Diaporama Hervé Sanguin

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Apport des NGS pour l'étude de la diversité mycorhizienne en
milieu méditerranéen
Perspectives pour le décryptage des réseaux écologiques
Herve Sanguin
UMR Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes
Exploration de la Biodiversité par NGS, de nouveaux horizons ? 16 mai 2013, IMBE, Marseille,
1
Symbioses
Mycorhiziennes
Explosion
Démographiques ?
350-420 K espèces
Angiospermes
Joppa et al. 2010
270 K espèces
Diversité
Hawksworth, 1991
Régions tempérées
CHAMPIGNONS
Régions tropicales
Exploration
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Angiospermes
9,9 M
Cannon, 1997
1,5 M
3,5-5,1 M
5,1 M ?
O’brien, 2005
Blackwell, 2011
APPORT DES NGS ?
1,5 M + ?
0,6-0,7 M
(100 K connues selon
The Dictionary of Fungi;
Kirk et al., 2008 )
(69-74 K connues)
Hawksworth, 1991; 2001
0,5 M
(43 K connues?)
May, 2000
Smith and Mueller, 2007; Mora et al. 2011
IMA fungus
Hawksworth 2011
LES MYCORHIZES
Angiospermes
Gymnospermes
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Ectomycorhizes (EcM)
Gymnospermes
Angiospermes
Mycorhizes à arbuscules
(CMA)
Ectendomycorhizes
Angiospermes
Gymnospermes
Bryophytes
Mycorhizes
Arbutoïdes et monotropoïdes
Ptéridophytes
Ericales
Endomycorhizes des Ericacées
Ericales
Bryophytes
Endomycorhizes des Orchidées
Orchidales
Selosse et Le Tacon, 1995; Brundrett, 2004, 2009; Smith and Read 2008; Van Elsas et al. 2006
“The study of plants without their mycorrhizas is the
study of artefacts. The majority of plants, strictly
speaking, do not have roots; they have mycorrhizas”
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16 mai 2013, IMBE, Marseille,
BEG-Committee, 25th May 1993
> 80% des plantes terrestres forment des symbioses mycorhiziennes
•
•
•
94% des angiospermes (familles), dont 82% avec des CMA et 2% avec des EcM
>250 000 espèces sont associées à des CMA
8000 espèces de plantes sont EcM
Apparition des CMA il y a plus de 460 M d’années (Ordovicien)
•
•
Symbiose ectomycorhizienne (- 130 M, Crétacé)
Symbiose rhizobienne (- 70 M)
Redecker et al. 2000
Rôle important dans le cycles des nutriments (N,P,C)
Amélioration de la nutrition des plantes (essentiellement P),
rôle crucial dans les environnements arides et semi-arides
Biomasse plante
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Mycorhizes et Services Ecosystémiques
mycorhizé
Pisolithus albus /
Acacia mangium
non-mycorhizé
P ajouté au sol
Rôle dans les processus de facilitation (réseaux mycorhiziens)
Rôle dans la succession végétale
Systèmes in vitro
Sous serre
plante hôte + substrat
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Les Glomeromycètes:
Biotrophes obligatoires
Production d’inoculum
IJdo et al. 2011
Collections (GINCO-BEL / IBG / INVAM)
(janvier 2013)
CMA
241
Espèces
Régions tropicales
EcM
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Régions tempérées
Nombreuses régions tropicales et
semi-arides faiblement étudiées
(forte diversité floristique)
> 5 000
espèces
2
« Barcoding »
pour les
Champignons
Mycorhiziens
Bouleversement familial
chez les Glomeromycètes
Oehl et al. 2011
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Kruger et al. 2011
Young et al. 2012
Schuessler et Walker 2010
Stockinger et al. 2009
Oehl et al. 2011
Oehl et al. 2011
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À partir de Krueger et al 2011
(Young et al. 2012)
Consensus pour la classification
des Glomeromycètes
4 ordres
11 familles
26 genres
Oehl et al. 2011
Redecker et al. 2013
Code barre Universel pour les champignons ?
