3 - Technique de coloration négative Intérêts Description morphologique (morphologie externe ) de macromolécules ou d’organites (ex :les ribosomes ), de virus , mais après isolement . Architecture moléculaire des éléments du cytosquelette (microtubules , microfilament d’actine..), de la chromatine , des pores nucléaires , mais après isolement . Technique d’isolement 1 Homogénéisation du tissu 2 Ultracentrifugation Ultracentrifugation différentielle UCD Homogénat cellulaire Fractions /Culots Surnageants Ultracentrifugation sur gradient de densité de saccharose UGD Bandes Principe de fractionnement / homogénéisation P .37 Homogénat cellulaire Cette technique permet la séparation de macromolécules et des organites cellulaires selon leur densité L’appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse nommée centrifugeuse La centrifugeuse et centrifugation P .38 La centrifugeuse est constituée d’un axe portant un rotor spécial . Le rotor porte des emplacements qui peuvent recevoir des tubes contenants les préparations biologiques AXE La macromolécule est soumise à une force centrifuge F Sous l ’effet de F , les molécules se déplacent vers le fond du tube tournant Procédés de l’ultracentrifugation différentielle UCD P .39 Principe de la centrifugation Les éléments se déposent selon leur poids et leur taille Procédés d’UGD 12 % saccharose La centrifugation(étape 4) entraine le déplacement des composants du culot ( récupéré à l’UCD ) à travers le gradient de densité de saccharose et s’arrêtent en une bande à leur densité (étape 5) . 2 Culot d’UCD Gradient de densité Récupération des bandes Principe de la coloration négative p .32 Cette technique concerne les microorganismes ; bactéries , virus . Les ribosomes , les ATPosomes mitochondriaux ……. Contraste par coloration négative de virus isolés à partir de cellules infectées ( hôtes ) But : Morphologie externe Bactériophages Virus de la Mosaïque du tabac Virus du SIDA Bactériophage Virus EBOLA Contraste par coloration négative des éléments du cytosquelette But : architecture moléculaire Microfilaments d’actine Microtubules Morphologie externe des ATPosomes de la crête mitochondriale ( membrane interne) Le microscope électronique à balayage Pouvoir séparateur de 22 nm Description Principe de fonctionnement Technique appliquées : Technique de cryofracture / cryodécapage + ombrage métallique L’ ombrage métallique sur échantillon entier MEB MEB en coupe Principe de fonctionnement du MEB Observation par réflexion Principe de la réflexion p. 25 Objet massif La microscopie électronique à balayage (MEB ) Utilise un faisceau d’électron qui se réfléchi sur une surface organique en relief , entière ou fracturée après congélation , et recouverte d’une couche très mince de métal . On recueille les électrons secondaires réémis depuis l’échantillon Le faisceau réfléchi est ensuite capté et enregistré par une caméra . Principe de formation de l’image en MEB Electrons primaires Electrons secondaires Détecteur d’électrons secondaires Grille Echantillon métallisé Image en 3D sur Écran TV M Techniques associées au MEB o r p h o l o g i e e But : morphologie en 3 D des surfaces internes et externes suite à un contraste par ombrage métallique MEB L’ Ombrage métallique Echantillon entier métallisé Etude des surfaces externes Technique de répliques / Cryodécapage +ombrage métallique Obtention d’une réplique Etude des surfaces internes/ externe (M P ) Obtention d’une réplique( surface interne ) grille cryofracture P . 30 Technique des répliques MET L’ Ombrage métallique Échantillon entier Support platine carbone Milieu acide réplique L’ Ombrage métallique Résultats de l’observation au MEB Observation de répliques Après Cryodécapage Aspect en 3D Cellules de levure en division observées après Cryodécapage réplique ombrée Réplique de la surface interne d’une cellule hépatique Vue en relief du noyau après cryodécapage (réplique ) Réplique de la membrane plasmique Résultats : présence de reliefs et de dépressions qui correspondent aux protéines transmembranaires Observation de surfaces externes d’échantillons entiers Après ombrage métallique Aspect en 3 D Aspect en 3 D de levures observées au MEB Cellule souche de moelle osseuse Bactérie E . COLI Chromosomes(à gauche) et cellules sanguines(à droite ) Aspect en 3D d’une tète de fourmis Spermatozoïde perforant l’ovocyte SPZ Aspect en 3 D de bactériophages Aspect biconcave de globules rouges au MEB E. COLI sur la pointe d’une épingle A C B D
