Université des Sciences & de la Technologie d’Oran Mohamed BOUDIAF. Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie. Département de Génétique Moléculaire Appliquée جامعت العلوم و التكنولوجيا دمحم بوضياف كليت علوم الطبيعت و الحياة Génétique des procaryotes Licence Génétique. Niveau 3. Département G.M.A Pr Nadjia. SAIDI-OUAHRANI 2016-2017 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Introduction Les protistes (terme créé par HAECKEL, 1866) sont les êtres unicellulaires et les êtres pluricellulaires sans tissus différenciés. Les protistes sont classés en deux catégories : • Les protistes supérieurs ou eucaryotes qui possèdent un noyau entouré d’une membrane, des chromosomes, un appareil de mitose et une structure cellulaire complexe (mitochondries). • Les protistes inférieurs ou procaryotes ont généralement un chromosome unique sans membrane nucléaire, sans appareil de mitose, et une structure cellulaire élémentaire (pas de mitochondries). Les bactéries font partie des protistes procaryotes. Le terme de microbes (crée en 1878, SEDILLOT) distingue les bactéries proprement dites et les virus. Le terme virus, qui au début désignait tout agent infectieux, est maintenant réservé à la catégorie bien particulière de microbes qui ne possèdent qu'un seul type d'acide nucléique et qui sont incapables d'assurer à eux-seuls la synthèse de leurs propres constituants. Les virus qui infectent les bactéries sont appelés bactériophage ou phages. La génétique des procaryotes traite de (1) la nature du matériel génétique (ADN) des procaryotes (bactéries) et des bactériophages, (2) les mécanismes qui permettent la stabilité de l’ADN (composition, structure et réplication), détaillés dans le premier chapitre ; sa conservation (réparation) ;(3) et sa diversité (mutation….) sont traités dans le deuxième chapitre ; (4) les échanges d’information génétique (recombinaison, éléments transposable) sont traités dans le troisième et quatrième chapitre); (5) la régulation de son expression (opéron) et son évolution rédigés dans le dernier chapitre. J’espère que nos étudiants trouveront dans mes cours toutes les informations nécessaires permettant de compléter leur formation en L3 spécialité génétique. 1 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Chapitre I Le matériel génétique bactérien Structure, organisation et réplication: Introduction Les procaryotes (bactéries) possèdent généralement un matériel nucléaire, sous forme d’ADN appelé le chromonème (chromosome) et des éléments génétiques extra-chromosomiques, appelés plasmides. Les bactéries peuvent être infectées par des bactériophages, des particules virales constituées d’ADN ou d’ARN, protégés par une enveloppe, appelée la capside. Le chromonème, le plasmide et le bactériophage, peuvent échanger des fragments d’ADN par des mécanismes de transfert attribuant aux bactéries de nouveaux phénotypes contribuant à leur diversité. Les plasmides et les phages sont utilisés par les chercheurs en géni-génétique et servent de vecteurs de transfert de matériel génétique. 1- Le chromosome bactérien - Le chromosome bactérien est localisé dans le cytoplasme, il n’est pas entouré d’une membrane nucléaire, comparé à celui des eucaryotes. - Le chromosome bactérien est constitué d’une molécule d’ADN circulaire (fermée), pelotonnée, surenroulée. Une douzaine de protéines dites nucléoïdes interviennent dans cette compaction (H-NS, HU, IHF, Dps, StpA et Lrp..). une fois déplié, le chromosome bactérien d’E.coli a près de 1 mm de long (1000 fois la longueur de la bactérie) et 3 à 5 nanomètres de large. La majorité des procaryotes sont monploïde (haploide). - L'analyse chimique du chromosome bactérien montre qu'il est composé à 80 % d'ADN (le chromosome), à 10 % d'acide ribonucléique ou ARN (amorce. ARNm.) et à 10 % de protéines (protéines de compaction, les ADN polymérases, les topoisomérases et ARN polymérases) - Les constituants de l’appareil nucléaire sont la cible d’action de plusieurs antibiotiques : les quinolones inhibent les topoisomérases et les rifamycines inhibent les ARN polymérases, tandis que les nitromidazoles entraînent la fragmentation de l’ADN chez les anaérobies stricts. 2 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Nouveau brin Fourche brin Fourche ADN parental Figure 1 : chromosome bactérien (E.J 1998). (A) vu au microscope électronique. (B) Le schéma montrant la forme de l’ADN en réplication (le trait rouge brins synthétisés). 2. Structure de l’ADN Bactérien 2.1 Structure primaire - La molécule d’ADN procaryotes est sous formes de 2 chaînes de polynucléotides (figure 2). - Elle résulte de la condensation de nucléotide par des liaisons phosphodiésters entre le carbone 3’ d’un premier nucléotide et le résidu phosphorylé porté par le carbone5’ du nucléotide suivant (figure 2). Par convention les chaines sont orientées dans le sens 5’ 3’. Figure 2 : composants de l’ADN. a) une liaison phosphodiester entre deux nucléotides d’une même chaine. b) une chaine de polynucléotides. (Kug et al 2006) 3 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Chaque chaine d’ADN est composée chimiquement d’une succession de nucléotides (figure 2b). Chaque nucléotide est composé d’un désoxyribose (figure 2a), reliée du côté externe par des molécules de monophosphate et de l’intérieure par des bases azotées. Les règles de complémentarité universelles entre les bases azotée : adénine, thymine, cytosine et gaunine sont: en face d’un nucléotide monophosphate à adénine (AMP) deux liaisons hydrogène se forment avec un nucléotide monophosphate à thymine (TMP) ; en face le nucléotide monophosphate à cytosine (CMP) 3 liaisons hydrogène se forment avec un nucléotide monophosphate à guanine (GMP) (fig3). Figure 3: appariement des bases A=T et G≡C. les pointillés représentent les liaisons hydrogènes entre les bases (Klug et al 2006) 2.2 Structure secondaire. Les 2 chaînes d’ADN sont hybridées deux à deux (modèle de Watson et Crick 1953). Leurs caractéristiques sont : 4 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N a) Antiparallèles : l’extrémité 5’ d’une chaine est du côté de l’extrémité 3’ de l’autre chaine. b) Complémentaires : les nucléotides d’une chaîne sont complémentaires aux nucléotides de la 2ème chaine (fig3). Les rapports A/T, C/G sont constants. Cette complémentarité est due à la conjonction de deux phénomènes : - Des contraintes sériques : la complémentarité purine-pyrimidine fait que chaque paire de base ayant la même dimension, la structure d’ADN est très régulière. - La création de liaisons d’hydrogènes: entre les bases complémentaires. Le nombre de liaison est de 2 entre A-T et de trois entre C-G. Ce nombre influe sur la stabilité de l’appariement. Pour rompre l’appariement A-T, il faut une énergie de 21kj, et 63kj pour rompre C-G (Figure 3). c)hélicoïdales : l’ADN s’enroule autour d’un axe central imaginaire en formant une double hélice droite (ADN A, ADNB) (Figure 3). Le pas de l’hélice est de 34Â (10pb), la distance entre deux bases voisines est de 3.4Â et le diamètre de 20Â. Figure 3: modèle de la double hélice de l’ADN proposé par Watson et Crick (Klug et al 2006) 5 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 2.3 Réplication Définition : la réplication est le mécanisme de synthèse de l’acide désoxyribonucléique qui reproduit exactement le génome d’une cellule bactérienne avant de se diviser. 1- Le mode de réplication est semi-conservatif (expérience de Meselson et Stahl, 1958 voir TD): chaque molécule d’ADN copiée contient un brin dérivée de la molécule mère (matrice) et un brin néosynthétisé. 2- Le sens de la synthèse se fait toujours de 5’ vers 3’. 2.3.1 Eléments de la réplication Les éléments de la réplication sont: 1- ADN matrice, 2- désoxyribonucléotides (dATP, dGTP,dCTP, dTTP) , 3- ions Mg2+ 4-Topoisomérases (DnaA): élimine les contraintes de surenroulement crées par l’hélicase (DnaB). 5 - Hélicase (DnaB) additionné de DnaC: sépare les brins d’ADN 6- SSB (Single Strand Binding) : protéines qui stabilise l’ADN monocaténaire 7- ADN polymérase III : polymérise les désoxyribonucléotides dans le sens 5’ 3’ (composé de sous unités α2 ε2 β4 γδδ’ χ et ψ) 8- Primase (DnaG) : synthétise les amorces d’ARN nécessaire à la polymérase 9- ADN ligase : attache les fragments d’Okazaki sur le brin retardé. 3.2 Mécanisme de la réplication chez les procaryotes - la forme (topologie) de l’ADN est circulaire. - La réplication commence à un endroit précis appelé origine de réplication (oriC) - Après séparation des deux brins au niveau de « Oric », il se forme une fourche de réplication (2 fourches qui progressent dans les deux sens opposés) (figure 1et 5). - Les fourches finissent par se rejoindre et fusionnent au niveau du site de terminaison (ter C). La réplication s’achève (fig 4). 6 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Remarque : le chromonème est appelé aussi un réplicon : un réplicon est toute molécule d’ADN avec une origine de réplication. Figure 4: réplication bidirectionnelle du chromonème. Formation de fourche de réplication (E.J. 1998). 2.3.3. Etapes de la réplication in vivo a) Initiation L’initiation commence par : -la formation de la fourche de réplication au niveau d’une origine de réplication (ori C). oriC est composée de trois régions riche en A-T (TTATCCACA) et de 4boites DnaA. De 10 à 12 molécule de protéines DnaA se lient aux boites DnaA et forme le complexe (fig 5c). - Le déroulement se fait dans les deux sens par le complexe DnaA (topoisomérases) ( fig 5b) Le complexe dissocie la région riche en A-T et ouvre la double hélice. - Séparation des deux brins par l’action d’une enzyme (hélicase/ DnaB). Une fois ouvert, DnaC se lie au DnaB (hélicase) pour démêler encore ce domaine. Les protéines, SSB (single strand binding) maintiennent le site ouvert, finalement la DnaG primase initie (commence) la synthèse par polymérisation d’un brin d’ARN, (fig5d).. 7 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 5 : initiation de la réplication chez les procaryotes ( b) L’élongation Au niveau de la fourche : - sur le brin matrice (synthèse du brin précose), l’élongation est continue, - sur l’autre matrice, l’élongation est discontinue (synthèse de fragments d’Okazaki). La figure 6 illustre l’avancée de la réplication de droite vers la gauche. Sur le brin continu la synthèse se fait par une DNA Pol III, liée à DnaQ qui fournit la fonction editing (Le domaine C-terminal de DnaQ se lie à la DNApol III et le domaine N-terminal contient l’activité exonucléasique (editing function= Correction des paires de bases dépareillées). Le brin retardé est synthétisé en fragments d’ADN (Okazaki). qui sont liés ensemble par la ligase après avoir enlevé le brin d’ARN par la DNA Poly I. 8 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 6: élongation de la réplication La ligation : les amorces ARN sont enlevées et remplacée par de l’ADN synthétisée par l’ADN polymérase I. Une autre enzyme (la ligase) va relier les fragments d’Okazaki par une liaison phosphodiester. ADN polymérase I ADN polymérase I est formé d’un petit domaine central qui possède une activité exonucléasique orientée de 3'->5' qui constitue l'activité de correction d'épreuves (édition). C'est grâce à cette activité que l'enzyme effectue une réplication fidèle, avec un taux d'erreurs extrêmement faible. Le gros domaine C-terminal possède l'activité de polymérisation, orientée de 5'->3'. Une protéolyse ménagée par la subtilisine permet de détacher très spécifiquement le petit domaine N-terminal. Les deux autres domaines restent liés et constituent le "fragment de Klenow" dépourvu d'activité exo 5'->3' (les nombres rouges indiquent les positions des acides aminés). Le fragment de Klenow est très largement utilisé au laboratoire dans les expériences de réplication in vitro. 