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Bellemain et al., 2010
Biais taxonomique amorcedépendant au cours de la
PCR
Combinaison d’amorces
pour l’environnement ?
COS1 (animaux) = faible amplification
Schoch et al., 2012
RPB1 = faible amplification
(peu de CMA, autres travaux en cours)
SSU = faible résolution au niveau
de l’espèce(pour les Glomeromycetes?)
ITS > LSU = performant
(pour les CMA? forte variabilité = faible résolution )
COMBINAISON DE MARQUEURS pour certains groupes taxonomiques?
Code barre spécifique pour les Gloméromycètes ?
SSU
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•
•
Base de données la plus large (environnement)
Relative résolution au niveau de l’espèce (moins de zone hypervariable
comme pour le 16S)
ITS
•
Trop forte variabilité au niveau de l’espèce (Stockinger et al. 2009) , ITS2
meilleure code barre que ITS1 car moins variable (6th New Phytologist
Workshop, Nancy, France, Novembre 2012)
•
Pas d’amorce spécifique (Environnement = 2% des séquences; Baldrian et al., 2011;
Blaalid et al. 2011)
LSU
•
•
•
Bonne résolution au niveau de certaines espèces
Base de données moins exhaustive
Amorces exclues une part de la diversité (+ non spécificité)
Fragment long (1500 pb)
= non adapté pour les étude haut–débit dans l’environnement
Accès aux Gloméromycètes dans l’environnement ?
SSU
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•
•
•
Base de données la plus large (environnement) mais faible résolution au
niveau de l’espèce ?
Plusieurs couples d’amorces pour les approches haut-débit
NS31/AM1 (Helgason et al. 1998)
- le plus utilisé
- non exhaustif en terme diversité
- non spécificité relativement élevé
- taille de l’amplicon adaptée pour les NGS
•
AML1-AML2 (Lee et al., 2008)
- exhaustif
- spécifique
- taille de l’amplicon trop grande pour les NGS
•
NS31-AML2 (Davison et al., 2011)
- exhaustif
- relativement spécifique
- taille de l’amplicon adaptée pour les NGS
Opik et al., 2009
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Base de données “Champignons”
http://unite.ut.ee/
http://www.fungalbarcoding.org/
http://aftol.org/
http://www.arb-silva.de/
http://www.barcodeoflife.org/
http://maarjam.botany.ut.ee/
3
NGS
et
Diversité
Mycorhizienne
Accès aux Glomeromycètes
au niveau mondial
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Opik et al., 2013
Majorité des études en Amérique du Nord et en Europe
(>70% des séquences en 2012)
Les écosystèmes SUD
méditerranéens restent encore peu explorés
Limites des approches traditionnelles
EcM
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• Morphotypage et/ou identification moléculaire
•
•
•
•
Laborieux
dépendant de l’expertise (biais utilisateur-dépendant)
dépendant du type de plantes, de l’âge de l’EcM, etc….
sous estimation / sur estimation de la diversité
CMA
• Tri de spores et/ou identification moléculaire
• Laborieux
• dépendant de l’expertise (biais utilisateur-dépendant)
• Non représentatif des « mycorhizes »
• Clonage/séquencage à partir de fragments racinaires
• 30 à 100 clones….
Saturation de la diversité ???
