITATION
- Ag soluble + Ac correspondant
- En milieu liquide ou sur gel
- Lecture à l ’oeil nu ou avec un appareil
(néphélomètre, turbidimètre)
→ 1h à quelques jours
- Peu sensible ( ~ mg)
Précipitation en milieu liquide
= test de l’anneau
Influencé par: - la T°
- le pH
- force ionique
- adjuvants
Précipitation sur gel
Gel d’agar ou d’agarose
1/Immunodiffusion double (Outcherlony)
- Double diffusion Ag et Ac en fonction de leur PM
- permet l’analyse qualitative d’un mélange d’Ag en solution
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/immu2.htm
Méthode d’Outcherlony
Puits central :
sérum de lapin
hyperimmunisé contre
la sérumalbumine
bovine (BSA)
Puits périphériques :
1 : sérum de chèvre
2 : sérum de porc
3 : sérum de lapin
4 : sérum de bœuf
5 : sérum de cheval
6 : BSA
Côté gauche
Puits central :
sérum de lapin hyperimmunisé
contre la sérumalbumine bovine (BSA)
Puits périphériques :
solutions de BSA :
1 - 1 mg/mL
4 - 125 µg/mL
2 - 500 µg/mL
5 - 65 µg/mL
3 - 250 µg/mL
6 - 32,5 µg/mL
1
1
6
2
6
2
5
3
5
3
4
4
Côté droit
Puits central :
sérum de lapin hyperimmunisé
contre la sérumalbumine bovine
(BSA) et l'ovalbumine de poule
(OVA)
Puits périphériques :
1 - OVA
2 - MSA (souris)
3 - MSA (souris)
4 - BSA
5 - BSA
6 - OVA
Précipitation sur gel
2/ Immunodiffusion radiale (méthode de Mancini)
Technique quantitative qui permet le dosage d’un Ag
(protéine)
Méthode de Mancini
Méthode de Mancini
Précipitation sur gel
3/ Electro-immunodiffusion (méthode de Laurell)
Cette technique quantitative permet d’accélérer le temps de diffusion en
obligeant l’Ag a migrer sous l’effet d’un champ électrique, dans un gel
contenant l’Ac. Le pH du gel est choisi de façon que les Ac soient
immobiles (pHi des Ig) et que l’Ag chargé négativement migre (blocage
des NH2 ; carbamylation, formylation).
Précipitation sur gel
4/ Immuno-électrophorèse
Cette technique renforce le pouvoir analytique des
doubles diffusions en identifiant les constituants d’un
mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilité
électrophorétique et leur spécificité antigénique.
1er temps: mélange d’Ag (souvent sérum) soumis à champ
électrique → les constituants (Ig et protéines) se
répartissent en fonction de leur mobilité
2ème temps: un immunoserum polyspécifique diffuse dans
un sens perpendiculaire à celui de la piste
électrophorétique dont les fractions diffusent en sens
inverse.
L’exploitation des résultats est basée sur celle de la
technique d’Ouchterlony
Patient
Contrôle
Immunoélectrophorèse
Précipitation sur gel
• 5/ Immunofixation
- séparation de la solution antigénique
(sérum) par électrophorèse
- Ac spécifique est déposé
- précipitation
- coloration
+ sensible et plus rapide que IE, mais
uniquement exploration Ig
→ Diagnostic des pathologies à Ig
monoclonales (myélome)
Immunofixation
ELECTROPHORESE
IMMUNODIFFUSION
Isotypes Isotypes
CH
CL
Immunofixation
ALBUMINE
Ig normales
ALBUMINE
Ig monoclonale
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
AGGLUTINATION
- Ag particulaire (bactéries, globules
rouges)
+
Ac correspondant
- Visible a l ’oeil nu
- Quelques minutes
- Plus sensible que la précipitation
AGGLUTINATION
• Il existe une relation entre l’agglutinabilité
et :
-le nombre de sites antigéniques
-leur localisation
• Le titre agglutinant est l’inverse de la dernière
dilution donnant une réaction positive
Dilution au 1/4 → titre 4
Dilution au 1/8 → titre 8
….