9 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure7 : ADN polymérase I et fragment de Klenow c) La terminaison de la réplication - La terminaison de la réplication se fait quand les deux fourches de réplication fusionnent au site (ter C) sous l’action de la DNA de terminaison de la réplication (fig 8) (Dnat). - La séparation des deux molécules filles d’ADN se fait grâce à l’action de la DNA gyrase (topoisomérase II) Figure 8: la terminaison de la réplication ( 3.4 Mécanismes d’action des topoisomérases 10 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Les topoisomérases catalysent la conversion interne des molécules d’ADN circulaires. Les molécules d’ADN peuvent être relâchées ou superenroulées, nouées ou dénouées, caténaire ou non, par l’action des topoisomérases. Deux types de topoisomérases classées en fonction du nombre de coupure faite sur l’ADN. Topo I : une cassure sur une des deux molécules. Topo II (gyrase) : cassures faites sur les deux molécules (figure 9). Figure 9: mécanismes d’action des topoisomérases ( 3 Les Plasmides naturels 3.1 Définition : un plasmide est un élément extra-chromosomique (Lederberg 1952) - Une bactérie peut contenir des plasmides naturellement (fig 10). - La taille d’un plasmide est entre 0,5 à 5 % du chromosome bactérien (5 à 4000 fois plus petit que le chromosome), Figure10 : plasmides naturels ( Différents états d’un plasmide 11 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - Un plasmide est généralement un élément génétique extrachromosomique capable d’une réplication autonome. - Le plasmide peut s’intégrer dans un chromosome bactérien, il est appelé épisome. 3.2 Classification des plasmides Les plasmides sont classés selon leurs propriétés de transfert, leur effet phénotypique ou d’incompatibilité…etc. 3.3 Propriétés de transfert a) Plasmides conjugatifs Les plasmides conjugatifs sont ceux qui permettent la conjugaison. Ces plasmides sont généralement grands et ont tous les gènes nécessaires pour la réplication autonome et pour le transfert d’ADN au receveur (ex : gènes du pilus sexuel) (voir chapitre IV) b) Plasmides non-conjugatifs Les plasmides non–conjugatifs sont ceux qui ne peuvent pas médier la conjugaison. Ils sont généralement plus petits que les plasmides conjugatifs et il leur manque un ou plusieurs gènes nécessaires pour le transfert d’ADN. Un plasmide non-conjugatif peut être transféré par conjugaison si la cellule porte aussi un plasmide conjugatif. 3.4. Effets phénotypiques a) Plasmide de fertilité (Facteur F) Le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert de fragments de chromosome bactérien par conjugaison (appariement de deux bactéries) (voir chapitre IV). b) Plasmides bactériocinogéniques Ces plasmides portent des gènes qui codent pour une substance qui tue les autres bactéries. Ces substances sont appelées bactériocines ou colicines. c) Plasmides de résistance (facteurs R) Ces plasmides portent des gènes de résistance aux antibiotiques et confèrent à la bactérie ces propriétés de résistance. Les gènes de résistance aux antibiotiques peuvent être organisés dans le plasmide au sein de transposons (Tn), (voir chapitre III). Les plasmides R sont des plasmides conjugatifs dans lesquels les gènes pour la réplication et le transfert sont localisés sur une partie du facteur R et les gènes de résistance sont localisés 12 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N sur une autre partie comme illustré dans la figure 11. RTF (Facteur de Résistance Transfert)porte les gènes de transfert. Figure11 : Structure d’un plasmide de résistance aux antibiotiques ( D’autres classifications de plasmides par classes d'incompatibilité (Inc) ont été établies. Deux plasmides s'excluant mutuellement, c'est-à-dire ne pouvant coexister dans la même bactérie, appartiennent au même groupe d'incompatibilité. d) Autres plasmides Certains plasmides sont responsables de la virulence (ex. : production de toxines), de la résistance aux antiseptiques, du métabolisme de certains composés (lactose, lysine, etc...), et de la dégradation de substances, par exemple le toluène, l'octane et l'acide salicylique résistance aux bactériophages. Les plasmides auxquels aucun trait phénotypique n’a encore été associé sont dits cryptiques. 3.5 Réplication des plasmides La synthèse d’ADN plasmidique se fait à partir de l’origine de réplication. Le mode de réplication est soit: a) Unidirectionnelle: Pt181 synthétise un brin d’ADN dans une direction à partir de l’origine, puis son brin complémentaire (fig 12a) b) Bidirectionnelle (fig 12b) R1 initie la synthèse d’un brin et juste après le second brin. pT181: Staphylococcus aureus R1: Salmonella paratyphi 13 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 12 : sens de réplication des plasmides ( 3.5.1. Structure de l’ADN au niveau de l’origine de réplication des plasmides • Deux exemples de structure d’ADN au niveau de l’origine (ori): L’origine contient une région riche en A-T et des sites de liaison de protéine d’initiation ou d’RNA. Le plasmide P1 code une protéine initiatrice réplicase A (RepA) qui se conjugue avec DnaA au niveau de l’ADN pour ouvrir la région A-T et commencé la réplication. Figure 13 : structure de l’origine de réplication 14 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 3.5.2. Mécanisme de réplication de plasmides naturels Le plasmide RSF 1010 : code toutes les protéines initiatrices (RepA, RepB et RepC) et n’utilise pas les protéines de l’hôte pour commencer sa réplication (fig 14). Figure14 : mécanisme de réplication du plasmide RSF1010 Le plasmide ColE1 : utilise une molécule d’ARN pour ouvrir et initier la synthèse d’ADN (fig 15). Figure 15 : mécanisme de réplication pColE1 3.6 Stratégie de répartition 15 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N La Répartition inégale d’un nombre élevé de copies au hasard dans les cellules filles sera résolue : - par la réplication (fig 16a) Figure16a : résolution par la réplication - Résolution de dimères : Certains plasmides à nombre de copies élevé contiennent un mécanisme pour résoudre les dimères de plasmide en monomères qui seront répartit indépendamment (fig 16b) Figure 17 : résolution des dimères de plasmides - Système de répartition utilisé pour les plasmides à nombre de copies faible : Chez le plasmide P1 la région « par » code pour deux protéines Par A et Par B. Le complexe ParA-ParB se lie en position cis, au niveau d’un site appelé site S ceci va diriger les deux molécules du plasmide au milieu de la cellule jusqu’à ce que les 16 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N cellules filles soient bien distinctes, ainsi les copies seront répartit équitablement (fig 18). Figure 18: stratégie de répartition de plasmides à faible nombre de copie 3.7 Plasmides incompatibles Deux plasmides sont dits incompatibles s’ils portent la même origine de réplication et dans ce cas la cellule fille finira par n’en gardé qu’un des deux (fig 19). Figure 19 : stratégie utilisé par la bactérie pour n’en garder qu’un des deux plasmides incompatibles NB Utilisation des plasmides Les chercheurs utilisent les plasmides naturels pour construire des plasmides artificiels appelés « vecteur » qui répondent aux besoins de la recherche. La science appelée « génie génétique » fabrique les plasmides artificiels et les utilise comme : 17 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - vecteur de clonage Qui consiste à intégrer dans la molécule d'un « plasmide construit » un fragment d'ADN provenant d'une autre source. On obtient un plasmide recombiné ou plasmide chimère. Principe : - pénétrer ces molécules recombinées dans des cellules d’Escherichia coli dépourvues de plasmide (transformation). - repérer les cellules qui ont reçu une molécule de plasmide grâce aux gènes du plasmide qui sont sélectionnables (résistance à une drogue). - reconnaître (ou sélectionner) celles qui portent un plasmide ayant intégré un fragment particulier de l'ADN étranger. L'ensemble des descendants d'une telle cellule constitue un clone. On dit que l'on a cloné un fragment d'ADN. - vecteur d'expression Une fois un fragment d'ADN cloné dans un plasmide on fait exprimer les gènes qu'il porte dans les cellules d'Escherichia coli. Cette expression nécessite la transcription de ce fragment et la traduction du messager. On peut ainsi faire fabriquer à Escherichia coli des protéines étrangères (par exemple, l'insuline humaine, l'hormone de croissance humaine). - vecteur pour la transformation de cellules eucaryotes introduire et faire exprimer de l'ADN dans des cellules eucaryotes (levure, cellules de Mammifères en culture…..). On peut ainsi après un clonage dans Escherichia coli réintroduire le gène cloné dans des cellules eucaryotes et le faire exprimer. 4. LES BACTERIOPHAGES (Phages°) - Un phage ou bactériophage est une particule (microbe) qui infecte une bactérie. - Le phage est composée essentiellement d’un matériel génétique (ADN ou ARN) protégé par une enveloppe appelé capside constituée de protéines. 4.1 Le phage lambda 18 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Le phage lambda (λ) infecte Ecoli. La tête du phage renferme l’ADN viral. La queue renferme des protéines. Elle permet la fixation du phage sur la cellule-hôte bactérienne (protéine J) (fig 20) Figure 20 : structure du phage λ • L’ADN du phage est un DNA double brin, linéaire, de longueur 48kb. Plusieurs dizaine de gènes. Extrémité simple brin de 12 nucléotides, complémentaires. Extrémités cohésives (bout collant) (fig 21) Figure 21 ADN du phage λ 4.2.1 Les cycles du phage λ Le phage se multiplie selon deux modes: - multiplication lytique 19 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - multiplication lysogénique. a) La multiplication lytique - Infection : liaison du phage à E.coli par la protéine J qui se lie à une porine à la membrane d’E.coli. - Adsorption et pénétration : injection de l’ADN phagique par diffusion passive à travers la membrane. L’ADN virale se circularise immédiatement par complémentarité des extrémités cohésives formant un site cos. Une ligase bactérienne scelle les brins (fig 22). Figure 22 : circularisation de l’ADN phagique λ - La multiplication du phage: expression des gènes codants divers protéines pour la réplication de l’ADN phagique, pour la synthèse des protéines de la tête et la queue. Formation d’un concatémère. Empaquetage d’une molécule d’ADN dans la tête puis assemblage tête et queue (figure 23). Figure 23: réplication de l’ADN phagique λ ( 20 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Empaquetage et Libération des phages : lyse bactérienne par action de deux protéines du phage (endolysine et holine), 200 phages sont produits par bactérie (fig 24). Figure 24: empaquetage (formation du phage λ) b) La multiplication lysogénique L’ADN viral s’intègre à l’ADN bactérien par recombinaison spécifique de site (figure 25), et sera répliqué en même temps que lui. Les gènes qui codent les protéines de la tête et de la queue ainsi que les gènes du cycle lytique sont réprimés par un répresseur codé par le gène viral Ci. Figure25 : intégration du phage λ dans le chromosome E.coli 4.2 Le bactériophage M13 Le bactériophage M13, un autre type de phage qui infecte E.coli Le phage M13 est Constitué d’un simple brin de DNA circulaire, de longueur 6.4kb appelé brin +. Il comprend 10 gènes et 2 petites régions « intergéniques ». 21 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Le DNA est recouvert de protéines donnant un phage en forme de batonnêt « filamenteux » (Figure 26 ). La transfection des bactéries par M13 et l’expression du phage dépendent de la présence d’un chromosome surnuméraire bactérien (épisome F’) : la présence de cet épisome permet le cycle normal du phage : synthèse d’un brin d’ADN complémentaire, réplication et en fin de cycle synthèse spécifique d’un seul des deux brins de l’ADN (brin +) qui sera pourvu d’une membrane et sécrété hors de la cellule. Lorsque l’épisome ne contient pas les gènes permettant ce cycle (épisome F’), l’ADN du phage s’incorpore sous la forme d’un ADN double brin capable d’exprimer les gènes qu’il contient Figure 26 la morphologie du phage M13 4.2.1Le cycle du phage M13 Le phage M13 a un cycle lytique et un cycle pseudo-lysogénique a) Le cycle lytique du phage M13 Le cycle du phage peut être divisé en trois étapes : - Entrée dans l’hôte: Le phage M13 entre dans la bactérie via le pilus F codé par un plasmide F (facteur de fertilité). 