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Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et des
substances apparentées
MICHEL DUBOIS, K. A. GILLES, J. K. HAMILTON, P. A. REBERS, and FRED SMITH
Division de biochimie, Université du Minnesota, St. Paul, Minn.
Les sucres simples, les oligosaccharides, les polysaccharides et
leurs dérivés, y compris les méthyléthers avec des groupes
réducteurs libres ou potentiellement libres, donnent une
couleur jaune orangé lorsqu'ils sont traités au phénol et à
l'acide sulfurique concentré. La réaction est sensible et la
couleur est stable. En utilisant cette réaction phénol-acide
sulfurique, une méthode a été mise au point pour déterminer
les quantités submicro de sucres et de substances apparentées.
En conjonction avec la chromatographie de partage sur papier,
le procédé est utile pour déterminer la composition des
polysaccharides et de leurs dérivés méthylés.
Les tests COLORI METRIC pour la réduction des sucres et Les
polysaccharides sont connus depuis longtemps. Les réactifs
tels que le 1-naphtol (33) pour les glucides en général;
benzidine pour les pentoses et les acides uroniques (27, 49,
50); naphto-résorcinol pour les acides uroniques (51); et le
résorcinol (43), le naphthore-sorcinol (39) et l'acide résorcinoldisulfonique (31) pour les cétoses sont des exemples bien
connus de tests colorimétriques pouvant être réalisés en
solution acide. De tels tests et leurs modifications utilisant des
amines aromatiques et des phénols (4, 22, 38) ont récemment
acquis une importance accrue depuis le développement
important de la chromatographie de partage pour la séparation
et la caractérisation de quantités infimes de sucres et de leurs
dérivés (1, 4, 8, 11, 12, 17, 18, 21—23, 26, 36, 39, 47). Les
polyols et les glucides avec un groupe réducteur peuvent être
détectés par le réactif d’argent de Tollens (39, 52), qui est peutêtre l’un des meilleurs réactifs de l’art de la chromatographie.
Les sucres réducteurs sont également décelables à l'acide
picrique (7, 17), à l'acide 3,4-dinitrobenzoïque (5), à l'acide 3,5dinitro-salicylique (6, 32, 48), à l'o-dinitrobenzène (17, 40) et
bleu de méthylène (54), tandis que le diazouracile est considéré
comme spécifique du saccharose ainsi que des oligosaccharides
et des polysaccharides contenant le résidu de saccharose (42).
Les procédures volumétriques impliquant l’utilisation de
ferriCyanure de potassium (19), de sulfate cérique (45), de
sulfate de cuivre (16, 44) et d’hypoïodite de sodium (20)
s’appliquent à la détermination de petites quantités de sucres
réducteurs après séparation par chromatographie de
séparation. Cependant, l'expérience montre que ceux-ci. Les
méthodes nécessitent une habileté considérable et prennent
beaucoup de temps et sont sensibles à de légères variations
dans les conditions.
Les réactifs anthrone (13, 14, 28, 34, 35, 53) et lnaphtolsulfonate (10) sont excellents pour les solutions de
sucre standard (34), mais, lorsqu'ils sont appliqués à l'analyse
des sucres séparés par chromatographie de partage, des traces
de révélateur solvant résiduel peuvent les rendre inutiles. La
plupart des sucres peuvent être séparés sur du papier filtre par
un solvant phénol-eau (39), mais ils ne peuvent alors pas être
déterminés par le réactif anthrone, car le phénol-eau résiduel
maintenu fermement dans le papier interfère avec la couleur
verte produite par le réactif anthrone. De plus, le réactif
anthrone est coûteux et ses solutions dans l'acide sulfurique ne
sont pas stables (30, 34). La méthode à l'anthrone présente
également l'inconvénient d'être satisfaisante pour les sucres
libres et leurs glycosides, son utilisation est limitée pour les
sucres méthylés et les pentoses. Bien que l'acide butanolpropionique-eau soit un excellent solvant pour séparer les
disaccharides (4), l'acide propionique résiduel interfère avec le
procédé au 1-naphtolsulfonate.Le phtalate d’anine (38) et le
trichloroacétate d’aniline (17) ont été utilisés pour la
détermination colorimétrique des sucres et de leurs dérivés (2,
3); ces réactifs, cependant, ne sont pas satisfaisants pour les
cétoses.
Le phénol en présence d'acide sulfurique peut être utilisé pour
la microdétermination colorimétrique quantitative des sucres et
de leurs dérivés méthyliques, des oligosaccharides et des
polysaccharides (15). Cette méthode est particulièrement utile
pour la détermination de petites quantités de sucres séparés
par chromatographie de partage sur papier avec le solvant
phénol-eau, ainsi que pour les sucres séparés avec des solvants
volatils, tels que butanol-éthanol-eau (39), acétate d'éthyleacétique. acide-eau (26), ou méthyléthylcétone-eau (4, 39). La
méthode est simple, rapide et sensible, et donne des résultats
reproductibles. Le réactif est peu coûteux et stable, et une
solution donnée nécessite une seule courbe standard pour
chaque sucre. La couleur produite est permanente et il est
inutile de porter une attention particulière au contrôle des
conditions.
DÉTERMINATION DE LA CONCENTRATION DE SUCRE
PURSOLUTIONS
Réactifs et appareils. Acide sulfurique, qualité de réactif
95,5%, conforme aux spécifications ACS, densité 1,84.Phénol à
80% en poids, préparé en ajoutant 20 grammes d’eau distillée
dans du verre à 80 grammes de phénol redistillé de qualité
réactif. Ce mélange forme un liquide blanc qui se pipette
facilement. On sait que certaines préparations restent
blanchies à l’eau après une année de conservation, alors que
d’autres deviennent jaune pâle en 3 ou 4 mois. La couleur
jaune pâle qui se développe parfois n'interfère pas dans la
détermination, dans la mesure où un blanc est inclus.Coleman
Junior, Evelyn, Klett-Summerson ou Beckman
Spectrophotomètres DU. Tous ont été utilisés avec satisfaisante
résultats dans cette enquête.
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