54-58-Biomedicaments_320.qxp 21/03/11 18:48 Page 54 Bioproduction Soigner par les plantes Produire rapidement et en quantité quasi-illimitée des médicaments en utilisant les plantes est aujourd’hui possible. Le « molecular farming » permet désormais la synthèse de protéines thérapeutiques moins chères et parfois plus efficaces que celles issues d’autres systèmes de bioproduction couramment utilisés par l’industrie pharmaceutique. D (1) Hiatt A et al. (1989) Nature 342, 76-8 (2) Houdebine L-M (2006) Biofutur 264, 32-7 (3) Faye L, Gomord V (2010) Plant Biotechnol J 8, 525-8 ès le début des années 1980, des protéines d’intérêt thérapeutique difficiles à isoler ou trop complexes pour être synthétisées sont produites en grande quantité et dans des conditions parfaitement contrôlées grâce à des organismes génétiquement modifiés (OGM) : bactéries, levures ou cellules animales. Le génie génétique révolutionne et enrichit rapidement les méthodes de recherche et de production des médicaments. Ce n’est qu’en 1989, avec la production d’un anticorps fonctionnel dans des plantes de tabac, que les plantes génétiquement modifiées (PGM) entrent dans la liste des OGM producteurs de biomédicaments recombinants (1). Les OGM classiquement utilisés permettent la production de molécules thérapeutiques plus ou moins complexes. La synthèse des composés les plus simples, comme l’insuline destinée au traitement du diabète de type I, est ainsi confiée à des bactéries ou à des levures transgéniques. En revanche, des molécules plus complexes, comme les anticorps, qui nécessitent pour leur activité thérapeutique de nombreuses étapes de maturation post-traductionnelle, sont produites le plus souvent dans des cellules de mammifères comme les cellules ovariennes de hamster chinois (CHO). Ces systèmes de bioproduction sont toutefois coûteux pour l’industrie pharmaceutique et mal adaptés à la croissance rapide de la demande en nouveaux biomédicaments. En particulier, les besoins en anticorps recombinants destinés à l’immunothérapie des cancers augmentent très rapidement et pourraient dépasser prochainement la capacité de production des installations disposant de grands volumes de cellules de mammifères cultivées en bioréacteurs. D’où l’intérêt de l’industrie pharmaceutique pour de nouveaux systèmes de production de biomédicaments, comme les plantes ou les animaux transgéniques. De nombreuses protéines thérapeutiques ont notamment été produites chez des animaux transgéniques producteurs de lait, ce dernier pouvant être une source industrielle de protéines biologiquement actives (2). Plusieurs biomédicaments, produits dans le lait de chèvres ou de brebis 54 BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 transgéniques, ont ainsi passé avec succès les premiers tests cliniques. C’est le cas de l’antithrombine III, premier produit de ce type approuvé par l’Agence européenne des médicaments en 2006 et la Food and Drug Administration (FDA) américaine en 2009. Les végétaux ne sont pas en reste. Depuis 1989 et la première production expérimentale d’un anticorps fonctionnel par une plante transgénique, plusieurs centaines de publications scientifiques et une centaine de familles de brevets concernent des composés biopharmaceutiques produits par ce procédé dit de « molecular farming » (1,3). Une douzaine de biomédicaments sont aujourd’hui en phase clinique d’essais et trois ont déjà reçu une autorisation de mise sur le marché (AMM) pour une administration à l’homme (tableau p. 60). La maîtrise de la transgenèse végétale a non seulement permis d’obtenir et de commercialiser, à partir de 1996, des plantes agricoles tolérantes à un herbicide et/ou résistantes à des insectes ravageurs, mais elle a également offert une alternative à la production de biomédicaments. Diversité des systèmes de production De nombreux médicaments recombinants (anticorps, vaccins, hormones...) ont été produits dans des plantes transgéniques et stockés plus particulièrement dans certains organes végétaux