Techniques d’étude en biologie moléculaire I- Électrophorèse Électrophorèse : C’est avec la chromatographie, la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation d’espèces. Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou des acides nucléiques. Dans un milieu donné, la séparation des espèces se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Cette technique est fondée sur le déplacement des ions sous l’effet d’un champ électrique. Du fait de leur caractéristiques propres et en fonction des conditions de l’électrophorèse, ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres. Les cations (+) migrent vers la cathode (-) et les anions se déplacent vers l’anode (+). A) Électrophorèse en veine liquide Dans ce cas, le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de champ est constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenables dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce support peut être liquide, c’est pourquoi on parle d’électrophorèse en veine liquide. Les espèces vont se séparer dans le tube en fonction de leur charge. B) Électrophorèse de zones (verticale et horizontale) Électrophorèse de zones : Ce type d’électrophorèse peut s’effectuer à l’horizontale ou à la verticale. Les principales applications utilisent un support poreux stabilisant la phase liquide : on parle alors d’électrophorèse sur support ou d’électrophorèse de zones. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, poreux et imprégné de tampon. Le support doit être homogène, poreux et inerte. Il existe plusieurs types d’électrophorèses de zones qui vont varier en fonction de leur support : électrophorèse sur papier, sur acétate de cellulose, sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide etc), ou en fonction du type d’électrophorèse : électrophorèse à focalisation isoélectrique (dépend du point isoélectrique), bidimensionnelle (dépend du point isoélectrique et de la masse moléculaire), ou immunoélectrophorèse (utilisation d’anticorps). Nous allons nous intéresser à la plus utilisée : L’électrophorèse sur gel. Électrophorèse sur gel : Électrophorèse utilisée pour séparer les macromolécules biologiques comme l’ADN en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Le gel est constitué d’une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur. Les molécules chargées négativement vont migrer de la borne – vers la borne + et inversement. Au cours de cette migration, les molécules plus petites vont migrer plus vites que les grosses molécules. En effet, le support agit comme un « tamis » dans lequel se prenne les grosses molécules qui ont du mal à progresser. Les deux principaux gels utilisés sont l’agarose et le polyacrylamide. Le gel d’agarose sert pour les acides nucléiques et le polyacrylamide peut servir pour les acides nucléiques et pour les protéines, globalement pour les molécules de très petites tailles. a) Technique Le produit de départ est un mélange de molécules, habituellement des fragments produits par digestion pour l’ADN (découpage) grâce à une enzyme de restriction ou à l’amplification en chaine par polymérase. Durant l’électrophorèse, ce mélange est séparé en bandes successives. Chaque bande contient des milliers de molécules de la même longueur. 1) Chaque échantillon, constitué d’un mélange de molécules, est placé dans un puit situé à une des extrémités d’une fine plaque de gel d’agarose ou de polyacrylamide. Le gel est maintenu en place dans un petit support de plastique : il baigne dans une solution tampon aqueuse dans un plateau et à chaque extrémité du dispositif se trouvent des électrodes. Des fragments de taille connue peuvent aussi être ajoutés dans un des puits pour servir de référence. 1 2) Lorsque le courant est appliqué, les molécules de charge négative se dirigent vers l’électrode positive. Les molécules plus courtes se déplacent plus rapidement que les longues. Les bandes sont illustrées ici en bleu, mais en réalité, elles ne sont pas encore visibles. b) Résultats Après avoir coupé le courant, on ajoute un colorant (bromure d’ethidium pour l’ADN). Pour le bromure d’ethidium, les bandes émettent une lumière rose par fluorescence lorsqu’elles sont placées sous une lumière ultraviolette, ce qui permet de distinguer les bandes séparées auxquelles le colorant est lié. Sur le gel ci-dessous, les bandes roses correspondent aux fragments d’ADN de longueurs différentes séparées par électrophorèse. Si tous les échantillons sont au départ coupé par la même enzyme de restriction, les motifs de bandes différents indiquent alors qu’ils proviennent de différentes sources. Vidéo : Électrophorèse animation : https://www.youtube.com/watch?v=VWAMz6WLwM0 C) Retard sur gel