22 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - Multiplication: une fois dans le cytoplasme le brin+ est répliqué en une forme double brin dite « RF » (replicative form). Après 100 à 200 RF la synthèse de DNA devient asymétrique. Seul le brin+ est produit (figure 27). Figure 27: Conversion du brin+ en forme réplicative: synthèse d’ARN amorce-polymérisation par pol III du brin-.100 copies de DNA du M13RF sont produits par réplication de RF par le mécanisme du cercle roulant-les gènes de structure sont transcrits et traduits. - Expulsion : à travers la membrane cytoplasmique (sans produire de plage mais de petite dépression dans la couche de milieu solide) les phages M13 sont expulsés revêtu de protéines. Comme M13 n’est pas enfermé dans une tête (comme λ), il n’y a pas de stricte limite à la longueur de DNA expulsé (fig28). 23 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N • Figure 28 : M13 est éjecté de la bactérie sans la lyser: La protéine gpV est suffisamment produite elle bloque la synthèse du brin- et s’attache au brin+ et oriente le phage vers la membrane plasmique. Le complexe (gpVII-gpIX DNA) traverse la membrane. gpVIII remplace gpV. b) Le cycle pseudo-lysogénique Lorsque l’épisome ne contient pas les gènes permettant le cycle lytique (épisome F’), l’ADN du phage s’incorpore sous la forme d’un ADN double brin capable d’exprimer les gènes qu’il contient. Ainsi le phage M13 ne fait pas de cycle lysogénique classique (il est atypique) 24 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N TD Fiche 1(chapitre I) 1.1 Composition et Structure du matériel génétique Exercice 1 : Que représente la figure ci-dessous ? Donner un maximum d’information. Exercice 2 : Que peut représenter ce schéma, à condition de le compléter ? 25 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 1.2 Mode et mécanisme de réplication Exercice 3 : J. Cairns (1963) a prouvé que l’ADN d’E.coli est circulaire (fermé) et que le mode de réplication est semi conservatif en utilisant la thymidine tritiée. R. Rodriguez a utilisé la méthode de Cairns et observa que la réplication est bidirectionnelle. Il a placé les bactéries pendant un temps variable dans un milieu contenant de la thymidine tritiée à faible niveau de radioactivité puis à fort niveau de radioactivité. D’après vos connaissances actuelles, schématiser les chromosomes observés par les deux chercheurs. Exercice 4 :Expérience de Meselson et Stahl (1958) Des bactéries E.coli sont cultivées dans un milieu de culture contenant l’isotope lourd de l’azote (N15). Après un grand nombre de division tout l’ADN de ces cellules est marqué par l’isotope lourd. Les bactéries sont ensuite transférées dans un milieu normal à N 14. Des échantillons bactériens sont prélevés toutes les demi-heures. L’ADN des bactéries est extrait des cellules et dissout dans une solution de chlorure de césium (CsCl) puis introduit dans une centrifugeuse. Lorsque le CsCl est centrifugé à très haute vitesse (50000 rpm) pendant plusieurs heures, les ions césium et chlorure migrent vers le font du tube sous l’effet de la force centrifuge. Un gradient d’ions s’établit avec une concentration plus élevée dans le fond. Les molécules d’ADN sont également poussées vers le fond mais les repoussent vers le haut en raison de leur densité de flottaison. Le trajet de l’ADN s’arrête à l’endroit du gradient ou la force centrifuge compense exactement la densité de flottaison qui dépend elle-même de sa densité. L’isotope lourd augmente la densité de l’ADN. L’ADN normal peut être donc distingué aisément de l’ADN marqué N15 grâce aux positions qu’ils occupent dans le gradient de chlorure de césium. Les résultats expérimentaux sont schématisés dans la figure suivante. 26 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Analyser et interpréter les résultats, que pouvez-vous déduire ? G : Génération EXERCICE 5: reprenez le schéma sur votre cahier et compléter la légende que représenteil ? Exercice 6 La figure ci-dessous représente un mécanisme ayant lieu in vivo ou in vitro. De quel mécanisme s’agit-il ? Compléter la légende en citant les éléments indispensables intervenant dans ce mécanisme. 27 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 1.3 Plasmide et Phage Exercice 7 Certaines souches bactériennes ont développé une résistance à un antibiotique (gentamycine). Quel est le mécanisme classiquement évoqué pour expliquer cette résistance ? Un tel mécanisme est-il envisageable dans le cas ou la résistance est très rapidement acquise d’une part et d’autre part elle s’accompagne de résistance à trois autres types d’agent antibactériens (le chloramphénicol, l’ampicilline et la sulfamide) ? Exercice 8 Analyser les propriétés de certains plasmides résumés dans le tableau suivant. Que pouvezvous déduire ? plasmide Taille (mégadaltons) Intervient dans la Nombre de copies de conjugaison ou non plasmides /cellule Phénotypes R1 65 + 1-3 Résistance à de multiples drogues R6 65 + 1-3 Résistance à de multiples drogues Ent P 307 65 + 1-3 Production d’entérotoxines Col E 1 4.2 - 10-15 Production de colicine E1 RSF 1030 5.6 - 20-40 Résistance à l’ampicilline Clo DF 13 6 - 10 Production de cloacine Exercice 9 : la figure suivante représente différentes topologies du même plasmide (a) (b). 1) Analysez les. Le plasmide surenroulé a été traité afin d’introduire des brèches simples-brins; 28 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N quel forme va t-il avoir ? 3) Si deux brèches se trouvent sur des brins opposées (à une distance de quelques bases l’une de l’autre, les liaisons hydrogènes ne suffiront plus à maintenir la molécule en cercle) , il aura quelle forme cette fois-ci ? c) représente une migration électrophorètique, sur gel d’agarose, de ces formes topologiques révélées par le bromure d’éthidium (BET) 4) Quel est le mode d’action du BET sur l’ADN? Sachant que les positions relatives des bandes dépendent de la concentration d’agarose dans le gel et de la concentration de bromure d’éthidium, 5) identifiez les trois formes du plasmide de la piste 3 (surenroulée, circulaire relâché et linéaire).6) Quelle serai votre déduction concernant les bandes des pistes 1 er 2 ? Exercice 10 : reprenez le schéma suivant sur votre cahier, compléter la légende,. Chez quel organisme ou particule ce mécanisme peut avoir lieu ? 29 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Chapitre II : Mutation et Réparation de l’ADN 1 la Mutation a) Définition: La mutation est une altération (modification) de la séquence d’ADN d’un organisme. b) Causes principales : - les mutations spontanées : erreurs accidentelles, non réparées, au cours de la réplication de l'ADN, tautomérisation...etc. Les mutations spontanées sont très rares, le taux de mutation est de 1 pour 1010 bases incorporées, chez les bactéries. - les mutations induites : effet d'agents mutagènes. Le taux de mutation augmente lorsque les cellules sont exposées à des agents mutagènes chimiques ou physiques. c) Type de mutation Parmi les mutations alléliques (mutation ponctuelle) qui créent un allèle mutant d'un gène en modifiant un ou quelques nucléotides : a) Le changement d’une base par une autre base est une mutation par substitution: - si une base purique est remplacée par une autre base purique ou une pyrimidine par une pyrimidine: c’est une mutation par substitution par transition. - Si une purine remplace une pyrimidine ou l’inverse, c’est une mutation par substitution par transversion. b) Les délétions/insertion : perte d’une base (délétion) ou gain d’une base (insertion), ce type de mutation provoque un décalage dans le cadre de lecture. 1.1 Les mutations spontanées Les causes des mutations spontanées sont multiples : - Mésappariements au cours de la réplication - Tautomérisation des bases : amino / imino et aldo / ceto - Désamination des bases : cytosine en uracile, adénine en hypoxanthine, guanine en xanthine et 5Me-cytosine en thymine ; 30 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - Perte de bases par dépurination et dépyrimidination : a lieu surtout à pH acide. - Oxydation par des radicaux libres : les radicaux hydroxyl OH et peroxyde H2O2sont libérés normalement au cours du métabolisme et attaquent les bases de l’ADN. 1.2 Mutations induites (environnementaux/agents mutagènes) Les agents environnementaux mutagènes induisant une mutation sont : a) Agents physiques - Radiations ionisantes Rayons X ou gamma provoquent des altérations des bases et conduisent à des cassures de brin. - Radiation non ionisante UV, aux longueurs d’onde proches du max d’absorption de l’ADN (260-280nm), provoquent la formation de dimère de thymine (effet germicide). Ceci provoque une torsion anormale. - La chaleur dans l’environnement est un agent significativement mutagène. Son effet sur les molécules d’ADN : provoque des sites apuriques et conduit après réplication à des mutations ponctuelles ou des délétions. b) Agents chimiques - agents alkylants tel que la méthylnitrosoguanidine qui ajoute des groupes méthyle à la guanine laquelle se mésapparie à la thymine - Agents intercalants comme la proflavine, bromure d’éthidium (BET) qui causent des décalages du cadre de lecture. - L’acide nitreux (NO2 H) est un puissant mutagène (bactérie et phage), provoque la désamination de l’adénine qui se transforme en hypoxanthine laquelle s’unit à la cytosine; provoque également la désamination de la cytosine en uracile laquelle s’unit avec l’adénine; provoque des transitions reverses (fig 29). 31 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure29: mode d’action mutagène de l’acide nitreux (Prévost 1976) - l’hydroxylamine (NH2OH) est un mutagène puissant de certains bactériophages. Son action altère la cytosine en hydroxylaminocytosine (hydroxyle l’azote en C4 de la cytosine), cette dernière s’apparie avec l’adénine. N’induit pas de transition dans le sens inverse. Figure 30: mode d’action mutagène de l’hydroxylamine (Prévost 1976) - Les analogues de bases tel que le 5- bromouracile est un analogue de la thymine il est mutagène chez les bactéries et les bactériophages. Une tautomérisation transforme la forme céto en forme énol qui s’apparie alors à la guanine (au lieu de l’adénine) introduisant une mutation à l’étape suivante de la réplication. exemple : apparition des 32 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N mutations chez des bactériophages qui se développent dans des bactéries cultivées en présence de 5-BU Figure 31: mode d’action mutagène du 5BU (Prévost 1976) 1.3 Conséquences au niveau de la protéine Les conséquences au niveau de la protéine sont: - Mutation synonyme (silencieuse): le codon muté code pour le même acide aminé (aa) que le codon sauvage. La protéine est normale/Fonction normale - Mutation faux sens conservative : le codon spécifie un aa fonctionnellement équivalent (Arg (AAA), lysine (AGA) - Mutation faux sens non conservative : le codon muté code pour un aa différent (chimiquement): protéine anormale/ perte de fonction - Mutation sur le codon stop: si c’est au début de la chaine (protéine tronchée: perte de fonction), si c’est vers la fin (protéine plus longue) 33 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - Mutations avec changement dans le cadre de lecture (frameshift), protéine complètement différente 2 Réparation de l’ADN Les mécanismes de réparation des lésions (altérations, modifications) sont multiples chez les procaryotes. Plus de vingt gènes ont été identifiés chez E. coli dont les produits interviennent dans divers processus de réparation. 2.1 Réparation des mésappariements (mismatch) chez E. Coli Une incision (=endonucléase) + exonucléase) + resynthèse Principe (figure32) Les enzymes de réparation (MutL et mutS) reconnaissent le brin nouvellement synthétisé du fait qu’il n’est pas encore méthylé (le brin parental est méthylé) et activent mutH Une incision (action endonucléase par mutH ) à proximité du nucléotide (nt) mal apparié est faite en face d’un site méthyle du brin parental, ensuite se produit une action exonucléase ( helicase + exonuclease) dégradent l’ADN) depuis le site de coupure jusqu’au mésappariement inclus. Cette exonucléase est bidirectionnelle (elle agit de 5’ vers 3’ et de 3’ vers 5’. La DNA polymérase III synthétise l’extension de 5’ vers3’. Une ligase terminera le travail. 