T H È S

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Cancérologie
Présentée et soutenue par Séverine LAVAL
Le 12 mai 2010
Titre : Rôle des hémidesmosomes dans le pouvoir anti-invasif du récepteur de
somatostatine sst2, dans le cancer du pancréas.
JURY
Pr Catherine Muller-Staumont, Professeur d'Université, IPBS CNRS UMR 5089, Toulouse - Présidente
Dr. Elisabeth Georges-Labouesse, Directeur de Recherche, IGBMC, Strasbourg - Rapporteur
Dr. Nelson Dusetti, Directeur de Recherche, INSERM U624, Marseille - Rapporteur
Dr. Pascal Dournaud, Chargé de Recherche, HDR, INSERM U676, Paris - Rapporteur
Dr. Corinne Bousquet, Chargé de Recherche, INSERM U858, Toulouse - Directrice de thèse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies de Toulouse
Unité de recherche : INSERM U858 - I2MR - équipe 16
Directeur(s) de Thèse : Dr. Christiane Susini et Dr. Corinne Bousquet
Rapporteurs : Dr. Elisabeth Georges-Labouesse
Dr. Nelson Dusetti
Dr. Pascal Dournaud
RESUME
L’adénocarcinome pancréatique est un cancer de très mauvais pronostic, du fait d’une
invasion locale et à distance précoce et de l’absence de traitement efficace. Un des challenges
majeurs dans la recherche sur le cancer du pancréas est donc d’identifier des événements
précoces initiant l’invasion tumorale. Les hémidesmosomes (HDs) sont des complexes multiprotéiques assurant l’ancrage des cellules épithéliales sur la lame basale sous-jacente (LB).
Ces structures sont perdues dans de nombreux cancers, en particulier dans les carcinomes
issus d’épithéliums stratifiés, favorisant ainsi le détachement des cellules cancéreuses de la
LB et l’invasion.
Nous avons décrit pour la première fois la présence, au niveau de l’épithélium simple
pancréatique, d’HDs de type I, comprenant l’intégrine α6β4 et la protéine BP180. Nous avons
également mis en évidence que la perte des HDs dans les cellules cancéreuses pancréatiques
stimule l’invasion tumorale, et identifié certains mécanismes impliqués dans le désassemblage
de ces structures. Nous avons pu montrer que l’activation de la voie PI3K, et de son effecteur
MMP9, entraîne le clivage extracellulaire de BP180, induisant un désassemblage des HDs,
associé à la phosphorylation sur tyrosine de la sous-unité β4 et la délocalisation de l’intégrine
α6β4 vers des structures de migration, où elle stimule l’invasion tumorale, notamment via
l’activation du facteur pro-invasif S100A4.
Les travaux de l’équipe ont démontré que le récepteur de somatostatine sst2, qui est
perdu dans 90% des adénocarcinomes pancréatiques, agit comme un suppresseur de tumeur
pour ce type de cancer. Nous avons pu montrer que la réexpression du récepteur sst2, dans les
cellules cancéreuses pancréatiques, induisait le réassemblage des HDs et démontré le rôle
clef, dans ce phénomène, de l’inhibition de la voie PI3K/MMP-9 et du clivage de BP180.
Ceci s’accompagne également de la déphosphorylation de la sous-unité β4, de l’augmentation
d’expression de protéines hémidesmosomales (BP230, cytokératines 5 et 14) et de la
diminution de sécrétion de laminine-332. Enfin, nous avons prouvé que le rétablissement des
HDs dans les cellules cancéreuses pancréatiques, via la réexpression du récepteur sst2,
représente un mécanisme efficace et orignal de réversion d’un phénotype cancéreux
migratoire et invasif vers un phénotype de cellules stationnaires non-invasives, à la fois in
vitro et in vivo. Afin de généraliser ces résultats, nous avons également travaillé sur des
kératinocytes immortalisés humains HaCaT, un modèle cellulaire de choix pour l’étude de la
dynamique des HDs. Ces cellules expriment le récepteur sst2 de manière endogène, et les
analogues de somatostatine, inhibent leur migration en stimulant la formation des HDs.
1
ABSTRACT
Pancreatic adenocarcinoma is a highly lethal disease, due to its propensity to rapidly
disseminate to the lymphatic system and distant organs, and its limited treatment options.
Thus, a major challenge in pancreatic cancer research is to identify critical events that initiate
invasion. Hemidesmosomes anchor epithelial cells to the basement membrane and are
frequently lost in carcinoma of stratified epithelia, leading to epithelial cell detachment from
the basement membrane and tumor invasion.
We report for the first time the presence of mature type-1 hemidesmosomal structures,
comprising integrin α6β4 and BP180, in the human pancreatic simple epithelium.
Importantly, we provide molecular evidences that disruption of these adhesive structures
promotes pancreatic cancer cell invasion. Underlying mechanisms involve the cleavage of
BP180, which is PI3K- and MMP-9-dependent. This cleavage results in hemidesmosomes
breakdown, associated with the tyrosine-phosphorylation and delocalisation of the integrin
α6β4 to the leading edges of migrating cells where it paradoxically promotes pro-invasive
signals through S100A4 activation.
We have introduced the proof of concept that re-introducing sst2, whose expression is
lost in 90% of pancreatic cancers, into human pancreatic cancer cells, inhibits, in vitro and in
vivo, cell proliferation, tumor progression and metastasis. We demonstrated that sst2 reintroduction into human pancreatic cancer cells induces hemidesmosomes reassembly, by
inhibiting the PI3K/MMP-9 pathway and the subsequent cleavage of BP180. This is also
accompanied by the β4 subunit tyrosine-dephosphorylation, the up-regulation of the
hemidesmosomal BP230, cytokeratins 5 and 14 proteins expression, and the decrease of
laminin-332 secretion by pancreatic cancer cells. Finally, we demonstrated that forcing
hemidesmosomes reassembly, by expressing sst2 in pancreatic cancer cells, is an efficient and
original mechanism to revert cancer cell pro-migratory and pro-invasive phenotype, in vitro as
well as in vivo. These results obtained using a heterologous sst2-expressing human pancreatic
cancer cell model were confirmed with the endogenous sst2-expressing keratinocyte HaCaT
cells upon somatostatin treatment.
2
SOMMAIRE
AVANT-PROPOS
7
PARTIE I – Introduction Bibliographique
9
CHAPITRE I : LES HEMIDESMOSOMES
A/ Structure et fonction
10
10
1. Morphologie et organisation des hémidesmosomes
10
2. Rôle des hémidesmosomes : maladies bulleuses cutanées
12
2.1
Les épidermolyses bulleuses
12
2.2
Les maladies pemphigoïdes
14
B/ Composants des hémidesmosomes
18
1. Intégrine α6β4
18
1.1
Les intégrines
18
1.1.1 Structure
18
1.1.2 Reconnaissance du ligand
20
1.1.3 Interactions cytoplasmiques
28
1.1.4 Signalisation « inside-out » et « outside-in
36
Intégrine α6β4
49
1.2.1 Structure et expression
49
1.2.2 Interactions au sein des hémidesmosomes
52
1.2
2. Connexion à la lame basale
2.1
2.2
55
Laminine-332
55
2.1.1 La famille des laminines
55
2.1.2 laminine-5/332
56
BP180/Collagène XVII
58
2.2.1 Famille des collagènes transmembranaires
58
2.2.2. BP180/BPAG2/collagène XVII
62
3. Connexion aux filaments intermédiaires
64
3
3.1. Famille des plakines
64
3.2
La plectine/HD1
69
3.3
BPAG1e/BP230
74
4. Tétraspanine CD151
76
CHAPITRE II : ASSEMBLAGE ET REGULATI ON DES
HEMIDESMOSOMES
82
A/ Assemblage des Hémidesmosomes
82
B/ Désassemblage des hémidesmosomes
87
C/ Homéostasie des épithéliums
95
D/ Hémidesmosomes et cancers
100
1. Rôles pro-tumoral vs. oncosuppresseur de l’intégrine α6β4
100
2. Signalisation induite par l’intégrine α6β4
104
2.1
Rôle de l’intégrine α6β4 dans l’invasion et le remodelage
de la MEC
104
2.2
Coopération avec les facteurs de croissance
106
2.3
Rôle majeur de la Y1494
107
2.4
Survie cellulaire et angiogenèse
108
2.5
α6β4 et métastases
109
4. BP180 et BP230 dans les cancers
CHAPITRE III : CANCER DU PANCREAS
A/ Cancer du pancréas
110
111
111
1. Généralités
111
2. Morphologie et origine cellulaire
112
3. Bases moléculaires du cancer du pancréas
118
3.1
Les oncogènes
118
3.2
Les gènes suppresseurs de tumeur
120
3.3
Les autres altérations dans le cancer du pancréas
123
B/ Cancer du pancréas et invasion tumorale
1. Cancer du pancréas et microenvironnement tumoral
1.1
126
126
Myofibroblastes/cellules stellaires et réaction desmoplasique 127
4
1.2
Cellules immunitaires et réaction inflammatoire
129
1.3
Angiogenèse et lymphangiogenèse
132
1.4
Invasion nerveuse
134
2. Mécanismes moléculaires
135
2.1
Facteurs de croissance
135
2.2
MEC et molécules d’adhérence
137
2.3
Remodelage de la MEC
141
2.4
Autres facteurs
143
C/ α6β4 et cancer du pancréas
CHAPITRE IV : LA SOMATOSTATI NE ET SES RECEPTEURS
A/ La somatostatine et ses récepteurs
145
147
147
1. La somatostatine
147
2. Les récepteurs de somatostatine
149
B/ Effets anti-tumoraux de la somatostatine
1. effets anti-tumoraux indirects
152
153
1.1
Effet anti-sécrétoire
154
1.2
Effet anti-angiogénique
154
1.3
Modulation du système immunitaire
155
2. Effets anti-tumoraux directs
156
2.1
Arrêt du cycle cellulaire
156
2.2
Effets pro-apoptotiques
156
1.3
Inhibition de la migration et de l’invasion tumorale
158
C/ sst2 et cancer du pancréas
158
1. Mécanismes responsables de la perte d’expression de sst2 dans
les PDACs
2. Rôle anti-oncogénique du récepteur sst2 dans le cancer du pancréas
158
159
3. Mécanismes responsables des effets anti-oncogéniques de sst2 dans
le cancer du pancréas
160
3.1
Induction de l’apoptose
160
3.2
Inhibition de l’angiogenèse et de l’invasion tumorale
160
3.3
Régulation de la traduction protéique
161
4. Conclusion
162
5
PARTIE II : Résultats Expérimentaux
163
ARTICLE : Hemidesmosomes reassembly blocks pancreatic cancer
cell invasiveness
165
Introduction de l’article
166
Article
168
Discussion de l’article
211
RESULTATS SUPPLEMENTAIRES
217
Introduction
218
Résultats
219
Discussion
223
Matériel et méthodes
226
PARTIE III – Conclusion générale et perspectives
229
PARTIE IV – Références Bibliographiques
235
ANNEXE
271
6
AVANT-PROPOS
L’objectif de ma thèse était d’identifier le rôle des hémidesmosomes dans la
cancérogenèse pancréatique mais également de comprendre leur implication dans les effets
anti-invasifs du récepteur de somatostatine sst2, dans le cancer du pancréas.
Ainsi, l’introduction bibliographique est découpée en 4 chapitres. Dans une
première partie, la structure des hémidesmosomes et le rôle de leurs différents composants
seront présentés. Puis, la régulation et l’implication des hémidesmosomes dans l’homéostasie
des épithéliums et en cancérologie seront décrits dans un deuxième chapitre. Le troisième
chapitre exposera les mécanismes moléculaires impliqués dans la cancérogenèse pancréatique
et plus particulièrement dans l’invasion tumorale. Enfin, le rôle anti-tumoral de la
somatostatine et de son récepteur sst2, en particulier, seront mis en lumière.
L’introduction bibliographique sera ensuite suivie de la présentation des résultats
expérimentaux obtenus durant ma thèse, sous la forme d’un article : “Hemidesmosomes
reassembly blocks pancreatic cancer cell invasiveness”, complété par des résultats
supplémentaires, non publiés.
Enfin, une conclusion générale et des perspectives à ces travaux seront présentées
dans une dernière partie.
7
8
INTRODUCTI ON BIBLIOGRAPHIQUE
9
I. LES HEMIDESMOSOMES
A/ structure et fonction
Les hémidesmosomes sont des complexes jonctionnels spécialisés qui contribuent à
l’ancrage des cellules épithéliales sur la lame basale sous-jacente. Ces structures ont tout
d’abord été décrites en microscopie électronique comme des demi-desmosomes présents sur
la face ventrale des kératinocytes basaux de la peau, faisant le lien entre les cytokératines
intracellulaires et la MEC (Matrice Extra-Cellulaire). Outre leur rôle dans l’adhésion
cellulaire, ces complexes multi-protéiques participent également à la polarisation et
l’organisation cellulaire ainsi qu’au maintien de l’architecture tissulaire. Initialement décrits
comme spécifiques des épithéliums stratifiés comme la peau, l’œsophage ou la cornée, leur
présence a été étendue à d’autres types d’épithéliums comme les épithéliums dits pseudostratifiés de la trachée, des bronches ou de la vessie, les épithéliums simples, notamment au
niveau du tractus gastro-intestinal ou encore l’épithélium mammaire, et même certains
épithéliums glandulaires (glandes salivaires)…
1. Morphologie et organisation des hémidesmosomes [fig.1] :
En microscopie électronique, les hémidesmosomes s’organisent sous la forme de
domaines, de 0,1 à 0,5µm, denses aux électrons, au niveau de la membrane plasmique en
contact avec le tissu conjonctif [fig. 1C]. Ils se caractérisent par une structure tripartite
constituée de trois plaques denses [fig. 1B]. La première plaque, interne ou cytoplasmique (en
anglais : inner plaque), est formée par la plectine et BP230/BPAG1 (bullous phemphigoid
antigen 230 ou 1), et sert d’ancrage au réseau de filaments intermédiaires de cytokératines 5 et
14 [fig. 1A]. La plaque dite « externe » (en anglais : outer plaque), se compose de protéines
transmembranaires : tétraspanine CD151, BP180/BPAG2 (bullous phemphigoid antigen 180
ou 2), encore appelé collagène de type XVII, ainsi que l’intégrine α6β4, pilier de la structure
hémidesmosomale. La troisième composante des hémidesmosomes est représentée par la
plaque sous-basale (en anglais : subbasal plaque), formée par la jonction entre les protéines
transmembranaires α6β4 et BP180 avec la laminine-332, anciennement laminine-5, élément
majeur de la lame basale sous-jacente. Des filaments d’ancrage, constitués de la laminine-332
10
B.
A.
IF
PRD
PRD
B P2 3 0
Pl e c t i n
PD
Sequence
Repeats
PD
ABD
C.
CD 15
1
α 6 β4
B P1 8 0
Subbasal
dense
plaqu e
Sb
La mi n i n e- 5
Col
VII
100nm
Fig 1 : structure et organisation des hémidesmosomes
A. Représentation schématique d’un hémidesmosomes et de ces composants (intégrine α6β4,
CD151, BP180, BP230 et plectine) interagissant avec la laminine-5/332 de la lame basale et
intracellulairement avec les filaments intermédiaires (IF) de cytokératines 5 et 14.
B. Représentation schématique de la structure des hémidesmosomes en microscopie
électronique.
C. Image de microscopie électronique au niveau de la jonction dermo-épidermale et montrant
la présence d’hémidesmosomes au pôle basal des kératinocytes humains.
(HD hémidesmosomes, IF filaments intermédiares, LL lamida lucida, LD lamina densa, Sb
plaque sous-basale, AF filaments d’ancrage, AFb fibrille d’ancrage, Col fibres de collagène,
PRD Plakin repeats domain, PD Plakin Domain, ABD, Actin Binding Domain, BM basal
membrane)
Adapté de : Borradori, j invest dermatol, 1999
Hirako, microscopy res and techn, 1998
Litjens, trends in cell biol, 2006
11
et de la partie extracellulaire de BP180 (Rousselle, J cell biol, 1991 ; Masunaga, J invest
dermatol, 1997), sont ensuite projetés à partir de cette plaque sous-basale, traversent la lamina
lucida et se connectent aux fibrilles d’ancrage de collagène VII au niveau de la lamina densa.
Cette structure tripartite,
comprenant
BP180 et
BP230,
est
caractéristique des
hémidesmsomes de type 1, initialement décrits comme restreints aux épithéliums stratifiés
comme au niveau de la peau, de la cornée ou de l’œsophage, alors que des structures
simplifiées, appelées hémidesmosomes de type 2, ne contenant que l’intégrine α6β4 et la
plectine, ont été décrites dans les épithéliums simples comme au niveau de l’intestin (Fontao,
exp cell res, 1999) [fig. 2]. Cependant, au fil des années, la présence d’hémidesmosomes de
type I s’est étendue à d’autres épithéliums tels que l’épithélium pseudo-stratifié de la trachée,
l’épithélium de transition de la vessie, ou encore les épithéliums glandulaires comme au
niveau des glandes salivaires, mais également certains épithéliums simples comme au niveau
du sein ou de l’amnios (Robinson, J invest dermatol, 1984 ; Owaribe, Diff, 1990 ;
Bergstraesser, Am j pathol, 1995).
2. Rôle des hémidesmosomes : maladies bulleuses cutanées
Le rôle primordial joué par les hémidesmosomes dans l’intégrité des épithéliums, et en
particulier de la jonction dermo-épidermique, est souligné par l’apparition de maladies
bulleuses cutanées causées par la destruction de ces structures. Ces maladies sont
caractérisées principalement par une fragilité excessive de la peau due à un détachement de
l’épiderme vis-à-vis du derme sous-jacent. Deux grandes classes de maladies bulleuses se
distinguent : les unes, appelées épidermolyses bulleuses, dues à des mutations héréditaires
touchant les gènes codants pour différentes protéines hémidesmosomales, les autres résultants
de réactions auto-immunes dirigées contre les composants hémidesmosomaux et rassemblées
sous le terme de maladies pemphigoïdes (Fassihi, Clin exp dermatol, 2006).
2.1
Les épidermolyses bulleuses
Bien que considérées comme des maladies orphelines, on compte près de 500 000 cas
dans le monde, et une trentaine de différents sous-types décrits. Les épidermolyses bulleuses
présentent une grande diversité tant au niveau du phénotype qu’au niveau de la gravité de la
maladie, pouvant aller d’une légère fragilité de la peau des mains et des pieds jusqu’à un
détachement généralisé de l’épiderme menant au décès des individus quelques semaines après
leur naissance. A ce jour, des mutations touchant dix gènes différents ont été identifiées
12
Fig.2 : schémas comparant la structure et la composition des hémidesmosomes de type I ou
de type II.
Les hémidesmosomes de type II sont présents dans les épithéliums simples, comme au niveau de
l’intestin, et sont composés de l’intégrine α6β4 et de la plectine. Les hémidesmosomes de type I
sont retrouvés dans les épithéliums (pseudo-) statifiés comme la peau, et contiennent en plus la
tétraspanine CD151, BP180 et BP230.
(K kératines, Ln, laminine)
Adapté de Margadant, curr opin cell biol, 2008
13
(codant pour les protéines : kératines 5 et 14, plectine, BP180, les sous-unités α6 et β4,
laminine-332 et collagène VII) et entraînant différents niveaux de clivage de la jonction
dermo-épidermale en fonction de la protéine altérée (Uitto, Am j med genet, 2004). Par
exemple, une séparation au niveau intra-épidermal est observée pour des mutations affectant
les gènes des kératines 5 ou 14, une séparation au niveau de la lamina lucida est décrite pour
des mutations touchant la laminine-332, alors qu’on observe un détachement dans le derme
pour des mutations affectant le gène codant pour le collagène VII (à noter qu’aucune mutation
du gène codant pour BP230 n’a été décrite à ce jour). Un autre degré de complexité réside
dans le fait que ces maladies se manifestent aussi par des altérations extra-cutanées, reflétant
la distribution tissulaire de la protéine altérée. On peut citer en exemple la plectine qui est
fortement exprimée dans la peau mais aussi au niveau des muscles squelettiques ; ainsi des
mutations du gène de la plectine entraînent la survenue d’épidermolyses bulleuses associées à
des dystrophies musculaires (EBS-MD) (Pfendner, exp dermatol, 2005). Enfin, le type de
mutations détermine également la sévérité de la maladie ; dans certains cas, une modification
mineure de la séquence protéique peut déstabiliser les hémidesmosomes sans toutefois abolir
leur fonction dans l’adhérence cellulaire, alors que dans d’autre cas, les mutations peuvent
mener au changement d’un acide aminé essentiel aux interactions protéine-protéine au sein de
l’hémidesmosome, voire à l’apparition d’un codon stop prématuré entraînant la synthèse
d’une
protéine
tronquée
et
inhibant
complètement
la
formation des
structures
hémidesmosomales, à l’origine de manifestations beaucoup plus graves de la maladie [fig. 3].
Face à cette grande complexité phénotypique, une classification a été proposée de manière à
faciliter le diagnostic et la prise en charge des patients, basée sur le niveau de séparation de la
jonction dermo-épidermique observé en microscopie électronique ou après immunomarquage
avec des anticorps spécifiques des différentes protéines hémidesmosomales (Fine, J am acad
dermatol 2008). On distingue ainsi trois grandes classes d’épidermolyses bulleuses : la forme
« simplex », où la séparation entre derme et épiderme survient au niveau des kératinocytes
basaux qui se lysent suite à un traumatisme mineur ; la forme la plus classique, de
type « jonctionnel », avec une séparation au niveau de la lamina lucida, et enfin la forme
dite « dystrophique », où le clivage se situe dans le derme papillaire supérieur au niveau des
fibrilles d’ancrage [fig. 4].
2.2
Les maladies pemphigoïdes
Ces maladies auto-immunes bulleuses sont dues à une réponse auto-immune dirigée
contre les composants des hémidesmosomes. Elles sont classées en fonction de la zone ultra14
Fig 3 : mutations du gène ITGB4 responsables d’épidermolyses jonctionnelles
associées à une atrésie du pylore (JEB-PA)
Diagramme représentant l’organisation du gène ITGB4 et les différentes mutations
identifiées chez des patients souffrant de JEB-PA. Les différents exons du gène sont
représentés en hachuré et les domaines correspondants de la protéine sont représentés en
dessous. Les mutations létales sont représentées en noir, les non-létales en rouge, et les
mutations ayant un phénotype mixte en bleu.
Adapté de Dang, Acta Derm Venereol, 2008
Level of skin cleavage
EB type
Known targeted protein(s)
Intraepidermal
EBS (simplex)
Keratins 5 and 14 ; plectin ; α6β4 integrin
Intra-lamina lucida
JEB (junctional) Laminin-332/5 ; type XVII collagen ; α6β4 integrin
Sub-lamina densa
DEB (dystrophic)
Type VII collagen
Fig 4 : principales caractéristiques des différentes classes d’épidemolyses bulleuses.
Tableau récapitulatif des différents niveaux de clivage de la jonction dermo-épidermale et
des protéines altérées dans les 3 grandes classes d’épidermolyses bulleuses.
Adapté de Fine, j am acad dermatol, 2008
15
structurelle où sont déposés les immuno-réactants, les molécules ciblées et le type de réaction
auto-immune déclenchée (Eming, Clin chem lab med, 2006) [fig. 5]. L’action des
anticorpscomprend des mécanismes directs, comme la création d’un encombrement stérique,
la production d’espèces réactives de l’oxygène ou encore l’activation de voies de signalisation
cellulaire après liaison de l’antigène, et des mécanismes indirects impliquant l’interaction des
anticorps avec les autres partenaires de l’immunité, comme les cellules inflammatoires et
l’activation du complément.
Les MMPs (Mucous Membrane Pemphigoid) sont caractérisés par le dépôt
d’autoanticorps (IgG et IgA) au niveau de la lame basale des muqueuses, en particulier des
muqueuses orales, associé à des altérations au niveau de la peau dans 25% des cas. Ces
anticorps sont dirigés contre BP180, dans 40 à 70% des cas, mais aussi contre BP230, α6β4 et
la laminine-5/332. Dans ce type de maladies, aucune réaction inflammatoire n’est observée,
c'est-à-dire que les anticorps exercent leurs effets indépendamment de l’activation du
complément ou des leucocytes (Sitaru, Exp dermatol, 2005).
Les BPs (Bullous Pemphigoid) sont causés par des auto-anticorps (IgG) dirigés contre
BP180 ou BP230, retrouvés au niveau de la jonction dermo-épidermale ainsi que dans le sang
circulant et responsables d’une séparation entre le derme et l’épiderme. Les BPs se
caractérisent également par une activation des leucocytes (infiltration de neutrophiles,
dégranulation des mastocytes et activation des macrophages). Il a été montré que BP180
représentait le principal antigène ciblé par les auto-anticorps, et plus particulièrement le
domaine extracellulaire NC16A. De nombreux modèles animaux ont été utilisés pour
identifier les mécanismes impliqués et ont permis de mettre en évidence une cascade
d’effecteur responsable de la séparation dermo-épidermale. Les IgG dirigés contre BP180
entraînent une activation du complément et une forte infiltration de neutrophiles au niveau de
la peau, impliqués dans la sécrétion et l’activation de MMP-9, qui va alors inactiver α1-PI
(α1-proteinase inhibitor), permettant ainsi l’activation de l’élastase neutrophile. Cette dernière
va alors dégrader BP180 et entraîner une séparation de la jonction dermo-épidermale (Yancey,
J clin invest, 2005 ; Leighty, Arch dermatol res, 2007).
Dans l’EBA (Epidermolysis Bullosa Acquisita), des anticorps circulants et déposés au
niveau de jonction dermo-épidermale induisent le recrutement et l’activation de leucocytes.
Enfin, le LAD (Linear IgA Disease) se caractérise par des anticorps, dirigés contre
BP180, circulants et au niveau de la jonction dermo-épidermale et par une infiltration
inflammatoire dense, incluant des granulocytes, des monocytes et des neutrophiles,
l’interaction auto-anticorps/neutrophiles jouant un rôle essentiel dans la maladie.
16
Disease
Clinical characteristics
Direct
Immunofluorescence
characteristics
Target
antigens
Bullous
pemphigoid
Urticarial, pruriginous plaques
with taut blisters or erosions;
intertriginous areas on the flexor
side of the extremities; 10–30%
involvement of the mucous
membranes
Linear IgG (IgA) and
C3 at the BMZ
BP180,
BP230
Mucous
membrane
pemphigoid
Erosions and ulcerations with
atrophy of the mucous membranes
(beware
conjunctivitis,symblephara),
involvement of skin in ;25% of
cases, capillitium, head, upper
trunk
Linear IgG and/or IgA
and/or C3 at the BMZ
BP180,
BP230,
laminin-5,
α6β4integrin
Linear IgAbullous
dermatosis
Most frequent form in childhood;
polymorph, often centrifugally
grouped, pearl string-like arranged
taut blisters, often mucous
membrane involvement;
associations: colitis ulcerosa;
primary sclerosing cholangitis
Linear IgA (and C3) at
the BMZ
LAD-1,
BP180,
BP230
Epidermolysis
bullosa
acquisita
Mechanobullous, inflammatory
and atrophic variant, frequent
involvement of mucous
membranes; scarring and
formation of milia
Linear IgG and C3 at
the BMZ
linear IgA and C3 at the
BMZ (IgA-type EBA)
CollagenVII
BMZ, basement membrane zone
Fig 5 : principales caractéristiques des maladies auto-immunes bulleuses affectant les
protéines hémidesmosomales.
Adapté de Eming, Clin Chem Lab Med, 2006
17
B/ Composants des hémidesmosomes
1. Intégrine α6β4
1.1
Les intégrines
Les intégrines sont des récepteurs d’adhérence hétérodimériques composées de deux
sous-unités α et β, dont l’apparition remonte loin dans l’évolution, puisqu’on les retrouve chez
des métazoaires comme les éponges ou les coraux (Johnson, BBA, 2009). Chez l’homme, on
compte 18 sous-unités α qui s’assemblent avec 8 sous-unités β pour former 24 hétérodimères
différents. Le nom d’intégrine vient du fait que ces protéines sont des intégrateurs des
signaux, à la fois, intra- et extracellulaires et dénote du rôle important qu’elles jouent dans la
coordination entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire (MEC) (Hynes, Matrix biol,
2004).
1.1.1 Structure
Les sous-unités α et β sont des glycoprotéines transmembranaires de type I qui
s’assemblent de manière non covalente, formant un large domaine globulaire extracellulaire,
ou tête, au sommet de deux jambes qui traversent la membrane plasmique, et possédant un
court domaine cytoplasmique (moins de 75 aa., à l’exception de la sous-unité β4) (Hynes,
Cell, 1987).