Retard sur gel (EMSA) : Technique de biologie moléculaire permettant de détecter une interaction entre une protéine et de l’ADN ou de l’ARN. Cette expérimentation débute par une incubation d’une sonde radio d’acide nucléique marquée avec une protéine recombinante (donc possibilité d’observation par électrophorèse). On fait migrer par électrophorèse le fragment nucléotidique étudié sur une piste et sur une autre le fragment mis en contact avec la protéine susceptible de se fixer. Si la protéine se fixe effectivement sur le fragment, la migration de ce dernier sera plus lente et aura donc un retard. La bande correspondante aura migré moins loin sur le gel. II- Manipulation d’ADN et d’ARN A) Préparation a) Extraction d’ADN Extraction d’ADN : Technique permettant d’isoler l’ADN de cellules ou de tissus. L’ADN ainsi extrait peut ainsi être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telle que le séquençage, la PCR ou le clonage. Il existe différents protocoles pour extraire l’ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe : lyse des cellules, élimination des protéines, élimination des autres acides nucléiques (ARN, etc), concentration de l’ADN par précipitation à l’alcool. Différentes variantes sont employées, suivant que l’on cherche à extraire de l’ADN génomique (issu du ou des chromosomes des cellules analysées) ou de l’ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent par des cellules bactériennes comme E. coli). Dans les deux cas, le contrôle de l’extraction peut se faire par électrophorèse sur gel d’agarose, ou par spectrophotométrie. 2 Préparation d’ADN Génomique On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus, consistant éventuellement en un broyage, suivi d’une extraction par des détergents, qui vont disperser les bicouches lipidiques des membranes et dénaturer les protéines, et en particulier celles qui sont associées à l’ADN dans la chromatine. La solution obtenue est en général très visqueuse, car l’ADN ainsi libéré forme de très longs filaments qui s’opposent aux écoulements hydrodynamiques. L’étape suivante est la déprotéinisation de la solution qui se fait par une extraction au moyen de solvants organiques, en général du phénol additionné de plus ou moins de chloroforme. Le phénol va déprotéiner tandis que le chloroforme va nettoyer le phénol restant après utilisation. Les protéines dénaturées forment un précipité à l’interface phénol-eau, tandis que l’ADN reste en solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par décantation ou par centrifugation. L’ADN est ensuite précipité par addition d’éthanol ou d’isopropanol (pas besoin de sel mais dégrade les petits fragments) dans la phase aqueuse, collecté par centrifugation et dissout dans du tampon. Pour éliminer les traces de phénol et d’autres contaminants, on peut enfin pratiquer une dialyse ou une étape de purification par chromatographie préparative. Vidéo : Vidéo 1 Extraction de l’ADN : https://www.youtube.com/watch?v=qEvn3QWmCNg Vidéo : Je vous montre MON ADN ! – TP #6 : https://www.youtube.com/watch?v=MrtlAQPlTJ0 Préparation d’ADN plasmidique La préparation d’ADN plasmidique à partir de bactéries est l’une des techniques les plus courante de la biologie moléculaire. Le principe de l’extraction est connu sous le nom de lyse alcaline. Cette méthode permet de préparer sélectivement de l’ADN du plasmide contenu dans les bactéries, tout en éliminant l’ADN du chromosome bactérien. Le principe de cette méthode consiste à effectuer la lyse des cellules au moyen d’un détergent en présence de soude à pH13. À ce pH très alcalin, l’ADN est dénaturé, c’est-à-dire que les deux brins de la double hélice sont séparés. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la renaturation brutale. L’ADN chromosomique, très long (106 pb), ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. L’ADN plasmidique, court (103 pb) parvient à se réassocier complètement et reste en solution. On sépare alors les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées sont également éliminées avec le détergent et l’ADN chromosomique. L’ADN plasmidique, resté en solution, est alors concentré par précipitation à l’alcool. On peut également rajouter des constituants au fur et à mesure comme des éléments de protection de l’ADN (EDTA : protège contre les DNAse), et la purification peut se faire par des moyens physiques comme une chromatographie sur colonne. Vidéo : Extraction d’ADN à partir de bactérie : https://www.youtube.com/watch?v=QCcsTqWCLk b) Digestion enzymatique Digestion enzymatique : Technique utilisant des enzymes de restriction pour couper spécifiquement une molécule d’ADN afin de la manipuler ou de la cloner. Enzyme de restriction : Protéine capable de couper un fragment d’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides caractéristique appelé site de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnait ainsi un site spécifique. Plusieurs centaines d’enzymes de restriction sont actuellement connues. Naturellement présentes chez un grand nombre d’espèces de bactéries, ces enzymes sont devenues des outils importants en génie génétique. Dans la nature, elles sont utilisées par la bactérie pour se défendre contre les infections par des virus. En effet, elles coupent en petits morceaux l’ADN de ces intrus, ce qui restreint leur infectiosité (d’où leur nom). On utilise beaucoup EcoRI, BamHI ou encore HindIII, qui reconnaissent respectivement les séquences GAATTC, GGATCC, AAGCTT Vidéo : Restriction enzymes (Anglais) : https://www.youtube.com/watch?v=U2cKywEn6KY Vidéo : Restriction Enzymes (Anglais aussi) : https://www.youtube.com/watch?v=Ik_Pxht1LM0 3 c) Clonage Clonage : Multiplication provoquée d’un fragment d’ADN par l’intermédiaire d’un microorganisme. Cela consiste à isoler un fragment d’ADN (grâce à des enzymes de restriction) et à le multiplier à l’identique en l’« insérant » dans une molécule d’ADN appelée vecteur permettant son amplification. Cette technique peut être utilisée pour un clonage partiel, ne portant que sur un fragment de matériel génétique, mais aussi pour le clonage d’un gène entier permettant la production de la protéine recombinante correspondante qui serait intéressante. (ex : production d’insuline). L’« insertion » est souvent réalisée à l’aide d’un vecteur, le plus communément utilisées étant les virus ou les plasmides bactériens. B) Amplification a) Réaction de polymérisation en chaine (PCR) Réaction de polymérisation en chaine : Polymerase chain réaction (PCR). Cette méthode permet de dupliquer un grand nombre (avec un facteur de multiplication de l’ordre du milliard) de séquences d’ADN ou d’ARN connue, à partir d’une faible quantité (de l’ordre de quelques picogrammes) d’acide nucléique (appelé l’amplicon) et d’amorces spécifiques constituées d’oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides. 4 Étape 1 : Dénaturation initiale Avant de commencer les cycles de PCR proprement dit, une étape de chauffage (généralement de 10 à 15 minutes à 95°C) est réalisée. Cette étape permet de : déshybrider les ADN double brin, de casser les structures secondaires, d’homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique, d’activer les polymérases qui s’activent dans un contexte de chaleur élevée, de dénaturer d’autres enzymes qui pourraient être dans la solution. Étape 2 : Phase d’hybridation ou d’appariement des amorces Cette étape (généralement 2 à 60 secondes à 56-64°C) permet aux amorces sens et anti-sens de s’hybrider aux ADN matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. Peu de brins d’ADN matrice peuvent s’hybrider (se lier) avec leur brin complémentaire, ce qui empêche la fixation des amorces, car ces dernières sont bien plus courtes et en concentration bien plus importante. Étape 3 : Phase d’élongation Cette étape (généralement 4 à 120 secondes à 72°C) permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire de leur ADN matrice à une température qui leur est optimale. Ce brin est fabriqué à partir des dNTPs libres présents dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend normalement de la longueur de l’amplicon. Cette phase clos un cycle. Les cycles recommencent jusqu’à ce qu’on atteigne le nombre souhaité de fragments d’ADN. Vidéo : 5 minutes pour Comprendre – La PCR : https://www.youtube.com/watch?v=JPlTtFYd6e4 Vidéo : PCR – Polymerase Chain Reaction (IQOG-CSIC) (Anglais) : https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo b) PCR Quantitative ou PCR en temps réel PCR en temps réel (Real-time PCR) : Cette technique consiste à mesurer la quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur fluorescent. Ces marqueurs sont des sondes qui vont se fixer sur une zone de l’ADN et qui ne deviennent fluorescent que liés à cet ADN. Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l’appellation PCR quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR). Vidéo : Principe de la PCR en temps réel : https://www.youtube.com/watch?v=AZWLysiG3Rg Des sondes comme les sondes Taqman sont conçues pour accroitre la spécificité des techniques de PCR quantitative. On peut également utiliser le SYBR Green I, un composé faisant partie des cyanines (flurophore) qui peut se lier aux acides nucléiques et émettre une fluorescence. c) RT-PCR RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) : Technique qui associe une transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin complémentaire d’un ARN avec un désoxyribonucléotides en utilisant une ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est généralement destiné à être amplifié par PCR (l’ADNc étant plus stable, il permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes). Transcription inverse : Réaction inverse de la transcription. C’est la synthèse d’un brin d’ADN à partir d’une matrice ARN grâce à une ADN polymérase ARN dépendante ou encore transcriptase inverse ou rétrotranscriptase. Vidéo : Simplified RT – Reverse Transcription Animation (Anglais) : https://www.youtube.com/watch?v=0MJIbrS4fbQ&t=101s 5 d) Mutagenèse dirigée Mutagenèse dirigée : Induction d’une ou plusieurs mutations dans un génome, de façon précise et volontaire. Cette méthode est employée pour modifier les structures de l’ADN, l’ARN et des protéines. Ces méthodes sont basées sur la PCR. Les mutations sont introduites à l’aide d’amorces oligonucléotidiques qui sont préalablement synthétisées. Ces amorces sont complémentaires à la séquence sauvage à l’exception des nucléotides qui doivent être mutés. En effet, la PCR n’exige pas une stricte complémentarité entre l’amorce nucléotidique et la séquence d’ADN cible. Vidéo: In vitro Mutagenesis (Anglais) https://www.youtube.com/watch?v=vynUiWhOQ_Y C) Séquençage Séquençage de l’ADN : Consiste à déterminer l’ordre d’enchainement des nucléotides pour un fragment d’ADN donné. Il existe trois méthodes principales : la Méthode de Maxam et Gilbert, la Méthode de Sanger et le pyroséquençage. Vidéo : Le séquençage du génome : https://www.youtube.com/watch?v=TCnG7R50IlU a) Méthode de Sanger Méthode de Sanger : Méthode qui consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l’aide d’un petit oligonucléotide (amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de l’amorce est réalisée par une partie d’ADN polymérase puis maintenue par des ADN polymérase thermostable (les mêmes que la PCR). Les quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de l’un des quatre didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). 6 Ces ddNTP agissent comme des « poisons » terminateurs de chaine : une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent la poursuite de l’élongation. Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des nucléotides correspondant au ddNTP incorporé dans la réaction. Pour le séquençage complet d’un même fragment d’ADN, on répète cette réaction quatre fois en parallèle avec les quatre ddNTP différents. Par exemple, dans la réaction où on a ajouté du ddGTP, la synthèse s’arrête au niveau des G. Le mélange réactionnel contenant, à la fois du GTP et un peu de ddGTP, la terminaison se fait de manière statistique suivant que l’ADN polymérase utilise l’un ou l’autre de ces nucléotides. Il en résulte un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, qui se terminent tous au niveau d’un des G dans la séquence. Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide ce qui permet de repérer la position des G dans la séquence. La détection des fragments ainsi synthétisés se fait en incorporant un traceur dans l’ADN synthétisé. Initialement ce traceur était radioactif, aujourd’hui, on utilise des traceurs fluorescents, attachés soit à l’oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide. Vidéo : The Sanger Method of DNA Sequencing (Anglais): https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ 7 b) Méthode de Maxam et Gilbert Méthode de Maxam et Gilbert : Méthode basée sur une dégradation chimique de l’ADN qui utilise les réactivités différentes des quatre bases A, T, G et C, pour réaliser des coupures sélectives. En reconstituant l’ordre des coupures, on peut remonter à la séquence de nucléotides de l’ADN correspondant. On peut décomposer ce séquençage chimique en six étapes successives : 1) Marquage : Les extrémités des deux brins d’ADN à séquencer sont marquées par un traceur radioactif. Cette réaction s’effectue en général au moyen d’ATP radioactif et de polynucléotide kinase. 2) Isolement du fragment d’ADN à séquencer. Celui-ci est séparée au moyen d’une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. Le fragment d’ADN est découpé du gel et récupéré. 3) Séparation de brins. Les deux brins de chaque fragment d’ADN sont séparés par dénaturation thermique, puis purifiés par une nouvelle électrophorèse. 4) Modification chimique spécifiques. Les ADN simple-brin sont soumis à des réactions chimiques spécifiques des différents types de base. Walter Gilbert a mis au point plusieurs types de réactions spécifiques, effectuées en parallèle sur une fraction de chaque brin d’ADN marqué : par exemple, une réaction pour les G (alkylation), une réaction pour les G et les A (dépurination), une réaction pour les C, ainsi qu’une réaction pour les C et les T (hydrolyse alcaline). Ces différentes réactions sont effectuées dans des conditions très ménagées, de sorte qu’une moyenne chaque molécule d’ADN ne porte que zéro ou une modification. 