34 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 32 : Réparation des mésappariements (mismatch) chez E. Coli ((J. Etienne 1998) 2.2 Correction d’un mésappariement produit au cours de l’activité cellulaire : correction d’une base anormale • Des produits oxydants ou des mutagènes peuvent entrainer la désamination d’une base. Des enzymes vont cibler la réparation au niveau d’une seule base. Exemple : Cytosine méthylée va donner par désamination oxydative une thymine. La paire de base C/G devient T/G. ce mésappariement peut être corrigé par le mécanisme suivant. : • Principe - Une glycosidase élimine le résidu T mal apparié, - une endonucléase reconnait le site abasique (apyrimidique) et coupe la liaison phosphodiester adjacente, - une DNA polymérase resynthétise sur une longueur de quelques nt. - Une ligase va sceller. 2.3 Correction des dimères de thymine par excision-resynthèse 35 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N • Excinucléase (=2 incisions endonucléasiques) + resynthèse • Les UV peuvent produire des dimères pyrimidiques, des enzymes de réparation enlèvent la zone défectueuse. • Principe : – Reconnaissance de la distorsion – Séparation des 2brins par une hélicase – Coupure par une excinucléase à quelques nt de chaque côté de la lésion, le segment endommagé est enlevé – Resynthèse par la DNA polymérase et soudure par une ligase Figure 33 : Correction des dimères de thymine par excision-resynthèse (J. Etienne 1998) 2.4 Le système SOS Dans les années 1970 Radman a appelé ce système SOS car il intervient lorsque le système précédent est débordé. Ce mécanisme fait appel à une protéine de recombinaison appelé protéine Rec A. Principe: 36 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N La DNA polymérase sautera la lésion, ce qui va produire une lacune (1) post-réplicative : • Le brin parental contient un dimère de thymine (1) • Le brin fils contient une lacune (1). • La protéine Rec A va permettre un échange entre deux segments homologues de DNA (le 2ème brin parental intact (2) et le brin fils qui contient la lacune (1). • D’autres enzymes d’excision-resynthèse qui sur un brin élimineront le dimère de thymine, et sur le brin complémentaire la brèche (3). • Finalement les ligases souderont les fragments de DNA à lier (4) Figure 34 : Le système SOS (J. Etienne 1998) 37 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N TD FICHE 2 2.1 MUTATION Exercice 1 L ’acide nitreux est un puissant mutagène (bactérie et phage), provoque la désamination de l’adénine qui se transforme en hypoxanthine laquelle s’unit à la cytosine; provoque également la désamination de la cytosine en uracile laquelle s’unit avec l’adénine; provoque des transitions reverses. Exo2 Les analogues de bases tel que le 5- bromouracile est un analogue de la thymine il est mutagène chez les bactéries et les bactériophages. Une tautomérisation transforme la forme céto en forme énol qui s’apparie alors à la guanine (au lieu de l’adénine) introduisant une mutation à l’étape suivante de la réplication. exemple : apparition des mutations chez des bactériophages qui se développent dans des bactéries cultivées en présence de 5-BU 38 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 2.2 REPARATION Exercice 3. Chez E. coli, la fréquence d’erreurs commises lors de la réplication est de 1 pour 109 nucléotides. Sachant que le chromosome de E. coli est composé de 4,5 106 paires de bases, combien de nucléotides seront mal appariés pour 10 4 cellules effectuant une division? Quelle propriété de la polymérase permet d’expliquer la haute-fidélité de la réplication? Exercice 4. La réparation de l’ADN a lieu de préférence sur le brin néosynthétisé en utilisant le brin parental comme matrice. Quel est le sens de cette spécificité de correction ? Quelle serait la conséquence pour la cellule si le système de réparation ne tenait pas compte de cette spécificité ? Exercice 5. Les dommages sur l’ADN interfèrent fortement avec la réplication de l’ADN. Les rayons UV forment des dimères de thymine sur le même brin d’ADN. Quelles conséquences produisent ces lésions si elles ne sont pas réparées, sur la progression de la fourche de réplication ? Quel mécanisme permet à la cellule de ne pas compromettre définitivement la réplication ? 39 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Chapitre III- Recombinaison génétique et éléments génétiques mobiles 1- Définition : Les recombinaisons génétiques sont des réarrangements ou échanges de séquences entre molécules d’ADN. 2- Les mécanismes de recombinaison Les mécanismes de recombinaison impliquent une série d’enzymes permettant des cassures au niveau des liaisons phosphodiesters suivi soit d’un échange entre deux séquences homologues ou alors une intégration d’une séquence étrangère. 3- Les différentes classes de recombinaison: • Recombinaison homologue • Recombinaison spécifique de site • Recombinaison transpositionnelle Ces recombinaisons participent à modifier ou diversifier (acquisition, délétion) le pool de gènes et/ou le niveau de leur expression au niveau des génomes de tous les organismes. 3.1 Recombinaison homologue • La recombinaison homologue (modèle de Hollyday) est un échange de séquences d’ADN entre molécules d’ADN contenant des séquences identiques ou presque identique (fig1); les séquences sont dites homologues. les enzymes impliquées sont les recombinases (RecA, RecB, RecC, ruvA). Figure 35 : mode d’action des recombinases dans le model de Hollyday ( (C.Merlin, A. Toussaint 1999) 3.2Recombinaison spécifique de site (RSS) Pour cette voie de recombinaison (RSS), le premier processus connu est l’intégration du bactériophage lambda dans le chromosome d’E. coli (fig36). L’intégrase, de la famille des recombinases, codée par le phage, va reconnaître et synapser deux sites de recombinaison, attB (sur le génome de l’hôte) et attP (sur le génome du phage). Après recombinaison, le 40 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N génome viral sera intégré dans le génome de l’hôte encadré par deux sites recombinants attL et attR, qui seront reconnus et recombinés lors de l’excision. Figure 36 : RSS du bactériophage λ (C.Merlin, A. Toussaint 1999) - Rôles biologiques de la RSS Ce mode de recombinaison permet une adaptation rapide au milieu environnant. on peut citer • Les cycles d’intégration/excision des bactériophages tempérés ou plasmides intégratifs. • La résolution des dimères de réplicons, chromosomes, plasmides ou virus, permettant une ségrégation correcte dans les cellules filles.. • L’assemblage de gènes, composant les ilots de pathogénicité. • Le contrôle de l’expression génique, permettant d’adapter la spécificité d’hôtes dans le cas de certains bactériophages. 3.3Eléments génétiques mobiles : transposons / applications 41 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Un élément génétique mobile (séquence d’ADN double brin) est capable d’être transféré d’un site donneur vers un site cible sous l’effet d’une enzyme de recombinaison spécialisée, appelée la transposase. Parmi ces éléments sont identifiés : les IS (insertion sequence), les transposons et les phages mutateurs. a) Séquences d’insertion (IS) - Les IS sont les éléments transposables les plus simples (figure 37). - Elles ne contiennent que les informations génétiques nécessaires à leur transposition. - de petite taille (généralement inférieure à 2 500 pb), - elles sont bordées par des séquences IR (inversement répétées) de 20 à 40 pb qui sont reconnues par la machinerie de transposition. - détectées sur tous les chromosomes procaryotes, sur de nombreux plasmides et bactériophage - 18 familles d’IS sont répertoriées Figure 37: Structure des éléments transposables. Séquences IS. Les triangles noirs représentent les séquences terminales en répétition inverse (IR). Les IS existent sous une forme simple portant uniquement le gène de la transposase (tnpA), ou sous une forme contenant un cadre de lecture qui code pour tnpA et pour inh, version tronquée de tnpA agissant comme inhibiteur de la transposition. Dans la famille IS3, la transposase (OrfAB) résulte d’un déphasage programmé de la traduction entre deux cadres ouverts de lecture qui codent pour une protéine régulatrice de la transposition (OrfA) et une protéine de fonction inconnue (OrfB) C.Merlin, A. Toussaint 1999) b) Transposons composites Les Transposons composites sont des structures contenant deux IS et mobilisent le segment d’ADN qu’elles encadrent (fig38). Les IS peuvent être en orientation directe ou inverse. Très souvent, seule l’une des deux IS du transposon code pour une transposase 42 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N fonctionnelle, l’autre code souvent pour un régulateur de la transposition. C’est le cas chez Tn5 et Tn10. Le segment d’ADN encadré par les IS code pour n’importe quelle fonction, le plus souvent il s’agit de gènes de résistance aux antibiotiques (Kanamycine chez Tn5, tétracycline chez Tn10 ou chloramphénicol Tn9 ou de gène catabolique Tn3411….) Figure38 : Transposon composite: La séquence interne (notée XX) des transposons composites, contenant des gènes de résistance aux antibiotiques ou aux métaux lourds, ou des gènes cataboliques, est localisée entre deux IS C.Merlin, A. Toussaint 1999) c) Transposons non composites Les transposons non composites se caractérisent par l’absence d’IS à leurs extrémités (fig39). La plupart d’entre eux sont apparentés par leur transposase et par leurs séquences terminales de 35 à 48 pb, répétées en orientation inverse et reconnues par la transposase. Ces transposons ont des tailles variables (jusqu’à 70 kb dans le cas de Tn4651). Ils contiennent des informations génétiques essentielles à la transposition et des informations « auxiliaires » qui peuvent être des gènes cataboliques (Tn4651) ou des gènes de résistance aux antibiotiques (Tn3, Tn1721). Figure 39 : transposon non composite : tnpA et tnpR codent respectivement pour la transposase et la résolvase. Les boîtes rouges indiquent le site d’action de la résolvase (res) et les triangles aux extrémités, les IR, sites d’action de la transposase. On distingue deux types de structure selon la position relative de tnpA et tnpR C.Merlin, A. Toussaint 1999) d) Transposons Conjugatifs Les transposons conjugatifs (TnC) sont des éléments chimériques qui cumulent les propriétés d’intégration des bactériophages et les propriétés de transfert des plasmides conjugatifs. Ils existent sous deux formes : linéaire intégrée au génome de l’hôte, et circulaire libre, qui est 43 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N vraisemblablement la forme conjugative. Tous les TnC portent un gène int, généralement localisé à l’une des extrémités de l’élément, il code pour une intégrase qui catalyse l’excision et l’intégration de la forme circulaire du transposon. 3.4 -Bactériophages transposables : phage Mu Mu (pour « mutateur ») est le plus connu d’un petit groupe de phages tempérés transposables aussi appelés phages mutateurs en raison des mutations créées lorsqu’ils s’intègrent au hasard dans le génome de la bactérie hôte. Intégré, Mu peut persister sous forme de prophage latent. Son intégration est une transposition, dans laquelle sont impliquées les deux extrémités attLet attR, et deux gènes codant respectivement pour une transposase (pA) et une protéine activatrice de la transposition (pB). 