La partie ext racellu laire des sous-unités α est constituée d’un domaine « βpropeller », qui est une sorte de supra-structure en forme d’hélice faite de 7 lames, chaque
lame étant formée de feuillets β, participant à la formation de la tête de l’intégrine [fig. 6]. Les
3 ou 4 dernières lames de l’hélice possède des sites de liaison au Ca2+, affectant de manière
allostérique la liaison au ligand (Oxvig, PNAS, 1998). Dans certains cas, on trouve, inséré
entre les lames 2 et 3 de l’hélice, un domaine αI, ou domaine A, qui fait protrusion au sommet
de la sous-unité α (Larson, J cell biol, 1989 ; Springer, PNAS, 1997) et est responsable de la
reconnaissance du ligand par les intégrines possédant ce domaine. Faisant suite à ces
domaines, on trouve une région « Ig-like » constituant la cuisse de la structure (en anglais :
tigh), reliée par une région charnière, ou genou, à deux domaines « Calf-1 et 2 », constituant
la partie inférieure de la jambe α. La partie extracellulaire des sous-unités β se compose d’un
domaine PSI (plexin-semaphorin-integrin), d’un domaine hybride « Ig-like », dans lequel
s’insère un domaine βI, participant à la reconnaissance du ligand pour les intégrines ne
18
Head
Regio
Leg
Regio
I
Ions
Mn2+
Ions
Mg2+
Ions Ca2+
Domaine MIDAS
Domaine
ADMIDAS
Domaine LIMBS
Fig 6 : structure et organisation des intégrines.
Schéma d’une intégrine contenant un domaine αI. Neuf des 18 sous-unités α des intégrines possèdent
un domaine αI alors que toutes les sous-unités β possèdent un domaine βI.
A. Représentation des différents domaines d’une intégrine possédant un domaine αI (les étoiles
représentent les sites de liaison pour les ions divalents).
B. Représentation de l’arrangement des différents domaines d’une intégrine possédant un domaine αI
insérée dans la membrane plasmique.
(H domaine Hybride, PSI domaine « plexin-semaphorin-integrin », E1-4 domaines « EGF-like » 1 à
4, C1 et 2 domaines « Calf-1 et 2 », TM domaine transmembranaire)
Adapté de Barczyk, cell tissue res, 2009
19
possédant pas un domaine αI, de 4 domaines « EGF-like » (I-EGF1 à 4) et d’une queue β
(Xiong, Science, 2001). La jambe de la sous-unité β, possède, entre les différents domaines, de
nombreux ponts disulfures qui rigidifient la structure avec une zone charnière située entre les
domaines I-EGF1 et 2.
Peu de choses sont connues sur les do maines t ransmemb ranaires des intégrines et
les
données
principales
proviennent
de
l’étude
de
la
structure
des
domaines
transmembranaires de αIIbβ3 [fig. 7]. La chaine β3 forme une hélice α de 30 aa., inclinée dans
la bicouche lipidique. Cette inclinaison de l’hélice est spécifique des domaines
transmembranaires
des
intégrines
et
contrôle
la
signalisation
transmembranaire
bidirectionnelle. Une autre caractéristique est la présence en c-terminal du domaine
transmembranaire, d’une lysine (en position 742 pour la sous-unité β3) qui sort du domaine
transmembranaire et est suivi d’aa. hydrophobes qui se réinsèrent dans la membrane
plasmique (Lau, Biochem, 2008). Le domaine transmembranaire de la sous-unité αIIb compte
29aa. et comme pour la sous-unité β3, forme une hélice, dont le dernier aa. (lysine 989) sort
de la bicouche lipidique et est suivi des aa. hydrophobes GFF, qui se réinsèrent dans la
membrane plasmique. Ces aa. hydrophobes font partie d’un motif GFFXR, à l’interface entre
les domaines transmembranaire et cytoplasmique et très conservé dans les sous-unités α des
intégrines, participant à l’activation et aux changements de conformation des intégrines
(Vinogradova, Cell, 2002). De plus les domaines transmembranaires des sous-unités α et β
possèdent des motifs GXXXG, responsables de l’hétérodimérisation des intégrines (Kim,
Blood, 2009). Cette association entre les sous-unités α et β est renforcée par un pont salin
établit entre l’arginine du motif GFFXR de la sous-unité α (Arg-995 pour αIIb) et un acide
aspartique du motif HDRK/R de la sous-unité β (Asp-749 pour β3) dans la région juxtamembranaire. Cette interaction entre les sous-unités α et β caractérise un état inactif, alors que
l’éloignement de la sous-unité β correspond à une activation des intégrines (O’toole, J cell
biol, 1994 ; Imai, Blood, 2008 ; Kim, Blood, 2009 ; Bhunia, J biol chem, 2009). Enfin, les
sous-unités β possèdent également, dans leur domaine cytoplasmique, deux motifs NPXY/F
et NXXY/F, importants pour la liaison de partenaires cytoplasmiques et les fonctions
intracellulaires des intégrines (Ylänne, J biol chem, 1995) [fig. 7, cf. chapitre I.B, paragraphe
1.1.3, p 28].
1.1.2 Reconnaissance du ligand
Les intégrines ont pour ligands de larges molécules de la MEC mais aussi des molécules de
surface (Humphries, J cell sci, 2006), très variables d’une intégrine à l’autre, ce
20
989
K
742
K
995
R
749
D
773
779
785
Fig. 7 : Alignement des séquences cytoplasmiques des sous-unités α et β des intégrines.
Les sous-unités β4 et β8, dont les séquences divergent des autres sous-unités β, ne sont pas
représentées. Les motifs conservés GFFXR des sous-unités α, ainsi que HDRR/K, NPXY/F et
NXXY/F des sous-unités β sont encadrés respectivement en bleu, rose et marron. En violet
sont encadrés les deux résidus établissant un pont salin entre les sous-unités α et β et
importants pour l’hétérodimérisation des intégrines. Les différents sites de phosphorylation
identifiés sont numérotés. En mauve, sont surlignées les thréonines et sérines représentant des
sites importants de phosphorylation régulant l’interaction avec les partenaires cytoplasmiques
des sous-unités β. Les résidus sont numérotés d’après les séquences du NCBI (National
Center for Biotechnology Information).
Adapté de : Gahmberg, BBA, 2009
21
qui a rendu la caractérisation de cette famille de récepteurs très difficile. On classe
traditionnellement les intégrines en 4 groupes, en fonction du type de ligand qu’elles
reconnaissent : les récepteurs de type « RGD », qui comprennent les intégrines possédant les
sous-unités αIIIb et αV ainsi que α5β1 et α8β1 ; les récepteurs de collagènes comprenant les
intégrines possédant les sous-unités α1, α2, α10 et α11 ; les récepteurs de laminines
représentés par les sous-unités α3, α6 et α7 et enfin les récepteurs leucocytaires, comptant les
intégrines possédant la sous-unité β2, ainsi que les intégrines αEβ7, α4β7, α4β1 et α9β1 [fig.
8].
La reconnaissance du ligand par les intégrines implique leur domaine I. Il existe 2
types de domaines I : le domaine αI, présent seulement dans la moitié des sous-unités α et
faisant protrusion au sommet des hétérodimères (Nishida, Immunity, 2006), et le domaine βI,
présent sur toutes les sous-unités β, qui s’engage étroitement avec le domaine β-propeller de
la sous-unité α pour former la tête globulaire de l’intégrine et constitue le site de liaison du
ligand pour les intégrines ne possédant pas de domaine αI (Takagi, EMBO J, 2003). Ainsi,
certaines intégrines, comme αLβ2, possèdent 2 domaines I (αI et βI), et d’autres, comme
αVβ3, ne possèdent que le domaine βI. Bien que similaires, ces deux sites de liaison
présentent des modes différents de reconnaissance du ligand. La reconnaissance du ligand par
les domaines I des intégrines comprend un site précis et très particulier, le domaine MIDAS
(metal-ion dependant adhesion site), qui nécessite un ion Mg2+, à l’interface entre l’intégrine
et son ligand, et qui coordonne la liaison entre le domaine MIDAS de l’intégrine et un résidu
acide du ligand (Lee, Structure, 1995 ; Qu, Structure, 1996). Ce site MIDAS, est présent dans
les domaines αI et βI ; mais dans le cas de βI, deux autres domaines, liant des cations
divalents (Ca2+ et Mn2+), ont été décrits : le site ADMIDAS (pour adjacent to MIDAS) et le
site LIMBS (ligand induced metal binding site), régulant, respectivement, de façon négative et
positive, la liaison du ligand par le site MIDAS (Xiong, science, 2002 ; Chen, Nat struct biol,
2003 ; Zhu, Mol cell, 2008 ; Springer, J cell biol, 2008) [fig. 6, p 19].
Les intégrines possédant un domaine α I comprennent le groupe des récepteurs aux
collagènes (α1β1, α2β1, α10β1 et α11β1) et la majorité des intégrines leucocytaires (αLβ2,
αMβ2, αXβ2, αDβ2 et αEβ7). La liaison des intégrines aux collagènes implique la
reconnaissance d’un motif GFOGER (O = hydroxyproline) au sein de la triple hélice
collagénique, l’acide glutamique (E), représentant le résidu acide liant le Mg2+ au sein du site
MIDAS (Emsley, Cell, 2000) [fig. 9, p 25]. Cependant, cette séquence de reconnaissance peut
accepter certaines variations, comme la séquence GLPGER, présente au sein du peptide
22
Fig 8 : La famille des Intégrines
Chez les vertébrés, la famille des intégrines comprend 24 hétérodimères. Elles ont classées
en 4 sous-groupes, en fonction du type de ligand reconnu. Les sous-unités α possédant un
domaine αI sont représentées en orange.
Adapté de Barczyk, cell tissue res, 2009
23
bactérien ssc1, dont la structure ressemble à celle des collagènes, et qui est reconnue par les
intégrines α11β1 et α2β1 (Caswell, J biol chem, 2008).
Les intégrines possédant la sous-unité β2, spécifiques des leucocytes, reconnaissent
des molécules présentes à la surface des cellules, notamment au niveau des vaisseaux
sanguins, de type ICAM (intercellular cell-adhesion molecule) ou VCAM (vascular celladhesion molecule), cette interaction étant nécessaire pour le recrutement des leucocytes au
niveau des sites d’inflammation [fig. 9]. La structure du domaine αI de la sous-unité αL en
liaison avec les ICAMs 1 et 3 (Shimaoka, Cell, 2003 ; Song, PNAS, 2005) a montré la
reconnaissance par αL d’un acide glutamique, qui, comme pour les collagènes, établit la
liaison avec l’ion Mg2+ au sein du domaine MIDAS.
La structure des ligands reconnus par le domaine αI, est très variable, les seules
caractéristiques communes étant l’acide glutamique qui interagit avec le Mg2+ et le fait que
les motifs reconnus sont exposés en surface [fig. 10, p 27]. Chaque intégrine établit ensuite
des contacts supplémentaires spécifiques pour maintenir cette liaison (Vorup-Jensen, PNAS,
2005). Dans ce contexte, le domaine βI, même s’il n’établit pas de liaison directe avec le
ligand, joue un rôle important dans la régulation de l’affinité du domaine αI pour son ligand
en établissant une liaison interne avec un acide glutamique situé en C-terminal du domaine αI,
et très conservé dans les domaines αI des différentes intégrines (Vorup-Jensen, PNAS, 2005;
Yang, PNAS, 2004 ; Yang, J biol chem, 2006).
Pour les intégrines ne possédant pas de domaine αI, essentiellement récepteurs aux
laminines (intégrines possédant les sous-unités α3, α6, et α7) et les récepteurs RGD
(intégrines possédant les sous-unités αV et αIIb ainsi que α5β1 et α8β1), mais aussi les
intégrines leucocytaires : α4β1, α4β7 et α9β1, le site de reconnaissance du ligand est constitué
par une poche, située à l’interface entre le domaine β-propeller de la sous-unité α et le
domaine βI, dans laquelle se localise le site MIDAS. Le motif RGD a longtemps été
considéré comme le motif de reconnaissance par les intégrines. Or, seul un tiers des intégrines
sont capables de lier des séquences RGD [fig. 9]. Ce motif a d’abord été identifié comme
contenu dans la fibronectine (Pierschbacher, Nature, 1984), mais de nombreux autres ligands
possèdent cette séquence, comme la vitronectine (Pytela, PNAS, 1985), le fibrinogène (Plow,
PNAS, 1985) ou encore la forme latente du TGFβ (Munger, Cell, 1999 ; Mu, J cell biol,
2002 ; Aluwihare, J cell sci, 2009). L’étude de la structure cristallographique des domaines
extracellulaires des intégrines αVβ3 et αIIbβ3 liés à des peptides mimant leur ligand, a permis
de comprendre les mécanismes de reconnaissance des séquences RGD par ces intégrines
24
Fig 9 : Principaux ligands reconnus par les intégrines
Adapté de Barczyk, cell tissue res, 2009
25
(Xiang, Science, 2002 ; Xiao, Nature, 2004). Il a notamment été montré que l’acide aspartique
(D) de cette séquence constituait le résidu acide interagissant avec l’ion Mg2+ au sein du
domaine MIDAS, l’arginine (R), établissant, quant à elle, un pont salin avec le domaine βpropeller des sous-unités α. De plus, l’acide aspartique de la séquence RGD, se situe à l’apex
d’une boucle flexible permettant ainsi l’approche du site MIDAS, cette structure en forme de
boucle étant caractéristique des ligands de type RGD (Copie, J mol biol, 1998). Enfin, comme
pour la séquence de reconnaissance des collagènes, cette séquence RGD accepte également
des variantes, comme les séquences isoDGR ou RGE, reconnues par αVβ3 (Curnis, J biol
chem, 2006 ; Takahashi, J cell biol, 2007).
Les intégrines possédant les sous-unités α4 et α9 reconnaissent un motif LDV,
fonctionnellement proche du motif RGD. Ce motif LDV est présent au sein de la fibronectine
mais également au sein des molécules de surface VCAM-1 et MadCAM-1 (Mucosal
Addressin Cell Adhesion Molecule-1). Même si les données structurelles concernant la
reconnaissance de ce motif sont moins nombreuses et moins précises que pour les ligands de
type RGD, il semble que leurs modes de reconnaissance soient très proches avec, notamment,
la présence de l’acide aspartique du motif LDV à l’apex d’une boucle comme pour le motif
RGD (Wang, PNAS, 1995 ; Jones, Nature, 1995 ; Taylor, Acta crystallogr D biol crystallogr,
2001 ; Dando, Acta crystallogr D biol crystallogr, 2002) [fig. 10]. Par contre, la deuxième
interaction, avec le domaine β-propeller de la sous-unité α implique une liaison
hydrophobique pour le motif LDV, et non pas de type électrostatique comme pour le motif
RGD (Liu, Biopolymers, 2006 ; Peng, Nat chem biol, 2006).
Un autre type de ligand est reconnu par le domaine βI des intégrines α3β1, α6β1, α6β4
et α7β1 et regroupe la famille des laminines, chaque intégrine affichant une préférence pour
certaines isoformes (Nishiuchi, Matrix biol, 2006) [fig. 9]. Les données relatives aux
domaines d’interaction entre intégrines et laminines ont été beaucoup retardées, du fait de
l’utilisation de la laminine-1/111 comme modèle d’étude, cette isoforme s’étant avérée être,
par la suite, le ligand présentant la moins bonne affinité pour les récepteurs aux laminines. Les
laminines sont de larges glycoprotéines hétérotrimériques, constituées de 3 chaînes : α, β et γ
qui s’assemblent pour former une structure cruciforme (cf. chapitre I.B, paragraphe 2.1.1,
p55). L’étude de différentes mutations ainsi que l’utilisation d’anticorps bloquants a permis de
définir les domaines d’interactions avec les intégrines et comprenant le domaine globulaire Cterminal de la chaîne α et l’extrémité C-terminale de la chaîne γ des laminines (Ido, J biol
chem, 2004 ; Kunneken, J biol chem, 2004). Un peu plus tard, le site minimum d’interaction
avec les intégrines sera défini comme comprenant les domaines LG 1 à 3 C-terminaux de la
26
A.
B.
Fig. 10 : Modalités de reconnaissance du ligand par les intégrines
A. Reconnaissance du ligand par les différents domaines I des intégrines. Les domaines voisins
des domaines I, affectent l’accessibilité du domaine MIDAS, entraînant une préférence
pour les ligands de surface (domaines αI), ou pour les ligands en forme de boucle
(domaines βI).
B. Stucture de la poche de reconnaissance du ligand par le domaine βI. La poche est structurée
autour de deux points d’ancrage, l’un impliqué dans l’interaction avec le résidu acide
(acide aspartique ou glutamique), et l’autre faisant intervenir le domaine β-propeller de la
sous-unité α. Ce dernier point de contact interagit avec l’arginine du motif RGD
(rectangle bleu), mais peut également établir de nombreuses autres interactions
covalentes et non-covalentes.
Adapté de Takagi, curr opin cell biol, 2007
27
chaine α et l’acide glutamique 1607 de la chaine γ des laminines, cet acide glutamique
pouvant constituer le résidu acide nécessaire à la liaison avec le Mg2+ du domaine MIDAS
(Ido, J biol chem, 2007).
1.1.3 Interactions cytoplasmiques
Les intégrines sont au centre de complexes d’adhérence, appelés communément
contacts focaux, assemblés suite à la liaison par les intégrines de leurs ligands, et permettant
la transmission de signaux intracellulaires régulant la migration, la prolifération et la survie
cellulaire. Une revue récente de la littérature a permis de définir l’«integrin adhesome »,
comprenant une liste de 156 protéines connues pour être recrutées au niveau des sites
d’adhérence, et établissant entre elles près de 700 interactions (Zaidel-Bar, Nature cell biol,
2007) [fig. 11]. Aujourd’hui, 42 adaptateurs potentiels ont été identifiés comme pouvant lier
le domaine intracellulaire des sous-unités β des intégrines. En effet, les intégrines possèdent
de manière générale, un court domaine cytoplasmique, dépourvu d’activité enzymatique,
nécessitant le recrutement de molécules adaptatrices pour leur permettre d’intégrer et de
coordonner les signaux intra- et extracellulaires.
Ces adaptateurs, liant les domaines cytoplasmiques des intégrines se classent en 3
grandes catégories [fig. 12, p 31] : - des protéines de structure comme la taline, la filamine ou
la tensine, qui lient l’actine-F, couplant ainsi les intégrines avec le cytosquelette - des
protéines d’échafaudage comme la paxilline ou 14.3.3, qui forment des sortes de plateformes
permettant de lier d’autres composants des contacts focaux, - et enfin des adaptateurs
possédant des activités catalytiques incluant, entre autre, des kinases : FAK (focal adhesion
kinase), ILK (integrin-linked kinase) ou Src (Sarcoma viral oncogene homolog), ou des
phosphatases : PP2A (protein phosphatase 2A) ou SHP-2 (SH2 domain-containing
phosphatase 2)… et permettant de réguler la dynamique des contacts focaux et de transmettre
des signaux intracellulaires.
La sous-unité β3 est le plus souvent utilisée comme modèle pour l’étude des partenaires
cytoplasmiques [fig. 13, p 33]. Malgré l’existence de données structurelles précises sur
l’interaction entre β3 et la taline (Garcia-Alvarez, Mol cell, 2003 ; Wegener, Cell, 2007) et
des analyses par résonance magnétique nucléaire des sites de liaison de la taline et de la
protéine Dok1 (downstream of tyrosine-kinase 1) sur la queue cytoplasmique de β3 (Ulmer,
Biochem, 2003 ; Oxley, J biol chem, 2008 ), la plupart des sites de liaison ont été identifiés
suite à l’utilisation de peptides synthétiques mutés ou tronqués du domaine cytoplasmique des
sous-unité β. 3 sites préférentiels de liaison ont été identifiés sur la queue cytoplasmique des
28
Fig. 11 :Représentation schématique des interactions entre l’ensemble des composants
intrinsèques de l’adhésome, ainsi qu’une liste non exhaustive de composants associés
Les lignes noires avec des ronds noirs à leurs extrémités représentent des interactions nondirectionnelles, les flèches bleues indiquent une inhibition directionnelle (par exemple, une
déphosphorylation, l’inactivation de protéines-G, ou une protéolyse) alors que les flèches rouges
représentent une activation directionnelle (phosphorylation, activation de protéines-G). Les
formes et les couleurs des protéines représentées sont codées d’après la fonction des protéines.
Adapté de Zaidel-bar, nature cell biol, 2007
29
sous-unité β : un site HDRK/R dans la région juxta-membranaire et deux sites NPXY/F et
NXXY/F situés plus distalement.
Le motif HDRK /R de la sous-unité β3 interagit avec la kinase de la famille Src Fyn
(Reddy, J cell sci, 2008), la kinase FAK et la paxilline (Schaller, J cell biol, 1995). Comme
nous l’avons vu précédemment, cette séquence HDRK lie la sous-unité α des intégrines via un
pont salin établi entre l’acide aspartique (D) du motif HDRK et l’arginine (R) du motif
GFFXR de la sous-unité α. Cette interaction stabilise l’état inactif des intégrines et suggère
que la séquence HDRK ne devient disponible pour la liaison de partenaires cytoplasmiques
qu’après la séparation des sous-unités α et β des intégrines, mécanisme clef dans l’activation
des intégrines. En outre, il semble que des séquences additionnelles, situées en N-terminal du
motif HDRK, soient nécessaires pour la liaison de FAK ou de la paxilline. Ces séquences sont
normalement enfouies à l’intérieur de la membrane plasmique mais pourraient être exposées
dans le cytosol après l’activation de l’intégrine et ainsi devenir accessibles pour lier des
adaptateurs (Armulik, J biol chem, 1999 ; Li, Biochem, 2002 ; Stefansson, J biol chem, 2004).
Les deux autres motifs, conservés dans les sous-unités β, et impliqués dans la liaison
de partenaires cytoplasmiques, sont représentés par le motif proximal NPXY et le motif distal
NXXY. Ces deux motifs sont reconnus par les domaines PTB (phosphotyrosine-binding
domain) de nombreuses protéines (Calderwood, PNAS, 2003), incluant la taline (Calderwood,
J biol chem, 2002), les kindlines 1 et 2 (Kloeker, J biol chem, 2004), la filamine (Calderwood,
Nat cell biol, 2001), la tensine (Lo, Int j biochem cell biol, 2004), Dok1 (Yamanashi, cell,
1997), ou encore Shc (SH2 domain-containing transforming protein) (Songyang, j biol chem,
1995).
Le grand nombre de molécules capables de lier ces domaines NPXY, NXXY de la
sous-unité β suggère une régulation spatio-temporelle fine de ces interactions, et notamment
des régulations par phosphorylation. En effet, certains domaines PTB lient des tyrosines
phosphorylées alors que d’autres, au contraire reconnaissent des tyrosines non phosphorylées
(Uhlik, J mol biol, 2005). Les kinases de la famille Src, semblent être des régulateurs clefs de
la phosphorylation de ces motifs. Il a notamment été montré que Src phosphorylait les deux
motifs NPXY/NXXY de β1 et β3 (Sakai, PNAS, 2001 ; Law, J biol chem, 1996). D’autres
kinases de la famille Src comme Fyn et Lyn sont également capables de phosphoryler β3, de
même que la kinase Syk (spleen tyrosine kinase) (Law, J biol chem, 1996). L’importance de
la phosphorylation sur tyrosine de ces deux motifs dans l’adhérence et la migration cellulaire
30
Fig. 12 : protéines adaptatrices liant la partie cytoplasmique des sous-unités β des intégrines
Integrin to which
adaptor binds
Adaptor protein
Reference
Structural adaptors
α -actinin
BP180
Filamin
β1, β2, β3
β4
β1, β2, β3, β7
Myosin
Plectin
Skelemin
Talin
β1, β3, β5
β4
β1, β3
β1, β2, β3, β5, β7
Tensin
β1, β3, β5, β7
(Otey et al., 1993; Pavalko and LaRoche, 1993)
(Koster et al., 2003; Schaapveld et al., 1998)
(Calderwood et al., 2001; Kiema et al., 2006; Loo et al., 1998; Pfaff et al., 1998;
Sharma et al., 1995; Travis et al., 2004; Zent et al., 2000)
(Jenkins et al., 1998; Sajid et al., 2000; Zhang et al., 2004)
(Geerts et al., 1999)
(Reddy et al., 1998)
(Calderwood et al., 2003; Calderwood et al., 1999; Patil et al., 1999; Pfaff et al.,
1998; Sampath et al., 1998)
(Calderwood et al., 2003; McCleverty et al., 2007)
β1, β2, β3
β3
β1, β3
β1, β2, β3, β5, β7
β3, β5
β2, β3, β5, β7
β1, β2, β3, β6
β1
β3
β3
β2
β1, β3
β1, β3
β1
β3, β5
β1, β3
β1, β2, β5
β3, β4
β5
β7
(Fagerholm et al., 2005; Han et al., 2001)
(Eigenthaler et al., 1997; Shattil et al., 1995)
(Zent et al., 2000)
(Calderwood et al., 2003)
(Calderwood et al., 2003)
(Calderwood et al., 2003)
(Wixler et al., 2000)
(Samson et al., 2004)
(Blystone et al., 1996; Law et al., 1996)
(Brown et al., 1990)
(Bianchi et al., 2000)
(Ma et al., 2008; Montanez et al., 2008)
(Moser et al., 2008)
(Brancaccio et al., 1999)
(Calderwood et al., 2003)
(Chen et al., 2000; Schaller et al., 1995)
(Liliental and Chang, 1998)
(Dans et al., 2001; Law et al., 1996)
(Tang et al., 1999)
(Rietzler et al., 1998)
β3
β1, β2, β3
β2
β1, β3, β5
β6
β1, β2, β3, β5
β3
β1, β3
β1, β2, β3
β1, β3
β1
β4
(Arias-Salgado et al., 2003; Arias-Salgado et al., 2005)
(Arias-Salgado et al., 2005)
(Kolanus et al., 1996)
(Calderwood et al., 2003)
(Ahmed et al., 2002)
(Chen et al., 2000; Eliceiri et al., 2002; Schaller et al., 1995)
(Arias-Salgado et al., 2005)
(Hannigan et al., 1996; Pasquet et al., 2002)
(Arias-Salgado et al., 2005)
(Medeiros et al., 2005; Woods et al., 2004)
(Kim et al., 2004)
(Bertotti et al., 2006)
β1
β1
(Chang et al., 1997; Zhang and Hemler, 1999)
(Li et al., 1999)
Scaffolding
adaptors
14-3-3
β3 endonexin
CD98
Dab1
Dab2
Dok1
Fhl2
Fhl3
Grb2
IAP
JAB1
Kindlin 2
Kindlin 3
Melusin
Numb
Paxillin
Rack1
Shc
TAP20
WAIT1
Catalytic adaptors
Src
Yes
Cytohesin 1
Eps8
ERK2
FAK
Fyn
ILK
Lyn
PKD1
PP2A
Shp2
Other adaptors
ICAP1
MIBP
Adapté de Legate, J cell sci, 2009
31
est soulignée par la génération de souris exprimant une sous-unité β3 présentant une double
mutation YàF (mimant une tyrosine non phosphorylable) au niveau des motifs
NPXY/NXXY, et altérant les propriétés d’adhérence et de signalisation des intégrines
possédant cette sous-unité β3, notamment au niveau des plaquettes et des leucocytes.
(Blystone, J biol chem, 1997 ; Law, Nature, 1999).
La phosphorylation du motif proximal NPXY régule par exemple la liaison de la
taline, qui entre en compétition avec d’autres protéines comme Dok1 ou la tensine. La taline
lie la sous-unité β3 sous sa forme non phosphorylée et augmente l’affinité de l’intégrine pour
son ligand. En revanche, après phosphorylation sur la tyrosine Y773 du motif NPXY, Dok1
lie d’avantage ce motif et déplace ainsi la liaison de la taline (Oxley, J biol chem, 2008), ce
qui concorde avec le rôle de régulateur négatif de l’activation des intégrines décrit pour Dok1
(Wegener, cell, 2007). De la même manière la taline et la tensine entrent en compétition pour
la liaison du motif NPXY des intégrines β1, β3, β5 et β7 (Calderwood, PNAS, 2003 ;
Calderwood, J biol chem, 1999 ; Garcia-Alvarez, Mol cell, 2003 ; McCleverty, Protein sci,
2007). Alors que la taline lie β3, non phosphorylée, la liaison de la tensine est insensible à la
phosphorylation du motif NPXY. La régulation de l’interaction des sous-unités β des
intégrines avec la taline ou la tensine, pourrait représenter un « switch » entre un rôle
structurel des complexes d’adhérence et un rôle dans la signalisation cellulaire [fig. 14A, p
35]. En effet, la taline entre en jeu très tôt dans la formation des contacts focaux, permettant
l’activation des intégrines d’une part, et couplant les intégrines directement et indirectement,
via son interaction avec la vinculine, avec le cytosquelette d’actine (Tadokoro, Science,
2003). Une fois la formation des contacts focaux initiée, la taline n’est plus nécessaire pour
maintenir l’activation des intégrines, et la liaison de son domaine PTB sur les sous-unités β
est remplacée par la liaison du domaine PTB de la tensine. La taline n’est pas pour autant
exclue des contacts focaux, puisqu’elle possède un deuxième site liant les sous-unités β après
activation des intégrines (Rodius, J biol chem, 2008). La liaison de la tensine va permettre,
quant à elle, le recrutement au niveau des contacts focaux de PDK1 (3-PhosphoinositideDependant protein Kinase-1), PI3K (PhosphoInositide 3’-OH Kinase) ou encore de
régulateurs des petites protéines G et notamment des RhoGAPs (Rho GTPase activating
proteins), entrainant l’activation de voies de signalisation et la réorganisation du cytosquelette
d’actine (Auger, J biol chem, 1996 ; Qian, PNAS, 2007 ; Wavreille, ACS chem biol, 2007).