AGGLUTINATION ACTIVE
• Agglutination active
Résulte d’une union spécifique entre un Ac et un Ag
particulaire. Elle peut se faire en tube, en
microplaque ou sur lame et peut être:
- qualitative
- quantitative (titre agglutinant).
→ Sérogroupages bactériens (Salmonella,
Streptocoques, E. coli entérophathogènes…)
→ Groupage sanguin ABO
AGGLUTINATION ACTIVE
Quel groupes sanguins?
A
B
AB
O
AGGLUTINATION PASSIVE
• Agglutination passive
Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement
soluble, mais rendu particulaire par fixation sur un
support :
1. Les billes de latex → l’Ag est fixé par simple
contact (pH 8,2)
2. Les hématies (HEMAGGLUTINATION)
→ l’Ag est fixe par simple contact, par
traitement à l’acide tannique, par fixation
chimique (glutaraldehyde, di-nitro chlorobenzene…) ou par fixation immunologique (cas
des Ac dirigés contre des épitopes du GR).
AGGLUTINATION PASSIVE
• Inconvénients : hématies
- fragiles, elles s’hémolysent en 3
semaines (utilisation d’hématies
formolées, stables plusieurs mois à 4°C)
- elles portent une mosaïque d’Ag
→ recherche du facteur rhumatoïde
(réaction de Waaler Rose)
→ test de grossesse, détection de l’HCG
AGGLUTINATION PASSIVE
• Test de Coombs (test à l’antiglobuline)
→ détecter la présence d’Ac anti-hématies :
diagnostic anémie hémolytique
immunologique
Inhibition de l’hémagglutination
passive (IHA)
• Permet de rechercher la présence d’un Ag
dans un liquide biologique
• Le même Ag est fixé sur des hématies et
mis en présence d’Ac spécifiques
• Si cet Ag est présent dans le liquide
biologique, il se combine aux Ac
spécifiques qui ne peuvent plus alors
agglutiner les hématies
→ sérodiagnostic rougeole, rubéole
C’est tout………
pour aujourd’hui !
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
METHODES UTILISANT UN
MARQUEUR
- L ’immunofluorescence
. Ag ou Ac marqué avec un fluorochrome
. Lecture au microscope à fluorescence ou cytomètre en flux
. Moins de 2 heures
. Très sensible (mg/mL pg/mL)
- L ’immunoenzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
. Ag ou Ac marqué par une enzyme
. Lecture au spectrophotomètre
. Moins d ’une heure à plusieurs heures
. Très sensible ( pg/mL)
- Radio-immunologie: avec radio-isotopes (125I)
Le Western-Blot est également une technique immunoenzymatique
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
Immunofluorescence
L’immunofluorescence permet de déceler une réaction
Ag /Ac sur des cellules en suspension, des frottis
cellulaires, des microorganismes ou des coupes
d’organe.
Immunofluorescence
• Fluorochromes:
- FITC : dérivé de la fluorescéine (émission =
520 nm, couleur verte).
- Rhodamine et ses dérivés, utilisé en général
pour le double marquage, donne une fluorescence
rouge-orangée.
Applications:
-Auto-immunité : détection des Ac
antinucléaire, anti-organites ou Ac spécifiques
d’organe.
-Microbiologie : bactériologie, virologie
(cinétique de multiplication de virus, détection de
virus responsable d’infection respiratoire)…
Immunofluorescence
1/Indirecte (IFI): « méthode en deux temps »
Immunofluorescence
2/ Directe
•
Moins sensible
•
Méthode en « un temps », l’Ag est
recherché directement par l’Ac spécifique
marqué.
→ Recherche des dépôts d’Ig ou de
complément dans les tissus.