3.5.Application • Les transposons constituent un patrimoine commun dans lequel puisent les bactéries en fonction de leur nécessité d’adaptation ou de pression de sélection • Ils sont utilisés par les bactéries pour moduler l’expression de leurs gènes • Ils sont utilisés par les chercheurs en mutagénèse in vitro 44 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N CHAPITRE IV Echanges génétiques entre bactéries. Cartographie, analyse et constructions génétiques 4.1 Phénotype / génotype des bactéries Les bactéries peuvent synthétiser des substances telles que les acides aminés, les vitamines ; elles sont dites prototrophes (autotrophes). Lorsqu’elles sont incapables de les synthétiser ; elles sont dites auxotrophes pour ces substances. Elles sont capables d’utiliser un sucre (lac+) ou non (lac-). Elles peuvent être résistantes (stpR) ou sensibles (stpS) à un antibiotique ou un phage (T1R ou T1S). Tous ces caractères physiologiques sont le résultat d’un patrimoine génétique des bactéries. Chaque caractère est le résultat de l’effet d’au moins un gène. Chez les bactéries le phénotype est le reflet exact du génotype. Exemple : une souche d’E. coli Son phénotype : prototrophe pour la méthionine, auxotrophe pour la biotine, incapable de fermenter le lactose, sensible à la streptomycine et résistante au phage T1 Son génotype s’écrit : met+ bio- lac-stpS T1R Dans les chapitres précédents, nous avons parlé de plasmide, de phage (en plus des mutations), d’éléments transposables et de transposon. La variabilité génétique observée chez les procaryotes est la conséquence d’échanges entre les génomes des procaryotes à travers différents éléments (plasmide, IS…) ou particule (phage). Cette diversité génétique est un moyen d’adaptation aux différents milieux de stress des procaryotes (bactéries) 4.2 Echanges génétiques entre bactéries Les échanges génétiques entre bactéries se font par transfert de matériel génétique à travers 3 différents mécanismes (phénomène parasexuel). Les mécanismes de parasexualité se caractérisent tous par une 1ère étape : transfert de gène d’une cellule donatrice vers une cellule réceptrice, 2ème étape : intégration du fragment d’ADN (ADN exogénote) dans le chromosome de la bactérie réceptrice (ADN endogénote). Ils se distinguent par les modalités de transfert de l’ADN depuis la donatrice vers la réceptrice, ces modalités sont : • - Transformation, • - Transduction • - Conjugaison 4.2.1 La transformation bactérienne 45 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N La transformation bactérienne est un mécanisme de transfert de matériel génétique d’une bactérie donatrice vers une réceptrice (fig 40) Le mécanisme est divisé en deux étapes 1- la pénétration : est un processus actif, la cellule réceptrice doit être dans un état physiologique particulier appelé « compétence » dans cet état la bactérie porte à sa surface une protéine appelé facteur de compétence. Cette protéine est impliquée dans l’attachement de l’ADN exogénote à la surface cellulaire. Un seul des deux brins de cet ADN pénètre à l’intérieur de la cellule, l’autre brin est dégradé au cour de ce processus. La taille de la portion représente en moyenne 1% de la taille du génome total. 2- L’intégration : débute par la reconnaissance entre la séquence d’ADN exogénote et la séquence homologue de la cellule réceptrice. L’appariement des deux brins se fait par les liaisons H. le brin endogène de même polarité est dégradé. Le rétablissement entre les deux brins se fait et on a la formation d’un segment d’ADN double brin hétéroduplex. Ces deux brins hétéroduplex peuvent être différents par un caractère, dans ce cas après un cycle de réplication un des deux chromosomes fils sera recombiné, il aura acquis l‘information apportée par l’exogénote. La transformation est une technique de base du génie génétique, utilisée quotidiennement dans les laboratoires lors de clonage. 46 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 40 : étapes de la transformation bactérienne (Klug et al. 2006) 4.2.2 La transduction La transduction est un mécanisme de transfert de matériel génétique d’une donatrice vers une réceptrice par l’intermédiaire d’un bactériophage (fig 41). Le transfert est divisé en étapes suivantes 1- une portion de l’ADN de la bactérie donatrice est encapsidée par erreur à la place d’une portion d’ADN du phage dans l’enveloppe phagique. Le phage chimérique ainsi constitué est libéré après la lyse de la donatrice 2- le phage chimérique va s’adsorber sur la réceptrice dans laquelle il fait pénétré son ADN 3- L’ADN étranger va se placer (exogénote) en face de la région homologue dans la bactérie hôte réceptrice et des recombinaisons peuvent s’effectuer (crossing over). Une portion d’ADN récepteur est remplacée par une portion équivalente d’ADN donateur. Cette portion d’ADN a en moyenne une taille entre1 à 2% de celle du chromonème. 47 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 41 : étapes du mécanisme de la transduction (Klug et al. 2006) 4.2.3Utilisation de la transformation et de la transduction pour la localisation des gènes (cartographie) La transformation et la transduction sont utilisées par les chercheurs pour tracer la carte génétique chez les bactéries. Principe général Soit une réceptrice de génotype : ab et la donatrice AB Après transduction ou transformation, on sélectionne les bactéries réceptrice sur des milieux adéquats, permettant d’isoler les réceptrices devenues A, ou B ou alors AB. On calcule les proportions de : Ab, aB et AB, ce sont 3 génotypes de 3 souches recombinées. Résultat attendu : si on a que des Ab, cela signifie que A et B sont assez éloignés. Ils ne sont jamais emportés dans le même fragment car la distance qui les sépare dépasse 1 à 2% de la taille du chromonème. Si on a isolé des souches AB on déduit que A et B sont à une distance plus petite que la taille de l’ADN transduit ou transferé : plus la proportion de AB est élevée plus les deux gènes sont proches. Cette méthode a permis d’établir des cartes très précises de nombreuses espèces bactériennes. 48 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 4.2.4 La conjugaison bactérienne La conjugaison bactérienne est un mécanisme de transfert de matériel génétique d’une donatrice à une réceptrice qui, nécessite un contact physique entre les bactéries. Ce contact physique ne peut avoir lieu que lorsque deux souches de signes contraires sont dans un même milieu de culture. La donatrice est de phénotype particulier (F+) et la réceptrice est toujours (F-). a) conjugaison (F+ x F-) Les F+ se caractérisent par une pilosité de leur surface cellulaire (pili) creux, long et souples), présence du facteur F (plasmide) Ces pili reconnaissent la surface des bactéries Fqui en sont dépourvus. Les étapes du transfert sont : 1- l’extrémité du pilus fusionne avec la membrane de la bactérie réceptrice F-, un canal est ainsi formé 2- un transfert d’ADN va se faire à travers ce canal depuis les F+ vers les F-. Figure 42 : mécanisme de conjugaison F+ x F- (Klug et al. 2006) 49 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Pendant la conjugaison, le facteur F se réplique de façon autonome et une copie est transférée à la bactérie réceptrice, qui devient-elle même une F+. b) conjugaison (Hfr x F-) Le facteur F peut s’intégrer au chromonème et devient partie intégrante de ce dernier (épisome). Ces souches sont appelées Hfr (haute fréquence de recombinaison). Ces bactéries peuvent conjuguer avec les F- Figure 43 : étape de conjugaison entre HFR et F- (Klug et al 2006) b.1Etapes de transfert 1- Le transfert débute au niveau du facteur F et s’effectue de telle manière que c’est toujours la même portion qui pénètre en premier dans la réceptrice. Il est interrompu avant que le chromosome entier ne soit transmis à la réceptrice. Plus un gène est proche du facteur F, inséré du côté ou s’effectue le transfert, plus il aura de chance d’être transféré à la réceptrice 50 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 2- une partie de l’exogénote est intégré dans le chromosome de la réceptrice, le reste est dégradé. b.2 établissement de la carte chromosomique d’E coli. Les conjugaisons permettent de dresser des cartes chromosomiques sur les critères suivants : 1- les gènes sont ordonnés par rapport à l’origine de transfert 2- l’unité de carte est la minute 3- la durée de transfert du chromosome entier à 37°C est d’environ 90mn 4- en 1mn il y’a transfert de 4.104 à 5.105 pb soit 30 à 50 gènes. b.3 transfert polarisé : conjugaison interrompue Le principe de la conjugaison interrompue est le suivant - on mélange dans un milieu de conjugaison les Hfr et les F- (1/20) et en incube à 37°C - à intervalle de temps régulier (toutes les 10mn), on prélève un échantillon de ce mélange et on agite le tube pour interrompre les pont de conjugaison. - On étale plusieurs boite contenant un milieu sélectif gélosé de cette échantillon. On incube - Dénombre les colonises F- recombinés (pour 1 ou 2 ou 3 gènes) dans les différents milieux. Ce milieu contient un facteur appelé contre sélectif antibiotique ou un phage) qui permet d’éliminer les parent Hfr. Le parent F- est automatiquement éliminé. Application Hfr :thr+bio+trp+StpS F-: thr-bio-trp-StpR Après une conjugaison interrompue, le pourcentage de bactérie F- recombinés sont : 10mn 43% thr+, 23mn 30%bio+, et 30mn 15% trp+. Avec ces données, on peut tracer la carte chromosomique de Hfr pour ces trois gènes 4.3 Restriction Modification Le mécanisme de restriction consiste en la dégradation d’une molécule d’ADN par une endonucléase de restriction. L’enzyme est capable de dégrader de façon spécifique tout ADN. La protection de l’ADN de l’hôte contre ses propres enzymes de restriction est réalisée par une modification, qui consiste en une méthylation de certaines bases parmi celles qui interviennent dans les séquences de reconnaissance de l’enzyme de restriction elle-même. 51 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N CHAPITRE V Expression et régulation de l’information génétique chez les bactéries et bactériophages 5.1. La transcription chez les procaryotes: 1 Définition : La transcription est un processus biologique qui consiste en la copie de région précise de l’ADN en molécule d’ARN appelés transcrits. Tous les ARN cellulaires sont synthétisés par transcription et il en existe deux types : - Les ARN messagers (ARNm) relaient l’information génétique codée par les gènes qui sera ensuite, lors du processus de traduction, convertie en protéines. - Les ARN non codants (ARNnc) regroupent des transcrits impliqués dans d’autres fonctions, telle que la traduction (ARNt, ARNr, ARNm) ou des fonctions de régulations (ARN interférent, ARN antisens). 2 L’ARN polymérase L’ARN polymérase est l’enzyme (fig 44) qui catalyse la synthèse de l’ARN dans le sens 5’3’, elle se fixe au niveau du promoteur, c’est le début de la transcription. - Chez E.coli l’ARN polymérase est composée de 5sous-unités. L’ensemble αIαIIββ’ζ forme l’holoenzyme. Figure 44 : Représentation schématique de l’ARN polymérase bactérienne sous forme holoenzyme.Chaque sous unité formant l’holoenzyme (). 52 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 3- Promoteurs bactériens Un promoteur est la région en amont d’une séquence codante indispensable pour initier, localiser et orienter sa transcription. Le promoteur est spécifiquement reconnu et lié par l’ARN polymérase. 3.1 Structure du promoteur Un promoteur se termine par le site (+1) d’initiation de transcription, qui correspond à la première base copiée (ou transcrite) en ARN. Il est situé en moyenne à 35 paires de bases (pb) en amont du codon d’initiation (ou codon START) du gène transcrit. En général le site (+1) correspond à A ou G, plus rarement un C ou un T. Les promoteurs reconnus par les facteurs ζ sont organisés en deux éléments fonctionnels majeurs initialement nommés « -35 » et « -10 » en raison de leur position par rapport au site (+1). La séquence type (ou séquence consensus) de ces éléments a été bien établie pour les promoteurs reconnus par le facteur ζ d’E. coli (2 sites de reconnaissance) : TTGACA pour l’élément -35, TATAAT pour l’élément -10, Les deux éléments sont espacés de 15 à 21 pb (généralement de 16 à 18 pb) fig 45. Figure 45: région promotrice et séquences consensus du promoteur 53 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 4 Déroulement de la transcription. La transcription se déroule en Trois étapes : initiation, élongation et terminaison a) Initiation: La sous-unité ζ de l’ARN polymérase reconnaît les sites promoteurs. L’ARN polymérase s’y fixe et forme un complexe fermé, à ce niveau les deux brins d’ADN vont être séparés et forment avec l’enzyme un complexe ouvert, un des deux brins va être transcrit (brin non codant), une fois l’amorce (primer) formée, constituée de quelques ribonucléotides, la sous-unité ζ se détache du complexe, le corenzyme (α2ββ’) continue la synthèse de l’ARN en cours (figure ). Figure 46 : Initiation de la transcription b) Elongation: Le noyau α2ββ’ de l’ARN Poly catalyse l’élongation dans le sens 5’ 3’. (Les deux brins de l’ADN s’écartent par rupture des liaisons hydrogène) se déplace sur le DNA. Au fur et à mesure, l’ARN synthétisé qui est apparié au brin de DNA de façon transitoire, se détache. Les liaisons hydrogènes entre les deux brins d’ADN se reforment derrière l’ARN polymérase. Les deux brins d’ADN reprennent leur forme hélicoïdale. 