Biais du à la très forte proportion de certains taxa
Clonage-séquençage VS pyroséquençage
Clonage-séquençage
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•
Faible nombre de clones + surreprésentions de certains groupes
• mauvaise estimation de la saturation
•
Séquençage de long fragments d’ADN
• étude phylogénétique plus robuste
Pyroséquençage
•
Grands nombres de séquences (approches semi-quantitatives)
• meilleure estimation de la diversité
• Surestimation de la diversité = importance du débruitage des données
(Qualité des séquences, taille, chimère, type de clustering)
• Etapes de débruitage peu développés dans les études sur les communautés
mycorhiziennes
•
Grands nombres d’échantillons (approches globales)
• meilleure représentation de l’écosystème
•
Séquençage de fragments d’ADN plus ou moins long
• Importance du choix des couples d’amorces
• étude phylogénétique moins robuste
• Amélioration des performances (qualité/taille) des NGS
454, passage d’une moyenne de 100 à 400-500 pb en qques années
Cas du Genévrier de Phénicie
Juniperus phoenicea L. (family Cupressaceae)
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Espèce native du pourtour Méditerranéen
•
•
Résistance aux carences en eau et en nutriments
Propriétés de plantes pionnières
• Certaines populations menacées (IUCN Red List)
• Répartition en France, limite nord dans la réserve
des Gorges de l’Ardèche
Boratynski et al. 2009
Cas du Genévrier de Phénicie
Juniperus phoenicea L. (family Cupressaceae)
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Statut mycorhizien
•
•
Endomycorhizien ??? (Azevedo, N. F. dos S. de. 1971)
Reste peu documenté (Mejstrik and Cudlin, 1983)
Dépendance mycorrhizienne et statut endomycorizhien chez d’autres
espèces de Genévrier, mais peu d’étude de diversité
•
J. communis, J. chinensis, J. monosperma, J. osteosperma, J. oxycedrus and J.
procera (Roncadori and Pokorny, 1982; Reinsvold and Reeves, 1986; Wang and
Qiu, 2006)
Nécessité d’appréhender la diversité mycorhizienne
associée
•
•
Lien avec le contexte écologique (paramètre édaphique)
Développement de stratégie de mycorhization controlée performante
(lien diversité – contexte écologique)
= Domestication,
Restoration d’écosystème
Un habitat original
Les falaises des Gorges de l’Ardèche
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Trees 1 and 2
France
Tree 3
Gaud, Saint-Remèze
Gaud, Saint-Remèze
Tree 1
Méditerranée
Photo JP Mandin
Fortes températures, déficit en eau et en éléments nutritifs, développement
racinaire difficile, verticalité, régénération difficile (dissémination des graines),
perturbation rare mais violente
Exploration de la diversité des CMA
associés au Genévrier de Phénicie
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3 arbres modèles
•
•
Extraction ADN à partir de fragments racinaires
Approches PCR ciblant SSU adaptée de Davison et al. 2011 (NS31-AML2)
Pyroséquençage (454) d’amplicons
•
•
•
3000 à 4000 séquences brutes / arbre
Débruitage des données selon Schloss et al. 2011 (utilisation de Mothur)
Pre-Clustering (Huse et al 2010; Schloss et al 2011) , Eliminations des chimères
via UCHIME (Edgar et al. 2011) et des séquences non spécifiques, Clustering
(MOTUs), Eliminations des singletons(?) (Unterseher et al, 2011), et Normalisation
par ré-échantillonnage des MOTUs
avec singletons
232 MOTUs (97%)
sans singletons
56 MOTUs (97%)
Exploration de la diversité des CMA
associés au Genévrier de Phénicie
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Rhizophagus
12 MOTUs
Funneliformis
1 MOTU
Uncertain glomeraceae
19 MOTU
Sclerocystis
2 MOTUs
Glomerales
Uncertain position
Uncertain glomerales
1 MOTU
Claroideoglomeraceae
1 MOTU
Uncertain
position Glomus
Archaeosporales
Uncertain glomeraceae
20 MOTU
Paraglomerales
Diversisporales
Neighbor-Net analysis