La région située entre les deux motifs NPXY/F et NXXY/F des sous-unités β, est riche
en sérines et thréonines et la phosphorylation de ces résidus est également importante pour la
régulation des protéines liant les intégrines [fig. 7, p 21]. Il a notamment été montré que PKC
32
Fig. 13 : Sites de liaison des adaptateurs cytoplasmiques de la sous-unité β3.
Les lignes pleines indiquent les sites de liaison d’adaptateurs dont la liaison avec β3 a été
démontrée, alors que les lignes en pointillés indiquent les sites de liaison pour des adaptateurs
liant d’autres intégrines mais dont la liaison avec β3 n’a pas été montrée. Les résidus
normalement enfouis dans la membrane plasmique sont indiqués en vert et les résidus qui
peuvent être phosphorylés sont indiqués en rouge.
Adapté de Legate, J cell sci, 2009
33
induisait une phosphorylation sur sérine de β5 (Freed, EMBO J, 1989) et serait aussi
impliquée dans la phosphorylation de la sérine 785 de la sous-unité β1 (Hibbs, J exp med,
1991). Les sérines et thréonines situées dans la région correspondant aux aa. 777 à 779 de la
sous-unité β3, sont particulièrement conservées entre les différentes sous-unités β. Cependant,
les kinases impliquées dans leur phosphorylation diffèrent selon les intégrines. Les thréonines
788 et 789 de β1 sont phosphorylées par l’isoforme PKCε (Stawowy, Cardiovasc res, 2005).
PDK1, Akt et ERK2 sont capables de phosphoryler la T779 de β3. PKC et Cdc2 peuvent aussi
phosphoryler β3 sur d’autres résidus encore inconnus (Kirk, J biol chem, 2000 ; Lerea, BBA,
2007). Enfin, β2 est phosphorylée sur la T758 en réponse aux esters de phorbol et suite à
l’activation du TCR (T-cell receptor) (Valmu, Biochem j, 1999 ; Hilden, J immunol, 2003 ;
Nurmi, J biol chem, 2007 ; Takala, Blood, 2008).
Tout comme les phosphorylations sur tyrosines, les phosphorylations sur sérines et
thréonines permettent de contrôler la liaison d’adaptateurs sur les sous-unités β des intégrines.
Dans la sous-unité β2, cette région comprise entre les 2 motifs NPXY/F et NXXY/F, est
connue pour lier la filamine et 14.3.3ζ (Fagerholm, J cell biol, 2005 ; Sharma, J immunol,
1995 ; Valmu, Eur j immunol, 1999). La filamine interagit également avec l’isoforme A de
β1, β3 et β7 (Calderwood, Nat cell biol, 2001 ; Kiema, Mol cell, 2006 ; Loo, J biol chem,
1998 ; Travis, FEBS letter, 2004), alors que 14.3.3β est décrite comme un partenaire de β1 et
β3 (Han, Oncogene, 2001). Il a clairement été démontré que la filamine liait la partie
cytoplasmique des sous-unités β2 et β7 sous leur forme non phosphorylée (Kiema, Mol cell,
2006 ; Takala, Blood, 2008) et exerçait un rôle inhibiteur sur l’adhérence et la migration
cellulaire (Calderwood, Nat cell biol, 2001). En revanche, la phosphorylation des thréonines
758 de β2 et 784 de β7 abolit la liaison de la filamine. En outre, la phosphorylation de la T758
de β2 permet le recrutement de 14.3.3, ce qui favorise l’activation des petites protéines G
Rac-1 et Cdc42, impliquées dans la formation de lamellipodes et filopodes respectivement et
favorisant ainsi la migration cellulaire (Nurmi, J biol chem, 2007 ; Takala, Blood, 2008) [fig.
14B]. Ces mécanismes de régulation sont particulièrement importants pour le recrutement des
lymphocytes spécifiquement sur les lieux d’inflammation. L’inhibition exercée par la liaison
de la filamine permet aux leucocytes de circuler librement dans les vaisseaux sanguins. Suite
à une infection, la sécrétion de cytokines par l’endothélium, va induire des signaux
intracellulaires dans les leucocytes, activant les intégrines et levant l’inhibition exercée par la
filamine. Il s’ensuit alors la formation de clusters d’intégrines et le recrutement de molécules
adaptatrices comme 14.3.3 au sein de contacts focaux, qui vont permettre aux leucocytes
34
PI3K
Akt
Fig. 14 : Exemple de deux mécanismes illustrant la régulation de la liaison d’adaptateurs
au niveau de la partie cytoplasmique des sous-unités β des intégrines.
A. Switch entre la liaison de la taline et de la tensine avec la sous-unité β3, régulé par sa
phosphorylation sur tyrosine. Sous sa forme non phosphorylée (gauche), le motif NPLY de
l’intégrine β3 lie le domaine PTB de la taine. La connexion au cytosquelette d’actine intervient
via la liaison directe de la taline avec l’actine, ainsi que par son interaction avec la vinculine. La
phosphorylation sur tyrosine (étoile rouge) du motif NPLY de β3 (droite), déplace la taline et
permet la liaison de la tensine. Les interactions avec le cytosquelette d’actine sont maintenues
voire renforcées par la tensine, mais, en plus, la signalisation intracellulaire peut être activée par
la production de PtdIns(4,5)P2 via l’interaction de la taline avec PIPKI et par l’activation de Akt
via la liaison de la tensine avec PDK1.
B. Switch entre la liaison de la filamine et de 14.3.3 avec la sous-unité β2. La filamine interagit
avec la région de β2 riche en sérines/thréonines, lorsqu’elle n’est pas phosphorylée (gauche),
principalement par des interactions hydrophobiques. La connexion avec le cytosquelette d’actine
intervient via le domaine de liaison à l’actine des dimères de filamine. L’interaction filamineintégrine inhibe la migration cellulaire et l’activation des intégrines dans différents modèles
cellulaires. La phosphorylation (étoile rouge) de la T758 de β2 (droite) déplace la filamine et
permet la liaison de 14.3.3, via le groupe phosphate de la phosphothréonine. L’interaction
14.3.3-intégrine stimule la migration en induisant un réarrangement du cytosquelette d’actine de
manière dépendante de Rac1 et Cdc42, mais les mécanismes par lesquels 14.3.3 active ces
GTPases ne sont pas conus. La filamine et 14.3.3 fonctionnent tous les deux sous forme de
dimères et peuvent donc participer au « clustering » des intégrines en liant deux intégrines
simultanément.
Adapté de Legate, J cell sci, 2009
35
d’adhérer à l’endothélium puis de migrer au travers pour finalement arriver sur le site
d’inflammation [fig. 15].
Des phosphorylations sur sérines sont également connues pour réguler la liaison de
partenaires à la sous-unité α des intégrines, permettant ainsi de réguler l’activation de voies de
signalisation en aval des intégrines, impliquées dans la migration cellulaire. Un tel mécanisme
a été particulièrement détaillé pour la sous-unité α4 et impliqué dans la mise en place d’une
migration directionnelle. En effet, la sous-unité α4, sous sa forme non phosphorylée, interagit
avec la paxilline. Cette interaction permet le recrutement, par la paxilline, d’une Arf-GAP
(Arf-GTPase activating protein), qui catalyse l’hydrolyse du GTP, lié à la GTPase Arf (ADP
ribosylation factor) en GDP et inactive, de ce fait, la GTPase. Or l’activation de Arf est
nécessaire pour activer Rac. Ainsi la liaison entre la paxilline et la sous-unité α4, entraîne
l’inhibition de Rac et donc la formation de lamellipodes. Cependant, l’activation de voies de
signalisation, en réponse aux facteurs de croissance par exemple, au niveau des fronts de
migration spécifiquement, entraîne l’activation de PKA qui va phosphoryler la sérine 988 de
la sous-unité α4. Ceci va alors dissocier l’interaction entre α4 et la paxilline, et donc, lever
l’inhibition exercée sur Rac, permettant ainsi la formation de lamellipodes. Cette régulation
localisée va permettre une migration directionnelle, en activant Rac et la formation de
lamellipodes en avant de la cellule, alors que sur les faces latérales et à l’arrière de la cellule,
l’interaction entre α4 et la paxilline est maintenue et inhibe Rac (Han, J biol chem, 2003 ;
Goldfinger, J cell biol, 2003 ; Nishiya, Nat cell biol, 2005) [fig. 16, p 38].
1.1.4 Signalisation « inside-out » et « outside-in
La signalisation bidirectionnelle est une des singularités des intégrines. En effet, elles
sont capables d’intégrer des données de la MEC et de les transformer en signaux
intracellulaires via la formation de contacts focaux : signalisation « outside-in », et
inversement, la liaison de molécules sur leurs domaines cytoplasmiques modifie l’activation
et l’état d’affinité des intégrines pour leurs ligands, modifiant ainsi leurs propriétés
adhésives : signalisation « inside-out ».
Des changements de conformation aboutissant à l’éloignement des domaines
transmembranaires des sous-unités α et β représentent le mécanisme clef de cette signalisation
bidirectionnelle. De grandes avancées sur la compréhension des mécanismes d’activation des
intégrines ont été faites suite à la cristallisation de l’intégrine αVβ3, dans son état non lié,
36
A.
B.
Fig. 15 : recrutement des leucocytes à la surface de l’endothélium.
A. La liaison des ligands des sélectines exprimés à la surface des leucocytes avec les sélectines
endothéliales, ainsi que la liaison de faible affinité des intégrines leucocytaires avec les ICAMs à
la surface des vaisseaux endothéliaux ralentit la circulation des leucocytes dans le sang et induit
le phénomène de « rolling ». Ces liaisons ainsi que la sécrétion de chimiokines par l’endothélium
entraînent une signalisation « inside-out » qui aboutit à un état activé, de haute affinité, des
intégrines.
B. L’arrêt des leucocytes est induit par le « clustering » des intégrines activées, qui vont alors
agir par une signalisation « outside-in », régulant entre autre la migration transendothéliale des
leucocytes.
Adapté de Takada, genome biology, 2007
37
A.
B.
inactive
inactive
active
active
Pax
PKA
P S988
RTK
Trailing edge
Leading edge
Fig. 16 : Modèle de l’activation localisée de Rac par le complexe α4/Pxilline
A. A l’arrière de la cellule, la sous-unité α4 interagit avec la paxilline qui recrute GIT (G-proteincoupled receptor kinase InTeractor 1), une Arf-GAP, qui inhibe la GTPase Arf en catalysant
l’hydrolyse du GTP en GDP. Ceci inhibe l’activation de Rac et la formation de lamellipodes.
B. Par contre, au niveau du front de migration de la cellule, l’activation de PKA entraîne la
phosphorylation de la sous-unité α4 sur la sérine 988, ce qui dissocie le complexe α4/Paxilline, et
lève l’inhibition exercée sur Rac, permettant la formation de lamellipodes et la mise en place
d’une migration directionnelle.
Adapté de Nishiya, Nat Cell Biol, 2005
38
montrant une conformation en V du domaine extracellulaire, avec la tête de l’intégrine repliée
sur les jambes (Xiong, Science, 2001). Dans cette configuration, le domaine de liaison au
ligand fait face à la membrane plasmique, rendant la liaison du ligand difficile, et définissant
un état inactif et de faible affinité. L’activation complète des intégrines en solution est
obtenue en présence de ligands et d’ions Mn2+ et se caractérise par une extension et une
séparation des jambes des sous-unités α et β, associées à une ouverture du site de
reconnaissance du ligand vers le milieu extracellulaire (Takagi, Cell, 2002 ; Nishida,
Immunity, 2006). En outre, des états d’activation et d’affinité intermédiaires existent entre ces
deux conformations extrêmes. En effet l’observation en microscopie électronique d’intégrines
en solution a permis de définir au moins 3 conformations différentes et laisse supposer que
d’autres peuvent exister (Takagi, Cell, 2002 ; Xiao, Nature, 2004) [fig. 17 et 18]. Au cours du
temps, il est devenu de plus en plus évident que l’activation des intégrines résultait d’un
mouvement de bascule, vers l’extérieur de la structure, du domaine hybride de la sous-unité β,
qui s’éloigne ainsi du domaine β-propeller de la sous-unité α. Du fait de présence de
nombreux ponts disulfures qui rigidifient la structure de la jambe β, ce mouvement du
domaine hybride est transmis à toute la sous-unité β et aboutit à la séparation des domaines
transmembranaires des sous-unités α et β (Xiao, Nature, 2004 ; Puklin-Faucher, J cell biol,
2006) [fig. 19, p41].
Au cours de la signalisation « inside-out », les voies de signalisation induites par des
cytokines, des facteurs de croissance ou encore par l’activation du TCR dans les leucocytes,
régulent l’activation et l’affinité des intégrines pour leur ligand en modulant la liaison de
certains partenaires cytoplasmiques. La liaison de la taline au domaine cytoplasmique de la
sous-unité β, semble être un point de convergence vers lequel tendent les signaux
intracellulaires régulant l’activation des intégrines (Tadokoro, Science, 2003). La taline est
une protéine de 270kDa, composée d’une extrémité N-terminale globulaire et d’une queue Cterminale, et représente le principal activateur des intégrines. La tête globulaire de la taline se
compose d’un domaine FERM (domaine commun aux protéines 4.1, Ezrine, Radixine et
Moesine) qui contient un domaine PTB liant le motif NPXY des sous-unités β (Calderwood, J
biol chem, 1999 et 2002 ; Uhlik, J mol biol, 2005). En outre le domaine FERM de la taline lie
d’autres séquences des sous-unités β situées en N-terminal du motif NPXY. Enfin la queue Cterminale de la taline possède un dernier site de liaison pour le domaine cytoplasmique β. Des
mutations du motif NPXY des intégrines β1 et β3 (Bouaouina, J biol chem, 2008 ; Tadokoro,
Science, 2003) ou du domaine PTB de la taline (Wegener, Cell, 2007), inhibent l’interaction
39
A
B
C
100Å
Fig. 17 : Images de microscopie électronique montrant différentes conformations adoptées
par l’intégrine αVβ3 en solution après marquage négatif.
A. Conformation repliée en présence de Ca2+, caractérisant un état inactif.
B. Conformation dépliée ou étendue, avec une tête (site de reconnaissance du ligand) refermée,
en présence de Mn2+, caractérisant un état d’activation intermédiaire.
C. Conformation étendue, avec un site de reconnaissance du ligand ouvert vers l’extérieur, en
présence d’un peptide RGD et de Mn2+, caractérisant un état activé et de forte affinité.
Fig. 18 : représentation schématique des réarrangement de la structure quaternaire d’une
intégrine durant son activation.
Les trois conformations définies par microscopie électronique (A, D et E) ainsi que les
conformations intermédiaires hypothétiques induites au cours de la signalisation « outside-in »
(B) et « inside-out » (C), sont schématisées. En rouge et bleu foncé, sont représentées les têtes
des sous-unités α et β respectivement. En rose et bleu clair, sont représentées les jambes de ces
mêmes sous-unités.
Adapté de Takagi, cell, 2002
40
Fig. 19 : Relation entre conformations et fonctions des Intégrines.
A, B et C représentent les changements de conformation impliqués dans la signalisation
«inside-out ». L’intégrine inactivée (A) se présente sous une forme compacte, repliée, avec les
jambes et les domaines transmembranaires associés. Mais la flexibilité des zones charnières
permet un certain degré de mouvement de la structure (respiration). Des signaux
intracellulaires aboutissant à la liaison de la taline (B) permettent la relaxation et un
dépliement léger de la structure mais suffisant pour permettre la liaison du ligand (vert),
entraînant une extension de la structure, (C) et un état de haute affinité. Dans cet état,
l’extension de la structure entraîne une séparation partielle des deux jambes de la structure
mais leur degré de séparation n’est pas connu.
D et E représentent les changements de conformation impliqués dans la signalisation
« outside-in », initiés par la liaison de la taline et du ligand et caractérisée par l’initiation et la
maturation des contacts focaux. Les réarrangements du cytosquelette d’actine, d’une part, et la
liaison du ligand, d’autre part, vont générer des forces de traction (D) qui vont entraîner un
mouvement du domaine hybride de la sous-unité β vers l’extérieur de la structure. Ceci induit
une séparation complète des deux jambes de la structure, augmente l’affinité du récepteur pour
son ligand et va entraîner l’assemblage de contacts focaux initiant une cascade de signaux
intracellulaires (E).
Adapté de Askari, j cell sci, 2009
41
entre la taline et les sous-unités β et diminue l’affinité des intégrines pour leur ligand,
démontrant que cette interaction est primordiale pour l’activation des intégrines par la taline.
En outre, des expériences de RMN (résonnance magnétique nucléaire) et de FRET
(fluorescence resonance energy transfer), montre clairement que la tête de la taline entre en
compétition avec la sous-unité α pour la liaison à la sous-unité β et entraine une séparation des
2 sous-unités des intégrines (Vinogradova, PNAS, 2000 ; Kim, Science, 2003). La question
clef qui se pose alors est de savoir pourquoi la taline est capable d’induire l’activation des
intégrines alors que d’autres protéines comme Dok1, qui possèdent aussi un domaine PTB, ne
le sont pas. La réponse vient peut-être du fait que le domaine FERM de la taline possède 2
sites de liaison aux sous-unités β : le domaine PTB qui lie le motif NPXY, et une boucle qui
lie une séquence en amont du motif NPXY, et que ces deux interactions sont nécessaires pour
séparer les sous-unités α et β (Wegener, Cell, 2007). Le rôle primordial de la taline dans
l’activation des intégrines, implique une régulation fine de cette interaction, incluant des
phosphorylations des parties cytoplasmiques des intégrines, qui régulent la compétition entre
la taline et d’autres protéines pour la liaison à la sous-unité β (Oxley, J biol chem, 2008), ou
des mécanismes activant la taline comme un clivage par la calpaine (Yan, J biol chem, 2001)
ou la liaison de PIP2 (Phosphatidyl Inositol 2-Phosphate) (Goksoy, Mol cell, 2008) [fig. 20].
La taline n’est pas le seul régulateur clef de l’activation des intégrines. En effet, de
récents travaux ont montré que les kindlines, qui lient les sous-unités β1, β2 et β3, jouent un
rôle aussi important que la taline dans l’activation des intégrines. La famille des kindlines
regroupe trois membres : les kindlines 1, 2 et 3, qui sont des protéines possédant un domaine
FERM et sont toutes présentes au sein de sites d’adhérence dépendants des intégrines (Ma, J
cell biol, 2008 ; Montanez, Genes dev, 2008 ; Moser, Nat med, 2008 et 2009). Deux maladies
causées par des mutations des gènes des kindlines ont été identifiées et se caractérisent par un
défaut de la fonction des intégrines : le syndrome de Kindler est dû à une absence de kindline1 et montre un défaut d’adhérence des cellules épithéliales (Jobard, Hum mol genet, 2003),
alors que des mutations affectant le gène de la kindline-3 sont impliquées dans des cas rares
de déficience d’adhérence leucocytaire (LAD = leucocytes-adhesion deficiency) de type III
résultant d’un défaut d’activation des intégrines leucocytaires et plaquettaires (Mory, Blood,
2008 ; Malinin, Nat med, 2009). Des expériences sur des cellules issues de souris déficientes
en kindline-1, 2 ou 3 ont notamment permis de prouver que ces protéines étaient essentielles
au changement de conformation des intégrines de l’état de faible affinité vers celui de haute
affinité. En outre des études biochimiques ont montré que les kindlines interagissaient avec le
motif distal NXXY des sous-unités β1, β2 et β3 (Ma, J cell biol, 2008 ; Montanez, Genes dev,
42
Fig. 20 : Mécanismes potentiels régulant l’activation des intégrines par la taline.
Le trait épais et noir représente le pont salin stabilisant l’interaction entre les régions juxtamembranaires des sous-unités α et β, et caractérisant un état inactif.
A. Activation de la taline : Deux modèles d’inactivation de la taline sont réprésentés avec
l’extrémité C-terminale de la taline liant et inhibant son domaine FERM tri-lobé (F1, F2 et F3).
Le clivage de la taline par la calpaine ou la liaison de PIP2 démasquent le domaine FERM de la
taline qui peut alors lier la sous-unité β des intégrines, entraînant leur activation.
B. Inhibition de la liaison de la taline avec les intégrines : La phosphorylation par Src du
domaine NPXY des sous-unités β des intégrines, la compétition avec d’autres adaptateurs
possédant un domaine PTB et liant la partie cytoplasmique des sous-unités β, ou la liason à la
taline de PIPKIγ (phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase type-1 gamma), empêchent la
liaison de la taline avec les intégrines et inhibent leur activation.
Adapté de Calderwood, J Cell Sci 2004
43
2008 ; Moser, nat med, 2008 et 2009). Le fait que les kindlines lient un motif différent de la
taline sur les sous-unités β, suggère que ces protéines pourraient coopérer pour activer les
intégrines. En effet, la capacité des kindlines à activer les intégrines dépend de la présence de
la taline, et inversement, la taline n’est pas capable d’activer les intégrines dans des cellules
déficientes en kindlines.
Le but de cette signalisation « inside-out » consiste à activer les intégrines en séparant
les deux sous-unités α et β des intégrines et en induisant un état de haute affinité pour leur
ligand. Cette étape est immédiatement suivie par une signalisation « outside-in », induite par
la liaison du ligand et la génération de forces de traction, et aboutissant à la formation de
contacts focaux qui vont transmettre des signaux intracellulaires [fig. 19, p 41]. On définit
classiquement trois types de structures d’adhérence, qui présentent une grande hétérogénéité
tant au niveau de leur composition que de leur morphologie ou leur localisation, et dont
l’assemblage est régulé de manière spatio-temporelle : les complexes focaux, les adhérences
focales et les adhérences fibrillaires [fig. 21 et 22].
Les complexes focaux sont de petites structures adhésives, extrêmement dynamiques,
punctiformes, de 1µm de diamètre environ, présentes à l’extrémité des lamellipodes dont la
formation est initiée par la GTPase Rac. Les premiers composants à être intégrés dans les
complexes focaux sont les intégrines, la taline et la paxilline. La vinculine, la kinase FAK et
enfin l’α-actinine sont ensuite incorporées pour former des complexes focaux matures
(Zaidel-Bar, J Cell Sci, 2003 ; Zaidel-Bar, Biochem soc trans 2004). La taline, outre son rôle
dans l’activation des intégrines, joue aussi un rôle important dans la formation des contacts
focaux. En effet, elle permet le recrutement d’autres composants comme la paxilline, la
vinculine ou encore la Kinase FAK (Giannone, J cell biol, 2003 ; Priddle, J cell biol, 1998 ;
Izard, Nature, 2004 ; Gingras, J biol chem, 2005.). Au sein de ces structures adhésives
précoces, c’est la taline qui assure le couplage des intégrines avec le cytosquelette d’actine
(Jiang, Nature, 2003), par des liaisons directes et indirectes, via la liaison à la vinculine.
Enfin, elle est capable de s’homodimériser, participant ainsi avec la paxilline à la formation
de clusters d’intégrines. Ce regroupement des intégrines est essentiel à la formation des
contacts focaux, notamment pour la transactivation des protéines de signalisation comme Src
ou FAK (Miyamoto, Science, 1995 ; Hato, J cell biol, 1998). La vinculine et l’α-actinine
fournissent de nouveaux moyens de couplage entre les intégrines et le cytosquelette d’actine,
permettant de générer des forces de traction qui sont nécessaires à la maturation des
complexes focaux et à leur transformation en adhérences focales.
44
A
B
C
Fig. 21 : immunomarquages représentant les 3 grandes classes de contacts focaux.
A. Fibroblastes humains marqués avec un anticorps anti-phosphotyrosine, montrant la présence
d’adhérences focales, localisées principalement à la périphérie des cellules et de forme allongée.
B. Fibroblastes humains traités avec un inhibiteur (Y-27632) de la Rho-Kinase (ROCK) et
marqués avec un anticorps anti-phosphotyrosine, montrant des structures ponctiformes au niveau
des lamellipodes et caractéristiques des comlexes focaux.
C. Adhérences fibrillaires observées dans des fibroblastes humains après immunomarquage de la
tensine. Ces structures sont associées avec les fibrilles de fibronectine et sont localsées au centre
des cellules.
Fig. 22 : Tableau représentant les principales caractéristiques des différents types de
contacts focaux.
Adapté de Geiger, nat rev mol cell biol, 2001
45
En effet, lorsque le lamellipode avance, une majorité de complexes focaux se
désassemblent pour se reformer plus loin. Cependant, lors de la rétraction du lamellipode, la
génération de forces de traction, suite à la contraction du cytosquelette d’actino-myosine
induite par la GTPase Rho, va permettre la maturation de certaines de ces structures en
adhérences focales, qui sont des structures allongées de 2 à 5 µm de long, situées à la
périphérie des cellules (Zaidel-Bar, J cell sci, 2003 ; Riveline, J cell biol, 2001 ; Geiger, Curr
opin cell biol, 2001). Ces structures sont plus stables que les complexes focaux et sont
particulièrement enrichies en taline, vinculine, paxilline, α-actinine, FAK et autres
phosphoprotéines. Elles possèdent en plus de la Zyxine, totalement absente des complexes
focaux ainsi que de faibles quantités de tensine (Zaidel-Bar, Biochem soc trans 2004). La
Zyxine est une phosphoprotéine permettant la liaison de nombreux partenaires comme l’αactinine, des kinases de la famille Src, ou encore la protéine VASP (vasodilator-stimulated
phosphoprotein), impliquée dans la polymérisation des filaments d’actine (Beckerle,
Bioessays, 1997). Enfin le cytosquelette d’actino-myosine associé avec les adhérences focales
se présente sous la forme de fibres de stress et va permettre la traction du corps cellulaire
(Hotulainen, J cell biol, 2006).
Les adhérences focales jouent un rôle clef dans la signalisation intracellulaire. En
effet, ces structures agissent comme des senseurs des forces exercées sur les cellules et sont
capables de transformer ces informations en signaux intracellulaires, permettant de réguler
l’adhérence, la migration, la prolifération et la survie cellulaire. La sérine/thréonine kinase
ILK et le couple de tyrosine kinases FAK/Src sont des médiateurs importants de cette
signalisation intracellulaire.
Dans un premier temps, FAK est recrutée sur les sites d’adhérence via sa liaison avec
la taline et la paxilline et est activée par auto-phosphorylation de la tyrosine 397, ce qui
permet la liaison du domaine SH2 et l’activation de Src, qui en retour va phosphoryler FAK
(Schaller, Mol cell biol, 1994 ; Calalb, Mol cell biol, 1995, Calalb, BBRC, 1996). Ce
complexe FAK/Src ainsi formé va pouvoir contrôler l’organisation du cytosquelette d’actine,
en activant la nucléation des filaments d’actine, via la phosphorylation de N-WASP (WiskottAldrich syndrome protein) (Wu, J biol chem, 2004) mais également en activant les GTPases
Rac et Rho, via la phosphorylation de p130Cas (Crk-associated substrate) et la paxilline,
d’une part (Tachibana, J biol chem, 1997, Sawada, Cell, 2006), et la phosphorylation de
p190RhoGEF (guanine-nucleotide exchange factor), d’autre part (Zhai, J biol chem, 2003). La
phosphorylation de FAK par Src sur les Y861 et Y925 va permettre la liaison de GRB2,
entrainant l’activation de la prolifération cellulaire par les MAPKs (Schlaepfer, Nature,
46
1994 ; Schlaepfer, Mol cell biol, 1998). Par ailleurs, FAK active la survie cellulaire en
activant la voie PI3K/Akt et en inhibant l’apoptose induite par p53 (Schlaepfer, BBA, 2004).
La signalisation FAK-Src participe également fortement à l’invasion et l’angiogenèse
tumorale en stimulant l’expression de MMP-2 et 9 via l’activation de ERK et JNK (Hsia, J
cell biol, 2003 ; Hu, Cancer res, 2006), et du VEGF via l’activation de ERK2 (Mitra,
Oncogene, 2006). Enfin, le couple FAK-Src régule également l’internalisation puis la
dégradation de la E-cadhérine durant la progression tumorale, participant ainsi à la transition
épithélio-mésenchymateuse, par perte des jonctions adhérentes (Avizienyte, Curr opin cell
biol, 2005) [fig. 23].