54 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 47: Elongation de la chaine d’ARN c) Fin de la transcription : Chez les procaryotes la zone de terminaison est riche en séquence AT. C’est une région plus lâche d’où l’ARN polymérase pourra facilement sortir. L’ARN transcrit va se terminer par une boucle en épingle à cheveux, qui est responsable de l’arrêt de la transcription. Figure 48 : Fin de la transcription chez les procaryotes 5. les produits de la transcription Les différents produits de la transcription sont les ARNr, les ARNt et les ARNm ainsi que de petites molécules d’ARN (ARNs). - les ARNr rentrent dans la structure des ribosomes. Le ribosome chez les procaryotes est de 70S entier est constitué de 50S pour la grande sous-unité et 30S pour la petite 55 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N sous-unité (fig 49). Chaque sous-unité est composée d’ARNr et de protéines Les ribosomes sont impliqués dans le mécanisme de la traduction. Figure 49 : Structure du ribosome d'E.coli - les ARNt ont une petite taille 4S (70 et 80n). Il existe à l’intérieur de ces molécules, des séquences complémentaires qui permettent de déduire leur configuration: Ils se replient sur eux même en formant ( fig 50)une structure secondaire caractéristique (forme de trèfle) ou tertiaire (L inversé). Les ARNt sont impliqués dans le mécanisme de la traduction. Un ARNt possède à l’extrémité 3’ un site d’attachement de l’acide aminé spécifique et un autre site (au niveau de la boucle médiane) de reconnaissance du codon (anticodon). Figure 50 : Structures secondaire (à gauche) et tertiaire (à droite) d'un ARNt - les ARNm: leur taille est hétérogène (8S à 30S). Lors de la biosynthèse des protéines, les ARNm sont comparés au modèle qui détermine la séquence d’acides aminés. 56 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - chez les procaryotes pratiquement pas de modification. La traduction commence avant même que la transcription de l’extrémité 3’ de l’ARNm. 5.2. La traduction chez les procaryotes : Initiation, élongation, terminaison 1 Définition : La traduction est le mécanisme par lequel le mRNA est décodé. C’est la 2eme étape de la synthèse des peptides. La traduction s’effectue dans le cytoplasme au niveau du ribosome. 2 Les différentes étapes de la traduction a) Initiation : près de l’extrémité 5’phosphate du mRNA (une à deux centaines de nucléotides de cette extrémité) se trouve un codon signal qui indique que la traduction doit débuter : c’est le codon initiateur presque toujours 5’AUG3’. Il code pour la méthionine formylée. Les deux sous unité du ribosome sont dissociées et libres dans le cytoplasme. La petite sous unité se fixe en un point situé juste en amont de l’AUG, à l’extrémité 5’ de l’ARNm. Elle se déplace en aval jusqu’à la rencontre du premier AUG. Figure 51 : les trois régions de l’ARNm procaryotes L’ARN messager procaryote est composé de trois régions (fig 51), dont deux ont une signification particulière : La séquence 5' non traduite comporte un signal de positionnement du ribosome en amont de la séquence à traduire. Ce signal (séquence de Shine et Dalgarno) consiste en une suite de nucléotides complémentaires de l'extrémité 3' de l'ARN ribosomique 16S (figures). La séquence à traduire (cadre ouvert de lecture) commence toujours par un codon initiateur AUG situé à courte distance de la séquence de Shine et Dalgarno, et se termine par l'un des 3 codons stop (UAA, UAG ou UGA) en phase avec le codon initiateur (figure ). 57 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N La séquence3’ non traduite après le codon stop. Chez les Procaryotes, la N-formyl-L-méthionine est le premier acide aminé systématiquement utilisé pour l'initiation de la traduction. Cet acide aminé modifié est chargé sur un tRNA spécifique pour donner un f-methionyltRNAfMet (Fig 52) qui se lie au codon initiateur AUG dans le complexe d'initiation 30S. Le groupement formyle sera retiré après traduction. Figure 52: structure de L-méthionine et N-formyl-L-méthionine La grande sous unité s’ajoute alors ; le ribosome est maintenant constitué, et fonctionnel (Fig 53 ). Les ribosomes sont constitués de deux sites pour lier les tRNA et un site d’exit (E) *le site A (site acide aminé) dans lequel viendra le tRNA porteur de l’acide aminé. *le site P (site peptidique) pour le tRNA porteur de la chaîne peptidique en cours d’élongation. Le tRNA qui transporte la méthionine initiale a une conformation qui lui permet d’être logé d’emblée ; exceptionnellement, dans le site peptidique. 58 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure : 53 début de la traduction Chacune des deux sous-unités renferme une moitié des 3 sites de l'activité du ribosome : le site de fixation de l'aminoacyl-tARN (A), le site de fixation du peptidyl-tARN (P) et un site réservé à l'évacuation (E = exit) du tARN déchargé de son acide aminé L'initiation de la traduction commence par la formation du complexe d'initiation 30S. La petite sous-unité 30S se fixe à l'ARN messager et positionne précisément sa moitié de site P sur le codon initiateur AUG, grâce à la complémentarité entre la séquence de Shine et Dalgarno (SD) en 5' du messager et l'extrémité 3' de l’ARNr 16S. Le fMéthionyl-tARNfMet initiateur peut alors se placer sur le complexe. L'association de la grosse sous-unité 50S forme le complexe d'initiation 70S. b-Elongation A La formation de la première liaison peptidique commence l’étape dite d’élongation. Pour chaque acide aminé (aa) à accrocher et donc pour chaque liaison peptidique à fabriquer, un même cycle est à chaque fois décrit (Figure 54). 59 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Première étape : accrochage d’un nouvel aminoacyl-tRNA dans le ribosome : le deuxième tRNA vient avec l’aa n2 dans le site A de la grande sous –unité. Le choix de ce 2eme aa est déterminé par le codon n2 sur le mRNA ; qui détermine donc le choix du 2eme anticodon. Deuxième étape : formation de la liaison peptidique : il y’a rupture de la liaison entre la méthionine et son tRNA (par une enzyme dite ARNtdéacylase) (le tRNA est éjecté) puis se forme la liaison peptidique entre le COOH du 1eraa et le NH2 du 2ème aa porté par le tRNA (numéro 2). L’enzyme qui intervient dans cette liaison catalysé par un complexe peptidyl transférase. A ce stade il y’a formation d’un dipeptide porté par le tRNAn2 qui est logé dans le site A. le site peptidique est libéré. Troisième étape : translocation: le ribosome va avancer d’un cran sur l’ARNm dans la direction 5’ 3’ soit trois nucléotides (un codon). Un nouveau codon se trouve en face du site A. Le dipeptide est passé du site A au site P ; il a changé de loge : c’est la translocation. De nombreux cycle vont se succéder avec à chaque fois les trois étapes 60 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 54 : étapes d’élongation de la traduction c- La terminaison : la fin de la traduction se produit lorsque le ribosome trouve un codon stop : UAA, UAG ou UGA (figure). Ils ne codent aucun aa ; il n’existe aucun tRNA ayant un anticodont complémentaire à l’un de ces 3 codons. Il se produira une coupure entre le dernier tRNA et la chaîne peptidique. Les facteurs de libération font, que la peptidyl transférase transfert le polypeptide à une molécule d’eau plutôt qu’à un aa-ARNt supplémentaire (fig 55). 61 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 55: étapes de la terminaison de la traduction 62 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N TD FICHE 3 Exercice 1 Soit une culture d'E.coli, sensible à la streptomycine, dont la dilution 10 -7, étalée à raison de 0,1 ml sur un milieu gélosé en boîte de Pétri, donne après incubation, 10 colonies. 1) 0,1 ml de cette culture est étalé sur un milieu gélosé additionné d'un antibiotique, la streptomycine, à une dose supérieure à la CMI. Après incubation, la boîte de Pétri montre 4 colonies. Quel est le taux de mutation des résistants à la streptomycine 2) Quel est le phénotype des 4colonies La culture initiale est traitée par un agent mutagène, la nitrosoguanidine, puis étalée comme précédemment à raison de 0,1 ml sur le même milieu gélosé à la streptomycine (GN + Stp). Après incubation, la boîte de Pétri montre 40 colonies. 3) Calculez le taux de mutation (Tm2) des résistants. Comparez cette valeur à celle trouvée précédemment et conclure. Exercice 2 Six clones d'E.coli numérotés de 1 à 6, sont cultivés sur milieu minimum MM additionné de thréonine (Thr), leucine (Leu), Phénylalanine (Phe) et cystéine (Cys), puis repiqués par la technique du tampon de velours sur huit milieux minimum Mm diversement additionnés d'un ou de plusieurs de ces quatre acides aminés, comme indiqué sur la figure. Les clones qui poussent sur les boîtes de Pétri sont indiqués par leurs numéros. Indiquer les phénotypes de 6 clones. Exercice 3 63 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N On mélange une souche d'E.coliK12 Hfr portant les marqueurs (T+ L+ ): pouvoir de synthétiser la thréonine et la leucine, (T1s): sensible au phage T1, (Lac+):fermentant le lactose, (Gal +): fermentant le galactose, (Strs): streptomycine sensible et une souche F- portant les marqueurs ( T- L-), (T1r), (Lac-), (Gal-), et (Strr). On interrompt la conjugaison aux temps indiqués ci-contre et on étale pour chaque temps des échantillons sur des milieux qui permettent de cribler lesrecombinants. Les résultats sont: 10 mn : (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1r) 15 mn : (T+L+) (Gal-) (Lac-) ( Strr) (T1s) 20 mn : (T+L+) (Gal-) (Lac+) ( Strr) (T1s) 28 mn : (T+L+) (Gal+) (Lac+) ( Strr) (T1s) Déterminez l'ordre des gènes (T+L+) (Gal+) (Lac+) (T1s). Exercice 4 On réalise une expérience de transformation bactérienne avec une souche auxotrophe pour la Thymine et l’Arginine 1, et de l’ADN purifié à partir d’une souche auxotrophe pour l’Arginine 2. Des fractions diluées identiques sont étalées sur milieu minéral + glucose (milieu 1) et sur milieu minéral + glucose + Arginine (milieu 2). On observe 362 colonies sur le milieu 2 et 3 colonies sur le milieu 1. Calculer le % de recombinaison entre les deux marqueurs d’arginine. Exercice 5 Une souche bactérienne auxotrophe pour la lysine, est transduite par un lysat d’une souche auxotrophe pour l’Arginine. On étale une fraction diluée de cette culture sur un milieu minéral + glucose + Arginine (1) et une fraction identique sur milieu minéral + glucose. On obtient 195 colonies sur le milieu (1) et 10 colonies sur le milieu 2. Expliquer l’apparition des colonies sur le milieu 2- Calculer le pourcentage de bactéries recombinées. 64 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 5-3. Régulation de l’expression génétique chez les procaryotes 5.3.1. Au niveau transcriptionel 1. Rappels : Promoteurs bactériens Un promoteur est la région en amont d’une séquence codante indispensable pour initier, localiser et orienter sa transcription. Le promoteur est spécifiquement reconnu et lié par l’ARN polymérase. Un seul promoteur peut contrôler la transcription de plusieurs gènes (organisation en opéron, et réciproquement, plusieurs promoteurs peuvent contribuer à la transcription d’un seul gène. Un promoteur se termine par le site (+1) d’initiation de transcription, qui correspond à la première base copiée (ou transcrite) en ARN.. Il est situé en moyenne à 35 paires de bases (pb) en amont du codon d’initiation (ou codon START) du gène transcrit. En général le site (+1) correspond à A ou G, plus rarement un C ou un T. Les promoteurs reconnus par les facteurs ζ sont organisés en deux éléments fonctionnels (voir transcription) majeurs initialement nommés « -35 » et « -10 » en raison de leur position par rapport au site (+1). La séquence type (ou séquence consensus) de ces éléments a été bien établie pour les promoteurs reconnus par le facteur ζ d’E. coli : TTGACA pour l’élément -35, TATAAT pour l’élément -10, Les deux éléments sont espacés de 15 à 21 pb (généralement de 16 à 18 pb). 