Immunofluorescence
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique (ELISA)
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
ELISA
• Permet de doser n’importe quel antigène
pour lequel on dispose d’Ac spécifiques
• Très grande sensibilité
IMMUNOENZYMOLOGIE
(ELISA)
1/Principe
Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme
pour déceler les complexes immuns. Les
techniques ELISA sont très utilisées en :
-recherche fondamentale et
appliquée (reconnaissance des épitopes
protéiques)
- analyse médicale, pour le
dosage de nombreuses substances (Ag,
Ac, hormones, marqueurs tumoraux,
médicaments…)
2/Phase solide et fixation
Par adsorption passive sur du verre, du
plastique, du polystyrène, latex… sous
forme de billes, de plaques, de tubes, de
microplaques…
ELISA
3/ Enzyme
Couplée à un Ac ou un Ag
En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par
spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie.
ELISA
• Dosage des antigènes:
1/Par compétition: Vis à vis d’Ac présents en quantité
limitée, et fixés sur un support, il y a compétition entre
l’Ag à doser et l’Ag marqué (de même spécificité) ajouté
en quantité définie dans le même temps.
ELISA
2/ Méthode en sandwich
Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non). 100 fois plus
sensible que la méthode par compétition. Surtout en recherche.
ELISA
• Dosage des anticorps : très courant en clinique
- Indirect avec Ag marqué
- Indirect avec Ac secondaire marqué
ELISA
• Applications:
⇒ Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones
(insuline, glucagon…), médicaments, enzymes (énolase,
lipase…), les facteurs rhumatoïdes, vitamines, IgE…
⇒ Diagnostic sérologique : parasitaire,
bactériologique par titrage d’anticorps ( Brucella,
Salmonelle, Treponema…), virologique (HIV,rubéole,
hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe…)
⇒ Maladies auto-immunes : recherche et dosage des
Ac anti-ADN, anti-histones, anti-Dsg1/3…
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
Radioimmunologie (RIA : Radio
Immuno Assay)
Méthodes utilisant un marqueur
- Ag ou Ac marqué par un isotope
- De moins en moins utilisée
(déchets radioactifs, agrément)
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
• 6- Divers
WESTERN-BLOT
•
•
•
•
•
Appelé également immuno-empreinte ou immuno-transfert, immunoblot
Cette technique combine le pouvoir de séparation de l’électrophorèse et la
grande sensibilité de l’immunodétection, ce qui en fait un outil performant
pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac.
Permet de détecter une protéine spécifique dans un échantillon donné
Origine du nom : jeu de mots à partir du Southern Blot
Différentes étapes:
– A/ Préparation des échantillons
– B/ Electrophorèse sur gel
Séparation des Ag par SDS-PAGE
Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou
des protéines recombinantes dénaturées et
chargées négativement, migrent dans un gel
d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %) sous
l’action d’un champ électrique. Elles sont séparées en
fonction de leur PM
WESTERN-BLOT
C. Le transfert des protéines sur membrane
Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de
.
nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique
D/ Blocage ou saturation de la membrane
WESTERN-BLOT
E/Détection
anticorps primaire et secondaire couplé à une
enzyme le plus souvent
-par colorimétrie
-par chimiluminescence (la +sensible)
-par autoradiographie
-par fluorescence
WESTERN-BLOT
La révélation immunologique
WESTERN BLOT
WESTERN BLOT VIH
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
Cytométrie en flux
• Définition: étude précise de cellules isolées
entraînées par un flux liquide
• Permet une caractérisation qualitative et quantitative
des cellules
• Utilisation de fluorochromes (FITC,rhodamine)
→ taille
→ granulosité
→ cible
Cytométrie en flux
• Principe:
Les cellules sont canalisées par centrage hydrodynamique
(passage une a une) dans une veine liquide
traversée par un faisceau laser
↓
Les cellules émettent des signaux lumineux, reflets de propriétés
optiques intrinsèques ou induites des cellules
↓
Les signaux sont séparés (par des filtres optiques), collectés (par
des photomultiplicateurs) puis amplifiés
↓
Numérisation des signaux, traitement et stockage informatique des
données représentées sous forme d’histogrammes (1 paramètre)
ou de cytogrammes (2 paramètres)
Cytométrie en flux
Cytométrie en flux
Cytométrie en flux
• Applications :
• Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules souches
hématopoiétiques
• Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri
cellulaire et de gène rapporteur)
• Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon)
• Tri de chromosome (création de banques)
• Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des
souches pures d’algues unicellulaires par ex)
• Dénombrement de lymphocytes B, de lymphocytes T CD4+,
CD8+… réalisée en diagnostic médical
TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
Mesure de l’avidité des IgG
Définition: force de
liaison entre des Ag et
les Ac correspondants
Intérêt: aide à dater une
infection
→ en complément
dosage Ig (IgM faibles)
Les IgG synthétisés au cours d'une infection récente ont une
avidité faible. A l'inverse, les IgG produites lors des infections
anciennes ou des réinfections ont une avidité forte. L'indice
d'avidité mesure la dissociation de la liaison antigène-anticorps
en présence d'urée et date l'infection.