Un autre régulateur clef de la signalisation intracellulaire induite par les intégrines est
la kinase ILK, qui est le centre du complexe IPP, où elle s’associe avec la Parvine et PINCH
(Particularly Interesting New Cysteine-Histidine protein). Le complexe IPP se forme d’abord
dans le cytosol (Zhang, J cell sci, 2002) et est ensuite recruté aux adhérences focales en
réponse à l’activation des intégrines, grâce à la paxilline qui interagit avec ILK et la Parvine
(Nikolopoulos, J biol chem, 2001 et 2002). ILK agit ensuite sur de nombreuses voies de
signalisation [fig. 24]. ILK, régule, en particulier la phosphorylation de Akt et GSK-3
(glycogen synthase kinase 3) dans de nombreux modèles cellulaires (Delcommenne, PNAS,
1998 ; Imanishi, Cancer res, 2007 ; Joshi, FASEB J, 2007 ; McDonald, Cancer res, 2008 ;
Naska, J neurosci, 2006 ; Rosano, Mol cancer ther, 2006 ; Troussard, Cancer res, 2006). La
phosphorylation d’Akt entraine l’activation de voies de survie cellulaire, en particulier en
inhibant la voie des caspases et en activant la voie NF-κB (Hannigan, Nat rev cancer, 2005 ;
Legate, Nat rev mol cell biol, 2006). L’activation d’Akt conduit également à l’induction de
HIF-1α (hypoxia-inducible factor 1α), qui va, à son tour, stimuler l’expression du VEGF et
donc l’angiogenèse tumorale (Tan, Cancer cell, 2004). La phosphorylation de GSK-3 quand à
elle, aboutit à l’activation des complexes de transcription AP1 (activator protein 1) et βcaténine/LEF (lymphoid enhancer factor) / TCF (T cell factor), qui activent l’expression de
MMP-9 (Matrix Metalloproteinase 9) et la cycline D1, favorisant ainsi l’invasion tumorale et
la prolifération cellulaire (Hannigan, Nat rev cancer, 2005). En outre, ILK phosphoryle NAc
(Nuclear Accumbens), un co-activateur de AP-1 (Quelo, J biol chem, 2004). ILK agit
également sur la migration et l’organisation du cytosquelette d’actine en activant la cofiline,
qui facilite la dynamique de polymérisation / dépolymérisation des filaments d’actine (Kim, J
biol chem, 2008), et PIX (PAK-interactive exchange factor), un facteur d’échange de
nucléotides à guanine (GEF), qui active Rac et Cdc42 (Filipenko, Oncogene, 2005). Pour
finir, dans les cellules cancéreuses, ILK inhibe l’expression de la E-cadhérine en stimulant
47
Fig.23 : schéma de la signalisation
intracellulaire induite par FAK/Src, dans les
cellules normales (rose) et tumorales (bleu).
Le couple FAK/Src est recruté au niveau des
adhérences focales et activé par une cascade de
phosphorylation. Il s’en suit l’activation de
nombreuses voies de signalisation impliquées
dans la survie cellulaire, la prolifération, la
motilité, la croissance indépendante de
l’ancrage, l’invasion et l’angiogenèse tumorale.
Adapté de Mitra, curr opin cell biol, 2006
Fig. 24 : Schéma de la signalisation intracellulaire régulée par ILK.
ILK est un composant central de la signalisation des intégrines, impliquée à la fois dans
l’homéostasie tissulaire et la progression tumorale. L’activation d’ILK par les intégrines et par
des médiateurs solubles entraîne la régulation de nombreux effecteurs impliqués dans la motilité
et la contractilité cellulaire, la survie, la transition épithélio-mésenchymateuse, l’invasion, la
prolifération et l’angiogenèse tumorale.
Adapté de McDonald, j cell sci, 2008
48
l’expression de son répresseur Snail, participant ainsi la transition épithélio-mésenchymateuse
et favorisant ainsi l’invasion et la formation de métastases (Barbera, Oncogene, 2004).
Le dernier type de structures adhésives dépendantes des intégrines décrites est
représenté par les adhérences fibrillaires qui se présentent sous forme de fibrilles de 10µm
de long, disposées au centre de la cellule et parallèlement aux forces de traction exercées. Ces
structures sont composées essentiellement par l’intégrine α5β1, qui lie les fibrilles de
fibronectine de la MEC, et de tensine. Ces structures semblent en fait dériver des adhérences
focales par translocation vers le centre de la cellule de la tensine et de l’intégrine α5β1, après
liaison de son ligand, et vont permettre en retour de remodeler la MEC pour former des
fibrilles de fibronectine (Pankov, J cell biol, 2000 ; Zamir, Nature cell biol, 2000). En effet, la
fibronectine est une glycoprotéine qui circule dans le sang sous forme de dimères inactifs,
alors qu’elle se présente au niveau des tissus, sous forme de fibrilles insolubles, et est
nécessaire pour l’organisation de la MEC (McKeown-Longo, J cell biol, 1983 ; McDonald, J
cell biol, 1982). Deux mécanismes sont nécessaires à la formation de ces structures : la
génération de forces de traction par Rho (Zhong, J cell biol, 1998) et la phosphorylation de la
tensine par Src (Volberg, J cell sci, 2001). L’application de forces sur la MEC par les cellules
est le mécanisme clef de l’assemblage des fibrilles de fibronectine, car il va permettre
d’exposer des sites cryptiques de la fibronectine impliqués dans sa multimérisation (Ohashi,
PNAS, 1999 ; Krammer, PNAS, 1999 ; Craig, PNAS, 2001). Le rôle de ces structures est de
permettre aux cellules de s’adapter à la rigidité de la MEC. En effet, les adhérences fibrillaires
ne se forment que sur des matrices relativement souples et générant des forces variables, alors
que sur des matrices rigides générant des forces élevées et constantes, les adhérences focales
sont favorisées (Katz, Mol biol cell, 2000).
1.2
Intégrine α6β4
1.2.1 Structure et expression
L’intégrine α6β4 a été identifiée vers la fin des années 1980 par deux groupes
différents comme un complexe composé de deux glycoprotéines (d’environ 150 et 200 kDa)
reliées de façon non covalente, présent au niveau des cellules épithéliales normales et
tumorales, et tout d’abord nommé Ic-IcBP (Ic binding protein) et αEβ4 (Sonnenberg, J biol
chem, 1988 ; Kajiji, EMBO J, 1989). Le domaine extracellulaire de cet hétérodimère présente
la plupart des caractéristiques des intégrines : en effet, les deux sous-unités sont fortement
glycosylées et particulièrement riches en ponts disulfures, la sous-unité α étant formée de
49
deux chaines (une chaine lourde de 125 kDa et une chaine légère de 25 kDa) reliées, elles
aussi, par un pont disulfure. Le clonage de l’ADNc ainsi que l’analyse de la séquence d’acides
aminés de la sous-unité β4 a permis de mettre en évidence certaines particularités de cette
sous-unité par rapport aux autres intégrines (Hogervorst, EMBO J, 1990 ; Suzuki, EMBO J,
1990). Tout d’abord β4 ne peut s’associer qu’avec α6, alors que la sous-unité α6 peut
hétérodimériser avec β1 et β4, mais surtout le domaine cytoplasmique de β4 est très atypique.
En effet, il présente une longueur d’environ 1000 aa. et est formé d’un domaine calXβ dans sa
partie proximale, de deux paires de domaines Fibronectine de type III (FNIII), séparés par un
segment connecteur (CS) et se termine par une queue C-terminale de 90 aa. Cette structure
particulière du domaine cytoplasmique de la sous-unité β4 confère à l’intégrine α6β4 des
fonctions et des partenaires de liaison uniques, par rapport aux autres intégrines [fig. 25].
Son expression est restreinte à la majorité des épithéliums, où elle se localise
préférentiellement au pôle basal des cellules épithéliales, ainsi que dans les vaisseaux
sanguins de petit calibre et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique
(Sonnenberg, J cell sci, 1990 ; Natali, J cell sci, 1992) ; cependant seul le rôle de l’intégrine
α6β4 dans les épithéliums sera abordé dans cette introduction. En outre, au niveau des
épithéliums stratifiés comme la peau, seule la couche basale, en contact direct avec le tissu
conjonctif, exprime l’intégrine α6β4. Peu de choses sont connues sur la régulation de
l’expression de α6β4 dans les tissus normaux. L’étude des promoteurs des gènes codant pour
les sous-unités α6 et β4 (Lin, DNA cell biol, 1997 ; Takaoka, J biol chem, 1998) a permis
d’identifier différents sites fonctionnels de liaison à des facteurs de transcription comme Sp1
et AP2 sur le promoteur de α6 ou AP1, Ets ou NFκB sur le promoteur de β4. Plus récemment,
il a été montré que p63 (un facteur de transcription appartenant à la famille de p53) et plus
particulièrement l’isoforme ΔNp63α, préférentiellement exprimée au niveau des cellules de la
couche basale des épithéliums, régulait l’adhérence de ces cellules sur la MEC en activant
directement la transcription du gène de la sous-unité β4 (Carroll, Nature cell biol, 2006).
Enfin, le groupe du Dr. Mercurio a démontré que, dans l’épithélium mammaire murin,
constitué de deux couches de cellules épithéliales, l’expression de l’intégrine β4 était
restreinte à la couche basale, du fait de l’hyperméthylation de son promoteur dans la couche
luminale (Yang, J cell sci, 2009).
Différentes isoformes, résultant d’épissages alternatifs de l’ARNm, existent pour les
sous-unités α6 et β4, et sont exprimées différemment suggérant des rôles potentiellement
50
Plectin (PD)
Plectin (ABD)
1355
1054
1115
1218
1436
CS
FNIII FNIII
C
991
1382
FNIII
1320
1457
BP180
β4
FNIII
1552 1570
1667
1752
BP230
Fig. 25 : structure du domaine cytoplasmique de la sous-unité β4 et interactions avec les
protéines hémidesmosomales.
Le domaine cytoplasmique de la sous-unité β4, long d’environ 1000 aa., est formé d’un domaine
CalX-β, dans sa région juxtamembranaire, de deux paires de domaines Fibronectine de type III
(FNIII-1 à 4), séparés par un segment connecteur, et d’une queue C-terminale de 85 aa. La
position des différents domaines est indiquée en dessous du schéma de la protéine. La présence
de ces deux paires de domaines FNIII et du CS, spécifiques de la sous-unité β4, permet de
nombreuses interactions cytoplasmiques avec ses partenaires hémidesmosomaux : BP180 (bleu),
BP230 (vert) et la plectine (orange) et explique la localisation très particulière de l’intégrine α6β4
au sein des hémidesmosomes.
protein mutation
protein-protein interactions
disease
β4 (R1281W)
Plectin ABD
nonlethal PA-JEB
β4 (R1225H)
Plectin ABD
nonlethal PA-JEB
β4 (Q1714X)
Plectin plakin domain
lethal EBS
β4 (Δ1450-1499)
BP180?
nonlethal EBS
BP180 (Δ18-407)
β4, Plectin, BP230
nonlethal EBS
CD151 (Δ128-253)
α6
HN-PEB
Plectin (Δ893-895)
β4?
MD-EBS
Fig. 26 : liste de mutations retrouvées chez des patients souffrant d’épidermolyse bulleuse
et conséquences sur les interactions protéine-protéine au sein des hémidesmosomes.
La sous-unité β4A et l’isoforme 1C de la plectine ont été utilisées pour la numérotation des aa.
(PA-JEB pyloric atresia associated with junctional epidermolysis bullosa, HN-PEB hereditary
nephretis associated with pretibial epidermolysis bullosa, MD-EBS muscular dystrophy
associated with epidermolysis bullosa simplex)
Adapté de Wilhelmsen, Mol Cell Biol, 2006
51
distincts. L’intégrine α6 possède deux isoformes appelées α6A et α6B. Le gène codant pour
α6, localisé sur le chromosome 2, code pour une protéine de 150 kDa, composée d’un
domaine extracellulaire de 991 aa., d’un domaine transmembranaire de 23 aa. et d’un
domaine cytoplasmique de 36 aa. pour l’isoforme A ou de 54 aa. pour l’isoforme B, la seule
homologie de séquence entre les deux domaines cytoplasmiques résidant au sein du motif
juxta-membranaire GFFXR, commun à toutes les sous-unités α (Hogervorst, Eur j biochem,
1991). Certains tissus comme les glandes salivaires ou l’intestin expriment les deux variants,
alors que d’autres tissus expriment préférentiellement l’un des deux variants : α6A est le seul
variant exprimé dans la glande mammaire, les kératinocytes basaux et dans le tissu nerveux
périphérique, alors que α6B est plus spécifique du rein (Hogervorst, J cell biol, 1993 ;
Dydensborg, Histochem cell biol, 2009).
Le gène codant pour la sous-unité β4, situé sur le chromosome 17, code pour 5
isoformes différentes : 1- β4A, la forme la plus courante et la plus fortement exprimée ; 2,3les isoformes β4B et C, qui contiennent des insertions dans le segment connecteur de 53 et 70
aa. respectivement et sont exprimées dans le placenta, le système nerveux, ou la peau pour le
variant B et dans des lignées cancéreuses pancréatiques et coliques pour le variant C
(Hogervorst, EMBO J, 1990 ; Tamura, J cell biol, 1990 ; Niessen, J cell sci, 1994) ; 4l’isoforme β4D, qui porte une délétion de 7 aa. au niveau du 4ème domaine FNIII et est
présente dans le colon et le placenta (Clarke, Cell adhes commun, 1994) ; 5- et enfin le variant
E dont le domaine cytoplasmique ne contient que 232 aa., généré par un épissage alternatif
entrainant un codon stop prématuré et exprimé de manière assez large aussi bien au niveau de
la peau que du poumon ou de l’estomac (Van Leusden, BBRC, 1997).
1.2.2 Interactions au sein des hémidesmosomes [fig.25, p51]
Du fait de son domaine cytoplasmique atypique, l’intégrine α6β4 possède des
propriétés d’interaction très différentes des autres intégrines. En effet, c’est la seule intégrine
retrouvée au sein des hémidesmosomes, au niveau du pôle basal des cellules épithéliales, où
elle représente la protéine clef de ces structures, en établissant de multiples interactions
directes avec l’ensemble des protéines hémidesmosomales. La génération de souris
déficientes en β4, ou encore l’étude de patients portant des mutations sur le gène codant pour
les sous-unités α6 ou β4 montrent clairement que l’intégrine α6β4 joue un rôle crucial dans la
formation des hémidesmosomes et le maintien de l’intégrité des épithéliums (Dowling, J cell
biol, 1996 ; Van Der Neut, Nat genet, 1996 ; Georges-Labouesse, nat genet, 1996 ; Vidal, nat
genet, 1995 ; Niessen, J cell sci, 1996 ; Dang, Acta derm venereol, 2008).
52
Plusieurs études ont montré que le domaine cytoplasmique de β4 était essentiel à la
formation des hémidesmosomes (Nievers, J cell sci, 1998 ; Murgia, EMBO J, 1998). En effet
la partie cytoplasmique de la sous-unité β4 établit de nombreuses interactions avec la plectine,
BP180 et BP230. Il a tout d’abord été montré que les aa. 1115 à 1355 de la queue
cytoplasmique de la sous-unité β4, comprenant la 1ère paire de domaines FNIII ainsi que les
35 aa. N-terminaux du CS, étaient nécessaires au recrutement de l’intégrine α6β4 mais aussi
de la plectine au sein des hémidesmosomes (Spinardi, Mol biol cell, 1993 ; Niessen, J cell sci,
et Mol biol cell, 1997). En effet, cette région de la sous-unité β4 interagit directement avec la
partie N-terminale de la plectine, correspondant au domaine de liaison à l’actine de la plectine
(ABD). Ainsi la liaison de β4 avec la plectine empêche la liaison de cette dernière avec
l’actine, ce qui explique que l’intégrine α6β4, lorsqu’elle est présente dans les
hémidesmosomes, soit connectée aux cytokératines et non au cytosquelette d’actine, comme
les autres intégrines (Geerts, J cell biol, 1999 ; Litjens, Mol biol cell, 2003). Des études de
double hybride, de mutagenèse dirigée puis la modélisation et enfin la cristallisation des deux
domaines complexés ont permis de mieux définir cette interaction, montrant notamment
l’importance du 2ème domaine FNIII et du CS de β4, alors que le 1er domaine FNIII ne
contribuerait que de façon mineure dans l’association des deux protéines (Koster, Mol biol
cell, 2004 ; Litjens, Mol biol cell, 2003 ; Litjens, J biol chem, 2005 ; De Pereda, EMBO J,
2009). En outre, deux autres régions de la sous-unité β4, formées de la partie C-terminale du
CS de β4 d’une part (aa. 1382 à 1436), et du 4ème domaine FNIII ainsi de la queue C-terminale
de β4 d’autre part (aa. 1570 à 1752), ont été identifiées comme interagissant avec un domaine
plus central de la plectine, appelé le domaine plakine (Koster, Mol biol cell, 2004). Cette
deuxième interaction nécessite d’abord la liaison sur β4 de l’ABD de la plectine, qui pourrait
favoriser la bonne conformation de la sous-unité β4, de manière à permettre la liaison du
domaine plakine de la plectine, voire même les interactions avec BP180 et BP230. En effet la
sous-unité β4 établit des interactions supplémentaires, impliquant la 2ème paire de domaine
FNIII et l’extrémité C-terminale de β4 pour la liaison à BP230 (Hopkinson, Mol biol cell,
2000 ; Koster, J cell sci, 2003), et le 3ème domaine FNIII pour la liaison à BP180 (Borradori,
J cell biol, 1997 ; Schaapveld, J cell biol, 1998 ; Koster, J cell sci, 2003). L’importance de
ces interactions entre le domaine cytoplasmique de la sous-unité β4 et les autres composants
hémidesmosomaux est appuyée par l’étude de mutations retrouvées chez des patients
souffrant d’épidermolyses bulleuses, et affectant les différents domaines d’interactions de ces
protéines [fig. 26, p51].
53
Les interactions cytoplasmiques de l’intégrine α6β4, sont renforcées par des
interactions extracellulaires, permettant l’ancrage sur la MEC sous-jacente. Tout d’abord,
l’intégrine α6β4 est un récepteur des laminines-1/111, 2/211, 4/221 et 5/332 mais son ligand
préférentiel reste la laminine-5/332 (Niessen, Exp cell res, 1994 ; Rousselle, J cell biol, 1994 ;
Spinardi, J cell biol, 1995). L’importance de la liaison de α6β4 sur la laminine-5/332 dans la
formation des hémidesmosomes est soulignée par l’étude de mutations affectant les gènes
codant pour les différentes chaînes de la laminine-5/332 retrouvées chez des patients souffrant
de formes sévères d’épidermolyse bulleuse jonctionnelle (Aberdam, Nat genet, 1994 ;
Pulkkinen, Genomics, 1994 ; Pulkkinen, Nat genet, 1994 ; Kivirikko, Hum mol genet, 1995),
ou encore par la génération de souris portant une inactivation du gène codant pour la chaîne
γ2 de la laminine-5/332 qui reproduisent un phénotype d’épidermolyse bulleuse jonctionnelle
avec la formation de structures hémidesmosomales très rudimentaires et peu fonctionnelles
(Meng, J invest dermatol, 2003). En outre, la sous-unité α6 interagit directement avec la
portion extracellulaire, juxta-membranaire appelée NC16A de BP180 (Hopkinson, J cell biol,
1995). Bien que l’association entre l’intégrine α6β4 et BP180 soit majoritairement supportée
par des interactions cytoplasmiques avec la sous-unité β4, l’interaction entre le domaine
extracellulaire de BP180 et la sous-unité α6 joue un rôle non négligeable et pourrait être
impliquée dans la stabilisation des hémidesmosomes (Hopkinson, J invest dermatol, 1998).
En effet la génération d’un anticorps ciblant le domaine NC16A de BP180 induit une
séparation de la jonction dermo-épidermale chez la souris et près de 60% des sera de patients
souffrant de maladies pemphigoïdes bulleuses reconnaissent ce même domaine (Giudice, J
immunol, 1993 ; Zillikens, J invest dermatol, 1997, Lin, J immunol, 1999 ; Lin, J invest
dermatol, 2000 ; Thoma-Uszynski, J immunol, 2006). Ainsi, le désassemblage des
hémidesmosomes induits par de tels anticorps résulte probablement de la perturbation de la
liaison entre BP180 et α6.
Plus récemment, la molécule CD151, appartenant à la famille des tétraspanines, a été
identifiée comme un nouveau constituant des hémidesmosomes, intéragissant avec le domaine
extracellulaire de la sous-unité α6, et présent à la fois dans des complexes précédents la
formation des hémidesmosomes ainsi que dans les hémidesmosomes matures (Sterk, J cell
biol, 2000).
54
2. Connexion à la lame basale
2.1
laminine-332
2.1.1
La famille des laminines
Les laminines, découvertes il y a 30 ans comme un produit sécrété par les sarcomes
murins Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) (Timpl, J biol chem, 1979), sont de larges
glycoprotéines (400 à 900 kDa), extracellulaires, hétérotrimériques, constituées de 3 sousunités ou chaînes (α, β et γ) formant une structure en croix. Actuellement, 5 sous-unités α, 4
sous-unités β et 3 sous-unités γ ont été identifiées et forment 16 laminines différentes. Selon
l’ancienne nomenclature, elles étaient désignées par des chiffres de 1 à 15 suivant l’ordre dans
lequel elles avaient été découvertes, mais une nouvelle nomenclature (Aumailley, Matrix biol,
2005) les désigne selon les différentes sous-unités qui les composent. Ainsi la laminine-1
(sous-unités α1, β1 et γ1) est désormais appelée laminine-111 [fig. 27B, p57].
Leur distribution tissulaire est fortement liée à la régulation de l’expression de leur
chaine α. La chaine α1 (laminines-1/111 et 3/121), est fortement exprimée dans les cellules
épithéliales durant les premiers stades de l’embryogenèse. Chez l’adulte, son expression est
restreinte aux organes reproducteurs, les reins et le foie. (Ekblom, Matrix biol, 2003). La
chaine α2 (laminines-2/211, 4/221 et 12/213) est essentiellement exprimée au niveau du
système neuromusculaire, comme les membranes basales des sarcolemmes des fibres
musculaires et la jonction neuromusculaire. La chaine α3 (laminines-5/332, 6/311 et 7/321)
est principalement localisée au niveau de la peau et des autres épithéliums. La chaine α4
(laminines-8/411, 9/421 et 14/423) se retrouve au niveau de la MEC des cellules d’origine
mésenchymateuse. La laminine-8/411 est plus particulièrement sécrétée par les cellules de la
moelle osseuse (Wondimu, Blood, 2004) et constitue avec la laminine-10/511, les principales
laminines des membranes basales des cellules endothéliales. Enfin la chaine α5 (laminines10/511, 11/521 et 15/523) est la plus largement exprimée chez l’adulte, dans les tissus
épithéliaux, neuromusculaires et vasculaires. Elle est également exprimée de façon moindre
durant l’embryogenèse avec la chaine α1 (Yurchenco, Curr opin cell biol, 2004).
Chaque chaîne est constituée en C-terminal d’un large domaine « coiled-coil »
[régions I / II, fig. 27A, p57], responsable de l’hétérotrimérisation des sous-unités α, β et γ via
la formation d’une triple hélice stabilisée par des ponts disulfures. Les chaînes α possèdent en
plus en C-terminal, un large domaine globulaire (100kDa), appelé domaine-G, qui peut être
sous-divisé en 5 modules : LG 1 à 5 ; les modules LG1 à 3 ainsi que l’extrémité C-terminale
55
de la chaîne γ représentant le site de liaison des laminines avec les intégrines α3β1, α6β4,
α6β1 et α7β1 (Ido, J biol chem, 2007). Le domaine-G permet aussi de lier d’autres récepteurs
de surface tels que syndécans, dystroglycans ou protéoglycans d’héparan-sulfate [fig. 28A, p
59]. Les extrémités N-terminales ou bras courts des différentes chaînes sont formés d’une
alternance de domaines globulaires [régions IV / VI, fig. 27A] et de domaines « rod-like »,
composés de séquence répétées « EGF-like » [régions III / V, fig. 27A]. Bien que capables
aussi de lier certaines intégrines, les bras courts des différentes chaînes sont plutôt impliqués
dans la polymérisation, calcium-dépendante, des molécules de laminines via les domaines VI
de chacune des sous-unités, ainsi que dans la liaison avec d’autres composants de la MEC tels
que le collagène de type IV, le nidogène, le perlecan, la fibuline ou encore d’autres isoformes
de laminine [fig. 28A, p 59].
Ainsi assemblées en un réseau complexe interagissant avec le réseau de collagène IV
et stabilisées par des molécules comme le nidogène ou le perlecan qui interconnectent les
deux réseaux, les laminines contribuent fortement à l’assemblage et au maintien de l’intégrité
des membranes basales et des différents tissus qu’elles supportent (tissus épithélial,
endothélial, musculaire, graisseux ou nerveux). Pour preuve, des mutations touchant le gène
LAMA2 codant pour la chaine α2 de la laminine-2/211 causent des dystrophies musculaires
congénitales, ou encore des mutations touchant les gènes codant pour les différentes chaines
de la laminine-5/332 entrainent des épidermolyses bulleuses jonctionnelles dont certaines
formes (variants Herlitz) sont particulièrement graves. Par ailleurs, de part leurs interactions
avec les cellules, les laminines modulent également les phénomènes de différenciation,
d’adhérence et de migration cellulaire.
2.1.2 laminine-5/332
La laminine-5/332 (aussi appelée ladsine, niceine, kalinine ou épiligrine) est, avec la
laminine-10/511, un des composants majeurs de la lame basale de la peau et plus
généralement des épithéliums (Rousselle, R cell biol 1991 ; Carter, Cell, 1991).
Parmi toutes les différentes isoformes de laminines décrites, la laminine-332 présente
une structure unique. En effet, les bras courts de ses différentes sous-unités sont tronqués et ne
possèdent donc pas certains domaines présents sur les autres laminines, modifiant ainsi ses
partenaires d’interaction (Miyazaki, Cancer sci, 2006) [fig. 28B, p59]. Par exemple, la
laminine-332 ne possède pas les domaines de polymérisation permettant de s’auto-assembler
en réseau. Par contre, elle est capable d’interagir avec d’autres isoformes de laminines :
laminines 6/311 et 7/321 via sa chaine β3 (Champliaud, J cell biol, 1996). En outre, la chaine
56
A.
B.
Standard
α
β
γ chain
α1β1γ1
α2β1γ1
α1β2γ1
α2β2γ1
α3Aβ3γ2
α3Bβ3γ2
α3Aβ1γ1
α3Aβ2γ1
α4β1γ1
α4β2γ1
α5β1γ1
α5β2γ1
α2β1γ3
α4β2γ3
α5β2γ2
α5β2γ3
Actuelle
111
211
121
221
332 ou 3A32
3B32
311 ou 3A11
321 ou 3A21
411
421
511
521
213
423
522
523
ancienne
1
2
3
4
5 ou 5A
5B
6 ou 6A
7 ou 7A
8
9
10
11
12
14
15
Fig. 27 : structure et nomenclature des laminines.
A. Structure cruciforme et organisation des différents domaines de la laminine-1/111 formé par
une chaîne α1, une chaîne β1 et une chaîne γ1. Le large domaine LG globulaire est formé par
l’extrémité C-terminale de la chaîne α. Les domaines I et II de chaque chaîne s’assemblent pour
former une triple hélice hétérotrimérique. Enfin les extrémités N-terminales de chaque chaîne
forment les bras courts de la structure et sont formés par une alternance de domaines globulaires
(domaines IV et VI) et de domaines EGF-like répétés (domaines III et V).
B. Nomenclature des différentes laminines. La colonne de gauche décrit les différentes chaînes
de chaque laminine. La nomenclature actuelle (colonne centrale) désigne les différentes
laminines selon la composition de leur chaînes alors que l’ancienne nomenclature (colonne de
droite) les désigne selon l’ordre de leur découverte.
Adapté de Aumailley, Matrix Biol, 2005
57
β3, et de façon moindre, la chaine γ2, sont capables de lier directement les fibrilles d’ancrage
de collagène VII, assurant ainsi la connexion avec le derme au niveau de la peau (Chen, J
invest dermatol, 1999). Enfin, la chaine γ2 interagit également avec l’héparine, le perlecan, le
nidogène ou la fibuline (Sasaki, J mol biol, 2001). En interagissant ainsi avec tous ces
partenaires extracellulaires, la laminine-332 apparaît comme un organisateur central des lames
basales épithéliales et plus particulièrement de la jonction dermo-épidermale.
Côté cellulaire, la laminine-332 interagit classiquement, via son domaine LG, avec les
intégrines α6β4 et α3β1 (Kunneken, J biol chem, 2004 ; Mizushima, Cell growth differ, 1997),
mais également avec l’intégrine α2β1 et la protéine hémidesmosomale BP180, via le bras
court de sa chaine γ2 ; la liaison avec l’intégrine α3β1 étant essentielle au bon développement
de la lame basale (DiPersio, J cell biol, 1997), alors que l’interaction avec les protéines
hémidesmosomales, d’une part, et le collagène VII, d’autre part, intervient dans l’ancrage des
cellules épithéliales sur le tissu conjonctif (Dowling, J cell biol, 1996).