(bootstrap= 1000 iter)
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Exploration de la diversité des CMA
associés au Genévrier de Phénicie
Juniperus 1
30 MOTUs
Rhizophagus
MOTU_2
19
18
4
Uncertain
glomeraceae
MOTU_9
3
4
2
6
Uncertain
glomeraceae
MOTU_16
MOTU_2
J1 (419 séquences)
J2 (110)
J3 (957)
Juniperus 3
15 MOTUs
MOTU_9
J1 (5 séquences)
J2 (791)
J3 (43)
MOTU_16
J1 (1 séquences)
J2 (24)
J3 (3)
Juniperus 2
27 MOTUs
Cas de l’Arganier
Argania spinosa (family Sapotaceae)
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Espèce endémique du Maroc
•
Région du Sud-Ouest et en particulier la plaine du Souss (populations isolées
nord-est du Maroc et dans la région de Tindouf en Algérie)
•
L’arganeraie recouvre 828 000 hectares
• Patrimoine universel de l’UNESCO
Aire de distribution
• Forte adaptation au stress hydrique et aux
variations de températures (intérêt pour lutter contre la
désertification)
MAROC
ALGERIE
• Importance socio-économique (huile d’argan) et
environnementale
• Espèce menacée (pression anthropique et faible
régénération, réduction de 50% en un siècle)
Cas de l’Arganier
Argania spinosa (family Sapotaceae)
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Statut Mycorhizien
•
•
•
Endomycorhizien (Nouaim et al., 1994)
« Forte » dépendance mycorrhizienne (Nouaim et al 1994, 2002)
Pas d’étude exhaustive de la diversité des CMA associés (Lahcen et al.,
2009)
Nécessité de caractériser la diversité mycorhizienne
associée
•
•
Lien avec les contextes pédo-climatiques et la grande diversité des
terroirs et génétique des arganiers
Développement de stratégie de mycorhization controlée ou de gestion du
potentiel mycorhizien (lien diversité – contexte écologique – plantes
nurses)
= Domestication,
Amélioration de la régénération
naturelle, Restauration d’écosystèmes
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Sites d’étude
(15 sites, analyse spores et/ou racines)
Essaouira
Marrakech
Agadir
X2
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SPORES
Exploration de la diversité des
CMA associés à l’Arganier
Scutellospora sp1
Scutellospora sp2
Scutellospora sp3
Gisgaspora margarita
Gisgaspora margarita
RACINES
Glomerales
Exploration de la diversité des
CMA associés à l’Arganier
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Uncertain glomeraceae
> 80 MOTUs
Uncertain glomeraceae
3 MOTUs
Funneliformis 1 MOTU
Claroideoglomus 2 MOTUs
Archaeosporales
Glomus
4 MOTUs
Paraglomeraceae
3 MOTUs
Rhizophagus
41 MOTUs
Acaulosporaceae ?
Pacisporaceae
Sclerocystis
2 MOTUs
Gigasporaceae
1 MOTU
Diversiporaceae
Neighbor-Net analysis
3 sites et 2-3 arbres par site
Diversisporales
Comparaison par site
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•
Exploration de la diversité des
CMA associés à l’Arganier
3 sites
Site 1 (A1+A4)
60 MOTUs
42
21
5
Site 2 (A5+A6)
36 MOTUs
7
6
Uncertain glomeraceae
MOTU_3, 37, 38, 44, 49
3
46
Site 3 (A8+A11)
62 MOTUs
Rhizophagus
MOTU_6, 32
MOTU_3
S1 (680 séquences)
S2 (712)
S3 (315)
MOTU_6
S1 (111 séquences)
S2 (19)
S3 (155)
MOTU_37
S1 (1 séquence)
S2 (1)
S3 (2)
MOTU_44
S1 (1 séquence)
S2 (4)
S3 (3)
MOTU_32
S1 (1 séquences)
S2 (4)
S3 (5)
MOTU_38
S1 (1 séquence)
S2 (1)
S3 (1)
MOTU_49
S1 (3 séquence)
S2 (1)
S3 (2)
4
Réseaux
écologiques
Chagnon et al., 2012
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NGS, une avancée pour l’étude
des réseaux écologiques
Analyse d’un grand nombre d’échantillons
(communauté végétale et mycorhizienne)
Grand nombre de séquences
(analyse semi-quantitative)
Accès à une diversité mycorhizienne plus large
(taxa rares?)
Fontaine et al., 2011
Communautés mycorhiziennes = “Assemblage-structuration” aléatoire ?
→ Application récentes des réseaux écologiques
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Communautés mycorriziennes et
“Assemblage-structuration” aléatoire
?
