TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Thomas Hoffmann TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES But : - Mise en évidence des antigènes - Mise en évidence des anticorps TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Mise en évidence des antigènes (Ag) • Où : - dans les cellules - dans les tissus - dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urines…) • Comment : au moyen d ’anticorps - polyclonaux - monoclonaux TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Mise en évidence des anticorps (Ac) • Où ? : - essentiellement dans le serum - plus rarement dans les autres liquides biologiques (LCR, salive…) • Comment ? : au moyen d ’antigènes - le germe lui-même - les antigènes - les tissus... Anticorps 5 isotypes : . IgG, IgM . IgA . IgE, IgD Réaction Ag-Ac : complexe immun • Interaction épitope-paratope Antigène soluble = élément moléculaire étranger à l’organisme ⇒ complexe Ag-Ac forme un précipité Antigène particulaire = élément cellulaire étranger ou non à l’organisme, souvent issu de pathogènes ⇒ complexe Ag-Ac forme un agglutinat TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES ATTENTION : un Ac peut lui aussi être un Ag, vis à vis d’un Ac anti-Ac → un couple Ac/Ac anti-Ac peut être utilisé pour la mise en évidence Ag ou Ac Production d’un anticorps monoclonal Anticorps monoclonaux utilisés en thérapies anti-tumorales TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES Choix de la technique : - Concentration de l’antigène ou de l’anticorps pg → µg → mg - Forme de l ’antigène (soluble ou particulaire) - Localisation de l ’antigène ou de l’anticorps TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux • 6- Divers TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux • 6- Divers PRECIPITATION - Ag soluble + Ac correspondant - En milieu liquide ou sur gel - Lecture à l ’oeil nu ou avec un appareil (néphélomètre, turbidimètre) → 1h à quelques jours - Peu sensible ( ~ mg) Précipitation en milieu liquide = test de l’anneau Influencé par: - la T° - le pH - force ionique - adjuvants Précipitation sur gel Gel d’agar ou d’agarose 1/Immunodiffusion double (Outcherlony) - Double diffusion Ag et Ac en fonction de leur PM - permet l’analyse qualitative d’un mélange d’Ag en solution http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/immu2.htm Méthode d’Outcherlony Puits central : sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) Puits périphériques : 1 : sérum de chèvre 2 : sérum de porc 3 : sérum de lapin 4 : sérum de bœuf 5 : sérum de cheval 6 : BSA Côté gauche Puits central : sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) Puits périphériques : solutions de BSA : 1 - 1 mg/mL 4 - 125 µg/mL 2 - 500 µg/mL 5 - 65 µg/mL 3 - 250 µg/mL 6 - 32,5 µg/mL 1 1 6 2 6 2 5 3 5 3 4 4 Côté droit Puits central : sérum de lapin hyperimmunisé contre la sérumalbumine bovine (BSA) et l'ovalbumine de poule (OVA) Puits périphériques : 1 - OVA 2 - MSA (souris) 3 - MSA (souris) 4 - BSA 5 - BSA 6 - OVA Précipitation sur gel 2/ Immunodiffusion radiale (méthode de Mancini) Technique quantitative qui permet le dosage d’un Ag (protéine) Méthode de Mancini Méthode de Mancini Précipitation sur gel 3/ Electro-immunodiffusion (méthode de Laurell) Cette technique quantitative permet d’accélérer le temps de diffusion en obligeant l’Ag a migrer sous l’effet d’un champ électrique, dans un gel contenant l’Ac. Le pH du gel est choisi de façon que les Ac soient immobiles (pHi des Ig) et que l’Ag chargé négativement migre (blocage des NH2 ; carbamylation, formylation). Précipitation sur gel 4/ Immuno-électrophorèse Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilité électrophorétique et leur spécificité antigénique. 