En plus de cette fonction d’adhérence, la laminine-5/332 peut aussi agir comme un facteur de
motilité/migration, mais cette fonction nécessite des modifications de la molécule. En fait, un
clivage protéolytique de la laminine-5/332, impliquant entre-autre des métallo-protéases
(MMPs), influence la migration cellulaire ainsi que l’assemblage des hémidesmosomes. Ces
fonctions de la laminine-332 dans la migration cellulaire et sa maturation protéolytique sont
détaillées dans le chapitre II.C, p95.
2.2
BP180/Collagène XVII
2.2.1 Famille des collagènes transmembranaires
BP180 appartient à la famille des collagènes transmembranaires qui englobe un
groupe de protéines de type collagène agissant à la fois comme des récepteurs de surface et
des composants de la MEC. Actuellement cette famille de protéines comprend 7 membres
exprimés de manière assez large : les collagènes transmembranaires XIII, XVII, XXIII et
XXV, ainsi que des protéines plus éloignées structurellement : l’ectodysplasine-A, les
récepteurs macrophage scavenger de classe A et le récepteur MARCO (macrophage receptor
with collagenous structure) (Franzke, Matrix biol, 2003). Les collagènes XIII, XVII, XXIII et
l’ectodysplasine-A sont plutôt impliqués dans l’adhérence cellulaire, le collagène XXV aussi
appelé CLAC-P (collagen-like Alzheimer amyloïd plaque component precursor) est
spécifique du cerveau et est un composant des plaques amyloïdes dans la maladie
d’Alzheimer ; les récepteurs macrophage scavenger et le récepteur MARCO sont impliqués
58
α
Pol
Col VII
Laminin-311, 321
Integrins
heparin
Col IV
Nidogen
Perlecan
…
Pol
α2β1 integrin
Col IV, VII
BP180
Perlecan
Fibuline
…
Pol
Integrins
α-dystroglycan
α6β4, α3β1
integrins
Heparansulfate proteoglycans /syndecan
α-dystroglycan
A. Laminin-111
Heparansulfate
proteoglycans/syndecan
B. Laminin-332
Fig. 28 : Comparaison de la structure et des sites de liaisons des laminines-111 et 332.
A. Partenaires d’interaction de la laminine-111 (présentée comme un prototype) : les
domaines LG1 à 3 ainsi que l’extrémité C-terminale des laminines représentent le site de liaison
des intégrines. Mais les laminines possèdent de nombreux autres sites de liaison, en particulier
pour les autres composants de la MEC (rose). En outre, les domaines VI des bras courts
permettent une homopolymérisation des chaînes de laminines (Pol), permettant ainsi la
formation d’un réseau de laminines.
B. Structure et sites de liaison de la Laminine-332 : La laminine-332 est le ligand préférentiel
des intégrines α6β4 et α3β1. En outre, elle possède des bras courts tronqués, modifiant ses
capacités d’interaction (vert). Elle ne peut pas s’homopolymériser mais peut, en revanche
hétéropolymériser avec les laminines-311 et 321. En outre, les bras courts de ses chaînes β3 et γ2
peuvent lier directement le collagène de type VII. Enfin, le bras court de sa chaîne γ2 interagit
avec BP180 au niveau des hémidesmosomes.
Adapté de Miyazaki, Cancer Sci, 2006
59
dans la défense immunitaire. Parmi tous ces membres, le collagène XVII se présente comme
le mieux caractérisé.
Tous les collagènes transmembranaires sont des protéines transmembranaires de type
II et se présentent comme des homotrimères de chaines α contenant un domaine N-terminal
intracellulaire, un fragment transmembranaire hydrophobe, et un large domaine C-terminal
extracellulaire [fig. 29]. La longueur des chaines α varie entre 135 aa. pour l’isoforme la plus
courte de l’ectodysplasine-A et 1497 aa. pour le collagène XVII. Dans la plupart des cas, le
domaine intracellulaire est très court et ne représente que 10% de la molécule, à l’exception
du collagène XVII dont le domaine intracellulaire représente un tiers de protéine. Le domaine
transmembranaire est long de 21 à 26 aa. et est suivi par une large extrémité C-terminale avec
une structure « rod-like », faisant protrusion dans l’espace extracellulaire, et contenant de un à
plusieurs sous-domaines de type collagène, séparés par de courtes séquences non
collagéniques. Le segment juxta-membranaire extracellulaire, d’une longueur de 59 à 116 aa.,
forme la charnière entre la membrane plasmique et le premier domaine collagène et se
caractérise par la présence de structures « coiled-coil », servant de zone de nucléation pour la
trimérisation et l’assemblage en triple hélice des domaines de collagène (Engel, Matrix biol,
2000), cet assemblage se faisant dans le sens N à C-terminal, contrairement aux autres
collagènes (Snellman, EMBO J, 2000 ; Areida, J biol chem, 2001).
La région charnière, exhibe également des sites de clivage protéolytique permettant le
relargage d’une forme soluble de la molécule, au moins pour 4 des collagènes
transmembranaires : le collagène XIII, XVII, XXV et l’ectodysplasin-A. Actuellement, on ne
sait pas si ce sont les mêmes protéases (sheddases) qui clivent tous ces substrats. Cependant,
la présence d’une séquence consensus dans plusieurs molécules, a laissé supposer qu’une
furine pouvait être responsable de ce clivage (Schäcke, J biol chem, 1998 ; Snellman, EMBO
J, 2000 ; Elomaa, Hum mol genet, 2001 ; Chen, PNAS, 2001). En effet, des mutations au
niveau de cette séquence abolissent le clivage de l’ectodysplasine-A et du collagène XXV
(Chen, PNAS, 2001 ; Hashimoto, EMBO J, 2002). En revanche, le collagène XVII murin est
clivé malgré l’absence de cette séquence consensus et Franzke et ses collaborateurs ont
montré que le collagène XVII murin et humain n’était pas clivé par une furine, in vitro
(Franzke, EMBO J, 2002) et que les protéases ADAM-9, 10 (a disintegrin-andmetalloproteinase), activés par des furines, étaient les protéases physiologiques du collagène
XVII (Franzke, J biol chem, 2009).
60
Fig. 29 : représentation schématique de la structure des collagènes transmembranaires.
Les rectangles noirs représentent les domaines transmembranaires, les blancs, les domaines noncollagéniques alors que les verts représentent les domaines collagènes. L’échelle, en bas de la
figure représente le nombre d’acides aminés, la position 0 a été placée à la limite entre les
domaines cytoplasmiques et transmembranaires. Les valeurs positives définissent donc les
résidus transmembranaires et extracellulaires alors que les valeurs négatives définissent les
résidus cytoplasmiques.
(C, Cystéines, N sites potentiels de N-glycosylation)
Adapté de Franzke, Matrix Biol, 2003
61
2.2.2. BP180/BPAG2/collagène XVII
BP180 a tout d’abord été identifié comme un auto-antigène de 180 kDa dans les
maladies pemphigoïdes bulleuses (Labib, J immunol, 1986 ; Klatte, J cell biol, 1986). Son
gène, COL17A1 (Li, J biol chem, 1991) code pour des chaines α1 de 1497 aa. qui
s’assemblent pour former un homotrimère. Son expression a d’abord été décrite comme
restreinte aux épithéliums stratifiés (Giudice, J invest dermatol, 1992), mais certains
épithéliums simples comme l’épithélium mammaire expriment BP180 et sont donc capables
de former des hémidesmosomes de type I (comprenant α6β4, la plectine, BP180 et BP230)
(Bergstraesser, Am j pathol, 1995), contrairement au dogme établi selon lequel les
épithéliums simples forment des structures hémidesmosomales simplifiées de type II (ne
contenant que α6β4 et la plectine).
Son extrémité N-terminale, intracellulaire, présente une structure globulaire impliquée
dans des interactions avec les protéines hémidesmosomales : β4, BP230 et la plectine. Koster
et collaborateurs, par des expériences de double-hybride chez la levure ont déterminé de
manière assez précise les domaines d’interaction entre ces différentes protéines (Koster, J cell
sci, 2003) : ils ont notamment montré la présence de 2 sites de liaison pour la sous-unité β4
comprenant les aa. 1 à 145 et 231 à 401. Ces résultats confirment les travaux de Borradori (J
cell biol, 1997), et Schaapveld (J cell biol, 1998), qui avaient montré qu’une interaction entre
les domaines cytoplasmiques des 2 protéines était nécessaire au recrutement de BP180 au sein
des hémidesmosomes. La région comprise entre les sites de liaison de β4 (aa. 145 à 230), est
quand à elle, impliquée dans la liaison directe avec BP230 mais semble aussi interagir
directement avec la plectine, suggérant une compétition entre les deux protéines pour la
liaison à BP180 [fig. 30A].
Le domaine C-terminal de BP180, extracellulaire, se compose de 15 sous-domaines
collagéniques (répétitions de motifs Gly-X-Y) nommés COL1 à 15, séparés par des séquences
non collagéniques, nommées NC1 à 16, s’organisant pour former une structure en triple hélice
semblable à celle des collagènes (Hirako, J biol chem, 1996 ; Balding, Biochemistry, 1997).
Des techniques d’ombrage en microscopie électronique mais également de microscopie
électronique couplée à des immuno-marquages ont montré que le domaine extracellulaire de
BP180 s’organisait en 2 domaines distincts : l’un, comprenant le domaine non collagénique
16 (NC16A) et le large domaine collagène 15 (COL15), adopte une structure « rod-like » qui
traverse la lamina lucida et contribue à la formation des filaments d’ancrage (Masunaga, J
invest dermatol, 1997), l’autre, composé des 700 aa. C-terminaux, possède une plus grande
flexibilité et permet la formation d’une boucle dans la lamina densa (Nonaka, J invest
62
A. 180 kDa form
11 223 3 44556677889 9 1011121314
15
16A
101112131415
Laminin-332
α6
β4
β4
BP230
plectin
Shedding from
cell surface
ADAM9/10
B. 120 kDa form
C.
Collagenous domains
Non-collagenous domains
Fig. 30 : Struture, interactions et clivage extracellulaire de BP180
A. Structure et organisation des différents domaines de la forme pleine taille de BP180. Bp180
possède un large domaine extracellulaire C-terminal de 1008 aa., un domaine transmembranaire
de 23 aa. et un domaine intracellulaire de 466 aa. Le domaine extracellulaire est formé d’une
alternance de domaine collagéniques (numérotés en verts) et non-collagéniques (numérotés en
rose). Les rectangles colorés en dessous de la molécule représentent les différentes interactions de
BP180 au sein des hémidesmosomes.
B. Dans les kératinocytes, le domaine extracellulaire de BP180 est clivé, au niveau du domaine
NC16, par les ADAMs 9 et 10, en une forme de 120 kDa libérée dans le milieu extracellulaire.
C. Western blot montrant l’expression des formes pleine taille (180 kDa) et clivée (120 kDa) de
BP180 dans des extraits cellulaires (C) et le milieu de culture (M) de kératinocytes.
Adapté de Franzke, Matrix Biol, 2003
63
dermatol, 2000) [fig. 31 et 32]. Bien que le rôle exact de cette conformation du domaine
extracellulaire de BP180 soit encore mal compris, il semble que cela joue un rôle important
dans l’interaction de BP180 avec des composants de la MEC. Il a notamment été montré que
l’extrémité C-terminale de BP180 (comprenant les domaines collagènes 1 à 6) interagissait
avec la laminine-332, favorisant ainsi l’ancrage des cellules épithéliales sur la lame basale
(Tasanen, Am j pathol, 2004) [fig. 30A]. En outre, le domaine NC16A, portion extracellulaire
juxta-membranaire, en plus d’être impliqué dans la nucléation de la triple hélice collagénique
de BP180 (Areida, J biol chem, 2001), interagit directement avec la sous-unité α6 de
l’intégrine α6β4 (Hopkinson, J cell biol, 1995). Ainsi, il apparaît que BP180 agit comme une
protéine d’ancrage cruciale, connectant
les protéines hémidesmosomales intra et
extracellulaires. Cette idée est notamment supportée par le fait que certaines formes
d’épidermolyses
bulleuses
jonctionnelles
(GABEB,
generalized
atrophic
benign
epidermolysis bullosa) sont associées à des mutations du gène COL17A1.
Enfin, un clivage du domaine extracellulaire de BP180 au niveau du domaine NC16A,
par les protéases ADAM9 et 10, a été décrit dans les kératinocytes et diminuerait la migration
de ces cellules (Schäcke J biol chem, 1998 ; Franzke, EMBO J, 2002 – J biol chem, 2004 et
2009) [fig. 30B et C]. Le rôle exact de ce clivage reste peu compris. En 2004, Tanasen et ses
collaborateurs ont démontré que des kératinocytes déficients en BP180, isolés à partir de
patients souffrant d’épidermolyses bulleuses, avaient un phénotype migratoire mais
présentaient également des défauts d’organisation et de maturation de la laminine-332. Ces
résultats suggèrent que BP180, outre son rôle dans l’adhérence cellulaire, via l’implication de
son domaine intracellulaire dans la formation des hémidesmosomes, agirait également comme
un organisateur de la lame basale via le clivage de son domaine extracellulaire de 120 kDa,
fixant la MEC un peu comme une glue (Tasanen, Am j pathol, 2004).
3. Connexion aux filaments intermédiaires
3.1.
Famille des plakines
Les protéines BP230 et plectine, composant la plaque interne des structures
hémidesmosomales, appartiennent à la famille des plakines. Les plakines sont de larges
protéines adaptatrices, initialement identifiées en 1991, comme reliant les filaments
intermédiaires aux jonctions d’ancrage de la membrane plasmique des épithéliums
(hémidesmosomes et desmosomes). Leur nom vient d’ailleurs de la localisation de certains de
ses membres, en microscopie électronique, au niveau de la plaque dense cytoplasmique de ces
64
Fig. 31 : Photos de molécules de BP180 en solution
obtenues en microscopie électronique après
ombrage rotatif.
50
La partie globulaire correspond à l’extrémité Nterminale, cytoplasmique. La partie linéaire est formée
par le domaine non-collagénique NC16A et le domaine
collagène Col15, alors que les 700 aa. restants Cterminaux forment la partie plus flexible.
Fig. 32 : Contribution de BP180 à la formation des filaments d’ancrage des
hémidesmosomes.
Représentation schématique de l’organisation de BP180 observée en microscopie électronique.
La région linéaire, formée par les domaines NC16 et Col15 traverse la lamina lucida et participe
avec la laminine-332 à la formation des filaments d’ancrage des hémidesmosomes, alors que la
région plus flexible des 700 aa. C-terminaux est insérée dans la lamina densa où elle interagit
avec la laminine-332.
Adapté de Hirako, Microsc Res Tech, 1998
65
structures spécialisées membranaires. Puis, suite aux avancées en clonage moléculaire, et
grâce au séquençage du génome des mammifères et des invertébrés, de nouveaux variants et
de nouveaux gènes ainsi que de nouvelles fonctions ont été découverts pour cette famille de
protéines, comme par exemple la capacité de lier également les cytosquelettes d’actine et de
microtubules, faisant de celles-ci des organisateurs de l’architecture cellulaire (Wiche, J cell
sci, 1998 ; Leung, Trends cell biol, 2002).
Les plakines comptent, à l’heure actuelle, 7 membres identifiés : la desmoplakine, la
plectine, BPAG1/BP230, MACF (microtubule-actin crosslinking factor), l’envoplakine, la
périplakine et l’épiplakine [fig. 33B]. Les plakines sont exprimées dans des tissus subissant de
grands stress mécaniques comme les épithéliums et les muscles, où elles jouent un rôle vital
dans le maintien de l’intégrité des tissus en ancrant les filaments cytosquelettiques aux
complexes membranaires. Leur présence est également cruciale pour le bon développement
des neurones.
Cette famille se caractérise par la présence d’un domaine plakine et/ou de plakin
repeat domains (PRD). En plus de ces deux domaines communs, les plakines peuvent
posséder un domaine de liaison à l’actine (ABD = actin binding domain), un coiled-coil rod
domain, un spectrin-repeat-containing rod domain caractéristique de la sous-famille des
spectraplakines et des domaines de liaison aux microtubules [fig. 33A].
Le domaine plakine est présent dans toutes les plakines à l’exception de l’épiplakine. Il se
divise en 6 hélices α, nommée NN, Z, Y, X, W et V, qui s’organisent de façon antiparallèle.
La région comprise entre les segments NN et X, et plus particulièrement les domaines Z et Y,
est la plus conservée entre les différentes plakines. Des études cristallographiques des
domaines plakine de la plectine et BPAG1 (Jefferson, J mol biol, 2007 ; Sonnenberg, J mol
biol, 2007) ont permis de mettre en évidence que ce domaine correspondait en fait à 2 paires
de domaines spectrine répétés (a pair of tandem spectrin repeats) reliées par un domaine SH3 ;
cette structure particulière conférant une grande flexibilité du domaine permettant de
supporter de grandes tensions mécaniques comme c’est le cas au niveau de la peau ou des
muscles. Ce domaine est important pour la localisation des plakines au niveau des jonctions
d’ancrage de la membrane en interagissant avec les autres protéines de ces complexes : les
domaines plakine de la plectine et BPAG1 interagissent avec β4 et BPAG2 au sein des
hémidesmosomes (Koster, J cell sci, 2003) et celui de la desmoplakine lie les plakoglobines et
les plakophilines au sein des desmosomes (Getsios, Nat rev mol cell biol, 2004).
66
A.
NN Z Y
Z Y
V
X
XW
W V
B.
Fig. 33 : La famille des plakines et leur stucture.
A. Organisation des différents domaines des plakines : les différents domaines
caractéristiques des plakines et leurs fonctions sont indiqués. Les différents variants au niveau
des domaines CH, issus d’épissages alternatifs sont également décrits. (CH Calponin–Homology
domain, PRD Plakin repeats domain, GAR GAS2 related, GSR Glycine-Serine-Arginine repeats)
B. Structure des différentes isoformes de plakines chez les mammifères et les invertébrés
Adapté de Jefferson, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004
67
Les séquences répétées plakine (plakin repeats) sont des séquences spécifiques des
plakines, situées en C-terminal des plakines épithéliales et également présentes dans certaines
spectraplakines. Ce sont des séquences de 28 aa, organisées en tandem, responsables de la
liaison avec les filaments intermédiaires. Les domaines globulaires PRD (plakin repeat
domain) sont constitués de 4,5 séquences répétées et sont classés en 3 groupes : A, B et C,
basés sur leur homologie de séquence. La desmoplakine contient 3 PRD, la plectine 6,
BPAG1e 2 et l’envoplakine 1. La structure cristallographique des PRD B et C de la
desmoplakine (Choi, Nat struct biol, 2002) a permis de définir les sites de liaison des
filaments intermédiaires. De plus une séquence connectant ces deux PRD appelée « sousdomaine L » semble également importante pour la liaison des filaments intermédiaires
(Fontao, Mol biol cell, 2003).
Le domaine de liaison à l’actine est constitué de deux « calponin-homology
domains », (CH1 et CH2), d’une 100aine de résidus situés en N-terminal des plakines.
L’isolation des domaines de liaison à l’actine de la plectine (Fontao, J cell sci, 2001),
BPAG1n (Yang, Cell, 1996), ou MACF (Leung, J cell biol, 1999 ; Karakesisoglou, J cell biol,
2000) a montré une liaison directe à l’actine et la co-localisation de ces domaines avec les
filaments d’actine. Le domaine CH1 est capable, seul, de lier l’actine mais avec une affinité
plus faible que la paire CH1-CH2 (Way, J cell biol, 1992). En revanche, il existe certaines
isoformes, notamment de BPAG1 et de MACF qui ne possèdent pas le domaine CH1 ; cette
absence du domaine CH1 pouvant abolir la liaison à l’actine et au contraire favoriser
l’interaction avec d’autres partenaires. Enfin les domaines de liaison à l’actine sont capables
de s’homo- ou de s’hétérodimériser (Fontao, J cell sci, 2001), contribuant ainsi à
l’organisation du réseau d’actine.
Le « coiled-coil rod domain » est responsable de l’homo- et dans certains cas de
l’hétérodimérisation parallèle des plakines. Certaines plakines, les spectraplakines, possèdent
à la place de ce domaine, un nombre variable de domaines « spectrin repeats ». Chaque
spectrin repeat est formé de 3 hélices-α possédant une séquence répétée de 7 aa. chargés et
hydrophobes ; cette périodicité de 7 aa. étant nécessaire pour la dimérisation des
spectraplakines.
Certaines plakines sont également capables d’interagir avec les microtubules (Sun, J
cell sci, 2001). Le domaine principalement responsable de cette interaction est le domaine
GAR (GAS2 related), ainsi nommé pour son homologie de séquence avec la protéine GAS2
(growth arrest specific-2), et situé en C-terminal des plakines. Ce domaine est associé avec un
domaine GSR, riche en glycines, sérines et arginines, également impliqué dans la liaison avec
68
les microtubules. Généralement, les plakines ne possédant pas le domaine GAR
n’interagissent pas avec les microtubules. Cependant, la plectine, qui ne possède que le
domaine GSR, peut tout de même lier les microtubules.
Une autre grande caractéristique des plakines est la présence d’un grand nombre
d’isoformes dû à la présence de promoteurs alternatifs au niveau des gènes des plakines, à des
épissages alternatifs de leurs transcrits et également à différents sites d’initiation de la
traduction. Différents épissages alternatifs classiquement décrits aboutissent à la production
d’isoformes ayant 3 extrémités N-terminales différentes, possédant 1, 2 ou aucun domaine
CH, comme c’est le cas pour BPAG1 et MACF. Plusieurs isoformes se distinguent aussi au
niveau de la longueur de leur « rod domain », notamment pour la desmoplakine ou BPAG1.
La plectine, quant à elle, possède au moins 12 1ers exons alternatifs, et actuellement 16
isoformes décrites. Ces isoformes possèdent des propriétés et des localisations tissulaires et
subcellulaires différentes, ce qui a aboutit à une grande confusion dans la nomenclature des
plakines ainsi que dans leurs fonctions tissus-spécifiques et leur distribution.
3.2
La plectine/HD1
La plectine a été identifiée il y a plus de 25 ans (Pytela, PNAS, 1980) comme
interagissant avec les filaments intermédiaires et présumée impliquée dans l’organisation du
réseau cytosquelettique, d’où son nom qui vient du grec « πλεκτή », signifiant réseau (Wiche,
Exp cell res, 1982). 10 ans plus tard, le clonage et le séquençage de son ADNc chez le rat
(Wiche, J cell biol, 1991), puis l’analyse de la structure de son gène chez l’homme (situé sur
le chromosome 8q24) (Liu, PNAS, 1996 ; McLean, Genes dev, 1996), ainsi que l’analyse des
phénotypes de patients souffrant d’EBS-MD, dues à des défauts du gène de la plectine, ont
permis de faire de grands progrès dans la compréhension de son rôle majeur dans la stabilité
mécanique des cellules et des tissus. Ceci sera ensuite confirmé par la définition des
nombreuses interactions moléculaires de la plectine avec les 3 cytosquelettes cellulaires ainsi
que dans les complexes jonctionnels. La génération de souris déficientes en plectine (Andrä,
Genes dev, 1997) a permis de découvrir de nouvelles fonctions comme la régulation de
procédés de signalisation cellulaire. Plus récemment (Fuchs, Hum mol genet, 1999), l’analyse
de la complexité des extrémités 5’ des transcrits de la plectine, a encore augmenté la diversité
moléculaire de la plectine, aboutissant à l’identification de 18 potentielles isoformes ayant des
fonctions différentes.
La plectine pleine taille a un poids moléculaire compris entre 499 et 533 kDa, basé sur
la séquence murine (Rezniczek, Hum mol genet, 2003). L’analyse en microscopie électronique
69
montre un structure en altère avec un « rod domain » central entouré par 2 larges domaines
globulaires [fig. 34A]. Le domaine central est constitué de 7 domaines répétés, qui permettent
la formation de dimères anti-parallèles, comme indiqué par les dimensions microscopiques et
les données d’HPLC qui donnent un poids moléculaire, en solution, de 1100kDa (Foisner, J
mol biol, 1987). Le domaine globulaire C-terminal, long de 214 kDa, est codé par un seul
long exon (>6Kb) et est constitué de 6 larges domaines répétés, très homologues : les PRDs,
caractéristiques des plakines (Wiche, J cell biol, 1991). Le domaine globulaire N-Terminal,
contient un domaine de liaison à l’actine conventionnel (2 domaines CH) (Stradal, FEBS lett,
1998), précédé par des séquences codées par des exons alternatifs, ainsi qu’un domaine
plakine, lui aussi caractéristique de la famille des plakines [fig. 34B].
La plectine est, parmi les plakines, la protéine la plus versatile. En effet, elle présente
un très grand nombre d’isoformes dues à un épissage alternatif très complexe, en particulier
au niveau de l’extrémité 5’, de ses transcrits [fig. 34C et D]. L’analyse la plus précise du gène
de la plectine a été réalisée chez la souris (Fuchs, Hum mol genet, 1999). Il se situe sur le
chromosome 15, est long de 62Kb, et compte 40 exons. 16 variants présentant des différences
au niveau de leur extrémité 5’ ont été identifiés : 11, résultants d’un épissage alternatif au
niveau de l’exon 1 avec 3 variants supplémentaires au niveau de l’exon 1c, et 2 variants au
niveau des exons 2 et 3, qui sont les premiers des 6 exons codant pour le domaine de liaison à
l’actine. Suite à cette description, l’organisation du gène de la plectine a été revue chez le rat
et l’homme : les 11 variants, décrits au niveau de l’exon 1, sont présents chez le rat, et 8 ont
été confirmés chez l’homme (Zhang, Genome res, 2004). De plus, 2 nouveaux variants,
auxquels il manque l’exon 31 (codant pour le rod-domain) ont été identifiés chez le rat
(Elliott, Genomics, 1997) et l’homme (Brown, J immunol, 2001). Ce grand nombre
d’isoformes permet d’expliquer la grande diversité de fonctions que peut exercer la plectine,
cette diversité fonctionnelle pouvant, par ailleurs, être augmentée par l’hétérodimérisation de
différentes isoformes. Enfin, certaines isoformes peuvent avoir une spécificité tissulaire,
permettant ainsi de cibler un rôle particulier de la plectine au niveau d’un tissu précis.
La plectine, même si elle n’est pas ubiquitaire, présente une distribution très large dans
l’organisme. L’utilisation d’un panel d’anticorps monoclonaux et d’antisera a montré que la
plectine était exprimée au niveau de différents types de muscles, des épithéliums simples et
stratifiés, ainsi qu’au sein des cellules formant la barrière hémato-encéphalique (Errante, J
neurosci res, 1994 ; Wiche, J cell biol, 1983 ; Wiche, Exp cell res, 1984 ; Wiche, Crit rev
biochem mol biol, 1989). Au niveau cellulaire, elle est co-distribuée avec différents types de
filaments intermédiaires, ainsi qu’au niveau des structures d’attachement des IFs et des
70
100nm
BP180
Actin/β4
β4
Fig. 34 : La plectine, structure protéique et génomique.
A. Photo de molécules de plectine en solution obtenue en microscopie électronique après
ombrage rotatif et montrant une structure en forme d’altère.
B. Structure protéique de la plectine : La structure tripartite de la protéine est formée d’un
domaine central linéaire, flanqué par deux domaines globulaires N- et C-terminaux. Le domaine
N-terminal se compose d’un domaine de liaison à l’actine (ABD) intéragissant également avec la
1ère paires de domaines FNIII de l’intégrine β4 et d’un domaine plakine interagissant, d’une part
avec une portion C-terminale de β4 et d’autre part, avec BP180 (rectangles bleus clairs et foncés).
Le domaine C-terminal est impliqué dans la liaison aux filaments intermédiaires (rond bleu) et est
constitué de 6 domaines plakine répétés. Il contient également un site de phospsphorylation par
CDK1 (rouge). Enfin l’existence d’épissages alternatifs donne naissance à différentes isoformes
présentant des variations de leur extrémité N-terminale (étoile jaune).
C. Organisation du gène murin de la plectine : les exons sont représentés par des rectangles
noirs et les introns par des lignes.
D. Représentation schématiques des différents transcrits alternatifs de la plectine. On
dénombre au moins 16 transcrits différents. Les régions codantes sont représentées en noir, alors
que les régions non-codantes sont en orange. Pour les transcrits dont le 1er exon n’est pas codant
(1h, 1i, 1j), l’initiation de la traduction survient au niveau de l’exon 6 seulement.
Adapté de Rezniczek, methods cell biol, 2004
71
microfilaments à la membrane plasmique tels que les hémidesmosomes (Rezniczek, J cell
biol, 1998 ; Wiche, Exp cell res, 1984), les desmosomes (Eger, J cell sci, 1997), les contacts
focaux (Seifert, Eur j cell biol, 1992), les lignes-Z et les plaques denses des muscles striés et
lisses respectivement et les disques intercalaires du muscle cardiaque (Wiche, J cell biol,
1983). De plus, des expériences de protection à la RNase, utilisant des ribosondes spécifiques
des différents 1ers exons alternatifs, ont montré une expression spécifique de certaines
isoformes (Andrä, J invest dermatol, 2003 ; Fuchs, Hum mol genet, 1999) : les variants
possédant l’exon 1d sont spécifiques des muscles squelettiques et cardiaques, les variants 1a
des cellules épithéliales, les variants possédant l’exon 2α se retrouve au niveau du cerveau, du
cœur, et des muscles squelettiques, et l’exon 3α au niveau du cerveau. La localisation
subcellulaire des isoformes est également dépendante de leur extrémité alternative Nterminale (Rezniczek, Hum mol genet, 2003) : l’isoforme 1A codée par le variant 1a est
associée spécifiquement aux hémidesmosomes dans les kératinocytes, celle codée par le
variant 1b est associée aux mitochondries, et l’isoforme 1F se situe au niveau des contacts
focaux, associée à la vinculine à l’extrémité des fibres de stress.