Interactions entre espèces du vivant conditionnent les processus
écologiques
NECESSITE de CARACTERISER Les RESEAUX D’INTERCATIONS
Plusieurs types de comparaison
•
•
•
•
Modèles d’abondance
Modèles neutres
Test de randomisation
Analyses en réseau 2D (Plantes VS Mycorrizes)
Architecture emboitée, nestedness, et/ou modularité
Communautés mycorriziennes et
“Assemblage-structuration” aléatoire
?
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Différents niveaux d’approches pour les communautés végétales
•
> Famille, genre, espèce, variétés?
Quelques études marquantes
•
Forêt boréale (Estonie)
•
•
•
Région semi-aride (Mexique)
•
•
Opik et al 2009; chagnon et al 2012 (454, 458 échantillons=10 échantillons composites,
10 espèces de plantes, > 120 000 séquences)
Davison et al 2011 (Sanger, 212 échantillons, 11 espèces de plantes, 2500 séquences)
Montesinos-Navarro et al 2012a,b (Sanger, 130 échantillons, 35 espèces de plantes,
1523 séquences)
Orchidaceae (Europe, Régions méditerranéennes et Réunion)
•
•
Jacquemyn et al 2012 (Sanger, 222 échantillons, 16 espèces de plantes, 4800
séquences)
Martos et al 2012 (Sanger, 452 échantillons, 77 espèces, 547 séquences)
Structuration des communautés mycorhiziennes (CMA) non aléatoire
= SPECIFICITE D’INTERACTION ?
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Nestedness et Modularité
La « spécifité » des CMA est de plus en plus suggérée, et donc les
réseaux Plante-CMA sont attendus nested (mutualisme) avec une
modularité pour certaines espèces interagissant plus intimement avec
certaines plantes
Montesinos-Navarro et al 2012, Nestedness importante
•
Espèces végétales associées à peu de CMAs s’associent au CMAs
retrouvés chez la plupart des plantes, et les CMAs présent chez peu
d’espèces vegétales apparaissent aussi chez les plantes abritant la
plupart des CMAs
Montesinos-Navarro et al 2012, Modularité pour certaines espèces
•
Faible connections au sein du réseau entre des groupes d’espèces alors
que les espèces sont fortement connectées au sein d’un même groupe
(Montesinos-Navarro et al 2012)
Martos et al 2012, Cas des Orchidées, forte modularité entre les
espèces terrestres et épiphytes = barrière écologique
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Contraintes et impact des réseaux
sur les processus écologiques
?
Contraintes phylogénétiques dans les interactions ?
•
Cas des orchidées = Forte contrainte chez les 2 partenaires (Jacquemyn et
al., 2012; Martos et al 2012)
•
Ecosystème semi aride = CMA phylogénétiquement proches ont tendance
à interagir avec les mêmes espèces végétales, la réciproque est fausse
(Montesinos-Navarro et al 2012)
Impact sur les processus de facilitation
•
Plus probable entre des plantes présentant des communautés CMA
différentes (Montesinos-Navarro et al 2012)
Partage de communautés de CMA similaires pour amélioration de la croissance des
plantes connectées
OU
Complémentarité de niche (communautés différentes de CMA )
Partage des ressources ?
Cas des Truffières languedociennes
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4 sites d’études
3 types de conditions écologiques (Brûlé producteur, Brûlé non
producteur, et Hors-Brûlé)
Unité d’étude = Chêne vert (Quercus ilex) +/- Truffe noire du Périgord
(Tuber melanosporum)
Relation entre cortège floristique-mycorhize et production truffière
•
(>150 échantillons, 2 saisons, > 30 espèces de plantes, > 220 000
séquences)
Cas des subéraies marocaines
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Chêne liège (Quercus suber), importance écologique et socioéconomique (350 000 ha)
Problème de dégradation des subéraies
Analyse des cortèges mycorhiziens
(arbre/plantes accompagnatrices)
•
(81 -108 échantillons, 2 conditions,
3-4 espèces de plantes, > 15 000 séquences)
Optimisation des processus de facilitation
(plantes nurses)
Cas des associations caroubier - mycorhizes
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Espèce méditerranéenne à fort potentiel
écologique et socio-économique
Histoire évolutive du caroubier
?
