Techniques d'étude en biologie moléculaire

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Techniques d’étude en biologie moléculaire
I- Électrophorèse
Électrophorèse : C’est avec la chromatographie, la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation
et la caractérisation d’espèces. Elle a quelques applications en chimie, mais est principalement utilisée en biochimie ou
biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou des acides nucléiques. Dans un milieu donné, la séparation
des espèces se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille. Cette
technique est fondée sur le déplacement des ions sous l’effet d’un champ électrique. Du fait de leur caractéristiques
propres et en fonction des conditions de l’électrophorèse, ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont
donc se séparer les uns des autres. Les cations (+) migrent vers la cathode (-) et les anions se déplacent vers l’anode
(+).
A) Électrophorèse en veine liquide
Dans ce cas, le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le
support de champ est constitué par une solution tampon de pH et de concentration
convenables dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce support peut
être liquide, c’est pourquoi on parle d’électrophorèse en veine liquide. Les espèces
vont se séparer dans le tube en fonction de leur charge.
B) Électrophorèse de zones (verticale et horizontale)
Électrophorèse de zones : Ce type d’électrophorèse peut s’effectuer à l’horizontale ou
à la verticale. Les principales applications utilisent un support poreux stabilisant la phase
liquide : on parle alors d’électrophorèse sur support ou d’électrophorèse de zones. Le
mélange à séparer est déposé sur un support convenable, poreux et imprégné de
tampon. Le support doit être homogène, poreux et inerte. Il existe plusieurs types
d’électrophorèses de zones qui vont varier en fonction de leur support : électrophorèse
sur papier, sur acétate de cellulose, sur gel (amidon, agar, agarose, polyacrylamide etc),
ou en fonction du type d’électrophorèse : électrophorèse à focalisation isoélectrique
(dépend du point isoélectrique), bidimensionnelle (dépend du point isoélectrique et de
la masse moléculaire), ou immunoélectrophorèse (utilisation d’anticorps). Nous allons
nous intéresser à la plus utilisée : L’électrophorèse sur gel.
Électrophorèse sur gel : Électrophorèse utilisée pour séparer les macromolécules
biologiques comme l’ADN en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Le gel
est constitué d’une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur. Les
molécules chargées négativement vont migrer de la borne – vers la borne + et
inversement. Au cours de cette migration, les molécules plus petites vont migrer plus
vites que les grosses molécules. En effet, le support agit comme un « tamis » dans
lequel se prenne les grosses molécules qui ont du mal à progresser. Les deux principaux
gels utilisés sont l’agarose et le polyacrylamide. Le gel d’agarose sert pour les acides
nucléiques et le polyacrylamide peut servir pour les acides nucléiques et pour les
protéines, globalement pour les molécules de très petites tailles.
a) Technique
Le produit de départ est un mélange de molécules, habituellement des fragments produits par digestion pour l’ADN
(découpage) grâce à une enzyme de restriction ou à l’amplification en chaine par polymérase. Durant l’électrophorèse,
ce mélange est séparé en bandes successives. Chaque bande contient des milliers de molécules de la même longueur.
1) Chaque échantillon, constitué d’un mélange de molécules, est
placé dans un puit situé à une des extrémités d’une fine plaque de
gel d’agarose ou de polyacrylamide. Le gel est maintenu en place
dans un petit support de plastique : il baigne dans une solution
tampon aqueuse dans un plateau et à chaque extrémité du
dispositif se trouvent des électrodes. Des fragments de taille
connue peuvent aussi être ajoutés dans un des puits pour servir de
référence.

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2) Lorsque le courant est appliqué, les molécules de charge négative
se dirigent vers l’électrode positive. Les molécules plus courtes se
déplacent plus rapidement que les longues. Les bandes sont
illustrées ici en bleu, mais en réalité, elles ne sont pas encore
visibles.
b) Résultats
Après avoir coupé le courant, on ajoute un colorant (bromure d’ethidium pour
l’ADN). Pour le bromure d’ethidium, les bandes émettent une lumière rose
par fluorescence lorsqu’elles sont placées sous une lumière ultraviolette, ce
qui permet de distinguer les bandes séparées auxquelles le colorant est lié.
Sur le gel ci-dessous, les bandes roses correspondent aux fragments d’ADN
de longueurs différentes séparées par électrophorèse. Si tous les
échantillons sont au départ coupé par la même enzyme de restriction, les
motifs de bandes différents indiquent alors qu’ils proviennent de différentes
sources.
Vidéo : Électrophorèse animation : https://www.youtube.com/watch?v=VWAMz6WLwM0
C) Retard sur gel
Retard sur gel (EMSA) : Technique de biologie moléculaire permettant de détecter une interaction entre une protéine
et de l’ADN ou de l’ARN. Cette expérimentation débute par une incubation d’une sonde radio d’acide nucléique marquée
avec une protéine recombinante (donc possibilité d’observation par électrophorèse). On fait migrer par électrophorèse
le fragment nucléotidique étudié sur une piste et sur une autre le fragment mis en contact avec la protéine susceptible
de se fixer. Si la protéine se fixe effectivement sur le fragment, la migration de ce dernier sera plus lente et aura donc
un retard. La bande correspondante aura migré moins loin sur le gel.
II- Manipulation d’ADN et d’ARN
A) Préparation
a) Extraction d’ADN
Extraction d’ADN : Technique permettant d’isoler l’ADN de cellules ou de tissus. L’ADN ainsi extrait peut ainsi être
utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telle que le séquençage, la PCR ou le clonage. Il existe différents
protocoles pour extraire l’ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe : lyse des cellules,
élimination des protéines, élimination des autres acides nucléiques (ARN, etc), concentration de l’ADN par précipitation
à l’alcool. Différentes variantes sont employées, suivant que l’on cherche à extraire de l’ADN génomique (issu du ou
des chromosomes des cellules analysées) ou de l’ADN plasmidique (provenant de plasmides portés le plus souvent
par des cellules bactériennes comme E. coli). Dans les deux cas, le contrôle de l’extraction peut se faire par
électrophorèse sur gel d’agarose, ou par spectrophotométrie.