1er temps: mélange d’Ag (souvent sérum) soumis à champ électrique → les constituants (Ig et protéines) se répartissent en fonction de leur mobilité 2ème temps: un immunoserum polyspécifique diffuse dans un sens perpendiculaire à celui de la piste électrophorétique dont les fractions diffusent en sens inverse. L’exploitation des résultats est basée sur celle de la technique d’Ouchterlony Patient Contrôle Immunoélectrophorèse Précipitation sur gel • 5/ Immunofixation - séparation de la solution antigénique (sérum) par électrophorèse - Ac spécifique est déposé - précipitation - coloration + sensible et plus rapide que IE, mais uniquement exploration Ig → Diagnostic des pathologies à Ig monoclonales (myélome) Immunofixation ELECTROPHORESE IMMUNODIFFUSION Isotypes Isotypes CH CL Immunofixation ALBUMINE Ig normales ALBUMINE Ig monoclonale TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux • 6- Divers AGGLUTINATION - Ag particulaire (bactéries, globules rouges) + Ac correspondant - Visible a l ’oeil nu - Quelques minutes - Plus sensible que la précipitation AGGLUTINATION • Il existe une relation entre l’agglutinabilité et : -le nombre de sites antigéniques -leur localisation • Le titre agglutinant est l’inverse de la dernière dilution donnant une réaction positive Dilution au 1/4 → titre 4 Dilution au 1/8 → titre 8 …. AGGLUTINATION ACTIVE • Agglutination active Résulte d’une union spécifique entre un Ac et un Ag particulaire. Elle peut se faire en tube, en microplaque ou sur lame et peut être: - qualitative - quantitative (titre agglutinant). → Sérogroupages bactériens (Salmonella, Streptocoques, E. coli entérophathogènes…) → Groupage sanguin ABO AGGLUTINATION ACTIVE Quel groupes sanguins? A B AB O AGGLUTINATION PASSIVE • Agglutination passive Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble, mais rendu particulaire par fixation sur un support : 1. Les billes de latex → l’Ag est fixé par simple contact (pH 8,2) 2. Les hématies (HEMAGGLUTINATION) → l’Ag est fixe par simple contact, par traitement à l’acide tannique, par fixation chimique (glutaraldehyde, di-nitro chlorobenzene…) ou par fixation immunologique (cas des Ac dirigés contre des épitopes du GR). AGGLUTINATION PASSIVE • Inconvénients : hématies - fragiles, elles s’hémolysent en 3 semaines (utilisation d’hématies formolées, stables plusieurs mois à 4°C) - elles portent une mosaïque d’Ag → recherche du facteur rhumatoïde (réaction de Waaler Rose) → test de grossesse, détection de l’HCG AGGLUTINATION PASSIVE • Test de Coombs (test à l’antiglobuline) → détecter la présence d’Ac anti-hématies : diagnostic anémie hémolytique immunologique Inhibition de l’hémagglutination passive (IHA) • Permet de rechercher la présence d’un Ag dans un liquide biologique • Le même Ag est fixé sur des hématies et mis en présence d’Ac spécifiques • Si cet Ag est présent dans le liquide biologique, il se combine aux Ac spécifiques qui ne peuvent plus alors agglutiner les hématies → sérodiagnostic rougeole, rubéole C’est tout……… pour aujourd’hui ! TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux • 6- Divers METHODES UTILISANT UN MARQUEUR - L ’immunofluorescence . Ag ou Ac marqué avec un fluorochrome . Lecture au microscope à fluorescence ou cytomètre en flux . Moins de 2 heures . Très sensible (mg/mL pg/mL) - L ’immunoenzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) . Ag ou Ac marqué par une enzyme . Lecture au spectrophotomètre . Moins d ’une heure à plusieurs heures . Très sensible ( pg/mL) - Radio-immunologie: avec radio-isotopes (125I) Le Western-Blot est également une technique immunoenzymatique TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux Immunofluorescence L’immunofluorescence permet de déceler une réaction Ag /Ac sur des cellules en suspension, des frottis cellulaires, des microorganismes ou des coupes d’organe. Immunofluorescence • Fluorochromes: - FITC : dérivé de la fluorescéine (émission = 520 nm, couleur verte). - Rhodamine et ses dérivés, utilisé en général pour le double marquage, donne une fluorescence rouge-orangée. Applications: -Auto-immunité : détection des Ac antinucléaire, anti-organites ou Ac spécifiques d’organe. -Microbiologie : bactériologie, virologie (cinétique de multiplication de virus, détection de virus responsable d’infection respiratoire)… Immunofluorescence 1/Indirecte (IFI): « méthode en deux temps » Immunofluorescence 2/ Directe • Moins sensible • Méthode en « un temps », l’Ag est recherché directement par l’Ac