Lien entre diversité des caroubiers, diversité mycorhizienne (peu
caractérisée) et contextes écologiques
•
(800 échantillons, 3 contextes écologiques, 1 espèce de plante
(diversité?), > 1 000 000 séquences)
Stratégie d’ingénierie écologique performante
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Réseaux écologiques
et approches fonctionnelles
Cycle du phosphore
• Phytase
• Solubilisation du P
Stress hydrique
• Aquaporines
Transportome …
?
Remerciements
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FRANCE
• UMR LSTM (Equipe SRES)
• Robin Duponnois, Yves Prin, Ezekiel Baudoin, Jean-Francois Arrighi
• IMBE
• Thierry Gauquelin, Coralie Mathaux, Alex Baumel, Lucie Miché
• Société Botanique de l'Ardèche, Conseil Scientifique de la
Réserve naturelle nationale des gorges de l'Ardèche
• Jean-Paul Mandin
MAROC
• Université Cadi Ayyad, Faculté des sciences de Semlalia
(Marrakech)
• M. Hafidi, A. Boumezzough
• Centre de Recherche Forestière (Rabat)
• Salaheddine Bakkali Yakhlef, Younès Abbas
• Institut Agronomique et Vétérinaire (Agadir)
• Lahcen Kenny, A. Benismail
SRES
en
Méditerrannée
UMR LSTM
Equipe Symbioses et Résilience Ecosystémique
Exploration de la Biodiversité par NGS, de nouveaux horizons ?
16 mai 2013, IMBE, Marseille,
Thème de recherche
• Etude du rôle des associations symbiotiques rhizobiennes
et mycorhiziennes dans le fonctionnement des formations
végétales méditerranéennes et tropicales
Multi-institutionnelles et Pluri-disciplinaires
• CIRAD,IRD,INRA
• 11 permanents et autant de masters, doctorants et post-doctorants
chaque année
• Ecologie, Ecophysiologie, Biologie des plantes,
Microbiologie, Mycologie, Cytologie, Biologie moléculaire
UMR LSTM
Equipe Symbioses et Résilience Ecosystémique
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16 mai 2013, IMBE, Marseille,
Pays partenaires en méditerranée
•
•
•
•
Algérie
Liban
Maroc
Tunisie
Domaines d’intervention
• Durabilité des systèmes de cultures
traditionnels (agroforesterie, cultures
associées)
• Restauration d’écosystèmes dégradés
UMR LSTM
Equipe Symbioses et Résilience Ecosystémique
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Types d’intervention - Gestion/valorisation des symbioses
• Valorisation des essences forestières d’intérêt agronomique
•
•
•
•
Chêne liège
Arganier
Caroubier
Acacia
• Amélioration de la régénération naturelle
• Sauvegarde d’écosystèmes menacés
• Cyprès de l’Atlas et Genévrier thurifère
• Réhabilitation de sites dégradés
• Mines
• Carrières
STRATEGIE D’INTERVENTION
Ecosystème préexistant
Etat stable alternatif
Perturbation anthropique
anarchique et prolongée
Ecosystème dégradé
Seuil d’irréversibilité
de la dégradation
Ecosystème gravement dégradé
Abondance
Diversité
Gestion
Plantes de couvertures
Plantes « nurses »
Potentiel symbiotique
Exploration de la Biodiversité par NGS, de nouveaux horizons ?
16 mai 2013, IMBE, Marseille,
Raisonner la gestion des symbioses
(bactéries et mycorhizes) en fonction
des caractéristiques du milieu
Reconstitution
Inoculation en masse
Mycorhization contrôlée
Seuil d’irréversibilité
Témoin
Ecosystème très gravement dégradé
Inoculé
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