comme les graines (maïs, riz...) ou les feuilles (tabac, luzerne…) (figure ci-contre). En outre, les plantes offrent de nombreux compartiments cellulaires de stockage des molécules recombinantes, depuis leur système endomembranaire de sécrétion (vacuoles, réticulum endoplasmique) jusqu’à leur cytosol ou leurs chloroplastes. À l’instar de la graine ou de la feuille, ces compartiments de la cellule végétale représentent des systèmes d’expression distincts, où la stabilité et les maturations posttraductionnelles de la protéine d’intérêt s’expriment différemment. Si certaines plantes transgéniques productrices de médicaments sont cultivées en plein champ, 54-58-Biomedicaments_320.qxp 21/03/11 18:48 Page 55 Loïc Faye ANGANY Genetics, Seine Biopolis, 70, route de Lyons, 76000 Rouen [email protected] Production de biomédicaments après transformation génétique © ANGANY GENETICS Après clonage d’un ADN complémentaire (ADNc) codant la protéine thérapeutique (ici un anticorps), cet ADNc est souscloné dans un vecteur d’expression. Celui-ci sert à la transformation de la bactérie Agrobacterium tumefaciens. Lors de la coculture de l’agrobactérie transformée avec des fragments de tissus végétaux, l’ADNc est transféré dans le génome de cellules végétales qui seront multipliées sur un milieu de culture (photo). Ces cellules sont utilisées directement pour la production du biomédicament dans des fermenteurs. Elles permettent également de régénérer des plantes transgéniques cultivées pour la production de biomédicaments dans leurs graines ou leurs feuilles. Six à huit mois sont nécessaires pour la production d’un biomédicament suivant ces stratégies. la culture en serre et celle de cellules végétales en fermenteur permettent de contrôler l’environnement et la reproductibilité des conditions de production. Graines… Les plantes stockent naturellement des molécules de réserve dans leurs graines. Utiliser ce système naturel pour accumuler des protéines à forte valeur ajoutée offre l’avantage d’une grande stabilité et d’une forte concentration du produit cible. Des entreprises de biotechnologie l’ont bien compris et produisent des biomédicaments dans les graines de plantes transgéniques. La société américaine Ventria Biosciences, par exemple, a développé la production de lactoferrine (glycoprotéine bactéricide) et de lysozyme humains dans la graine de riz (dans une zone sans riziculture alimentaire). Un facteur de croissance et des cytokines humaines sont également produits dans l’orge, sous serres, par la société islandaise ORF Genetics. Citons encore le facteur intrinsèque*1 humain recombinant produit par l’entreprise danoise Cobento Biotech dans des graines d’Arabidopsis thaliana. La production dans les graines est particulièrement compétitive pour des applications qui nécessitent de grandes quantités de biomédicaments. C’est ce qui a poussé la société canadienne SemBioSys à développer un procédé de production d’une insuline humaine recombinante dans les graines de carthame*2. Même avec des taux d’expression relativement faibles, trois entreprises agricoles utilisant un tel système de production végétale pourraient couvrir à elles seules la demande globale en insuline. Ce type de production est en effet très rentable puisque 100 hectares de cultures suffisent à produire 200 à 400 kg de protéine. Autre avantage de la production de biomédicaments dans les graines, la possibilité de séparer les phases de production, d’extraction et de purification en raison des capacités naturelles de stockage et de conservation des graines. Un anticorps peut ainsi rester stable pendant trois ans dans des graines de maïs stockées à température ambiante (4). BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 55 *1 Ou facteur de Castle. Glycoprotéine stomacale indispensable à l’absorption de la vitamine B12 (cobalamine) impliquée dans la production des neuromédiateurs. *2 Famille de plantes méditerranéennes proches du chardon (4) Baez J et al. (2000) BioPharm 3, 50-4 