Telechargé par bensoltane_samira

prsentation chapitre ii suite 3

publicité
3 - Technique de coloration négative
Intérêts
Description
morphologique
(morphologie
externe ) de
macromolécules ou
d’organites (ex :les
ribosomes ), de
virus , mais après
isolement .
Architecture moléculaire
des éléments du
cytosquelette
(microtubules ,
microfilament d’actine..),
de la chromatine , des
pores nucléaires , mais
après isolement .
Technique d’isolement
1
Homogénéisation
du tissu
2
Ultracentrifugation
Ultracentrifugation
différentielle UCD
Homogénat
cellulaire
Fractions /Culots Surnageants
Ultracentrifugation
sur gradient de
densité de
saccharose UGD
Bandes
Principe de fractionnement / homogénéisation
P .37
Homogénat
cellulaire
Cette technique permet la séparation de
macromolécules et des organites
cellulaires selon leur densité
L’appareil utilisé est une machine tournante
à grande vitesse nommée centrifugeuse
La centrifugeuse et centrifugation
P .38
La centrifugeuse est constituée d’un axe
portant un rotor spécial . Le rotor porte des
emplacements qui peuvent recevoir des tubes
contenants les préparations biologiques
AXE
La macromolécule
est soumise à une
force centrifuge F
Sous l ’effet de F , les
molécules se déplacent
vers le fond du tube
tournant
Procédés de l’ultracentrifugation différentielle
UCD
P .39
Principe de la centrifugation
Les éléments se déposent selon leur poids
et leur taille
Procédés d’UGD
12 % saccharose
La centrifugation(étape 4) entraine le
déplacement des composants du culot
( récupéré à l’UCD ) à travers le
gradient de densité de saccharose et
s’arrêtent en une bande à leur densité
(étape 5) .
2
Culot
d’UCD
Gradient
de
densité
Récupération
des bandes
Principe de la coloration négative p .32
Cette technique concerne les microorganismes ; bactéries ,
virus . Les ribosomes , les ATPosomes mitochondriaux …….
Contraste par coloration négative
de virus isolés à partir de cellules
infectées ( hôtes )
But : Morphologie externe
Bactériophages
Virus de la
Mosaïque du
tabac
Virus du
SIDA
Bactériophage
Virus
EBOLA
Contraste par coloration
négative des éléments du
cytosquelette
But : architecture moléculaire
Microfilaments
d’actine
Microtubules
Morphologie externe des ATPosomes de la
crête mitochondriale ( membrane interne)
 Le microscope électronique à balayage
Pouvoir séparateur de 22 nm
Description
Principe de fonctionnement
Technique appliquées :
Technique de cryofracture /
cryodécapage + ombrage métallique
L’ ombrage métallique sur échantillon entier
MEB
MEB en coupe
Principe de fonctionnement du MEB
Observation par réflexion
Principe de la réflexion p. 25
Objet massif
La microscopie électronique à balayage (MEB )
Utilise un faisceau d’électron qui se
réfléchi sur une surface organique en
relief , entière ou fracturée après
congélation , et recouverte d’une couche
très mince de métal .
On recueille les électrons secondaires
réémis depuis l’échantillon
Le faisceau réfléchi est ensuite capté
et enregistré par une caméra .
Principe de formation de l’image en MEB
Electrons
primaires
Electrons
secondaires
Détecteur
d’électrons
secondaires
Grille
Echantillon
métallisé
Image en
3D sur
Écran TV
M
Techniques associées
au MEB
o
r
p
h
o
l
o
g
i
e
e
But : morphologie en 3 D des surfaces
internes et externes suite à un contraste
par ombrage métallique
MEB
L’ Ombrage
métallique
Echantillon
entier
métallisé
Etude des surfaces
externes
Technique de
répliques /
Cryodécapage
+ombrage métallique
Obtention
d’une réplique
Etude des
surfaces internes/
externe (M P )
Obtention d’une réplique( surface interne )
grille
cryofracture
P . 30
Technique
des
répliques
MET
L’ Ombrage métallique
Échantillon
entier
Support
platine
carbone
Milieu
acide
réplique
L’ Ombrage métallique
Résultats de l’observation au MEB
Observation de répliques
Après Cryodécapage
Aspect en 3D
Cellules de levure en division observées
après Cryodécapage
réplique ombrée
Réplique de la surface
interne d’une cellule
hépatique
Vue en relief du noyau après cryodécapage
(réplique )
Réplique de la membrane plasmique
Résultats : présence de reliefs et de dépressions qui
correspondent aux protéines transmembranaires
Observation de surfaces externes
d’échantillons entiers
Après ombrage métallique
Aspect en 3 D
Aspect en 3 D de levures observées au MEB
Cellule souche de
moelle osseuse
Bactérie E . COLI
Chromosomes(à gauche) et cellules sanguines(à
droite )
Aspect en 3D d’une
tète de fourmis
Spermatozoïde
perforant l’ovocyte
SPZ
Aspect en 3 D de
bactériophages
Aspect biconcave de
globules rouges au
MEB
E. COLI sur la pointe d’une épingle
A
C
B
D
Téléchargement
Explore flashcards