En plus de cette grande diversité d’isoformes et de localisations, la plectine interagit
avec de nombreux partenaires. En fait, à l’heure actuelle, aucune autre protéine de la famille
n’a montré une telle capacité d’interactions (Wiche, J cell sci, 1998). Tout d’abord, la plectine
est capable de lier les 3 cytosquelettes cellulaires. Elle a d’abord été identifiée comme liant les
filaments intermédiaires de vimentine, via une séquence de 50 aa. située entre les 5ème et 6ème
PRDs (sous-domaine L) (Nikolic, J cell biol, 1996). Mais elle peut également interagir avec
d’autres filaments intermédiaires : la desmine (Reipert, Exp cell res, 1999), la lamine-B
(Foisner, PNAS, 1991) et les cytokératines de type I/II, notamment les cytokératines 5 et 14
au niveau des hémidesmosomes (Geerts, J cell biol, 1999 ; Steinböck, J cell sci, 2000). En
outre, ces interactions sont régulées par des phosphorylations par les protéines kinases PKA et
PKC (Foisner, PNAS, 1991), ou encore p34cdc2 pendant la mitose (Foisner, Mol biol cell,
1996). Son interaction avec le cytosquelette d’actine implique son extrémité N-terminale
(ABD) (Andrä, Genes dev, 1998), cette activité pouvant être modulée par un épissage
alternatif au niveau des exons 2 et 3, mais également par la présence d’un site alternatif
d’initiation de la traduction dans l’exon 6, qui entraine la perte du domaine CH1 et abolit la
liaison à l’actine (Fuchs, Hum mol genet, 1999 ; Rezniczek, Hum mol genet, 2003).
Concernant sa liaison au réseau de microtubules, il a d’abord été montré que la plectine
interagissait avec les protéines associées aux microtubules MAP1 et 2 (Herrmann, J biol
chem, 1987), avant que des marquages à l’or en microscopie électronique ne montrent qu’elle
72
reliait les microtubules avec la vimentine (Svitkina, J cell biol, 1996). Elle est encore capable
de lier de nombreux autres partenaires très divers, comme la desmoplakine au niveau des
desmosomes (Eger, J cell sci, 1997), les protéines sous-corticales fodrine et α-spectrine
(Herrmann, J biol chem, 1987). Enfin, elle interagit également avec des kinases et des
molécules de signalisation, ces interactions lui conférant un rôle dans la régulation de la
signalisation intracellulaire. Par exemple, elle interagit et régule négativement la tyrosine
kinase Fer (Lunter, BBRC, 2002). La Plectine interagit aussi avec RACK1 (receptor for
activated C kinase 1), impliquée dans la localisation et l’activation de la PKC au niveau des
récepteurs aux facteurs de croissance. Ainsi, en interagissant avec RACK1, la plectine régule
sa localisation subcellulaire, régulant de ce fait l’activation de PKC (Osmanagic-Myers, J biol
chem, 2004).
Au sein des hémidesmosomes, la plectine établit des interactions multiples avec les
protéines hémidesmosomales β4 et BP180 [fig. 34B]. L’interaction entre la plectine et le
domaine cytoplasmique de β4 fait intervenir plusieurs sites. Le premier point de contact
implique le domaine de liaison à l’actine (ABD) et est permissif pour la 2ème interaction qui
fait intervenir le domaine plakine de la plectine. Durant ces 10 dernières années, la
compréhension du mécanisme d’interaction entre l’ABD de la plectine avec la partie
cytoplasmique de β4 a suscité un grand intérêt. En effet, cette liaison est primordiale pour le
recrutement de la plectine au sein des hémidesmosomes et semble être un point clef de
l’initiation de l’assemblage des structures hémidesmosomales (Niessen, J cell sci, 1997 ;
Niessen, Mol biol cell, 1997 ; Nievers, J cell sci, 2000). Différentes méthodes : doublehybride et transfections de mutants (Geerts, J cell biol, 1999 ; Litjens, Mol biol cell, 2003),
structure cristallographique de chacun des domaines isolés (De Pereda, EMBO J, 1999 ;
Garcia-Alvarez, Structure, 2003 ; Sevcik, Eur j biochem, 2004), modélisation (Litjens, J biol
chem, 2005) et structure cristallographique (De Pereda, EMBO J, 2009) des deux domaines
complexés, ont été utilisées afin de mieux appréhender l’interface entre ces deux domaines
ainsi que les résidus et les régions exactes impliquées dans leur interaction. Cette première
interaction s’établit entre la 1ère paire de domaines FNIII ainsi que la partie N-terminale du
segment connecteur (CS) de β4 (aa. 1115 à 1355), d’une part, et le domaine de liaison à
l’actine (ABD) ainsi que les séquences N-terminales de la plectine (aa. 1 à 339), d’autre part,
entrainant une compétition entre l’actine et β4 pour ce site de liaison (Geerts, J cell biol,
1999). Il a notamment été montré la présence d’une ceinture basique au niveau du domaine
CH1 de la plectine qui s’insère dans une poche acide formée par la 1ère paire de domaine
FNIII de β4. Le domaine CH2, bien que n’entrant pas directement en jeu dans l’interaction,
73
reste nécessaire pour permettre le bon positionnement du domaine CH1, les 5 aa. (aa. 60 à 64)
situés en N-terminal de l’ABD de la plectine jouant également un rôle important dans cette
interaction [fig. 35]. En 2004, koster et ses collaborateurs identifient un deuxième site au
niveau du domaine plakine de la plectine, interagissant avec 2 portions de β4 comprenant le
C-terminal du CS d’une part et le 4ème domaine FNIII ainsi que l’extrémité C-terminale de la
protéine d’autre part (Koster, Mol biol cell, 2004). Le domaine plakine, et plus
particulièrement son sous-domaine Y, interagit également avec BP180, cette interaction entre
BP180 et la plectine étant nécessaire au bon recrutement de BP180 au sein des
hémidesmosomes (Pulkkinen, Hum mol genet, 1996 ; Koster, J cell sci, 2003). Enfin, le
domaine de dimérisation (rod-domain) joue également un rôle non négligeable dans la
formation des HDs comme le montre la présence de formes de la plectine ne possédant pas ce
domaine chez des patients souffrant d’EBS-MD (Koster, Mol biol cell, 2004).
3.3
BPAG1e/BP230
Cette protéine a tout d’abord été identifiée comme un auto-antigène de 230kDa dans
des maladies pemphigoïdes bulleuses (Stanley, Cell, 1981), avant d’être décrite comme un
composant des HDs (Westgate, J invest dermatol, 1985). Ce rôle dans la structure des
hémidesmosomes est en effet confirmé par le phénotype des souris déficientes en BP230,
souffrant de détachements localisés de la peau en réponse à des stress mécaniques (Guo, Cell,
1995). Cependant ces souris présentent d’autres altérations et notamment une dystonie
musculaire, une dégénération des neurones sensoriels et une désorganisation des
microtubules. En fait le gène bpag1 code pour 4 isoformes différentes : BPAG1a, b, e et n.
BPAG1a est fortement exprimé dans les neurones ainsi que, à des degrés moindres, BPAG1b
et n. BPAG1b est également fortement exprimée dans les muscles squelettiques et le cœur.
Enfin BPAG1e (ou BP230) est spécifique de la peau et des épithéliums muqueux du tractus
digestif (Leung, J cell biol, 2001).
Ces différentes isoformes sont le résultat d’épissages alternatifs qui entrainent des
variations structurelles entre les isoformes (Leung, J cell biol, 2001 ; Leung, J cell sci, 2001 ;
Okumura, J biol chem, 2002 ; Yang, Cell, 1996) : BPAG1e/BP230 possède en N-terminal un
domaine plakine, responsable de la liaison avec les protéines hémidesmosomales (Hopkinson,
Mol biol cell, 2000 ; Koster, J cell sci, 2003), un rod-domain central, impliqué dans la
dimérisation de la molécule, et en C-terminal, deux domaines plakine répétés (PRD) qui lient
les filaments intermédiaires (Yang, Cell, 1996 ; Leung, J cell biol, 2001 ; Fontao, Mol biol
cell, 2003). BPAG1n possède une structure très similaire, avec une extension N-terminale
74
A.
B.
Fig. 35 : Structure du complexe β4/plectine.
A. Schéma des domaines cytoplasmiques de l’intégrine β4 et de la plectine : les domaines de
chaque protéine dont l’interaction a été étudiée par cristallographie sont encadrés en jaune.
B. Structure cristallographique et modélisation du complexe entre l’ABD de la plectine et
les domaines FN-III 1 et 2 de β4 : le cœur de l’interface est formé par les feuillets β ABE et la
boucle BC du domaine FNIII-2 de la sous-unité β4 qui s’organise autour d’une ceinture basique
délimitée par les résidus R1225, K1279 et R1281, qui fait face à la surface acide du domaine CH1
de la plectine. R1225 et R1281 établissent des ponts salins avec les résidus D151 et E95 de la
plectine, respectivement. Un troisième pont salin est établit entre les résidus E1242 de β4 et R98
de la plectine. Ces trois interactions sont essentielles à l’interaction entre la sous-unité β4 et la
plectine. Des contacts directs sont établis entre la boucle BC de β4 et la boucle FG de la plectine,
avec notamment le résidu D154 de la plectine qui établit une liaison hydrogène avec le résidu
E1242 de β4. Enfin, le résidu hydrophobique M182 du feuillet β E de l’intégrine β4 interagit avec
le résidu P157 et la chaîne aliphatique de la K158 de la plectine.
Adapté de De Pereda, EMBO J, 2009
75
composée d’un domaine de liaison à l’actine (ABD). Cet ABD est également présent dans les
isoformes a et b, qui par ailleurs, ont leur domaine central remplacé par des « spectrinrepeats », et possède en C-terminal un domaine de liaison aux microtubules. Enfin, alors que
BPAG1a ne possède pas de PRD, BPAG1b en possède un, permettant à cette isoforme de lier
les trois cytosquelettes cellulaires (Green, Adv protein chem, 2005).
Le rôle de BP230 dans les hémidesmosomes est souligné par la génération de souris
déficientes pour cette protéine (Guo, Cell, 1995) ; en effet, aucune mutation du gène bpag1
n’a été observée chez l’homme, ne permettant pas, contrairement aux autres protéines
hémidesmosomales, l’étude du rôle de BP230 dans la formation des hémidesmosomes chez
l’homme. L’observation de la structure des hémidesmosomes en microscopie électronique,
dans ces souris déficientes en BP230, montre l’absence de plaque interne, et suggère que
BP230 jouerait un rôle essentiel dans la liaison entre les cytokératines 5 et 14 (Fontao, Mol
biol cell, 2003) et les protéines hémidesmosomales β4 et BP180. Il a été montré que les aa. Nterminaux 1 à 98 de BP230 interagissent avec la deuxième paire de domaines FNIII et la
partie C-terminale de β4 (Koster, J cell sci, 2003). Cependant, même si les aa. 56 à 98,
correspondant au début du domaine plakine de BP230, renforce la liaison avec β4, la région
minimale permettant une interaction avec β4 comprend les aa. 4 à 56. La définition de la
région de BP230 impliquée dans cette interaction explique que seul BP230/BPAG1e soit
capable d’interagir avec β4. En effet, BP230 partage une grande homologie de séquence avec
l’isoforme BPAG1n ou dystonine, excepté au niveau de cette extrémité N-terminale précédant
le domaine plakine, où BPAG1n possède un domaine de liaison à l’actine [fig. 36]. Enfin, le
domaine plakine de BP230 interagit également avec l’extrémité N-terminale de BP180, mais
implique cette fois-ci le sous-domaine Y (aa. 347 à 549), cette interaction pouvant être
renforcée par des séquences additionnelles, situées au niveau du sous-domaine Z de BP230
(Pulkkinen, Hum mol genet, 1996 ; Hopkinson, Mol biol cell, 2000 ; Koster, J cell sci, 2003).
4. tétraspanine CD151
Les tétraspanines, qui comprennent 36 membres chez les mammifères, sont des
molécules de 200 à 350 aa. possédant 4 segments transmembranaires, avec des extrémités Net C-terminales cytoplasmiques et une courte boucle intracellulaire, ces portions
cytoplasmiques possédant de nombreux sites de palmitoylation, ainsi que deux boucles
extracellulaires, l’une courte (EC1) et l’autre (EC2), plus longue, N-glycosylée et possédant
des résidus cystéines conservés impliqués dans la formation de ponts disulfures importants
76
Plakin
domain
A.
PRD
4 56
347
549
BP230/BPAG1e
β4
B.
BP180
Intermediate
filaments
ABD
CH1-CH2
BPAG1n
Fig. 36 : structure et interactions de BP230 avec les protéines hémidesmosomales
A. Structure de BP230 : les différents domaines de BP230 ainsi que les régions minimales
d’interactions avec BP180 et la sous-unité β4 (rectangles bleus) sont représentés. Le rectangle
rose indique la région impliquée dans l’interaction avec les cytokératines.
B. Comparaison de la structure de BP230/BPAG1e avec son isoforme BPAG1n : la structure
des deux isoformes est très proche, hormis dans la région N-terminale, où BPAG1n possède un
domaine de liaison à l’actine que ne possède pas BP230 ; ce qui explique que seul BP230 puisse
interagir avec la sous-unité β4.
(ABD Actin Binding Domain, PRD Plakin Repeats Domain)
77
pour l’organisation structurelle de la boucle EC2 (Boucheix, CMLS, 2001) [fig. 37]. Les
tétraspanines, établissent de nombreuses interactions entre elles mais également avec une
grande variété d’autres molécules transmembranaires, formant des micro-domaines enrichis
en tétraspanines (Levy, Physiology, 2005 ; Hemler, Nat rev mol cell biol, 2005 ; Charrin,
Biochem j, 2009). La liste des protéines interagissant avec les tétraspanines s’est
considérablement accrues ces dernières années et regroupe des intégrines et autres molécules
d’adhérence (comme VCAM-1 ou ICAM-1), des protéines possédant des domaines Ig
(CD9P-1, EWI-F, EWI-2…), des enzymes extracellulaires (métalloprotéinases), et des
molécules de signalisation (protéines-G hétérotrimériques, PI4K, PKC) [fig. 38 et 39, p80 et
81]. Bien que les mécanismes moléculaires responsables de leurs effets ne soient pas encore
très clairs, il semble qu’elles soient impliquées dans la régulation de la migration, de la
polarité et de la différenciation cellulaire, en agissant probablement comme des plateformes
transmembranaires facilitant le recrutement de molécules de signalisation au niveau des
intégrines.
CD151 est exprimée dans une grande variété de tissus et de types cellulaires incluant
les cellules épithéliales, endothéliales, les érythrocytes, les cellules de Schwann, les
mégacaryocytes et les plaquettes… (Fitter, Blood, 1995 ; Sincock, J histochem cytochem,
1997 ; Kramatic Crew, Blood, 2004), où elle s’associe notamment , via leur sous-unité α, avec
un grand nombre d’intégrines : α3β1, α2β1, α5β1, α6β1, α6β4, α7β1 ou encore αIIbβ3
(Yauch, Mol biol cell, 1998 ; Yanez-Mo, J cell biol, 1998 ; Fitter, Biochem j, 1999 ; Serru,
Biochem j, 1999 ; Sincock, J cell sci, 1999 ; Sterk, J cell biol, 2000 ; Yauch, J biol chem,
2000 ; Kazarov, J cell biol, 2002 ; Sterk, J cell sci, 2002).
CD151 est la plus récente des molécules à avoir été décrite dans les hémidesmosomes,
et se localise à la fois dans des structures précédant la formation des hémidesmosomes ainsi
que dans des structures plus matures, où elle interagit avec la sous-unité α4 (Sterk, J cell biol,
2000). Cependant son rôle exact dans les hémidesmosomes reste mal compris. En effet, dans
un premier temps, des souris déficientes en CD151 ne montrent aucune fragilité de la peau
(Wright, Mol cell biol, 2004) et dans des cellules exprimant des molécules chimériques
possédant le domaine cytoplasmique de β4, mais incapables de s’associer avec α6 et donc
CD151, des hémidesmosomes matures sont formés (Nievers, J cell sci, 1998). D’un autre
côté, une mutation non-sens du gène codant pour CD151, amenant à la synthèse d’une
protéine tronquée, a été identifiée chez un patient souffrant d’une épidermolyse bulleuse
localisée (Karamatic Crew, Blood, 2004).
78
Fig. 37 : structure des tétraspanines.
Les tétraspanines possèdent 4 domaines transmembranaires, une courte boucle extracellulaire
(EC1), une très courte boucle intracellulaire (4 aa. classiquement) et une large bouble
extracellulaire (EC2), flanquées par de courtes extrémités N- et C-treminales cytoplasmiques (de
8 à 21 aa.). La boucle EC2 se divise en une région constante (orange), contenant les hélices α A,
B et E, et une région variable (bleue), contenant les sites d’interaction protéine-protéine. Les
différentes tétraspanines connues partagent un grand degré d’homologie de séquence (65 à 95%).
Parmi les résidus très conservés, toutes les tétraspanines possédent un motif CCG après l’hélice
B ainsi que 2 autres cystéines conservées (orange), établissant des ponts disulfures
intramoléculaires (lignes rouges). La majorité des tétraspanines contiennent 2 autres cystéines
conservées (vert) qui établissent aussi un pont disulfure (pointillés rouges). Presque toutes les
tétraspanines possèdent également des sites de palmitoylation.
Adapté de Hemler, Nat rev mol cell biol, 2005
79
ASSOCIATED
Tetraspaninsa
Confirmed by or comment
MOLECULE
b1 integrins
a1b1
a2b1
CD9
CD9, CD151b
a3b1
CD9, CD63, CD81, CD82,
cross-linking (most evident for CD151)
CD151, NAG-2, Co-029
masked epitope (CD151)
a4b1
CD9, CD53, CD81, CD82, CD151
a5b1
CD9, CD151
a6b1
CD9, CD63, CD81, CD82,
CD151, NAG-2, Co-029
Other integrins
a6b4
CD9, CD151b
Integrin aIIbb3
CD9, CD151
cross-linking (CD9)
aLb2CD82b
CD63, 157,
CD82b
Integrin aLb2 CD63,
158157, 158
Other adhesive receptors
CD44
CD9
Syndecan
CD9
CD42 (GpIb/V/IX)
CD9
CD47
CD9
cross-linking
Molecules of the immune system
HLA-DR
CD9, CD37, CD53, CD81,
FRET, cocapping (CD81)
CD82
MHC class I
CD82
FRET
CD53,
CD81
FRET only
CD4 (human/mouse) CD9, CD81, CD82,
CD8
cocapping
CD81, CD82
CD3 (human/mouse) CD9, CD81
CD19
CD9, CD81, CD82
cocapping; functional effect
CD21
CD81
indirect via CD19
Leu-13
CD81
CD46
CD9, CD81, CD82, CD151
indirect via integrins
CD5 (mouse)
CD9
cocapping
CD2 (rat)
CD53
Others
ProHB-EGF
CD9, CD63, CD81, CD82
functional effect (CD9);
cross-linking (CD9)
proTGFa
CD9
CD9P-1
CD9, CD63, CD81, CD82, CD151b
functional effect
cross-linking (CD9)
g-glutamyl
CD37, CD81, CD53, CD82
cocapping
EGF receptor
CD82
functional effect
UPII, UPIII
UPIa, UPIb
cross-linking
transpeptidase
Fig. 38 : Association des tétraspanines avec les molécules de surface membranaires
Adapté de Boucheix, CMLS, 2001
80
Tetraspanin
Cell type
Enzyme
Association with enzymatic activities
CD9
carcinoma cell lines
Ser/Thr kinase
CD53
thymoma
Tyrosine phosphatase
CD63
rat basophilic cell line
CD63
neutrophils
tyrosine kinase (Lyn, Hck)
CD9, CD 63, CD81
various
PI4K
HB2 mammary epithelial cells
EGF-R
CD151, TALLA-1 *
CD82
primary keratinocytes A549;
small-cell lung carcinoma
Signal transduction
CD9
schwann cells
Ca++, tyrosine phosphorylation
CD9, CD 151
platelets
Fc receptor recruitment by mAbs
CD82
U937
Fc receptor recruitment by mAbs
CD53
monocytes, B cells
Ca++
CD9, CD 63, CD81
MDA-MB-231
FAK phosphorylation/
CD82, CD151
dephosphorylation
CD81, CD53
B cells
tyrosine phosphorylation
CD9
transfected B cells
tyrosine phosphorylation
Fig. 39 : Activités enzymatiques associées aux tétraspanines
Adapté de Boucheix, CMLS, 2001
81
II. ASSEMBLAGE ET REGULATI ON DES HEMIDESMOSOMES
A/ Assemblage des Hémidesmosomes
Comme nous avons vu précédemment la formation des hémidesmosomes implique de
nombreux partenaires, qui semblent tous nécessaires pour la formation de structures stables et
parfaitement fonctionnelles. Cependant, ces différents partenaires jouent des rôles plus ou
moins importants dans l’assemblage et la stabilité des hémidesmosomes. En outre, l’étude des
interactions protéine-protéine au sein des hémidesmosomes a montré que certains sites
d’interactions pouvaient se superposer. Enfin, la longue partie cytoplasmique de l’intégrine β4
semble subir des changements conformationnels qui pourraient réguler la liaison de certains
de ses partenaires hémidesmosomaux. Ces changements conformationnels peuvent être
régulés notamment par la phosphorylation de la partie cytoplasmique de la sous-unité β4, qui
est, comme nous nous le verrons un peu plus tard, la cible de différentes kinases, ce qui
entraîne le désassemblage des hémidesmosomes. L’intervention de phosphatases semble donc
être un pré-requis à l’assemblage des structures hémidesmosomales, cependant aucune
phosphatase responsable de la déphosphorylation de la sous-unité β4 n’a encore été identifiée
à ce jour.
L’ensemble de ces données suggère que l’assemblage des hémidesmosomes
pourrait se faire de manière séquentielle et un modèle hiérarchisé d’assemblage a été proposé
[fig. 40].
Une des 1ères étapes clefs régulant l’assemblage des hémidesmosomes semble être
l’interaction entre le domaine cytoplasmique de β4 et la plectine. L’étude de mutations
retrouvées chez des patients, affectant la plectine (Elliott, Genomics, 1997 ; Koster, Mol biol
cell, 2004), ou la sous-unité β4 et abolissant sa liaison avec la plectine (Geerts, J cell biol,
1999 ; Koster, J invest dermatol, 2001 ; Nakano, Pediatr res, 2001), ainsi que la génération
de souris déficientes en plectine (Andrä, Genes dev, 1997) montrent clairement le rôle crucial
du couple β4/plectine dans l’intégrité des hémidesmosomes. En outre, des hémidesmosomes
de type II, ne possédant pas les protéines BP180 et BP230, sont présents au niveau de certains
épithéliums simples comme l’intestin (Orian-Rousseau, Dev dyn, 1996). Plus encore,
plusieurs études ont montré que l’interaction entre le domaine cytoplasmique de β4 et la
plectine serait suffisante pour initier l’assemblage des hémidesmosomes en l’absence de la
liaison de α6β4 sur son ligand (Nievers, J cell sci, 1998 ; Homan, J cell sci, 1998 ; Nievers, J
82
Fig. 40 : modèle présentant l ’assemblage séquentiel des hémidesmosomes.
La sous-unité β4 présente un repliement interne de son extrémité C-terminale sur la partie Cterminale du segment connecteur (CS). La liaison du domaine de liaison à l’actine de la plectine
au niveau de la 1ère paire de domaine FNIII faciliterait l’ouverture de cette boucle interne mais la
proximité du domaine C-terminal de β4 avec le CS permettrait une deuxième interaction entre ces
2 régions et le domaine plakine de la plectine. Il est connu que cette séquence d’interactions
permet une conformation correcte de la sous-unité β4 pour lier BP180, via son 3ème domaine
FNIII. Le recrutement de BP180 au sein des hémidesmosomes permet ensuite celui de BP230 qui
interagit avec la 2ème paire de domaine FNIII de β4 mais aussi avec BP180, pour former des
structures hémidesmosomales matures.
Adapté de Koster, mol biol cell, 2004
83
cell sci, 2000 ; Russell, J cell sci, 2003). Enfin, le recrutement de BP180 et BP230 au sein des
hémidesmosomes nécessite au préalable la liaison de β4 avec la plectine (Koster, J invest
dermatol, 2001 ; Koster, J cell sci, 2003 ; Koster, Mol biol cell, 2004). En effet, les régions de
β4 impliquées dans la liaison du domaine plakine de la plectine : portion C-terminale du CS
(aa.1382 à 1436) et extrémité C-terminale (aa. 1667 à 1752), sont également capables
d’interagir entre elles, entraînant un repliement interne de la sous-unité β4 (Schaapveld, J cell
biol, 1998 ; Rezniczek, J cell biol, 1998) [fig. 41]. Il a d’abord été supposé que ce repliement
interne pourrait masquer les sites de β4 interagissant avec BP180 et BP230 et que la liaison de
la plectine, pourrait entraîner un changement conformationnel permettant ainsi la liaison de
BP180 et 230. En effet, la liaison du domaine plakine de la plectine dissocie cette liaison
interne. Cependant, des délétions de la portion cytoplasmique de la sous-unité β4, visant à
abolir ce repliement interne, ne facilite pas pour autant, la liaison de BP180 et BP230. En
outre, ce repliement rapproche les domaines de liaison à la plectine et on pense aujourd’hui
qu’il pourrait, au contraire, faciliter la liaison de β4 avec ses partenaires hémidesmosomaux.
Le recrutement de BP180 au sein des hémidesmosomes est dépendant de ses interactions avec
β4 et la plectine (Pulkkinen, Hum mol genet, 1996 ; Borradori, J cell biol, 1997 ; Schaapveld,
J cell biol, 1998) et précède celui de BP230. En effet, dans des kératinocytes déficients en
BP180, le recrutement de BP230 au sein des hémidesmosomes est sévèrement altéré
(Schaapveld, J cell biol, 1998 ; Borradori, Exp cell res, 1998 ; Hopkinson, Mol biol cell,
2000 ; Koster, J cell sci, 2003). En outre, la plectine et BP230 interagissent avec la même
région de BP180, mais l’interaction entre BP180 et BP230 est plus forte que celle entre
BP180 et la plectine ; ce qui concorde bien avec l’idée que BP230 est recruté en dernier,
permettant d’abord la liaison entre BP180 et la plectine avant, à son tour, d’interagir avec
BP180 (Koster, J cell sci, 2003). L’étude de la structure des hémidesmosomes présents chez
des souris déficientes en BP230 montre l’absence de formation de la plaque interne (Guo,
Cell, 1995). Ainsi, malgré la similarité de structure entre la plectine et BP230, ces protéines
permettant, toutes deux, de relier les hémidesmosomes aux filaments intermédiaires
intracellulaires, il semble que BP230 soit plus impliqué dans la formation de la plaque interne,
alors que la plectine interviendrait plutôt dans l’assemblage et la stabilisation des
hémidesmosomes. Le recrutement plus tardif de BP180 par rapport à la plectine et les
nombreuses interactions de BP180 au sein des hémidesmosomes, suggèrent que BP180 joue
un rôle dans la stabilisation des hémidesmosomes, et non dans leur initiation. Cependant, des
structures hémidesmosomales persistent malgré l’absence de l’intégrine α6β4 chez certains
84
plectin
1382
C
FNIII FNIII
1115
CS
1436
1570
FNIII
1667
FNIII
1752
β4
1355
Fig. 41 : interactions entre la sous-unité β4 et la plectine : rôle du repliement interne de β4.
La plectine et l’intégrine β4 établissent plusieurs interactions. La première concerne le domaine
de liaison à l’actine (ABD) de la plectine et la 1ère paire de domaines FNIII (aa. 1115 à 1355) de
β4 et est permissive pour la deuxième interaction. Cette dernière liaison intervient entre le
domaine plakine de la plectine et deux portions de β4, comprenant les aa. 1382 à 1436 et les aa.
1570 à 1752. L’existence d’un repliement interne entre l’extrémité C-terminale (aa. 1667 à 1752)
et le domaine C-terminal du segment connecteur (CS, aa. 1382 à 1436) de la sous-unité β4
(flèche rouge), pourrait ainsi faciliter la liaison du domaine plakine de la plectine.
Adapté de Margadant, Curr opin cell biol, 2008
85
patients atteints d’épidermolyses bulleuses. Ce qui laisse supposer que BP180 pourrait
représenter, de par sa liaison avec la laminine-5/332, un mécanisme alternatif d’initiation des
hémidesmosomes, même si ces structures sont moins robustes et ne compensent que très
partiellement l’absence d’α6β4 (Niessen, J cell sci, 1996).