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Préparation d’ADN Génomique
On commence en général par une lyse des cellules ou des tissus, consistant éventuellement en un broyage, suivi d’une
extraction par des détergents, qui vont disperser les bicouches lipidiques des membranes et dénaturer les protéines, et
en particulier celles qui sont associées à l’ADN dans la chromatine. La solution obtenue est en général très visqueuse,
car l’ADN ainsi libéré forme de très longs filaments qui s’opposent aux écoulements hydrodynamiques. L’étape suivante
est la déprotéinisation de la solution qui se fait par une extraction au moyen de solvants organiques, en général du
phénol additionné de plus ou moins de chloroforme. Le phénol va déprotéiner tandis que le chloroforme va nettoyer le
phénol restant après utilisation. Les protéines dénaturées forment un précipité à l’interface phénol-eau, tandis que l’ADN
reste en solution dans la phase aqueuse qui est récupérée par décantation ou par centrifugation. L’ADN est ensuite
précipité par addition d’éthanol ou d’isopropanol (pas besoin de sel mais dégrade les petits fragments) dans la phase
aqueuse, collecté par centrifugation et dissout dans du tampon. Pour éliminer les traces de phénol et d’autres
contaminants, on peut enfin pratiquer une dialyse ou une étape de purification par chromatographie préparative.
Vidéo : Vidéo 1 Extraction de l’ADN : https://www.youtube.com/watch?v=qEvn3QWmCNg
Vidéo : Je vous montre MON ADN ! – TP #6 : https://www.youtube.com/watch?v=MrtlAQPlTJ0
Préparation d’ADN plasmidique
La préparation d’ADN plasmidique à partir de bactéries est l’une des techniques les plus
courante de la biologie moléculaire. Le principe de l’extraction est connu sous le nom de lyse
alcaline. Cette méthode permet de préparer sélectivement de l’ADN du plasmide contenu
dans les bactéries, tout en éliminant l’ADN du chromosome bactérien. Le principe de cette
méthode consiste à effectuer la lyse des cellules au moyen d’un détergent en présence de
soude à pH13. À ce pH très alcalin, l’ADN est dénaturé, c’est-à-dire que les deux brins de la
double hélice sont séparés. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la
renaturation brutale. L’ADN chromosomique, très long (106 pb), ne parvient pas à se
réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. L’ADN plasmidique,
court (103 pb) parvient à se réassocier complètement et reste en solution. On sépare alors
les espèces par centrifugation. Les protéines précipitées sont également éliminées avec le
détergent et l’ADN chromosomique. L’ADN plasmidique, resté en solution, est alors
concentré par précipitation à l’alcool. On peut également rajouter des constituants au fur et
à mesure comme des éléments de protection de l’ADN (EDTA : protège contre les DNAse),
et la purification peut se faire par des moyens physiques comme une chromatographie sur
colonne.
Vidéo : Extraction d’ADN à partir de bactérie : https://www.youtube.com/watch?v=QC-
csTqWCLk
b) Digestion enzymatique
Digestion enzymatique : Technique utilisant des enzymes de restriction
pour couper spécifiquement une molécule d’ADN afin de la manipuler ou de
la cloner.
Enzyme de restriction : Protéine capable de couper un fragment d’ADN au
niveau d’une séquence de nucléotides caractéristique appelé site de
restriction. Chaque enzyme de restriction reconnait ainsi un site spécifique.
Plusieurs centaines d’enzymes de restriction sont actuellement connues.
Naturellement présentes chez un grand nombre d’espèces de bactéries, ces
enzymes sont devenues des outils importants en génie génétique. Dans la
nature, elles sont utilisées par la bactérie pour se défendre contre les
infections par des virus. En effet, elles coupent en petits morceaux l’ADN de
ces intrus, ce qui restreint leur infectiosité (d’où leur nom). On utilise
beaucoup EcoRI, BamHI ou encore HindIII, qui reconnaissent
respectivement les séquences GAATTC, GGATCC, AAGCTT
Vidéo : Restriction enzymes (Anglais) : https://www.youtube.com/watch?v=U2cKywEn6KY
Vidéo : Restriction Enzymes (Anglais aussi) : https://www.youtube.com/watch?v=Ik_Pxht1LM0