54-58-Biomedicaments_320.qxp 21/03/11 18:49 Page 56 Bioproduction *3 Ou pseudo-peste aviaire. Zoonose virale proche de la grippe aviaire. *4 En France, l’ATU permet la mise à disposition précoce d’un médicament avant l’obtention de l’AMM. Elle est accordée dans des situations prévues par la loi, en particulier pour le traitement de maladies rares et quand il n’existe pas de traitement approprié disponible sur le marché. Contrairement à un essai clinique, elle n’a pas pour objectif d’apporter une réponse sur l’efficacité du médicament. *5 Particules mimant la structure originale d’un virus mais dénuées de matériel génétique viral, donc non infectieuses et incapables de se multiplier. (5) Shaaltiel Y et al. (2007) Plant Biotechnol J 5, 579-90 (6) Marillonnet A et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 6852-7 (7) Landry N et al. (2010) PLOS ONE 5(12), doi:10.1371/journal.pone.00 15559 … feuilles… Les systèmes de production foliaires sont également très utilisés car ils permettent une production rapide en très grand volume. Les feuilles de plantes transgéniques, principalement du tabac, ont permis de produire avec succès de nombreuses molécules thérapeutiques. Une douzaine est en phase d’essais cliniques et deux ont reçu une AMM pour une administration à l’homme (tableau p. 60). Dans les feuilles, les molécules d’intérêt sont essentiellement produites et stockées dans les chloroplastes et le système de sécrétion. La transformation du génome du chloroplaste offre de très hauts rendements de production, le biomédicament pouvant représenter jusqu’à 70 % des protéines solubles de la feuille. Cependant, l’origine bactérienne de ce compartiment cellulaire ne permet d’y produire que des molécules thérapeutiques simples. La maturation des protéines y est en effet moins efficace que dans le système de sécrétion des cellules foliaires, dont la machinerie enzymatique très voisine de celle des cellules de mammifères permet la production de protéines complexes, mais au détriment du rendement, qui dépasse rarement 1 à 2 % des protéines contenues dans un extrait foliaire. La société américaine Planet Biotechnology produit ainsi une immunoglobuline A (IgA) composée de dix polypeptides dans le système de sécrétion de plants de tabac. Commercialisée pour une utilisation chez l’homme sous le nom de CaroRX, cette IgA sécrétoire est destinée au traitement de la carie dentaire. … et bioréacteurs végétaux Si la majorité des protéines recombinantes à usage pharmaceutique disponibles sont produites par des cellules de mammifères ou des bactéries dans des bioréacteurs, les cultures de cellules végétales sont également utilisées depuis plusieurs décennies pour produire des métabolites secondaires thérapeutiques, anticancéreux comme le paclitaxel ou antibactériens comme la shikonine. Ces cellules font désormais figure d’alternative avantageuse aux cellules de mammifères © ANGANY GENETICS Pour la production de petits lots de biomédicaments par la technique de l’expression transitoire, les agrobactéries sont injectées manuellement (à gauche). Des disques foliaires prélevés 6 à 10 jours plus tard servent à analyser les différents prototypes de biomédicaments (à droite). 56 BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 pour la production de biomédicaments dans des conditions optimales de confinement des produits. Ceci fut d’abord illustré par Dow AgroSciences, qui produit dans des cellules de tabac un vaccin protégeant les volailles contre le virus de la maladie de Newcastle*3, approuvé par la FDA en janvier 2006. L’agence américaine est également en passe de donner son accord pour l’utilisation d’une glucocérébrosidase humaine produite dans des cellules de carottes par la société israélienne Protalix Biotherapeutics et destinée à l’enzymothérapie substitutive des patients atteints de la maladie de Gaucher de type I (5). Ce biomédicament, produit par Pfizer et connu sous le nom de UPLYSO, a obtenu une Autorisation temporaire d’utilisation*4 en