Même si de nombreuses études ont montré que l’interaction entre α6β4 et la plectine
était nécessaire et suffisante pour initier la formation des hémidesmosomes, la liaison de
l’intégrine sur son ligand, la laminine-5/332, joue un rôle tout aussi important. Plusieurs
études, utilisant des anticorps bloquant la liaison entre l’intégrine et son ligand, ou un
dominant négatif de la sous-unité β4, ne possédant pas de partie cytoplasmique, ont permis de
mettre en évidence le rôle de la laminine-5/332 aussi bien dans la nucléation que dans la
stabilisation des hémidesmosomes (Jones, Cell regul, 1991 ; Kurpakus, J cell biol, 1991 ;
Spinardi, J cell biol, 1995) . Des études de microscopie électronique faites sur des coupes de
peau ainsi que l’utilisation de kératinocytes issus de patients n’exprimant pas la laminine5/332, montrent clairement une réduction importante du nombre d’hémidesmosomes, une
altération de leur structure ne présentant pas de plaque sous-basale, ainsi qu’un défaut
d’adhérence (Gagnoux-Palacios, J biol chem, 1996 ; Dellambra, Hum gene ther, 1998 ;
McMillan, J invest dermatol, 1998). L’ensemble de ces données montre donc que
l’assemblage des hémidesmosomes peut être initié à la fois par les interactions
cytoplasmiques de β4 avec la plectine mais également par la liaison de l’intégrine α6β4 sur
son ligand. Le clivage protéolytique des différentes chaînes de la laminine-5/332 est
également connu pour réguler la dynamique des hémidesmosomes. Le clivage des domaines
LG 4 et 5 de la chaîne α3 favorise la liaison de l’intégrine α6β4 au sein des hémidesmosomes
alors qu’un domaine LG intact ou encore le clivage de la chaine γ2 favorisent au contraire la
liaison de l’intégrine α3β1 et la migration cellulaire (Goldfinger, J cell sci, 1999 ;
Hintermann, Matrix biol, 2004 ; Sadowski, CMLS, 2005). On a longtemps cru que le clivage
des domaines LG 4 et 5 de la chaine α3 de la laminine-5/332 jouait un rôle à la fois dans
l’initiation et dans la stabilité des hémidesmosomes mais le groupe de Meneguzzi a montré
que ce clivage intervenait spécifiquement dans la maturation des hémidesmosomes (Baudoin,
J invest dermatol, 2005).
De manière intéressante CD151 et l’intégrine α3β1 sont retrouvés associés dans des
structures décrites comme « pré-hémidesmosomales » au pôle basal des kératinocytes, la
formation de ces structures précédant celle des hémidesmosomes (Sterk, J cell biol, 2000). Le
86
rôle de ces complexes dans la nucléation des hémidesmosomes pourrait être, d’une part, de
fournir un premier point d’ancrage des kératinocytes sur la lame basale via la liaison de α3β1
sur la laminine-5/332, et d’autre part, du fait de la capacité de CD151 à interagir avec, à la
fois, α3β1 et α6β4, de créer des plateformes, au pôle basal des kératinocytes, permettant le
recrutement et la bonne localisation de α6β4 afin d’initier la formation des hémidesmosomes.
En outre, l’étude de la peau de souris déficientes en intégrine α3β1, a permis de démontrer le
rôle de cette intégrine dans l’organisation et/ou le maintien de l’intégrité de la lame basale,
qui représente un pré-requis pour la formation des hémidesmosomes (DiPersio, J cell biol,
1997). Une fois la formation des hémidesmosomes initiée, l’intégrine α3β1 est délocalisée de
ces
structures
pré-hémidesmosomales
vers
des
contacts
focaux
entourant
les
hémidesmosomes matures, formant ainsi une sorte de barrière physique permettant de
contenir les hémidesmosomes et pouvant contribuer à leur stabilisation. Une partie de CD151
colocalise avec l’intégrine α3β1 au niveau de ces contacts focaux, mais la majorité des
molécules de CD151 reste incorporée dans les hémidesmosomes de type I et II, participant
probablement également à leur stabilisation. Malgré tout, ces deux protéines ne sont pas
essentielles à l’intégrité des hémidesmosomes et semblent n’avoir qu’un rôle facilitateur. En
effet, des souris déficientes en intégrine α3β1 ou en CD151, présentent des hémidesmosomes
apparemment normaux tant en taille qu’en nombre (DiPersio, J cell biol, 1997 ; Wright, Mol
cell biol, 2004).
B/ Désassemblage des hémidesmosomes
Bien que fournissant un ancrage solide et durable des cellules épithéliales sur la lame
basale, les hémidesmosomes sont des structures dynamiques, en renouvellement permanent
(Geuijen, Mol biol cell, 2002 ; Tsuruta, Cell motil cytoskeleton, 2003). Cet état dynamique
permet un désassemblage rapide des hémidesmosomes, dans certaines conditions, comme le
renouvellement de l’épiderme, la différenciation des kératinocytes ou encore leur migration
dans les processus de réparation. Au cours de ces processus, les hémidesmosomes se
désassemblent et l’intégrine α6β4 est délocalisée vers des structures de migration de type
lamellipodes et filopodes, où elle va activer des voies de signalisation en coopération avec les
récepteurs aux facteurs de croissance et ainsi permettre la prolifération et la migration
cellulaire. Le désassemblage des hémidesmosomes est également une des premières étapes
participant à l’invasion tumorale en permettant le détachement des cellules tumorales de la
87
lame basale sous-jacente de manière à coloniser de nouveaux tissus. En outre, la
délocalisation de l’intégrine α6β4 des hémidesmosomes vers les structures de migration, dans
les cellules cancéreuses, participe fortement à leur potentiel invasif. Bien que le rôle de
l’intégrine α6β4 ait été particulièrement étudié tant dans la migration des kératinocytes, que
dans les propriétés invasives des cellules de carcinomes, peu d’études ont réellement abordé
les évènements moléculaires responsables du désassemblage des hémidesmosomes.
Plusieurs études ont mis en évidence, dans des kératinocytes normaux mais aussi dans
des cellules de carcinomes, un rôle clef de la phosphorylation sur sérine de la sous-unité β4
dans le désassemblage des hémidesmosomes (Rabinovitz, J cell biol, 1999 ; Alt, Cancer res,
2001 ; Rabinovitz, Mol cell biol, 2004 ; Wilhelmsen, Mol biol cell, 2007). Des expériences de
« phosphopeptide mapping » ont montré, suite à l’activation de PKC par un traitement au
PMA (phorbol myristate acetate) ou par un traitement à l’EGF, qui constitue une condition
plus physiologique, la phosphorylation des sérines 1356, 1360 et 1364, situées au niveau du
CS de la sous-unité β4. Ces 3 sérines se concentrent dans une région très conservée entre les
différentes espèces [fig. 42], suggérant un rôle crucial de cette région de β4. L’étude de
mutants de la sous-unité β4, dans lesquels les différentes sérines ont été substituées soit par
des acides aspartiques, mimant une phosphorylation constitutive, soit par des alanines,
mimant des sérines non phosphorylables, a permis de montrer que la phosphorylation de deux
des trois sérines en question suffisait à empêcher la liaison entre l’ABD de la plectine et la
sous-unité β4, régulant ainsi la dynamique des hémidesmosomes de type I. Bien que plusieurs
études aient montré l’implication de la famille des PKCs dans la phosphorylation de ces
résidus, et notamment PKCα et δ (Alt, Cancer res, 2001 ; Rabinovitz, Mol cell biol, 2004), le
groupe de Sonnenberg a montré récemment que la sérine 1360 était le seul substrat de PKC,
dans les kératinocytes, alors que la sérine 1364 pouvait être un substrat de PKA (Wilhelmsen,
Mol biol cell, 2007) [fig. 45, p93].
Il est intéressant de noter que ces trois sérines font suite au domaine de liaison de la
sous-unité β4 (aa. 1115 à 1355 comprenant la 1ère paire de domaine FNIII et la partie Nterminale du CS) avec l’ABD de la plectine. De plus, la comparaison de la structure
cristallographique du 2ème domaine FNIII et de la partie N-terminale du CS de β4, seuls ou
complexés avec l’ABD de la plectine montre clairement une différence d’organisation du CS
par rapport au domaine FNIII (De Pereda, EMBO J, 2009), suggérant une régulation
allostérique de cette interaction [fig. 43]. En effet, dans son état non lié à la plectine, la partie
N-terminale du CS de β4 se replie sur le 2ème domaine FNIII, empêchant, de ce fait, la liaison
88
Fig. 42 : Conservation de la région de la sous-unité β4 contenant les sérines 1356, 1360 et
1364.
Alignement des résidus 1352 à 1368 de la séquence humaine de β4 avec les séquences
correspondantes de différentes espèces. Les 3 sérines très conservées sont encadrées en bleu.
Adapté de Margadant, Curr opin cell biol, 2008
89
A
B
C
Fig. 43 : changement conformationnel du segment connecteur de la sous-unité β4 entre
l’état libre et l’état lié à la plectine.
A. Modélisation des aa. 1126 à 1348 (domaines FNIII-2 et N-terminal du CS) de β4 libre :
cette région comprend le domaine FNIII-2 (bleu) et une partie du segment connecteur (orange)
de β4. Dans cette conformation, le CS est replié sur le domaine FNIII-2. La zone du CS en
pointillée représente une région riche en prolines dont certaines interagissent directement avec le
domaine FNIII-2 et d’autres se retrouvent exposées en surface. Cette région du CS, ainsi repliée,
masque les sites de liaison au domaine CH1 de la plectine.
B. Modélisation du domaine FNIII-2 de β4 lié au domaine CH1 de la plectine (rouge) : dans
cette conformation, le CS de β4 n’est plus replié sur le domaine FNIII-2, suggérant qu’un
réarrangement conformationnel du CS est nécessaire pour permettre la liaison de la plectine.
C. Représentation schématique du réarrangement conformationnel (flèches mauves) de la
structure de β4 nécessaire pour permettre la liaison de la plectine.
Adapté de De Pereda, EMBO J, 2009
90
de l’ABD de la plectine. Ainsi, la phosphorylation des sérines 1356, 1360 et 1364 pourrait
être à l’origine de ce changement de conformation, entraînant donc le décrochage de la
plectine. Cependant, les domaines de β4 cristallisés ne comprenant pas ces trois sérines, il est
difficile de vérifier cette hypothèse. En outre, le repliement du CS sur le 2ème domaine FNIII,
expose en surface une région riche en prolines, comprenant des motifs PxxP, impliqués dans
des interactions protéine-protéine, pouvant potentiellement recruter de nouveaux adaptateurs
sur la sous-unité β4, et empêchant la liaison de la plectine. Enfin, les sérines phosphorylées
pourraient permettre elles-mêmes la liaison de protéines de signalisation [fig. 44]. En effet, il
a notamment été montré que, au cours de la réparation des épithéliums, le récepteur Ron au
MSP (macrophage stimulating protein), une fois activé, entraînait son autophosphorylation
sur sérine ainsi que la phosphorylation par PKC de la sous-unité β4, permettant ainsi la liaison
de 14.3.3. sur les deux protéines et séquestrant l’intégrine des hémidesmosomes (Santoro,
Dev cell, 2003).
Plus récemment, un nouveau site de phosphorylation par PKC sur la sérine 1424 a été
identifié au niveau de la sous-unité β4, dans des kératinocytes immortalisés ainsi que dans des
cellules issues de carcinomes squameux (Germain, Mol biol cell, 2009) [fig. 45]. La mutation
de cette sérine en acide aspartique a permis de montrer que sa phosphorylation induisait un
désassemblage des hémidesmosomes et coopérait avec les trois autres sérines déjà identifiées
dans ce mécanisme. Au contraire la mutation de cette sérine en alanine, mimant un résidu non
phosphorylé, augmente la localisation de l’intégrine α6β4 au sein des hémidesmosomes et
protège même du désassemblage induit par l’EGF. La génération d’un anticorps phosphospécifique a montré que la sous-unité β4 était phosphorylée sur la sérine 1424 au niveau des
fronts de migration et de rétraction des cellules, et de manière plus surprenante à la périphérie
des hémidesmosomes. Dans ces zones en marge des hémidesmosomes, la sous-unité β4, bien
que phosphorylée sur la sérine 1424, co-localise encore avec la plectine, mais jamais avec
BP180 ou BP230, ce qui laisse suggérer que la phosphorylation de cette sérine pourrait
précéder celles des sérines 1356, 1360 et 1364, et réguler plus spécifiquement l’interaction
avec BP180 et BP230.
La sous-unité β4 possède également de nombreux sites de phosphorylation sur
tyrosine, ces tyrosines se localisant dans les régions d’interactions de la sous-unité β4 avec ses
autres partenaires hémidesmosomaux et pouvant donc également réguler la dynamique des
hémidesmosomes. Il a notamment été montré, dans des cellules normales et cancéreuses, que
les tyrosines 1257, 1422, 1440, 1494, 1526 et 1642 de la sous-unité β4 pouvaient être
91
Fig. 44 : modèle du désassemblage des hémidesmosomes induit par la phosphorylation sur
sérine de la sous-unité β4.
Dans son état non phosphorylé, la partie cytoplasmique de β4 interagit avec l’ABD et le domaine
plakine de la plectine. Après la phosphorylation sur sérine du CS de la sous-unité β4, la liaison de
l’ABD de la plectine peut être inhibée (A) soit par un repliement intramoléculaire du CS sur le
domaine FNIII-2 de β4, (B) soit par la liaison sur ces sérines phosphorylées, de nouveuaux
partenaires protéiques.
(Les cercles vides représentent les sérines 1356, 1360 et 1364 non phosphorylées alors que les
cercles pleins représentent ces mêmes sérines phosphorylées)
Adapté de Margadant, Curr opin cell biol, 2008
92
Hemidesmosmes disassembly
14.3.3
PKC, PKA
S1356
S1360
S1364
S1424
FNIII FNIII
C
SFK
Y1257
CS
FNIII
Y1422 Y1494
Y1440 Y1526
SHP-2
FNIII
β4
Y1642
Shc
Ras and PI3K activation
Fig. 45 : schéma des différents sites de phosphorylation de la sous-unité β4.
La phosphorylation sur tyrosines est due à l’activation et au recrutement dans la portion
juxtamembranaire du domaine cytoplasmique de β4 de kinases de la famille Src (SFK), comme
Fyn ou Yes. La palmitoylation de la sous-unité β4 permet l’incorporation de l’intégrine α6β4 au
sein des rafts lipidiques et facilite son interaction avec les SFKs. Les phosphorylations sur
sérines sont quant à elles induites par l’activation de kinases telles que PKC et PKA. Ces
phosphorylations permettent le recrutement de molécules de signalisation comme 14.3.3, SHP-2
ou encore Shc, les phosphorylations sur sérines étant plutôt imliquées dans le désassemblage des
hémidesmosomes alors que les phosphorylations sur tyrosines sont plutôt impliquées dans
l’activation de voies de signalisation comme Ras ou la PI3K, induisant la prolifération, la survie
cellulaire ou l’invasion.
Adapté de Giancotti, TRENDS pharmacol sci, 2007
93
phosphorylées après ligation de l’intégrine et/ou activation de récepteurs de facteurs de
croissance comme le récepteur à l’HGF (hepatocyte growth factor) c-Met (Shaw, Mol cell
biol, 2001 ; Trusolino, cell, 2001 ; Dans, J biol, chem, 2001 ; Bertotti, J cell biol, 2006 ;
Merdek, J biol chem, 2007), la phosphorylation de ces différents résidus menant à l’activation
des voies de signalisation de la PI3K et des MAPK [fig. 45]. La phosphorylation, dans
différentes lignées normales et tumorales, des Y1422, 1440, 1526 et 1642, plus
particulièrement, induit un désassemblage des hémidesmosomes (Dans, J biol chem, 2001).
De plus, des études ont montré que l’EGF phosphorylait la sous-unité β4 sur tyrosines et
entraînait une perte des hémidesmosomes, ces effets étant dépendant de la kinase de la famille
Src : Fyn, et nécessitant l’interaction de la kinase avec la région comprenant les aa. 854 à
1183 de β4 (Mariotti, J cell biol, 2001). Par la suite, il a été montré que la phosphorylation de
β4 par Fyn nécessitait également la palmitoylation et la localisation de l’intégrine au niveau
des rafts lipidiques (Gagnoux-Palacios, J cell biol, 2003). Cependant les données sur le rôle
de la phosphorylation sur tyrosines sont plus controversées que les phosphorylations sur
sérines. En effet, des études ont montré que les Y1422 et 1440, phosphorylées étaient requises
pour la formation des hémidesmosomes, alors que d’autres études, et pour certaines, du même
groupe, montraient qu’elles induisaient le désassemblage des structures hémidesmosomales
(Mainiero, EMBO J, 1995 ; Mainiero, J cell biol, 1996 ; Dans, J biol chem, 2001 ;
Dellambra, J biol chem, 2001). Une explication peut être fournie par le fait que, dans ces
études, des substitutions des tyrosines de la sous-unité β4 en phénylalanines ont été utilisées
et que les effets observés venaient peut-être d’un problème de conformation plutôt que d’une
absence de phosphorylation de ces résidus.
Même si les phosphorylations sur sérines ou tyrosines de la sous-unité β4 semblent
jouer un rôle clef dans la dissociation des hémidesmosomes, il reste possible que d’autres
mécanismes interviennent. En effet, l’EGF, qui est le facteur de référence induisant le
désassemblage des hémidesmosomes, n’entraîne pas une perte totale de ces structures. Dans
ce sens, il est important de souligner que PKC est capable d’induire la phosphorylation de
BP180 et sa délocalisation des hémidesmosomes, dans une lignée de kératinocytes traitée
avec des IgG issus d’un pemphigus vulgaris, une maladie auto-immune induisant une lyse de
l’épiderme et des muqueuses orales, due à des anticorps dirigés contre les protéines des
desmosomes (Kitajima, J investig dermatol symp proc, 1999). Enfin, au cours de la
différenciation des kératinocytes induite par le Ca2+, la calmoduline est capable d’interagir
avec l’ABD de la plectine, et entraîne, en coopération avec la phosphorylation par PKC de la
94
sous-unité β4, la dissociation du complexe plectine/β4 et donc des hémidesmosomes (Kostan,
J biol chem, 2009).
C/ Homéostasie des épithéliums
Au cours des processus de réparation ou de renouvellement des épithéliums, nous
avons vu, qu’une des premières étapes consistait en une diminution temporaire de l’ancrage
des cellules épithéliales sur la lame basale via le désassemblage des hémidesmosomes de
manière à permettre la division et/ou la migration cellulaire. Outre son rôle au sein des
hémidesmosomes, l’intégrine α6β4 présente la particularité d’être impliquée dans un autre
type de structures adhérentes, au niveau des fronts de migration des cellules (lamellipodes et
filopodes), où elle interagit avec le cytosquelette d’actine et participe activement, en stimulant
différentes voies de signalisation, aux processus de renouvellement et de réparation des
épithéliums.
Plusieurs études utilisant des souris transgéniques exprimant des formes de β4 délétées
de leur partie cytoplasmique ont permis de démontrer le rôle capital de la sous-unité β4 dans
la prolifération des cellules épithéliales (Murgia, EMBO J, 1998 ; Nikolopoulos, Mol cell
biol, 2005). Il a notamment été montré que l’activation de l’intégrine α6β4 par des anticorps
ou par la liaison sur son ligand était capable d’induire la prolifération des kératinocytes en
activant les MAPKs (mitogen-activated protein kinases) Erk et JNK, via l’activation de Shc et
de la PI3K respectivement (Mainiero, EMBO J, 1997 ; Dans, J biol chem, 2001) [fig. 46].
L’activation de la PI3K par α6β4 n’est pas directe, puisque la sous-unité β4 ne possède pas les
séquences permettant la liaison de la sous-unité régulatrice p85 de la PI3K. Cependant des
études ont montré, dans des cellules de carcinome de sein, que l’activation de la PI3K par
α6β4 nécessitait l’activation de l’IRS (insuline receptor substrate) via la phosphorylation de la
Y1494 de la sous-unité β4 (Shaw, Mol cell biol, 2001). D’autres études ont montré que
l’intégrine α6β4 pouvait également activer la PI3K en interagissant et en activant le récepteur
ErbB2, appartenant à la famille des récepteurs à l’EGF (Nguyen, J biol chem, 2000 ;
Hintermann, J cell biol, 2001 ; Hintermann, J biol chem, 2005). Concernant l’activation de
Shc, l’équipe de Giancotti a montré que la sous-unité β4 interagissait directement avec Shc,
via ses tyrosines phosphorylées 1422, 1440, 1526 et 1642 (Dans, J biol chem, 2001). De plus,
l’intégrine α6β4 participe à une forte activation de la prolifération des kératinocytes induite
95
Y
Y1494
PI3K
PTP
pervanadat
e
Rac
Jnk
MITOSIS
Fig. 46 : Activation, par l’intégrine α6β4, de la prolifération in vitro, des kératinocytes.
Schéma représentant différentes voies de signalisation impliquées dans l’activation de la
prolifération des kératinocytes par l’intégrine α6β4. La liaison du ligand ou d’anticorps activant
l’intégrine α6β4, entraîne sa délocalisation vers les rafts lipidiques et sa phosphorylation sur
tyrosine, par des kinases de la famille Src (SFK). La phosphorylation des Y1422, 1440, 1642 et
plus particulièrement de la Y1526, induit le recrutement et l’activation de Shc. De manière
intéressante, le récepteur à l’EGF activé par son ligand, (EGFR) peut aussi activer Shc,
indépendamment de l’intégrine α6β4, et entre en compétition avec celle-ci pour la liaison de Shc.
D’un autre côté, l’intégrine α6β4 peut interagir avec et activer le récepteur à l’EGF, entraînant
l’activation de la voie PI3K. La phosphorylation de la tyrosine Y1494 de l’intégrine est
également connue pour activer la voie PI3K, mais les mécanismes impliqués sont peu connus.
L’activation de Shc, d’une part, et de la PI3K, d’autre part, induit l’activation des MAPKs (Erk et
Jnk) et la progression dans cycle cellulaire. (PTP, Protein Tyrosine Phophatase)
Adapté de Wilhelmsen, Mol Cell Biol, 2006
96
par l’EGF, en régulant la translocation nucléaire de ERK, JNK et NFκB (Nikolopoulos, Mol
cell biol, 2005), et nécessite la délocalisation de l’intégrine vers les rafts lipidiques et sa
phosphorylation par des kinases de la famille Src (Gagnoux-Palacios, J cell biol, 2003).
Le rôle de l’intégrine α6β4 dans la survie des kératinocytes est très peu détaillé, la
majorité des données étant issues d’études réalisées sur des cellules cancéreuses. Cependant,
l’étude de kératinocytes issus de souris exprimant une sous-unité β4 délétée de sa partie Cterminale (Δ1355) a montré une induction massive de l’apoptose, due à un défaut d’activation
de la voie PI3K/Akt par α6β4 (Nikolopoulos, Mol cell biol, 2005).
L’implication de l’intégrine α6β4, dans la migration des cellules épithéliales et plus
particulièrement dans la réparation de l’épiderme a largement été étudiée au cours des années.
A la suite d’une blessure de l’épithélium, on observe un désassemblage des hémidesmosomes
et la relocalisation de l’intégrine α6β4 au niveau de structures de migration, où elle participe à
la migration des cellules épithéliales en coopération avec l’intégrine α3β1 (Gipson, Exp cell
res, 1993 ; Lotz, Am j pathol, 2000 ; Goldfinger, J cell sci, 1999). La délocalisation de
l’intégrine α6β4 est due à la phosphorylation de sa sous-unité β4 suite à l’activation de
récepteurs à des facteurs tels que l’EGF et le MSP (macrophage stimulating protein), sécrétés
au niveau de la blessure. Ainsi localisée et phosphorylée, α6β4 va s’associer avec le
cytosquelette d’actine et permettre la migration sur la laminine-5/332 ainsi que l’activation de
voies de signalisation menant à l’activation de NFκB et JNK et p38, nécessaires à la migration
induite par l’EGF ou le MSP (Rabinovitz, J cell biol, 1997 ; Santoro, Dev cell, 2003 ;
Mariotti, J cell biol, 2001 ; Nikolopoulos, Mol cell biol, 2005). L’association avec le
cytosquelette d’actine n’est pas directe mais peut être dirigée par la plectine. En effet, même
s’il a été montré que la liaison de la sous-unité β4 avec la plectine empêchait la liaison de
cette dernière avec l’actine (Geerts, J cell biol, 1999), il ne faut pas oublier que la plectine est
capable de dimériser (Wiche, J cell biol, 1991), permettant ainsi la liaison de β4 et de l’actine.
L’intégrine α6β4 joue également un rôle important dans la réorganisation de la MEC
et plus particulièrement de la laminine-5/332, nouvellement synthétisée au niveau de la
blessure et permettant ainsi une migration directionnelle. En effet, des kératinocytes déficients
en β4 ont une migration circulaire qui reflète l’organisation en arc de cercle de la laminine5/332 sous-jacente. La réorganisation de la laminine-5/332 en travée, permettant une
migration directionnelle, nécessite l’association de l’intégrine α6β4 avec la GTPase Rac1 et
son activation au niveau des fronts de migration, permettant ainsi l’activation de la cofiline. Il
s’ensuit alors une stimulation de la dynamique du cytosquelette d’actine et de l’intégrine
97
α6β4, permettant de réguler la polarité cellulaire, le sens de migration et une correcte
organisation de la laminine-5/332 (Sehgal, J biol chem, 2006 ; Kligys, J biol chem, 2007).
Enfin, il a récemment été montré que ces phénomènes étaient dépendants de BPAG1e/BP230
qui jouait le rôle d’adaptateur entre α6β4 et Rac1 (Hamill, Mol biol cell, 2009). En outre, la
migration induite par le MSP, entraîne l’augmentation de synthèse des métalloprotéinases
MMP2 et 3, via l’activation de NFκB et p38 par α6β4. Ceci participe également au
remodelage de la MEC par α6β4 au cours du processus de réparation de l’épiderme (Santoro,
Dev cell, 2003).
La laminine-5/332 et plus particulièrement son état de maturation, va en retour agir sur
la migration cellulaire en régulant l’affinité de ces deux principaux récepteurs : les intégrines
α6β4 et α3β1. Comme nous avons vu précédemment, la laminine-5, après sécrétion subit de
nombreux clivages (Hintermann, Matrix biol, 2004 ; Sugawara, Exp dermatol, 2008) [fig.
47]. La chaine α3, ayant un poids moléculaire initial de 200 kDa peut être clivée en une forme
de 165 kDa par la plasmine, la forme non maturée facilitant plutôt la liaison de l’intégrine
α3β1, alors que le clivage amenant à la forme de 165 kDa a une meilleure affinité pour
l’intégrine α6β4 (Goldfinger, J cell biol, 1998). La chaine β3 de 145 kDa peut être maturée en
une forme de 80 kDa par MMP7 ou MT1-MMP dans certaines lignées (Remy, Cancer res,
2006 ; Nakashima, J cell biochem, 2007). Enfin, la chaine γ2, de 160 kDa initialement, peut
subir deux clivages clivage pour atteindre 105kDa et 80 kDa, impliquant MMP19 et MT1MMP, ces clivages de la chaine γ2 induisant un shift de liaison de l’intégrine α6β4 vers
l’intégrine α3β1 (Gilles, J cell sci, 2001 ; Koshikawa, J biol chem, 2005 ; Sadowski, CMLS,
2005). En outre, ils libèrent un fragment riche en domaines répétés EGF, activant le récepteur
ErbB1 et induisant le désassemblage des hémidesmosomes (Schenk, J cell biol, 2003). Ainsi,
la régulation de l’affinité des intégrines α6β4 et α3β1 sur la laminine-5/332 par sa maturation
protéolytique va permettre de réguler la réponse des cellules épithéliales lors du processus de
réparation de l’épithélium. Dans un épithélium sain, la laminine-5/332 maturée au niveau de
sa chaine α3, prédominante, va favoriser la liaison de l’intégrine α6β4 et la formation des
hémidesmosomes, alors que lors d’une blessure, la néo-sécrétion de laminine-5/332, non
mature, va favoriser l’engagement de l’intégrine α3β1 et la migration (Goldfinger, J cell sci,
1999). Cette migration induite par la seule liaison de α3β1 sur la laminine-5/332 est dite
haptotactique et dépend de RhoA. De nombreuses études ont montré que la liaison de
l’intégrine α6β4 sur la laminine-5/332 inhibait spécifiquement ce type de migration via
l’association de α6β4 avec le récepteur ErbB2 et l’activation consécutive de la PI3K et des
GTPases Rac1 ou cdc42 amenant à la relocalisation de l’intégrine α3β1 au niveau des
98
α3-
β3-
γ2-
Fig. 47 : maturation protéolytique de la laminine-332 et son rôle dans la régultion de la
migration cellulaire.