2. Notion de force du promoteur Règle principale Tous les promoteurs ne sont pas également compétents pour initier la transcription d’un gène. - un promoteur est d’autant plus efficace (ou fort) qu’il présente d’identité avec les séquences consensus. - La variation d’une base par rapport au consensus affecte d’autant l’efficacité du promoteur qu’elle est située à une position fortement conservée. -La transcription ne peut se faire que si le promoteur est libre de se fixer à l’ARNpol. 65 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - Le promoteur joue un rôle essentiel dans la régulation d’un gène ou d’un opéron, c’est une régulation en cis. 3. Rôle des facteurs sigma dans la régulation - le facteur ζ a une affinité sélective bien plus forte pour les promoteurs. Les bactéries contiennent un nombre variable de facteurs ζ, de 1 chez Mycoplasmagenitalium à 65 chez Streptomycescoelicolor. - La sous-unité sigma distingue les séquences spécifiques du promoteur et se fixe, à travers laquelle, l’ARNpol peut s’attacher (holoenzyme) à l’ADN pour sa transcription. - La sous unité sigma joue un rôle de régulation de l’expression de gène en positiontrans. Cas des promoteurs à ζ70 Les deux premières bases (« TA ») et le dernier « T » de l’élément -10 d’un promoteur à ζ70 sont particulièrement conservés et jouent un rôle crucial pendant l’initiation de la transcription ; la mutation de ces seules bases peut suffire à inactiver totalement un promoteur à ζ70. ont établi, pour chaque position des éléments -35 et -10, la hiérarchie des bases en fonction de la force du promoteur généré. Cependant, au-delà des éléments -35 et -10, d’autres régions contribuent à la force des promoteurs de ζ70 4. Disponibilité du promoteur (modèle de variation de phase chez les bactéries) Chez les bactéries une protéine peut exister sous deux formes antigéniques dont les gènes sont localisés sur des régions différentes du chromosome. Cependant une seule forme est synthétisée à la fois (soit l’une ou l’autre). Il arrive qu’une cellule bactérienne sur 10000 synthétise l’autre forme antigénique ainsi que toutes les cellules descendantes, on parle de variation de phase. Cette variation de phase dépend de la disponibilité du promoteur (réprimé ou activé) (formes antigénique de la flagéline chez salmonelle) 5. Régulation par les facteurs de transcription : régulation positive et négative - Le niveau d’activité des promoteurs est modifié par des facteurs de transcription (Plus de 300 gènes du chromosome d’E.coli codent des protéines) qui se fixent aux promoteurs. 66 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N -Les facteurs de transcription assurent la coordination de l’expression des gènes d’une même voie métabolique ou d’un système respiratoire. - Les FT interviennent sur l’initiation de la transcription d’un gène en se fixant sur un site opérateur qui en général est situé à proximité du promoteur ou le chevauche. Il y’a les FT positifs (activateurs) et les FT négatif (répresseurs) a)Facteurs de transcriptions positifs (activateurs) Les opérateurs de ces facteurs activateurs sont en amont de l’élément -35 du promoteur régulé. Les activateurs influencent positivement l’initiation de la transcription : - En favorisant le recrutement de l’ARN polymérase via des interactions avec sa sous unité ζ. - En favorisant le recrutement de l’ARN polymérase via des interactions avec la région du facteur activateur. - En modifiant l’architecture du promoteur régulé. b)Facteurs de transcriptions négatifs (répresseurs) D’autres FT agissent en réprimant l’expression des gènes : - La liaison de certains FT sur leur opérateur empêche par encombrement stérique la fixation de l’ARN polymérase sur le promoteur. ( exemple que la protéine LexA réprime, dans les conditions optimales de croissance, l’expression de gènes impliqués dans la réponse au stress oxydatif). - D’autres FT modifient la conformation de l’ADN lorsqu’ils sont liés à leur opérateur, de sorte à masquer le promoteur à l’ARN polymérase (exemple, des molécules du FT GalR liées à des opérateurs en aval du promoteur galP1 interagissent avec d’autres molécules de GalR liées à des opérateurs en amont : cette interaction entraine une courbure de l’ADN qui isole le promoteur dans une boucle, le rendant moins accessible aux ARN polymérase). - Un FT répresseur peut également empêcher l’activation d’un promoteur par un FT activateur 67 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N ( exemple, l’interaction du FT répresseur CytR avec le FT activateur CRP lié à un promoteur empêche le fonctionnement de ce dernier. 6.Modes d’action des différentes classes de répresseurs et d’activateurs a- Distinction entre contrôle positif et contrôle négatif Les gènes sous contrôle négatif sont exprimés, sauf s'ils sont inhibés sous l'effet d'un répresseur. À l'opposé, l'expression des gènes sous contrôle positif ne sera effective que sous l'effet d'un activateur. Au lieu de nuire à la transcription, la protéine activatrice sera essentielle à la transcription. La figure suivante schématise les différentes façons d'obtenir un contrôle positif ou négatif de la répression et de l'induction. - La régulation de l'expression d'un gène sous contrôle négatif passera par l'utilisation d'un répresseur à l'origine actif (induction) ou inactif (répression). Dans l'induction, le répresseur actif à l'origine, donc dans un état inhibant ou réprimant la transcription, sera rendu inactif sous l'effet d'un inducteur .On dira aussi que le gène est déréprimé. C'est le cas classique de l'opéron lactose. Une autre façon d'obtenir un contrôle de type négatif sera d'avoir un répresseur à l'origine inactif qui, sous l'effet d'un corépresseur, devient actif et réprime la transcription. C'est le mode de répression utilisé, par exemple, par l'opéron tryptophane. - La régulation de l'expression d'un gène sous contrôle positif passera par l'utilisation d'un activateurà l'origine inactif (induction) ou actif (répression). Dans l'induction, l'activateur inactif à l'origine, donc n'influençant pas encore la transcription sera rendu active suite à l'interaction avec l'inducteur. Sous l'effet de l'inducteur, il y’aura donc activation de la transcription. Dans le mode impliquant la répression, l'activateur à l'origine actif, donc activant la transcription, sera rendu inactif sous l'effet d'un corépresseur. Un contrôle de la régulation tant positif que négatif pourra donc être obtenu en utilisant les interactions appropriées entre soit le répresseur ou l'activateur (la protéine activatrice), et une petite molécule, soit un inducteur, soit un corépresseur. L'induction de la transcription pourra donc passer par un contrôle de type négatif, lorsqu'on aura un répresseur libre, ou par un contrôle de type positif, lorsqu'on aura un activateur (inactif au départ) lié à un inducteur. La répression de la transcription pourra passer par l'activation d'un répresseur par un corépresseur (contrôle négatif) ou par l'inactivation d'un activateur par une petite molécule corépresseur. 68 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Contrôle négatif contrôle positif Induction réprimé induit réprimé Induit Répression induit réprimé induit réprimé Figure 56 : Modes d’action des différentes classes de répresseurs et d’activateurs 6.1 Régulation négative inductible : opéron lactose Un opéron est une unité de régulation de la transcription, composée de deux classes de gènes différencié par leur fonction : les gènes structuraux et les gènes régulateurs. a) L’opéron lactose, L’opéron lactose se compose de : 69 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Trois gènes de structure indispensables à la dégradation du lactose: Le gène lacZ : il code la β –galactosidase.Elle hydrolyse la liaison β 1-4 osidique des β -galactosides. gène lacY. : code la lactose perméase (Cette protéine membranaire permet l’entrée du lactose dans la cellule. gène lacA : code la thiogalactosidetransacétylase Son rôle n’est pas bien connu. Elle acétyle les β -galactosides non métabolisables qui peuvent alors être éliminés hors de la cellule par diffusion à travers la membrane plasmique. Une région responsable de la régulation des gènes de structure Cette région régulatrice comprend le promoteur et l’opérateur (régulation cis). On trouve également en amont de l’opéron lactose, le gène régulateur (lacI) qui code une protéine régulatrice appelé le répresseur (régulation trans) Figure 57 : structure de l’opéron lactose b) Le métabolisme du lactose. Les enzymes nécessaires à l’utilisation du lactose ne sont synthétisées qu’en présence de ce substrat (le lactose). La lactose-perméase permet l'entrée dans la cellule du lactose et la β galactosidase hydrolyse le lactose en hexoses qui suivent d'autres voies métaboliques. 6.1.1 Régulation négative de la transcription. a) En absence de lactose : le répresseur (FTN) est sous sa forme active. Il se lie spécifiquement au niveau de l’opérateur en bloquant l’accès de l’ARN polymérase au site d’initiation de la transcription. Ainsi, il y a régulation négative de la transcription des gènes de l’opéron lactose. Les enzymes nécessaires au métabolisme du lactose ne sont pas synthétisées car inutiles en absence de lactose. L'expression de ce répresseur est constitutive, c'est à dire 70 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N qu'il est exprimé quel que soit les conditions de croissance de la bactérie. Par contre, son affinité pour l'opérateur sera modifiée en présence de lactose. Figure58 : régulation de l’expression de l’opéron lactose en absence de lactose b) Levée de l'inhibition de la transcription. En présence de lactose/absence de glucose : l’allolactose,(un isomère du lactose ou IPTG) se lie au répresseur pour l’inactiver. Cette liaison entraîne un changement conformationnel du répresseur qui perd alors son affinité pour l’opérateur. Le site opérateur étant libéré, l’ARN polymérase peut atteindre le site d’initiation de la transcription et synthétiser l’ARN polycistronique. La production des enzymes nécessaires au métabolisme du lactose est donc dépendante de la présence du substrat. Le substrat (le lactose) est un inducteur. Figure 59 : Expression de l’opéron lactose (présence de lactose/absence de glucose) 6.1.2 Les différents allèles des gènes de l’opéron lactose a) les allèles du gène de l’opérateur (O) 71 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N O+ : permet aux cistrons (gènes) qui lui sont adjacents de s’exprimer (régulation cis). Cet allèle est sensible au répresseur qui bloque la transcription. Oc : opérateur constitutif, il n’est pas sensible au répresseur et laisse transcrire de façon continue les cistrons adjacents. O0 : opérateur défectif, les cistrons adjacents ne sont jamais transcrits. b) les allèles de lacZ (Z) Z+ : code pour la β –galactosidase active. Z- : code pour une protéine Cz inactive. c) les allèles de lacY (Y) Y+: code pour la lactose perméase active. Y- ne code pour aucune protéine d) les allèles du gène régulateur lacI (I) I+ produit un répresseur diffusible, il bloque l’activation de O+ en absence du lactose I- ne produit pas de répresseur Is produit un super-répresseur qui n’est plus inactivé par le lactose 6.2 Régulation négative répressible : opéron tryptophane L’opéron trp code pour les enzymes requises pour la synthèse du tryptophane (trpAE). La synthèse d’ARNm de l’opéron est contrôlée par un répresseur et son corépresseur. Figure 60 : structure de l’opéron tryptophane Mécanisme de régulation - En l’absence du tryptophane, le répresseur reste inactif, l’ARN polymérase s’attache au niveau de l’opérateur et la transcription des gènes de structure (E, D, C, B, A) se fait afin d’assurer la synthèse du tryptophane. 