France en juillet 2010. Outre l’aspect purement scientifique, c’est le faible coût de ces systèmes d’expression végétaux qui les rend avantageux. La glucocérébrosidase de Protalix est un exemple des économies pour les systèmes de santé que représente l’utilisation de biomédicaments produits chez les plantes. Alors que le coût de Cerezyme, le même traitement produit dans des cellules CHO par l’américaine Genzyme, peut atteindre 200 000 euros par an (coût de traitement par patient), UPLYSO coûte de 100 000 à 150 000 euros par an. Produire plus et plus vite L’adoption des PGM pour la production de biomédicaments a jusqu’ici été limitée en raison des faibles rendements observés pour la majorité des protéines thérapeutiques. Limitation levée par l’utilisation récente de l’« expression transitoire » de gènes d’intérêt dans des plantes qui permet d’atteindre des rendements très élevés, de l’ordre de 25 à 50 % des protéines solubles. Les plantes en question ne sont pas des PGM : le gène ne s’intègre pas au génome des cellules dans lesquelles il est introduit, il est simplement exprimé à partir d’un vecteur – un virus spécialement conçu à cet effet, par exemple – le temps de synthétiser la protéine thérapeutique (6). Il s’agit donc ici d’une transfection et non d’une transgenèse. L’émergence récente de pandémies grippales, comme celles qui ont incriminé les virus H5N1 et H1N1, a mis en avant un autre atout de l’expression transitoire : la production en quantité de biomédicaments moins d’une semaine après la transfection des plantes. Alors que plusieurs mois ont été nécessaires pour produire un vaccin par les systèmes traditionnels, la société canadienne Medicago a injecté à des souris un vaccin conférant une forte réaction immunitaire spécifique contre le virus H1N1 seulement un mois après la publication de la séquence du génome de celui-ci. Ce vaccin est produit par expression transitoire du tabac, sous la forme de pseudoparticules virales*5 (7). Ces résultats, et le passage du candidat vaccin en phase II de tests cliniques, illustrent le potentiel de l’expression transitoire pour la production de vaccins dans un contexte pandémique ou d’attaque bioterroriste. D’autres applications de cette technique sont en cours 54-58-Biomedicaments_320.qxp 21/03/11 18:49 Page 57 © ANGANY GENETICS Production de biomédicaments par expression transitoire de développement. La société rouennaise Angany Genetics utilise par exemple l’expression transitoire chez le tabac pour produire des allergènes recombinants destinés à la désensibilisation par voie orale de patients allergiques aux acariens. Bayer Innovation utilise également l’expression transitoire chez le tabac pour produire des vaccins individualisés destinés au traitement des lymphomes non hodgkiniens. Medicago au Canada, Kentucky Bioprocessing aux ÉtatsUnis… Plusieurs sites de bioproduction arborant le label GMP (Good Manufacturing Practices) et utilisant l’expression transitoire chez le tabac sont déjà opérationnels sur le continent nord américain. Un projet d’installation est également en cours d’étude en France. Ces unités de production sont organisées autour de serres présentant un très haut niveau de confinement. Avec la construction d’unités de production à faible coût dont la capacité de production dépasse la centaine de millions de doses de vaccin par an, l’expression transitoire chez les plantes pourrait faire évoluer rapidement les choix de l’industrie pharmaceutique en faveur de l’utilisation des plantes pour la production de médicaments. Dans la production par expression transitoire, Agrobacterium tumefaciens est utilisée pour le transfert d’un ADNc codant le biomédicament, mais le gène d’intérêt n’est pas intégré dans le génome de la cellule végétale. On parle ici de transfection et non de transgenèse. L’agrobacterie est transférée dans le tissu foliaire par agro-infiltration selon deux procédés. Pour la production de petits lots de biomédicament destinés au criblage de prototypes, les