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c) Clonage
Clonage : Multiplication provoquée d’un fragment d’ADN par l’intermédiaire d’un microorganisme. Cela consiste à isoler
un fragment d’ADN (grâce à des enzymes de restriction) et à le multiplier à l’identique en l’« insérant » dans une
molécule d’ADN appelée vecteur permettant son amplification. Cette technique peut être utilisée pour un clonage partiel,
ne portant que sur un fragment de matériel génétique, mais aussi pour le clonage d’un gène entier permettant la
production de la protéine recombinante correspondante qui serait intéressante. (ex : production d’insuline).
L’« insertion » est souvent réalisée à l’aide d’un vecteur, le plus communément utilisées étant les virus ou les plasmides
bactériens.
B) Amplification
a) Réaction de polymérisation en chaine (PCR)
Réaction de polymérisation en chaine : Polymerase chain réaction (PCR). Cette méthode permet de dupliquer un
grand nombre (avec un facteur de multiplication de l’ordre du milliard) de séquences d’ADN ou d’ARN connue, à partir
d’une faible quantité (de l’ordre de quelques picogrammes) d’acide nucléique (appelé l’amplicon) et d’amorces
spécifiques constituées d’oligonucléotides de synthèse de 20 à 25 nucléotides.

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Étape 1 : Dénaturation initiale
Avant de commencer les cycles de PCR proprement dit, une étape de chauffage (généralement de 10 à 15 minutes à
95°C) est réalisée. Cette étape permet de : déshybrider les ADN double brin, de casser les structures secondaires,
d’homogénéiser le milieu réactionnel par agitation thermique, d’activer les polymérases qui s’activent dans un contexte
de chaleur élevée, de dénaturer d’autres enzymes qui pourraient être dans la solution.
Étape 2 : Phase d’hybridation ou d’appariement des amorces
Cette étape (généralement 2 à 60 secondes à 56-64°C) permet aux amorces sens et anti-sens de s’hybrider aux ADN
matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. Peu de brins d’ADN matrice peuvent
s’hybrider (se lier) avec leur brin complémentaire, ce qui empêche la fixation des amorces, car ces dernières sont bien
plus courtes et en concentration bien plus importante.
Étape 3 : Phase d’élongation
Cette étape (généralement 4 à 120 secondes à 72°C) permet aux polymérases de synthétiser le brin complémentaire
de leur ADN matrice à une température qui leur est optimale. Ce brin est fabriqué à partir des dNTPs libres présents
dans le milieu réactionnel. La durée de cette étape dépend normalement de la longueur de l’amplicon. Cette phase clos
un cycle. Les cycles recommencent jusqu’à ce qu’on atteigne le nombre souhaité de fragments d’ADN.
Vidéo : 5 minutes pour Comprendre – La PCR : https://www.youtube.com/watch?v=JPlTtFYd6e4
Vidéo : PCR – Polymerase Chain Reaction (IQOG-CSIC) (Anglais) :
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo
b) PCR Quantitative ou PCR en temps réel
PCR en temps réel (Real-time PCR) : Cette technique consiste à mesurer la
quantité d’ADN polymérisé à chaque cycle (temps réel) grâce à un marqueur
fluorescent. Ces marqueurs sont des sondes qui vont se fixer sur une zone de
l’ADN et qui ne deviennent fluorescent que liés à cet ADN. Elle permet par son
principe de faire des mesures quantitatives (expliquant l’appellation PCR
quantitative, qPCR) mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers. Il ne faut
surtout pas la confondre avec la RT-PCR (Reverse Transcription PCR).
Vidéo : Principe de la PCR en temps réel :
https://www.youtube.com/watch?v=AZWLysiG3Rg
Des sondes comme les sondes Taqman sont conçues pour accroitre la spécificité
des techniques de PCR quantitative. On peut également utiliser le SYBR Green
I, un composé faisant partie des cyanines (flurophore) qui peut se lier aux acides
nucléiques et émettre une fluorescence.
c) RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) : Technique qui associe une
transcription inverse (RT) suivie d’une PCR. Elle permet de synthétiser le brin
complémentaire d’un ARN avec un désoxyribonucléotides en utilisant une
ADN polymérase ARN dépendante (transcriptase inverse). Cet ADNc est
généralement destiné à être amplifié par PCR (l’ADNc étant plus stable, il
permet plus de liberté que les ARN pour les analyses suivantes).
Transcription inverse : Réaction inverse de la transcription. C’est la
synthèse d’un brin d’ADN à partir d’une matrice ARN grâce à une ADN
polymérase ARN dépendante ou encore transcriptase inverse ou
rétrotranscriptase.
Vidéo : Simplified RT – Reverse Transcription Animation (Anglais) :
https://www.youtube.com/watch?v=0MJIbrS4fbQ&t=101s