72 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N - En présence du tryptophane dans le milieu de culture de la bactérie, le répresseur inactif devient actif en se liant au tryptophane (co-répresseur) le complexe se lie au niveau de l’opérateur et bloque l’ARNpolymérase, ainsi les gènes de structure ne seront pas transcrits (figure) Figure 61 : régulation de l’expression de l’opéron trp 6.3 Régulation positive par l’activateur CAP/AMPc, cas de l’opéron lactose Lorsque les bactéries disposent de glucose et de lactose; Tant que le glucose est présent la bactérie va le métaboliser préférentiellement, à ce moment-là l’opéron lactose est réprimé (répression catabolique). Lorsque le glucose diminue, un signal de carence alimentaire est déclenché sous forme d’une augmentation du taux de l’AMPc. 73 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 62 : régulation positive de l’opéron lactose Cette AMPc forme un complexe avec la protéine CAP (Catabolite ActivatorProtein). L’interaction du complexe CAP-AMPc va agir comme un inducteur et augmenter l’affinité de l’ARNpoly pour le promoteur de l’opéron. C’est une régulation positive qui permet d’augmenter d’un facteur 50 la transcription de l’opéron lactose. En présence de glucose, il n’ya pas de complexe CAP-AMPc, disponible et donc la transcription de l’opéron lactose est très faible. L’induction de l’opéron lactose nécessite deux conditions la (1) présence du lactose et(2) l’absence du glucose. La régulation de l’opéron lactose est sous le contrôle de deux protéines régulatrices:-le répresseur LacI : qui se fixe au niveau de l’opérateur lorsque le lactose est absent: c’est une régulation négative.- La protéine CAP qui sous forme d’un complexe avec l’AMPc se lie à l’ADN est permet d’augmenter l‘affinité de l’ARNpoly pour le promoteur : c’est une régulation positive 74 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 6.4 Régulation positive et négative : opéron arabinose Structure de l’opéron L’opéron arabinose est constitué de 3gènes de structures (B ,A , D) en amont un site de contrôle (O, I,P) et un gène de contrôle (C). Figure 63 : structure de l’opéron arabinose En présence d’arabinose, la protéine AraC (activateur) se lie à l’arabinose, et se lie au site araI et active la transcription de l’opéron arabinose. De plus, le système de répression catabolique CAP-AMPc s’ajoute à ce système de contrôle. En présence d’arabinose, le complexe CAP-AMPc et le complexe AraC-arabinose doivent se fixer à araI pour que l’ARN polymérase se fixe au promoteur et active la transcription. En absence d’arabinose, le protéine AraC adopte une conformation différente et réprime l’opéron arabinose en se fixant à la fois à araI et à un second site distant, araO, formant ainsi une boucle qui empêche la transcription. 75 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 64 : régulation de l’expression de l’opéron arabinose 6.5 Régulation par l’atténuation : opéron tryptophane - La transcription du triptophane (trp) est également contrôlée par l’atténuation, un processus qui aboutit à la transcription d’un petit ARNm traduit en un petit polypeptide Une petite séquence codante (leader RNAm) en avant de l’opéron trp contient deux codons pour le tryptophane de suite. La capacite du ribosome de lire ces codons régule un choix de tige et boucle (terminateur ou anti-terminateur) : - Lorsque la quantité de tryptophane dans la cellule est limitée, le ribosome arretea ces codons trp (formation de l’antiterminateur) la transcription ontinue - Quand le trp est abondant le ribosome traduit rapidement l’ARNm menant à la formation d’une structure tige-boucle empêchant l’ARNpol de continuer (formation du terminateur). 76 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 65 : séquence leader (domaine 1) Situation 1 : le tryptophane est absent (ou en quantité insuffisante): Dans le cas où il y’a carence en trp dans la cellule, le ribosome fait une pause au niveau des codons UGG et permet aux domaines 2 et 3 de s’apparier, donc formation d’un antiterminateur, l’ARN polymérase continue de transcrire. (figure) Situation 2 : le tryptophane est abondant Quand il y’a du trp dans la cellule, le ribosome traduit très vite la séquence leader (domaine 1) En plus il masque le domaine 2 avant que l’ARN poly ait transcrit la séquence du domine 3, ainsi il y’aura l’appariement 3-4 (qui fonctionne comme un signal de terminaison (terminateur) la transcription s’achève avant que l’ARN polymérase atteigne les gènes permettant la synthèse du tryptophane (figure) 77 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Figure 66: Figure 67 : régulation de la transcription de la séquence leader 6.6Régulation par antiterminaison de la transcription : bactériophage lambda 78 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Dans le cas du cycle lytique: a) Transcription primaire de l’ADN phagique commence Très tôt au cours de l’infection. Le produit du gène N est un facteur d’antiterminaison, qui en se fixant sur l’ARN polymérase bactérienne, permet la transcription des gènes très important pour le cycle lytique -O : codant pour une protéine phage, qui se fixe sur l’origine de réplication du génome du phage. - P : codant pour une protéine qui va interagir avec O, pour permettre sa fixation sur ORI, et inhiber certaines protéines bactériennes. - Q : est un facteur d’antiterminaison, il modifie l’ARN polymérase et initie la transcription au niveau du promoteur fortpR’ pour les protéines de lyse et structure du phage. D’autre part, l’accumulation du produit du gènecro sur l’opérateur du gène ci (protéine répresseur) (OR3), permet de bloquer sa transcription, et ainsi d’inhiber complètement l’entrée en phase lysogène. b) Transcription secondaire de l’ADN phagique: Une accumulation de la protéine Q, permet la transcription des gènes tardifs (protéines de structures de la tête, de la queue, etc…) La protéine N est donc un régulateur important dont l’activité est nécessaire pour la phase lytique du bactériophage lambda. La protéine CI est un répresseur dont l’activité est nécessaire pour la phase lysogène. Figure 68 : 79 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N 4.3.2. Régulation au niveau traductionnel Structure de l’ARNm est impliquée dans sa régulation pendant sa traduction :l’ARNmest structuré, il a structure IIaire (tige-boucle séparé par des régions SB et une structure IIIaire (repliement) plus il y’a de GC plus la structure est stable plus sa durée de vie est longue plus le ribosome aura du mal à le traduire. 1- Régulation au niveau de l’initiation L’ARN messager procaryote est composé de trois régions, dont deux ont une signification particulière : La séquence 5' non traduite comporte un signal de positionnement du ribosome en amont de la séquence à traduire. Ce signal (séquence de Shine et Dalgarno) consiste en une suite de nucléotides complémentaires de l'extrémité 3' de l'ARN ribosomique 16S. La séquence à traduire (cadre ouvert de lecture ORF) commence toujours par un codon initiateur AUG situé à courte distance de la séquence de Shine et Dalgarno (AGGA), et se termine par l'un des 3 codons stop (UAA, UAG ou UGA) en phase avec le codon initiateur (figure ). Le ribosome entre directement sur le site d’initiation et l’encrage se fait grâce à l’interaction SD-anti SD. 3 facteurs d’initiation interviennent pour permettre au deux sous unités du ribosome de se former ou non. 2- Différents mécanismes de la traduction Un ARNm peut être traduit de plusieurs façons a) Traduction de manière indépendante : les cistrons sont traduits à leur rythme en fonction de la structure de l’ARNm b) Traduction d’un ARNm structuré : le site d’initiation du 2ème cistron est en interaction avec une partie de la séquence codante du 1èr cistron, aucun ribosome ne peut s’y fixer pour initier la traduction jusqu’à ce que la traduction du 1èr soit terminée. Le décalage de synthèse entre la Prot1 et la Prot2, cecci peut être important si les deux Prot.interviennent à des moments différents dans une chaine métabolique. c) Traduction d’un ARNm dont la région intercistronique a une structure particulière : le codon stop du 1èr cistron est très prôche du codon d’initiation du 2ème cistron. Lorsque le ribo atteint le codon de terminaison, il se dissocie, 80 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N seul la petite sous unité reste attachée à l’ARNm et se déplace au dela de la structure en hélice (tige-boucle) jusqu’à la reconnaissance du codon d’initiation du 2ème cistron= réinitiation. 3- Les différentes stratégies de régulation Les mécanismes d’action d’une protéine au niveau de la traduction : a) Répression : la protéine empêche la fixation du ribosome (compétition entre le ribosome et la protéine). Ou séquestre le ribosome dans un complexe d’initiation abortif (mécanisme de piégeage) b) Activation : la protéine induit un changement de conformation de l’ARNm libérant le site de reconnaissance du ribosome. Figure 69 4- Atténuation de la traduction, Voir exemple opéron trp 5- Terminaison de la traduction - Voir exemple opéron trp 6- Contrôle par un ARN antisens 81 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N L’ARN antisens est un ARN complémentaire de l’ARNm, les deux molécules peuvent s’apparier et former un hybride sens-antisens. Ce système présente un grand intérêt pour la régulation de la traduction de l’ARNm puisque l’ARN antisens conduira à la formation de l’hybride qui masquera le site d’initiation et empêchera ainsi l’accès du ribosome au site fonctionnel de l’ARNm. Exemple : contrôle de la synthèse REP A par l’ARNantisens (plasmides R1). 82 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Fiche4 TD Régulation Exercice 1 Pourquoi dit-on que les gènes z, y, et a codant respectivement pour les protéines βgalactosidase, βgalactoside perméase et galactoside transacétylase appartiennent au même opéron? De quel opéron s’agit-il ? Quel est le mode de régulation de cet opéron ? Complétez le tableau suivant en utilisant (+) pour la synthèse et (-) pour l’absence de synthèse de Perméase (P) ou de la β-galactosidase (β-gal) Génotype Inducteur absent P β- gal i +o+ y+ z+ i -o+ y+ z+ i so+ y+ z+ i +oc y+ z+ i +oo y+ z+ i -oc y+ z+ i –oo y+ z+ i soc y+ z+ i sooy+ z+ Inducteur présent P β-gal Conclusion Exercice 2 Les diploïdes partiels suivants ont été créés: i +z-/F’i-z+ et i-z+/F’i+z-. Chez ces deux diploïdes les trois enzymes sont inductibles. - Quelle conclusion pouvez-vous tirer de ces expériences? - La régulation se fait-elle en cis ou en trans? Exercice 3 a) Un mutant d’E. coli synthétise de grandes quantités de β-galactosidase, que l’inducteur soit présent ou non. Un diploïde partiel formé de ce mutant et de F’i+z+ synthétise également de grandes quantités de β-galactosidase que l’inducteur soit présent ou non. - Quelle sorte de mutation peut rendre compte de ce résultat? b) Un mutant Is (super répresseur) de l’opéron lactose se comporte comme un mutant non inductible. L’allèle Is est dominant sur I+ dans des bactéries diploïdes partielles. - Quelle est la nature moléculaire probable de cette mutation? c) Dans les mutants y-, le gène codant pour la β-galactosidase n'est pas affecté. Pourtant, la βgalactosidase n'est plus induite par le lactose dans ce mutant. Pourquoi?r Exerccice 4 souche génotype 1 2 3 IS Z+Y+/F’I+Z+Y+ O+Z+Y+/F’O+Z+YO+Z-Y+/F’OcZ+Y- B-gal Inducteur Inducteur Absent Présent P Inducteur Absent conclusion Inducteur Présent 83 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Exercice 5 L'opéron tryptophane code pour 5 enzymes (E, D, C, B, et A) qui transforment le chorismate en tryptophane. Des mutants de régulation ont été obtenus pour cet opéron. La production de l'enzyme trpE a été étudiée dans le mutant trpR-. Quel est le rôle de trpR. Complétez le tableau par (+) : synthèse ou par (-) : pas de synthèse. milieu + tryptophane milieu - tryptophane Sauvage (trp R+) ttrpR- 84 USTO. FSNV. DGMA. S1. 2017 L3.Cours Génétique des procaryotes. Pr SAIDI-OUAHRANI. N Références bibliographiques -Christophe Merlin, Ariane Toussaint. Les éléments transposables bactériens. Société Française de Génétique. m/s n° 8-9, vol. 15, août-septembre 99 - Etienne Jacqueline. Biochimie génétique. Biologie moléculaire. Masson. Paris 1998. Klug W., Cummings M, Spencer C. Génétique. Pearson Edition France 2006. -Philippe Thomen. Transcription par une ARN Polymerase : mesures de forces à l'échelle de la molécule unique (thèse de doctorat). https://tel.archives-ouvertes.fr/tel- 00011391. Submitted on 16 Jan 2006 - Prévost Georges. Génétique. Hermann. Paris 1976. 85