agrobactéries sont injectées manuellement grâce à une seringue appliquée contre l’épiderme de la face inférieure de la feuille. Des disques foliaires prélevés dans les feuilles 6 à 10 jours après l’agro-infiltration sont utilisés pour l’analyse des différents prototypes de biomédicaments (photo p.56). Cette étape de criblage permet de définir le vecteur d’expression qui sera utilisé pour l’obtention d’un biomédicament de qualité optimale. Le même procédé est utilisé pour la production à grande échelle en condition GMP (Good Manufacturing Practices). L’agro-infiltration s’effectue alors sous vide, dans des enceintes contenant plusieurs litres d’une culture d’agrobactéries et où plusieurs dizaines de plantes sont infiltrées simultanément. Ces plantes sont ensuite remises en culture pendant 6 à 10 jours avant la purification du biomédicament à partir des extraits foliaires. Du biosimilaire au biobetter La machinerie de maturation des protéines des plantes étant très voisine de celle des mammifères, on peut lui faire produire des molécules complexes biologiquement actives et utilisables en thérapie. Toutefois, certains mécanismes de maturation, en particulier la N-glycosylation, ne sont pas exactement identiques d’un règne à l’autre. Il a ainsi été montré, dix ans après la synthèse du premier du genre dans un plant de tabac, qu’un anticorps produit dans une plante présente une glycosylation typiquement végétale, suffisante pour son activité mais immunogène chez les mammifères (8,9). La recherche s’est alors très activement penchée sur la question, avec pour résultat majeur la production dans plusieurs systèmes d’expression végétaux d’anticorps à la glycosylation parfaitement humanisée (10). L’ingénierie de la N-glycosylation, et plus globalement des maturations protéiques, permet aujourd’hui d’utiliser les plantes pour la production massive et à un faible coût de médicaments biosimilaires*6. Parmi les exemples notables, on peut citer le trastuzumab, un anticorps monoclonal destiné au traitement du cancer du sein, BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 57 *6 Biomédicament qui a prouvé sa similarité en termes de qualité, de sécurité et d’efficacité par rapport à un médicament de référence. (8) Cabanes-Macheteau M et al. (1999) Glycobiology 9, 365-72 (9) Gomord V et al. (2004) Plant Biotechnol J 2, 83-100 (10) Gomord V et al. (2010) Plant Biotechnol J 8, 564-87 54-58-Biomedicaments_320.qxp 21/03/11 18:49 Page 58 Bioproduction Biomédicaments et vaccins produits dans les plantes et ayant franchi avec succès le cap des essais précliniques Système végétal d'expression Tabac transgénique (feuille) Culture cellulaire de carotte transgénique Pomme de terre transgénique (tubercule) Produit Application/traitement Guy's 13 SIgA (CaroRx) (Anticorps) Carie dentaire RhinoRx (Anticorps) Prophylaxie du rhinovirus 2G12 IgG (Anticorps) Prophylaxie du VIH Glucocérébrosidase (Enzyme thérapeutique) Maladie de Gaucher Acétylcholestérase (PRX6105) (Enzyme thérapeutique) Défenses naturelles Antigène de surface du virus de l'hépatite B (Vaccin) Protéine de capside du virus Norwalk (Vaccin) Vaccins contre les grippes pandémiques et saisonnières (pseudo-particules virales) Compagnie Essais cliniques Planet Biotechnology Inc. Phase II terminée. Approuvé pour l'Union Européenne Phase II Pharma-Planta consortium Protalix Phase I (début Q2 2009) Essais en phase III terminés en sept 2009, ATU en juillet 2010 Phase I (mars 2010) Hépatite B Groupe du Pr Arntzen, Arizona State University Phase I Risques de transmission de la grippe Medicago Inc. Phase I terminée (déc. 2009) Phase II Q4 2010 IgG personnalisées (Vaccin) Lymphomes non-hodgkiniens Bayer Innovation Phase I (déc 2009) Lipase gastrique (Enzyme thérapeutique) Mucoviscidose, pancréatite Lactoferrine (Nutrition) Infections gastrointestinales infantiles Lentille d’eau transgénique Interferon alpha-2b (Cytokine) Hépatite C Biolex Therapeutics Phase III (2011) Carthame transgénique (graine) Insuline (SBS-1000) (Protéine thérapeutique) Diabète SemBioSys Phase I/II terminée Q1 2009 Arabidopsis thaliana transgénique (graine) Facteur intrinsèque humain (Nutrition) Déficience en vitamine B12 Cobento Biotech SA Phase II terminée. En vente dans l'Union Européenne Nicotiana benthamiana (transitoire, feuille) Maïs transgénique (graine) Laitue transgénique (feuille) Epinard (transitoire, feuille) (11) Grohs B et al. (2010) J Agric Food Chem 58, 10056-63 (12) Vezina L et al. (2009) Plant Biotechnol J 7, 442-5 (13) Brevet WO2008/056265 « A set of sequences for targeting, expression and control of post translational modification of recombinant polypeptides ». Licence exclusive d’exploitation L10287-ANGANY Genetics *7 Alors que le biosimilaire est une imitation aussi efficace que le médicament original, le « biobetter » contient des améliorations moléculaires lui conférant, par exemple, une meilleure efficacité ou une sécurité renforcée. Antigène de surface du virus de l'hépatite B (Vaccin) Glycoprotéine du virus de la rage (Vaccin) Gastroentérite virale Hépatite B Rage récemment produit par expression transitoire dans le tabac (11). Cet anticorps présente la même structure et une activité biologique similaire au trastuzumab produit dans des cellules CHO et commercialisé par l’industriel suisse Roche sous le nom d’Herceptin. Les plus récents développements du molecular farming démontrent que les systèmes végétaux peuvent répondre à des demandes encore non satisfaites de l’industrie pharmaceutique. Car non content d’offrir la possibilité de produire des biosimilaires, le molecular farming permet aussi celle de biomédicaments plus efficaces, dits « biobetters »*7. Les maturations protéiques spécifiques des plantes peuvent être, dans certains cas, un atout pour la production de biobetters, comme en témoigne la glucocérébrosidase humaine recombinante produite par Protalix Biotherapeutics. Contrairement à celle de Genzyme, produite dans des cellules CHO, elle ne nécessite aucun remodelage in vitro de sa glycosylation pour être efficace dans le traitement de la maladie de Gaucher. L’efficacité d’un biomédicament peut également être optimisée par l’ingénierie métabolique du système de production, en particulier de sa machinerie de glycosylation, pour mieux répondre aux demandes de l’industrie pharmaceutique. La plateforme d’Angany Genetics associe ainsi, d’une part, la rapidité et les rendements importants permis par l’expression transitoire chez le tabac et, d’autre part, des techniques d’ingé58 BIOFUTUR 320 • AVRIL 2011 Meristem therapeutics Phase II Phase I Thomas Jefferson University Polish NAS Groupe du Pr Yusibov, Fraunhofer, USA Phase I Phase I nierie métabolique qui optimisent la qualité et l’efficacité thérapeutique des biomédicaments recombinants (12,13). Un avenir végétal Après plus de vingt ans de mise au point, les plantes productrices de biomédicaments constituent maintenant une alternative pratique aux systèmes standard d’expression utilisés, depuis plusieurs décennies, par l’industrie pharmaceutique. De nombreuses plateformes végétales de bioproduction sont d’ores et déjà disponibles. Elles permettent la production en masse et à bas coût de médicaments dans les graines ou les feuilles de plantes transgéniques et dans des cellules végétales cultivées en fermenteur. Elles permettent encore, grâce à l’expression transitoire, la production en quelques jours d’un très grand nombre de doses de vaccin. De très nombreuses molécules complexes couvrant une large gamme d’effets thérapeutiques peuvent y être synthétisées, dont certaines viennent de faire leur entrée sur le marché ou seront commercialisées très prochainement. ! Remerciements : L’auteur bénéficie du soutien financier de la communauté européenne dans le cadre du réseau Molecular Farming : COST Action FA0804. Les Dr A.-C. Fitchette et V. Gomord sont vivement remerciées pour leur contribution à la préparation de cet article et plus particulièrement V.G. pour la réalisation des illustrations.