5) Coupure. Après ces réactions, l’ADN est clivé au niveau de la modification par réaction avec une base. 6) Analyse. Pour chaque fragment, les produits des différentes réactions sont séparés par électrophorèse en conditions dénaturantes et analysés pour reconstituer la séquence de l’ADN. Cette analyse est analogue à celle que l’on effectue pour la méthode de Sanger. Vidéo: Maxam-Gilbert DNA Sequencing Method Animation: https://www.youtube.com/watch?v=_B5Dj8PL4E0 c) Pyroséquençage Pyroséquençage : Technique qui permet d’effectuer un séquençage rapide et à moindre coût qu’un séquençage par la méthode de Sanger. En effet, cette technique ne nécessite pas de clonage (donc gain de temps et d’argent) et permet une lecture directe de la séquence obtenue après le séquençage. Ici, les nucléotides ne sont pas ajoutés tous ensemble comme dans une réaction de séquençage normale mais l’un après l’autre. Si le nucléotide ajouté dans le milieu réactionnel correspond à celui attendu par la polymérase, il est incorporé dans le brin au cours de synthèse et libère un pyrophosphate. Une enzyme vient alors transformer ce pyrophosphate en ATP qui est alors utilisé pour former après multiples réactions un signal lumineux. Vidéo: Pyrosequencing: https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA 8 D) Quantification a) Southern blotting (buvardage de Southern) Southern blot : Méthode permettant l’analyse de l’ADN. Elle a été inventée en 1975 par Edwin Southern, un professeur britannique de biologie moléculaire. C’est ce nom (Southern) qui inspiré par jeu de mot l’appellation d’autres techniques : western blot, northern blot, et far eastern blot. L’ADN est digéré par les enzymes de restriction. Ils sont ensuite placés dans les puits d’un gel d’électrophorèse. On effectue une migration horizontale d’électrophorèse puis une coloration au bromure d'ethidium, et on révèle les fragments sous rayons UV. Le gel est ensuite trempé dans une solution alcaline afin de permettre la dénaturation de l’ADN. Une feuille de membrane en nitrocellulose est placée sur le gel. Une pression est appliquée en plaçant une pile de serviettes de papier. Cela va permettre de déplacer l’ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité grâce à une solution saline. L’ADN va se fixer sur la membrane. La membrane est chauffée ou exposée au rayonnement ultraviolet. La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde spécifique marquée avec un flurophore de l’ADN recherché. La sonde va révéler la position sur la membrane des fragments d’ADN recherchés. Plusieurs situations peuvent se présenter : - Les fragments d’ADN sont semblables au lieu d’hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci les fragments sont de même taille : il n’y a pas de polymorphisme - Un site de restriction au voisinage de la sonde n’est présente que chez l’un des deux individus ; les fragments n’ont pas la même taille et ne sont donc pas à la même hauteur sur le gel : il y a polymorphisme de sites de restriction - Les sites de restriction sont identiques, mais une séquence supplémentaire est présente chez l’un des fragments. Les vitesses de migration des fragments et donc leur position sur le gel sont donc, ici aussi, différentes : il y a polymorphisme d’insertion/délétion. Vidéo : Southern blot / Biomolecule / MCAT / Khan Academy (Anglais): https://www.youtube.com/watch?v=Zps2uH8aWVU 9 b) Northern blotting (buvardage de northern) Northern blot : Technique qui dérive du Southern blot, sauf qu’au lieu d’étudier de l’ADN on étudie de l’ARN. Une autre différence par rapport à Southern est l’utilisation de formaldéhyde dans le gel d’électrophorèse comme dénaturant (pas double brin mais permet de casser les structures secondaires). Cette technique permet d’apprécier des ARN dans les tissus et d’étudier leur abondance relative. On peut alors déduire de ces observations l’expression plus ou moins importante de certains gènes. Enfin, cette technique sert à détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d’épissage des ARN. Vidéo: Northern Blot: https://www.youtube.com/watch?v=KfHZFyADnNg c) Spectrophotométrie Spectrophotométrie : Domaine qui étudie la mesure de l’énergie transportée par les rayonnements électromagnétiques dans le domaine de la lumière visible. On se base sur la loi de Beer-Lambert qui nous permet de déduire une concentration à partir de l’absorbance mesurée de l’échantillon par un