spécifique marqué. → Recherche des dépôts d’Ig ou de complément dans les tissus. Immunofluorescence TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique (ELISA) -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytometrie en flux ELISA • Permet de doser n’importe quel antigène pour lequel on dispose d’Ac spécifiques • Très grande sensibilité IMMUNOENZYMOLOGIE (ELISA) 1/Principe Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les complexes immuns. Les techniques ELISA sont très utilisées en : -recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance des épitopes protéiques) - analyse médicale, pour le dosage de nombreuses substances (Ag, Ac, hormones, marqueurs tumoraux, médicaments…) 2/Phase solide et fixation Par adsorption passive sur du verre, du plastique, du polystyrène, latex… sous forme de billes, de plaques, de tubes, de microplaques… ELISA 3/ Enzyme Couplée à un Ac ou un Ag En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie. ELISA • Dosage des antigènes: 1/Par compétition: Vis à vis d’Ac présents en quantité limitée, et fixés sur un support, il y a compétition entre l’Ag à doser et l’Ag marqué (de même spécificité) ajouté en quantité définie dans le même temps. ELISA 2/ Méthode en sandwich Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non). 100 fois plus sensible que la méthode par compétition. Surtout en recherche. ELISA • Dosage des anticorps : très courant en clinique - Indirect avec Ag marqué - Indirect avec Ac secondaire marqué ELISA • Applications: ⇒ Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones (insuline, glucagon…), médicaments, enzymes (énolase, lipase…), les facteurs rhumatoïdes, vitamines, IgE… ⇒ Diagnostic sérologique : parasitaire, bactériologique par titrage d’anticorps ( Brucella, Salmonelle, Treponema…), virologique (HIV,rubéole, hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe…) ⇒ Maladies auto-immunes : recherche et dosage des Ac anti-ADN, anti-histones, anti-Dsg1/3… TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux Radioimmunologie (RIA : Radio Immuno Assay) Méthodes utilisant un marqueur - Ag ou Ac marqué par un isotope - De moins en moins utilisée (déchets radioactifs, agrément) TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytometrie en flux • 6- Divers WESTERN-BLOT • • • • • Appelé également immuno-empreinte ou immuno-transfert, immunoblot Cette technique combine le pouvoir de séparation de l’électrophorèse et la grande sensibilité de l’immunodétection, ce qui en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac. Permet de détecter une protéine spécifique dans un échantillon donné Origine du nom : jeu de mots à partir du Southern Blot Différentes étapes: – A/ Préparation des échantillons – B/ Electrophorèse sur gel Séparation des Ag par SDS-PAGE Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou des protéines recombinantes dénaturées et chargées négativement, migrent dans un gel d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %) sous l’action d’un champ électrique. Elles sont séparées en fonction de leur PM WESTERN-BLOT C. Le transfert des protéines sur membrane Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de . nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique D/ Blocage ou saturation de la membrane WESTERN-BLOT E/Détection anticorps primaire et secondaire couplé à une enzyme le plus souvent -par colorimétrie -par chimiluminescence (la +sensible) -par autoradiographie -par fluorescence WESTERN-BLOT La révélation immunologique WESTERN BLOT WESTERN BLOT VIH TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux • 6- Divers Cytométrie en flux • Définition: étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide • Permet une caractérisation qualitative et quantitative des cellules • Utilisation de fluorochromes (FITC,rhodamine) → taille → granulosité → cible Cytométrie en flux • Principe: Les cellules sont canalisées par centrage hydrodynamique (passage une a une) dans une veine liquide traversée par un faisceau laser ↓ Les cellules émettent des signaux lumineux, reflets de propriétés optiques intrinsèques ou induites