Mesure de l’avidité des IgG
ELISPOT (« Enzyme-linked
immunospot »)
• Principe:
Détecter et dénombrer les cellules à partir de leur sécrétion
Basé sur la technique ELISA
Technologie de référence pour la mesure des réponses
spécifiques des lymphocytes T
Reproduit la coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT
→ Test diagnostique de la tuberculose infection
latente (T-Spot.TB®)
ELISPOT
1 spot =
1 LT activé
Evaluation d’une méthode
•
La « sensibilité analytique » est la plus petite quantité de substance
d'un échantillon qui peut être mesurée correctement par une technique.
•
La « sensibilité diagnostique » est le pourcentage de personnes
atteintes d'une maladie donnée qui sont identifiées par la technique comme
porteur de cette maladie.
Sensibilité=Vrais positifs (VP)/[VP+ Faux négatifs (FN)]
→ identifier les positifs
•
La « spécificité analytique » se rapporte à la capacité d'une technique
de mesurer un organisme ou une substance particulière, plutôt que d'autres,
dans un échantillon
•
La « spécificité diagnostique » est le pourcentage de personnes qui
n'ont pas une maladie donnée et qui sont identifiés par la technique comme non
porteur de cette maladie.
Spécificité=Vrais négatifs (VN)/[VN+ Faux Positifs (FP)]
→ identifier les négatifs
Evaluation d’une méthode
• La valeur prédictive positive (VPP) d’un test diagnostique désigne la
probabilité d'avoir une certaine maladie si on présente un test
positif.
VPP= [ VP/[VP+FP]]
• La valeur predictive négative (VPN) d’un test diagnostique désigne la
probabilité ne pas avoir une certaine maladie si on ne présente un
test négatif
VPN= [ VN/[VN+FN]]
• La valeur globale (VG) d’un test diagnostique indique la proportion
de résultats exacts donnés par ce test parmi l’ensemble de tous les
résultats du test
VG= [VP+VN/ [VP+VN+FP+FN] ]
Exercice
Vous souhaitez évalué un nouveau test de dépistage du
cancer du poumon. Ce test dose un marqueur par
technique « ELISA sandwich ».
L’échantillon étudié porte sur 450 patients suivis dans un
service de pneumologie. Vous savez qu’il a été
diagnostiqué auparavant 60 cancers dans cet
échantillon.
Le test est appliqué à l’ensemble de l’échantillon: 300 non
malades ont eu un test négatif et 55 malades ont eu un
test positif
Calculer la sensibilité, spécificité, VPP, VPN et
la valeur globale du test
Solution exercice
• 55 VP et 300 VN, donc 60-55=5 FN et
450-60-300=90 FP
•
•
•
•
•
Sensibilité = 55/(55+5) = 91,7%
Spécificité = 300/(300+90) = 76,9%
VPP = 55/(55+90) = 37,9%
VPN = 300/(300+5) = 98,4%
VG = (55+300)/(55+300+5+90) = 78,9%
Merci pour votre attention
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