spectrophotomètre. Une solution absorbe la lumière quand elle est capable d’arrêter un rayon lumineux à une longueur d’onde précise. A260 = 1 pour l’ADN double brin ó 50 µm / mL A260 = 1 pour l’ADN simple brin ó 40 µm / mL Hyperchromicité : Augmentation de l’absorbance lors de la dénaturation de la molécule d’ADN double brin en molécule simple brin qui s’explique par l’exposition des bases azotées aux rayons lumineux. Une molécule riche en GC est beaucoup plus difficile à dénaturer qu’une molécule riche en AT en raison du fait que G et C sont liées par 3 liaisons hydrogènes contrairement à A et T qui ne sont liées que par 2 liaisons. La température de fusion dépend directement de la composition du brin d’ADN. Vidéo : Introduction à la spectrophotométrie : https://www.youtube.com/watch?v=0piX0t7lozA 10 E) Autres a) Puce à ADN Puce à ADN : Ensemble de molécules d’ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface qui peut être du verre, du silicium ou du plastique. Cette biotechnologie récente permet d’analyser le niveau d’expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange complexe, à un moment donné dans un état donné par rapport à un échantillon de référence. Le principe est qu’on part d’ARN qu’on va amplifier pour obtenir une grande quantité de matériel génétique. Les ARNm sont ensuite transformés en ADN complémentaires par la technique de rétrotranscription et marqués. Ce marquage est possible par un fluorochrome. Les cibles ainsi marquées sont ensuite mises en contact avec la puce (portant l’ensemble des sondes à sa surface) Cette étape est nommée l’hybridation. La biopuce est ensuite lavée par des bains spécifiques pour éliminer les brins d’ADNc ne s’étant pas hybridés car non complémentaires des sondes fixées sur la lame. La biopuce va ensuite être analysée par un scanner à très haute résolution et ce à la longueur d’onde d’excitation du fluorochrome. Vidéo : DNA microarrays (Anglais) : https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM b) Marquage des acides nucléiques Marquage des acides nucléiques : Il existe deux principales méthodes de marquage des acides nucléiques. L’une nécessite l’utilisation de monomères des acides nucléiques (ADN ou ARN), les nucléotides, rendus radioactifs. Ceuxci sont incorporés par la cellule dans les brins d’acides nucléiques néosynthétisés et les rendent radioactifs. L’autre se fait par le biais d’agents intercalant fluorescents. Ces éléments s’intercalent entre les bases des brins d’acides nucléiques et les rendent ainsi fluorescents sous rayons. c) Transgénèse Transgénèse : Fait d’incorporer un ou plusieurs gènes dans le génome d’un organisme vivant. Ce transgène pourra être exprimé dans l’organisme transformé. Stratégie servant initialement aux chercheurs pour étudier la fonction des gènes, cette approche est également utilisée par les industries pharmaceutiques et agro-alimentaire. Elle est entre autres la nouvelle stratégie d’obtention de variétés végétales ou animales résistantes au stress biotique ou abiotique. Ces nouvelles variétés sont généralement regroupées sous le terme d’organisme génétiquement modifiés (OGM) 11 - - - - On commence par identifier le « gène d’intérêt », le gène dont on veut étudier le fonctionnement ou le gène responsable de la caractéristique jugée intéressante à transférer pour un OGM (Ex : résistance à la pyrale portée par le gène Bt dans le maïs Bt) La construction du transgène implique la réalisation d’une séquence nucléotidique comportant : la séquence codant la protéine d’intérêt, un promoteur et des séquences régulatrices, un terminateur de transcription. Le choix des séquences régulatrices permet d’orienter l’expression du gène, de la limiter à une partie de l’organisme. Dans certains cas, l’insertion du transgène se fait par l’intermédiaire d’un vecteur. Les vecteurs les plus connus sont les plasmides bactériens. Ensuite l’organisme cible va subir une transformation par intégration de l’ADN dans les cellules cibles. L’introduction peut se faire par perméabilisation des membranes par un procédé mécanique ou encore par un vecteur biologique (ex : Agrobacterium tumefaciens est une bactérie engagée dans la transformation des plantes ou encore un phage pour la transformation des bactéries). Il est également possible d’introduire la construction génique directement par microinjection dans la cellule. Sélection des cellules transformées Vidéo : Transgénèse et universalité de l’ADN – SVT Seconde – Les Bons Profs : https://www.youtube.com/watch?v=AkkBIuycqCA d) Hybridation fluorescente in-situ (FISH) FISH : Technique utilisant des sondes marquées à l’aide d’un marqueur fluorescent et utilisées sur des coupes en microscopie et en