des cellules ↓ Les signaux sont séparés (par des filtres optiques), collectés (par des photomultiplicateurs) puis amplifiés ↓ Numérisation des signaux, traitement et stockage informatique des données représentées sous forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) Cytométrie en flux Cytométrie en flux Cytométrie en flux • Applications : • Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules souches hématopoiétiques • Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri cellulaire et de gène rapporteur) • Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon) • Tri de chromosome (création de banques) • Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des souches pures d’algues unicellulaires par ex) • Dénombrement de lymphocytes B, de lymphocytes T CD4+, CD8+… réalisée en diagnostic médical TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES • 1- Précipitation • 2- Agglutination • 3- Utilisant un marqueur: -Immunofluorescence -Immunoenzymatique -Radioimmunologie (RIA) • 4- Western-blot • 5- Cytométrie en flux • 6- Divers Mesure de l’avidité des IgG Définition: force de liaison entre des Ag et les Ac correspondants Intérêt: aide à dater une infection → en complément dosage Ig (IgM faibles) Les IgG synthétisés au cours d'une infection récente ont une avidité faible. A l'inverse, les IgG produites lors des infections anciennes ou des réinfections ont une avidité forte. L'indice d'avidité mesure la dissociation de la liaison antigène-anticorps en présence d'urée et date l'infection. Mesure de l’avidité des IgG ELISPOT (« Enzyme-linked immunospot ») • Principe: Détecter et dénombrer les cellules à partir de leur sécrétion Basé sur la technique ELISA Technologie de référence pour la mesure des réponses spécifiques des lymphocytes T Reproduit la coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT → Test diagnostique de la tuberculose infection latente (T-Spot.TB®) ELISPOT 1 spot = 1 LT activé Evaluation d’une méthode • La « sensibilité analytique » est la plus petite quantité de substance d'un échantillon qui peut être mesurée correctement par une technique. • La « sensibilité diagnostique » est le pourcentage de personnes atteintes d'une maladie donnée qui sont identifiées par la technique comme porteur de cette maladie. Sensibilité=Vrais positifs (VP)/[VP+ Faux négatifs (FN)] → identifier les positifs • La « spécificité analytique » se rapporte à la capacité d'une technique de mesurer un organisme ou une substance particulière, plutôt que d'autres, dans un échantillon • La « spécificité diagnostique » est le pourcentage de personnes qui n'ont pas une maladie donnée et qui sont identifiés par la technique comme non porteur de cette maladie. Spécificité=Vrais négatifs (VN)/[VN+ Faux Positifs (FP)] → identifier les négatifs Evaluation d’une méthode • La valeur prédictive positive (VPP) d’un test diagnostique désigne la probabilité d'avoir une certaine maladie si on présente un test positif. VPP= [ VP/[VP+FP]] • La valeur predictive négative (VPN) d’un test diagnostique désigne la probabilité ne pas avoir une certaine maladie si on ne présente un test négatif VPN= [ VN/[VN+FN]] • La valeur globale (VG) d’un test diagnostique indique la proportion de résultats exacts donnés par ce test parmi l’ensemble de tous les résultats du test VG= [VP+VN/ [VP+VN+FP+FN] ] Exercice Vous souhaitez évalué un nouveau test de dépistage du cancer du poumon. Ce test dose un marqueur par technique « ELISA sandwich ». L’échantillon étudié porte sur 450 patients suivis dans un service de pneumologie. Vous savez qu’il a été diagnostiqué auparavant 60 cancers dans cet échantillon. Le test est appliqué à l’ensemble de l’échantillon: 300 non malades ont eu un test négatif et 55 malades ont eu un test positif Calculer la sensibilité, spécificité, VPP, VPN et la valeur globale du test Solution exercice • 55 VP et 300 VN, donc 60-55=5 FN et 450-60-300=90 FP • • • • • Sensibilité = 55/(55+5) = 91,7% Spécificité = 300/(300+90) = 76,9% VPP = 55/(55+90) = 37,9% VPN = 300/(300+5) = 98,4% VG = (55+300)/(55+300+5+90) = 78,9% Merci pour votre attention