imagerie moléculaire. Le FISH est une technique de cytogénétique permettant de voir les éléments situés à l’intérieur même de la cellule. Les sondes peuvent être utilisées sur de l’ADN ou de l’ARN. Il existe plusieurs types de sondes à ADN - Centrométrique : permet de mettre en évidence les centromères des chromosomes. - Chromosomique : permet de mettre en évidence les chromosomes individuellement par processus « peinture chromosomique » - Locus/loci particuliers : permet de mettre en évidence un ou plusieurs gènes particuliers. Video: FISH – Fluorescent in Situ Hybridization: https://www.youtube.com/watch?v=LiRJoTi44TA III- Manipulation de protéines a) Western blotting (buvardage de western) ou Immunoblot Western blot : Méthode de biologie moléculaire permettant la détection et l’identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique à l’aide d’anticorps dirigés contre ces protéines que l’on souhaite détecter. - Préparation des échantillons : Les échantillons sont refroidis, homogénéisés et centrifugés afin d’isoler les fractions cytosoliques, nucléaires et membranaires. L’échantillon est ensuite traité de façon à recueillir un taux constant de protéines (dosage). L’échantillon est ensuite bouilli ce qui va dénaturer les protéines puis précipiter (SDS riche en charges négatives) - Électrophorèse : Migration sur gels de polyacrylamide (en général) - Transfert sur membrane : Comme pour Southern et northern, les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose. - Coloration des protéines : Permet la visualisation de la protéine totale sur la membrane - Blocage : Le blocage des sites d’interaction non spécifiques entre la membrane et les anticorps est réalisé en plongeant la membrane dans une solution. Le but est que les anticorps ne se lient pas à la membrane. - Détection : La membrane est « sondée » pour la protéine d’intérêt avec des anticorps lié à une enzyme qui va émettre un signal lumineux ou coloré en fonction de l’enzyme associée. - Analyse : La détection peut se faire par colorimétrie, chimioluminescence, autoradiographie ou fluorescence. Vidéo : Le western blot : de la paillasse à la vidéo : https://www.youtube.com/watch?v=SrYzulGMBBE 12 b) Chromatographie Chromatographie : Méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un mélange. Il existe plusieurs méthodes, mais nous allons nous intéresser aux quatre principales : exclusion, hydrophobe, échange d’ion et affinité. a. Exclusion Chromatographie d’exclusion : Méthode de chromatographie permettant de séparer des macromolécules en fonction de leur volume hydrodynamique. Elle est notamment utilisée pour faire l’étude de polymères. Le principe ici est basé sur la taille et la forme des macromolécules en solution. On va utiliser des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues des billes de gel et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort. Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée. Les solutés sont donc élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires. Vidéo : Chromatographie d’exclusion sur gel : https://www.youtube.com/watch?v=bCiUi2fkcSM b. Hydrophobe Chromatographie d’interaction hydrophobe : Chromatographie en phase liquide à haute performance utilisée pour la séparation sans dénaturation des acides aminés hydrophobes, des peptides et des protéines. Le gel de chromatographie porte des groupements hydrophobes tel qu’un noyau phénol à l’extrémité d’une chaine carbonée. Au fur et à mesure de la migration, les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines vont alors se fixer sur ce gel, et les molécules apolaires ou neutres vont être éluées grâce à une solution saline. Une élution progressive dans un degrés de polarité se fait par la diminution progressive de la salinité dans la solution qui va diminuer les interactions entre les protéines polaires et le gel. Pour récupérer plus tard les molécules polaires restantes, il suffit de rincer la colonne avec une solution tampon à force ionique, qui va capter les acides aminés accrochés au gel. Plus un acide aminé va être polaire, plus il va tenir. Video: Principles of Hydrophobic Interaction Chromatography (Anglais): https://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA c. Échangeuse d’ion Chromatographie à échange d’ions : Identification des ions à l’aide de résine échangeuses d’ions. Cette technique sépare les molécules selon leurs groupes chargés respectifs. Le principe de séparation est basé sur les propriétés électrostatiques de produits à séparer, c’est-à-dire la charge nette. On va donc utiliser des résines chargées positivement (chromatographie échangeuse d’anions) ou négativement (chromatographie échangeuse de cations). La résine va retenir les molécules ayant une charge opposée à la sienne, ce qui va permettre de séparer les molécules en fonction de leur charge. Pour éluer, on peut utiliser des tampons avec des charges négatives ou positives afin des décoller les molécules de la résine, ou varier le pH. Vidéo : Chromatographie EI : https://www.youtube.com/watch?v=eZz-TrtqdCA 13 d. Affinité Chromatographie d’affinité : Technique de chromatographie qui permet de séparer un composé en utilisant des interactions biologiques entre un ligand spécifique (greffé sur une matrice macromoléculaire) et son substrat, en l’occurrence la molécule à isoler. Dans le gel se situent des molécules qui ont une affinité avec d’autres molécules (ex-enzyme à substrat). Les molécules qui ont une affinité vont donc s’associer à la molécule dans le gel et les molécules qui n’en ont pas vont être éluées au fur et à mesure. Vidéo : Affinity Chromatography (Anglais) : https://www.youtube.com/watch?v=qAZBI9qFb2c c) Centrifugation Centrifugation : Procédé de séparation des composés d’un mélange en fonction de leur différence de densité en les soumettant à une force centrifuge. Le mélange à séparer peut-être constitué soit de deux phases liquides, soit de particules solides en suspension dans un fluide. L’appareil utilisé est une machine tournante à grande vitesse appelée centrifugeuse. Cette technique allie la poussée d’Archimède et la force centrifuge. Vidéo : Centrifugation d’une eau boueuse : https://www.youtube.com/watch?v=NS15IpOGvsQ d) Precipitation différentielle Précipitation différentielle : Cette technique utilise la solubilité différentielle des protéines. Chaque protéine est plus ou moins soluble en solution selon sa composition, on peut en séparer plusieurs en fonction de leur tendance à précipiter plus ou moins vite quand on change la force ionique de la solution qui les contient. Une force ionique élevée peut avoir deux effets sur la solubilité : neutraliser certaines charges ioniques requises en surface pour le maintien de la solubilité, et compétitionner avec les protéines pour les molécules d’eau disponibles en solution. Quand la concentration en sel est assez élevée pour priver une protéine de molécules d’eau qui l’hydratent, celle-ci sort de solution et précipite. C’est ce qu’on appelle le phénomène de salting-out. Les protéines seront éventuellement toutes précipitées par une teneur en sel assez élevée, mais certaines d’entre elles seront remarquablement résistantes alors que d’autres précipiteront très facilement. C’est cette différence de solubilité qui permet de les séparer. e) Dialyse Dialyse : C’est la méthode la plus utilisée pour changer la concentration en sels d’une solution protéique. Dans une dialyse, les protéines dans une concentration de sels donnée sont séparées d’une solution à la concentration en sels différente par une membrane poreuse. Les pores de cette membrane peuvent avoir différentes tailles ; certaines membranes ne laisseront passer que des ions alors que d’autres laisseront même passer de petites protéines (jusqu’à des poids moléculaires de 50 000 Da). Les sels auront tendance à équilibrer leur concentration de part et d’autre de la membrane. Le seuil de coupure (masse molaire critique pour laquelle 90% des solutés sont retenus par la membrane) défini la taille des pores de la membrane de dialyse. Seuls les éléments de taille inférieure peuvent entrer ou sortir. La dialyse se défini comme un mouvement de particules dans le sens du gradient de concentration, elle se déroule donc dans un grand volume de tampon. 14 f) Immunoprécipitation Immunoprécipitation : Technique qui permet la précipitation d’un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement une protéine particulière dans une solution en contenant beaucoup d’autres grâce à la spécificité des anticorps. On l’utilise pour isoler et concentrer une protéine précise parmi des milliers d’autres. L’Immunoprécipitation impose que l’anticorps soit lié à un substrat solide à certaines étapes du traitement. Vidéo : La co-immunoprécipitation : de la paillasse à la vidéo (une variante de l’immunoprécipitation) : https://www.youtube.com/watch?v=It9UH573z_w Sources : Internet : Wikipédia, droguet-sebastien.e-monsite.com, YouTube, snv.jussieu.fr, biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrooke.ca, takween.com, futura-sciences.com, gnis-pedagogie.org, supagro.fr ; gnis-pedagogie.org ; 123bio.net, biochimej.univ-angers.fr ; planet-vie.ens.fr ; biochimiedesproteines.espaceweb.usherbrooke.ca ; docplayer.fr ; Livre : Campbell Cours : L3 Techniques et application en biologie molécule, M1 Génie génétique et cancérisation, Techniques d’étude des protéines 15