La laminine-332 néo-synthétisée et non maturée favorise l’haptotactisme via la liaison de
l’intégrine α3β1, alors que le clivage par des sérines protéases, des domaines LG 4 et 5 de sa
chaîne α3 (rouge), favorise la liaison de l’intégrine α6β4, induisant l’assemblage des
hémidesmosomes et l’adhérence des cellules épithéliales sur le tissu conjonctif sous-jacent. Lors
de processus de réparation des épithéliums, l’activation, en plus des sérines protéases, de
métalloprotéinases (MMP19 et MT-MMP1), induit le clivage de la chaîne γ2 (bleu) et libère des
domaines « EGF-like » activant des récepteurs de la famille de l’EGFR tels que ErbB1. Ceci
induit le désassemblage des hémidesmosomes, relocalise l’intégine α6β4 vers les structures de
migration où elle va participer, en coopérant avec l’intégrine α3β1, à la migration par
chimiotactisme.
Adapté de Hinetrmann, Matrix Biol, 2004
99
jonctions cellule-cellule (Hintermann, J cell biol, 2001 ; Russell, J cell sci, 2003 ;
Hintermann, J Biol chem, 2005). Ce mécanisme va permettre de garantir l’intégrité de
l’épithélium lors du processus de réparation. En effet, une fois la migration induite, lorsque le
« tapis » cellulaire va avancer, la maturation progressive de la chaine α3 de la laminine-5/332
va permettre la liaison de l’intégrine α6β4, qui va ralentir la migration et renforcer les
jonctions cellule-cellule de manière à coordonner la migration de l’épithélium entier et non
pas la migration de cellules isolées. En revanche, au niveau du front de migration, l’intégrine
α6β4 va coopérer avec α3β1 et les récepteurs aux facteurs de croissance, en mettant en place
une migration dépendante de la PI3K et de Rac1 et favorisant la formation de lamellipodes
(Nguyen, J biol chem, 2000) [fig.48].
Les intégrines α6β4 et α3β1 ne sont pas les seules à promouvoir la migration des
kératinocytes lors de la réparation de l’épiderme. Nous avons vu précédemment que la
protéine BP180, ou collagène XVII, pouvait être clivée, libérant un domaine extracellulaire de
120 kDa, agissant au sein de la MEC comme une glue (Tasanen, Am j pathol, 2004). Ceci est
valable dans des kératinocytes quiescents. Cependant dans des conditions différentes, comme
la réparation de l’épiderme, les kératinocytes expriment de nouvelles intégrines comme α5β1
ou des intégrines possédant la sous-unité β3 (Larjava, J clin invest, 1993). En 2001, Nykvist
et collaborateurs ont montré que ces intégrines reconnaissaient au sein de la forme clivée de
BP180, un motif KGD, proche du motif classique RGD, favorisant ainsi la migration des
kératinocytes sur collagène XVII (Nykvist, J biol chem, 2001).
D/ Hémidesmosomes et cancers
1. Rôles pro-tumoral vs. oncosuppresseur de l’intégrine α6β4
Les tumeurs malignes se caractérisent par l’acquisition de propriétés invasives des
cellules tumorales, ce qui se traduit par leur capacité à se dissocier de la tumeur primaire par
rupture des contacts cellule-cellule et cellule-MEC, à devenir indépendantes de leur
environnement, à migrer au travers des tissus pour atteindre la circulation sanguine, et
finalement coloniser d’autres tissus. Ainsi la perte de l’ancrage fourni par les
hémidesmosomes sur la lame basale constitue une des premières étapes nécessaires à
l’acquisition des propriétés invasives des cellules épithéliales au cours des processus de
cancérogenèse. Dans ce sens, une perte d’expression des protéines hémidesmosomales α6β4,
100
Kératinocytes basaux
α3β1
E-cadh
Chimiotactisme coordonné et directionnel
EGF
HD
LB
actine
EGFR
α6β4
PI3K-Rac
α3β1
Derme
Remodelage de la MEC
Laminine-332
• Chaîne α3 clivée
• Chaîne γ2 non clivée
Laminine-332
• Chaîne α3 clivée
• Chaîne γ2 clivée
Laminine-332
• Chaîne α3
non clivée
Fig. 48 : migration des kératinocytes lors de blessures de l’épiderme.
Lors du processus de réparation d’une blessure, la sécrétion au niveau de la zone lésée, de
facteurs de croissance comme l’EGF, induit la migration des cellules épithéliales par
chimiotactisme. Ce chimiotactisme implique l’activation de la voie PI3K-Rac qui permet la
formation de lamellipodes et la polymérisation du cytosquelette d’actine. L’activation des
récepteurs à l’EGF (EGFR) antagonise la formation des hémidesmosomes et relocalise
l’intégrine α6β4 au niveau des structures de migration où elle va participer, en coopération avec
l’EGFR, à l’activation de la PI3K. En dehors de la zone lésée, les hémidesmosomes sont
maintenus et l’intégrine α6β4 assure également le maintien des jonctions cellule-cellule en
régulant la E-cadhérine et la relocalisation de l’intégrine α3β1 au niveau de ces jonctions. Ces
mécanismes permettent de maintenir l’intégrité de l’épithélium et la migration cordonnée de
l’ensemble du tapis cellulaire. En outre, l’implication des intégrines et les différentes fonctions
de l’intégrine α6β4 sont régulées par le niveau de maturation de la laminine-332. En effet, de la
laminine-332, non maturée (au niveau de sa chaîne α3), est sécrétée au niveau de la lésion
favorise la liaison de l’intégrine α3β1. Puis sa maturation protéolytique par des protéases
extracellulaires, (clivage des domaines LG4 et 5), va alors engager la liaison avec l’intégrine
α6β4. La laminine-332 subit également des clivages protéolytiques au niveau de sa chaîne γ2, par
des métalloprotéinases activées au niveau de la zone de blessure, libérant des domaines « EGFlike », qui vont participer à l’activation des récepteurs à l’EGF, à l’induction du chimiotactisme
et au désassemblage des hémidesmosomes. Au niveau des zones saines de l’épithélium, ces
métalloprotéinases ne sont pas actives, permettant la formation de structures hémidesmosmales
matures, assurant la jonction entre le derme et l’épiderme.
101
laminine-5/332, BP180 et BP230, associée à la diminution de leur ARNm et responsable
d’une perte des hémidesmosomes, est observée dans des carcinomes du nasopharynx, des
couches basales de l’épiderme, ou encore de la prostate (Lo, Cancer lett, 2001 ; Nagle, Am j
pathol, 1995 ; Vanaja, Cancer res, 2003 ; Chopra, J invest dermatol, 1998 ; Allen, Hum
pathol, 1998). Mercurio et son groupe a récemment montré qu’au cours de la transition
épithélio-mésenchymateuse induite par le TGFβ dans des cellules épithéliales mammaires
murines exprimant β4 (les cellules NMuMG), l’expression de β4 était diminuée par
méthylation de son promoteur et également par modifications de l’histone H3 (Mercurio, J
cell sci, 2009). En effet, des modifications post-traductionnelles (méthylations et acétylations)
des histones, et notamment de l’histone H3, régulent l’état de compaction de la chromatine, et
de ce fait, l’accessibilité des promoteurs à la machinerie transcriptionnelle. Ainsi, il a été
montré que, après traitement au TGFβ des cellules NMuMG, l’expression de β4 était
diminuée suite à l’augmentation des modifications répressives (méthylation sur la lysine 27)
et à la diminution des modifications activatrices (méthylation sur la lysine 4 et acétylation de
la lysine 9) de l’histone H3, entraînant une diminution de la transcription du gène codant pour
la sous-unité β4.
Paradoxalement, l’intégrine α6β4 a été initialement identifiée comme une protéine
spécifique des tumeurs (TSP180, pour « tumor-specific protein 180 »), up-régulée dans des
lignées cellulaires murines issues de carcinomes pulmonaires et de mélanomes métastatiques
(Kennel, Cancer res, 1981 ; Falcioni, Cancer res, 1986). Par la suite, de nombreuses études
ont fournie la preuve que α6β4 était augmentée durant la progression maligne de divers
carcinomes squameux et notamment de la tête et du cou, de la peau, du col de l’utérus ou des
poumons (Van Waes, Cancer res, 1991 ; Savoia, J invest dermatol, 1993 ; Carico, Gynecol
oncol, 1993 ; Mariani Costantini, Cancer res, 1990 ; Boelens, J clin pathol, 2007). De plus,
alors que β4 n’est pas exprimée dans les cellules thyroïdiennes, elle est néo-exprimée dans les
carcinomes papillaires de la thyroïde et particulièrement up-régulée dans ceux qui métastasent
au niveau des nodules lymphatiques loco-régionaux (Serini, J natl cancer inst, 1996 ; Lohi, J
pathol, 1998 ; Kitajiri, Pathol int 2002). Enfin, son expression est également augmentée dans
les cancers gastriques au niveau des cellules tumorales invasives, ainsi que dans les cancers
colorectaux et pancréatiques (Tani, Am j pathol, 1996 ; Ni, Oncogene, 2005 ; Gleason, J
histochem cytochem, 2005). En concordance avec le rôle pro-invasif de α6β4, de forts niveaux
d’expression de l’intégrine ont été associés avec un mauvais pronostic dans des cancers du
sein ou de la vessie (Tagliabue, Clin cancer res, 1998 ; Grossman, Oncol rep, 2000). Enfin,
l’expression de α6β4 dans des lignées cancéreuses de sein et de colon, ne l’exprimant pas de
102
manière endogène, augmente leurs propriétés invasives (Chao, Cancer res, 1996 ; Shaw, Cell,
1997), et inversement l’extinction d’expression de l’intégrine, par « ARN interférence », dans
des cellules cancéreuses mammaires inhibe leur pouvoir invasif (Lipscomb, Clin exp
metastasis, 2003). L’ensemble de ces observations démontre que, dans ces différents types
tumoraux, l’up-régulation de α6β4 fournit un avantage significatif favorisant la progression
tumorale.
Plusieurs études ont montré que PTHrP (parathyroid hormone-related peptide), un
facteur important pour la progression tumorale et le pouvoir invasif des cancers du sein et du
colon, pourrait agir via l’induction transcriptionnelle de α6β4 (Shen, Exp cell res, 2006 et
Cancer lett, 2007). En outre, différents facteurs de transcription ont été identifiés comme
régulant l’expression de la sous-unité β4 : c-Myc et ZKSCAN3 (Zinc finger KRAB and
SCAN domains protein 3), dans le cancer du colon (Ni, Oncogene, 2005 ; Yang, J biol chem,
2008), et les facteurs de la famille E2F dans le cancer du sein (Yoon, Cancer res, 2006).
Récemment, il a été montré que, dans différentes lignées cancéreuses de sein, de colon et de
prostate, l’intégrine α6β4 était régulée transcriptionnellement par les facteurs de la famille de
p53. En effet, dans les cellules p53 sauvage, HIPK2 (Homeodomain-Interacting Protein
Kinase 2), un partenaire activateur de p53, s’associe avec ce dernier pour réprimer
transcriptionnellement l’expression de α6β4 et ainsi empêcher la progression tumorale, alors
que la perte de fonction de p53 ou HIPK2 dans les cellules cancéreuses, entraîne une forte
expression de α6β4, dépendante de TAp63 et TAp73, ce qui favorise l’invasion et la
croissance indépendante de l’ancrage (Bon, Cancer res, 2009).
En outre, le statut de p53 dans les cellules cancéreuses semble être un régulateur
important de la fonction de α6β4, puisque, dans des cellules cancéreuses mammaires ou
coliques, α6β4 peut coopérer avec p53 pour induire l’apoptose, le rôle pro-tumoral et proinvasif de l’intégrine α6β4 ne pouvant apparemment s’accomplir que dans un contexte où p53
est muté ou absent (Bachelder, J biol chem et J cell biol, 1999). Ce double rôle de l’intégrine
α6β4 : suppresseur de tumeur vs acteur pro-tumoral a été clairement démontré pour la
première fois en 2007 par le groupe de Sonnenberg. En effet, après isolement de cellules de
peau, issues de souris déficientes en p53 et smad4, et présentant les caractéristiques de
cellules souches épidermales, ils ont montré que, en fonction du contexte cellulaire,
l’intégrine α6β4 pouvait promouvoir la progression tumorale en présence d’un Ras
oncogénique, ou au contraire, agir comme un suppresseur de tumeur, ce dernier effet, étant
dépendant de son association avec la plectine et donc de la formation des hémidesmosomes
(Raymond, mol biol cell, 2007).
103
2. signalisation induite par l’intégrine α6β4
Tout comme lors des processus de réparation des épithéliums, la délocalisation de
l’intégrine α6β4 des hémidesmosomes vers des structures de migration de types filopodes et
lamellipodes, constitue un pré-requis à ses fonctions de signalisation impliquées dans la
progression tumorale et l’invasion. Nous avons vu précédemment que cette délocalisation
résultait de phosphorylations sur sérines et tyrosines de sa sous-unité β4 induites par des
récepteurs aux facteurs de croissance, comme les récepteurs à l’EGF ou le récepteur à l’HGF,
lesquels sont souvent surexprimés et suractivés dans les cancers (Mariotti, J cell biol, 2001).
2.1
Rôle de l’intégrine α6β4 dans l’invasion et le remodelage de la MEC [fig.
49]
Au sein de ces structures de migration, où elle s’associe avec le cytosquelette
d’actine, l’intégrine α6β4 va jouer un rôle important dans la migration chimiotactique des
cellules cancéreuses, et notamment via l’activation des Rho-GTPases (Rabinovitz, J cell biol,
1997 et 1999, O’connor, J cell biol, 1998 ; Gilcrease, J exp clin cancer res, 2009). En effet,
α6β4 est localisée à la fois à l’extrémité des lamellipodes où elle favorise la polymérisation de
l’actine et la formation de protrusions membranaires via l’activation de la PI3K et Rac, mais
aussi, à la base des lamellipodes, où cette fois-ci, elle régule l’organisation des fibres d’actine
et permet la génération de forces de traction via l’activation de RhoA.
Des essais de détection des forces de traction ont montré que l’intégrine α6β4 était
capable de soutenir de fortes tractions, sans l’intervention d’autres intégrines, et que, par
ailleurs, ces forces de traction permettaient de compacter la MEC sous-jacente, ouvrant des
brèches dans les zones adjacentes et facilitant le passage au travers de la lame basale et donc
l’invasion tumorale (Rabinovitz, Mol biol cell, 2001).
Outre l’influence mécanique qu’exerce l’intégrine α6β4 sur la MEC, elle participe
également à son remodelage via la régulation de protéases extracellulaires. Il a, en effet, été
montré que l’activation de l’intégrine α6β4 par liaison d’un anticorps stimulait l’expression de
la métalloprotéinase MMP-2, favorisant ainsi la dégradation de la MEC et facilitant ainsi la
migration et l’invasion de cellules d’adénocarcinome colique, in vitro et in vivo (Daemi, Int j
cancer, 2000). Plus récemment, une étude sur la sialidase Neu1 a montré que la désialysation
de l’intégrine α6β4 entraîne la déphosphorylation de la sous-unité β4 et atténue ainsi son
activité dans la signalisation cellulaire, en particulier au niveau de la voie FAK-Erk. Il
s’ensuit une diminution de l’expression de MMP-7 et une baisse du potentiel invasif et
104
+
S100A4
MMPs
S100A4
MMPs
NFAT5
Fig. 49 : Rôle de l’intégrine α6β4 dans l’invasion tumorale.
Les différentes voies de signalisation impliquées dans les effets pro-invasifs de l’intégrine α6β4
sont montrées. La coopération de l’intégrine α6β4 avec les récepteurs aux facteurs de croissance
(EGFR et c-Met), ainsi que son activation par des anticorps, conduisent à une activation de la
voie PI3K. En conditions hypoxiques, une uprégultion de Rab11 augmente l’expression
membranaire de l’intégrine α6β4. Enfin, l’intégrine α6β4 stimule la production extracellulaire de
facteurs pro-invasifs, comme le sLPA (acide lysophosphatidique, produit à partir de
lysophosphatidylcholine = LPC), S100A4 ainsi que les métalloprotéinases MMP-2 ou MMP-7.
Adapté de Wilhelmsen, Mol Cell Biol, 2006
105
métastatique de cellules de cancer colique, suggérant que α6β4 peut également réguler
l’expression de cette protéase pour remodeler la MEC et favoriser l’invasion tumorale
(Uemura, Oncogene, 2009).
Très récemment, il a été montré que α6β4 activait transcriptionnellement l’expression
de S100A4 ou Metastasin, un puissant facteur pro-invasif et pro-métastatique, dans des
cellules cancéreuses mammaires (Chen, J biol chem, 2009). Ce mécanisme implique la
phosphorylation de la Y1494 de la sous-unité β4, l’activation de Src et d’Akt, aboutissant à
l’activation du facteur de transcription NFAT5 (Kim, Mol cancer res, 2009). S100A4 est
notamment connu pour jouer un rôle important dans la régulation de l’activité et de
l’expression des MMPs et de leurs inhibiteurs, et plus particulièrement MMP-2 et 13, MT1MMP et TIMP-1 (Schmidt-Hansen, J biol chem, 2004 ; Garrett, J biol chem, 2006),
participant ainsi au remodelage de la MEC induit par l’intégrine α6β4.
Les facteurs de transcription de la famille NFAT activés par l’intégrine α6β4, et en
particulier NFAT1, contribuent également à la stimulation de synthèse et de sécrétion de
l’autotaxine par α6β4 et participe ainsi à la motilité cellulaire et l’invasion, dans les cancers
du sein. L’autotaxine ou ENPP2 (exonucleotide pyrophosphatase and phosphodiesterase 2) est
en effet capable de générer du LPA (lysophosphatidic acid) à partir de LPC
(lysophosphatidylcholine), ce qui stimule fortement la migration et la survie cellulaire
(Umezu-Goto, J cell biol, 2002 ; Mills, Nat rev cancer, 2003).
2.2
Coopération avec les facteurs de croissance
Les effets pro-invasifs de l’intégrine α6β4 impliquent une coopération étroite avec les
récepteurs aux facteurs de croissance et notamment la famille des récepteurs à l’EGF. Il a tout
d’abord été montré que les récepteurs EGFR et ErbB2 étaient capables d’induire la
phosphorylation de la sous-unité β4, via l’activation de kinases de la famille Src, favorisant
ainsi le pouvoir invasif et métastatique de cellules de carcinomes squameux pour l’EGFR, de
cancers mammaires et de cellules NIH3T3 pour ErbB2. En retour, l’intégrine α6β4 va
amplifier les voies de signalisation de ces facteurs de croissance, notamment en favorisant
leur phosphorylation mais aussi en stimulant la traduction des récepteurs ErbB2 et 3. De cette
coopération résulte alors une forte activation de Src et de la PI3K. L’activation de la PI3K va
permettre de promouvoir l’invasion mais également la survie cellulaire et même la résistance
au Tamoxifène. L’activation de Src va, quand à elle, permettre la prolifération cellulaire en
activant la voie des MAPK ainsi que l’invasion en activant le facteur de transcription STAT3,
qui va réguler négativement les jonctions adhérentes et serrées (Gambaletta, J biol chem,
106
2000 ; Mariotti, J cell biol, 2001 ; Yoon, Cancer res, 2006 ; Guo, Cell, 2006 ; Folgiero,
Cancer res, 2007 ; Folgiero, Plos one, 2008). Enfin, l’activation de la voie PI3K peut
également agir en amont de l’intégrine α6β4, en favorisant la formation de clusters
d’intégrines α6β4 et de récepteurs à l’EGF, de manière indépendante de la liaison à la
laminine-5/332, ce qui va contribuer à l’activation du récepteur à l’EGF (Gilcrease, Cancer
res, 2004 et J exp clin cancer res, 2009).
L’intégrine α6β4 coopère également avec le récepteur à l’HGF, Met, pour promouvoir
la progression tumorale. Même si deux groupes se sont quelque peu affrontés sur le fait que
l’intégrine α6β4 était nécessaire à l’invasion induite par l’HGF ou qu’au contraire ces deux
molécules pouvaient agir indépendamment l’une de l’autre, il n’en reste pas moins qu’elles
sont capables de coopérer pour favoriser l’invasion. Il a notamment été montré que leur
coopération menait à l’activation de Src et de la PI3K, l’activation de Src étant due au
recrutement de SHP-2 sur les tyrosines phosphorylées 1440 et 1494 de la sous-unité β4
(Trusolino, Cell, 2001 ; Chung, J biol chem, 2004 ; Bertotti, J cell biol, 2006 ; Merdek, J biol
chem, 2007).
Enfin, la formation de clusters d’intégrines α6β4 et son association avec les facteurs de
croissance peuvent également être stimulées par Rab11, un facteur appartenant à la famille
des petites protéines G, impliqué dans le trafic vésiculaire des endosomes vers le réseau transgolgien, puis vers la membrane plasmique (Sönnichsen, J cell biol, 2000 ; Maxfield, Nat rev
mol cell biol, 2004), favorisant ainsi le recyclage membranaire de différentes molécules
comme les intégrines β1 ou encore les récepteurs à l’EGF (Powelka, Traffic, 2004 ; Cullis, J
biol chem, 2002). Il a, en effet, été montré que Rab11, en condition hypoxiques, stimulait la
localisation membranaire, et plus particulièrement à la périphérie des cellules, de l’intégrine
α6β4, favorisant ainsi la survie cellulaire et l’invasion, dans les cancers du sein (Yoon, Cancer
res, 2005).
2.3
Rôle majeur de la Y1494
Ces études ont petit à petit souligné l’importance de la phosphorylation de la Y1494 de
la sous-unité β4 dans l’activation, par α6β4, des voies Src et PI3K au cours de la progression
tumorale. En effet, de nombreuses études ont démontré le rôle clef de l’activation de la PI3K
dans le pouvoir pro-invasif de l’α6β4 (Shaw, Cell, 1997 ; Gambaletta, J biol chem, 2000 ;
Trusolino, Cell, 2001 ; Gagnoux-Palacios, J cell biol, 2003). De plus de nombreuses cibles
agissant en aval de la PI3K, incluant Akt, Rac ou mTOR, sont des régulateurs centraux des
fonctions des cellules de carcinomes et leur régulation par α6β4 a largement été décrite
107
(Shaw, Cell, 1997 ; Chung, J cell biol, 2002 ; Russell, J cell sci, 2003). La substitution
Y1494F de la sous-unité β4 inhibe la capacité de l’intégrine α6β4 à activer la PI3K et à
promouvoir l’invasion et la survie de cellules cancéreuses mammaires (Shaw, Mol cell biol,
2001). De plus, cette mutation empêche la phosphorylation de l’ensemble des tyrosines de la
sous-unité β4, suggérant que cette tyrosine agit comme le régulateur central de la
phosphorylation de β4 et de la signalisation induite par α6β4 dans les cancers. La Y1494 se
localise au sein d’une séquence consensus (ITIM = Immunoreceptor Tyrosine-Based
Inhibitory Motif) permettant la liaison des domaines SH2 des phosphatases SHP-1 et 2 (SH2
domain containing tyrosine phosphatase 1 et 2), connues pour réguler la signalisation de
nombreux facteurs de croissance (Chong, Histol histopathol, 2007). Récemment différents
groupes ont montré que SHP-2 interagissait directement avec la sous-unité β4, que la Y1494
contribuait fortement à cette interaction, et enfin, que cette interaction était nécessaire pour
l’activation des voies Erk et Akt via la stimulation de Src par α6β4 (Chung, J biol chem,
2004 ; Merdek, J biol chem, 2007). L’ensemble de ces données sur le rôle clef de la Y1494
dans la signalisation induite par l’intégrine α6β4 au cours de la progression tumorale et
l’invasion a été confirmé in vivo sur un modèle orthotopique de cancer du sein chez la souris
(Dutta, Cancer res, 2008).
2.4 Survie cellulaire et angiogenèse
L’activation de la survie cellulaire représente un des mécanismes clefs favorisant la
progression tumorale. Encore une fois, l’activation de la PI3K par l’intégrine α6β4 participe
activement à la survie cellulaire et à la résistance aux traitements hormonaux et
chimiothérapeutiques dans les cancers du sein et de la prostate respectivement (Bon, Clin
cancer res, 2006 ; Bhatia, Mol cancer res, 2009).
Il a notamment été démontré par le groupe de Mercurio, que la promotion de la survie
de cellules cancéreuses mammaires, aussi bien in vitro qu’in vivo, impliquait l’activation par
α6β4 de la PI3K menant à une up-régulation traductionnelle du VEGF (Chung, J cell biol,
2002 ; Lipscomb, Cancer res, 2005). L’intégrine α6β4 joue également un rôle plus direct sur
l’angiogenèse puisqu’elle est exprimée dans les vaisseaux sanguins de petite taille, et favorise
la migration des cellules endothéliales via la translocation nucléaire de Erk et NF-κB
(Nikolopoulos, Cancer cell, 2004).
Un autre rôle de l’intégrine α6β4, important pour la survie cellulaire, est la l’induction
de la survie indépendante de l’ancrage (inhibition de l’anoïkis). En effet, l’indépendance des
cellules cancéreuses vis-à-vis de la MEC environnante, fournit aux cellules cancéreuses un
108
avantage certain leur permettant de coloniser d’autres tissus. Dans ce sens, une étude a montré
que les cellules cancéreuses mammaires étaient capables de synthétiser localement de la
laminine-5/332, ce qui permettait la liaison de l’intégrine α6β4, activant alors Rac et NF-κB et
permettant la survie indépendamment du milieu extracellulaire environnant et de l’ancrage
impliquant d’autres intégrines (Zahir, J cell biol, 2003).
2.5
α6β4 et métastases
Nous avons vu que l’intégrine α6β4 agissait à différentes étapes de la diffusion
métastatique, en particulier au niveau de la dissociation des jonctions cellule-matrice, de la
migration, de la croissance indépendante de l’ancrage, ou encore de la survie cellulaire. Elle
exerce un rôle plus distant sur la formation de métastases, via la capacité, entre autre, à
interagir avec les cellules endothéliales et à activer la migration transendothéliale.
La co-expression de α6β4 et de la protéine GEF (Guanine exchange factor) Net1,
contrôlant l’activation de RhoA, dans les cancers du sein, est associé avec un haut risque de
métastases, et il a été suggéré que cette co-expression pouvait représenter un biomarqueur de
l’agressivité de ces cancers (Gilcrease, Cancer epidemiol biomarkers prev, 2009). Les
cellules cancéreuses mammaires sont, en effet, capables d’adhérer sur des cellules
endothéliales pulmonaires via l’interaction directe entre l’intégrine α6β4 et les canaux
chlorure calcium-dépendants (CLCA), présents à la surface des cellules endothéliales (AbdelGhany, J biol chem, 2003). Il a notamment été montré que cette interaction entraîne
l’activation de l’intégrine α6β4, qui active, à son tour, la voie Erk, de manière dépendante de
FAK/Src, favorisant ainsi les premières étapes de la croissance métastatique intra-vasculaire
(Abdel-Ghany, J biol chem, 2002).
L’intégrine α6β4 est également impliquée dans la formation de métastases hépatiques
après injection de cellules cancéreuses coliques dans la rate de souris athymiques, ou en intraartériel chez le rat (Enns, J gastrointest surg, 2004 ; Uemura, Oncogene, 2009). Des
expériences de microscopie intravitale ont notamment permis de montrer que l’intégrine α6β4
était impliquée à la fois dans l’adhérence à l’endothélium de la microcirculation hépatique et
dans l’extravasation dans le parenchyme hépatique des cellules cancéreuses coliques (Enns, J
gastrointest surg, 2004). Une étude a tenté de préciser les mécanismes moléculaires impliqués
dans ces phénomènes et a montré que les cellules cancéreuses coliques adhèrent sur des
cellules HUVECs, activées par le TNFα, via la liaison, tout d’abord, de la E-sélectine,
exprimée à la surface des cellules endothéliales, ce qui va alors induire l’activation et la
liaison de l’intégrine α6β4, laquelle va être phosphorylée et induire la migration
109
transendothéliale (Laferrière, Clin exp metastasis, 2004). D’autres études ont montré que
l’intégrine α6β4 était également capable d’interagir directement avec les hépatocytes, mais
également avec une forme soluble de ADAM9, sécrétée abondamment par les
myofibroblastes hépatiques, lors de la formation de métastases hépatiques (Kemperman,
Cancer res, 1993 ; Mazzocca, Cancer res, 2005).
4. BP180 et BP230 dans les cancers
Nous avons vu précédemment, que l’expression des protéines hémidesmosomales était
perdue dans un certain nombre de carcinomes, entraînant une perte des hémidesmosomes et
facilitant l’invasion tumorale. Cependant, une augmentation d’expression de BP180 a pu être
observée dans de nombreux cancers tels que les carcinomes squameux de la peau et de la
langue, en particulier au niveau des fronts d’invasion ainsi que dans le stroma adjacent à la
tumeur (Stelkovics, Appl immunohistochem mol morphol, 2008 ; Parikka, J histochem
cytochem, 2003), les améloblastomes (Parikka, J oral pathol med, 2001), les
adénocarcinomes coliques ou encore les carcinomes ovariens (Aho, J cell biochem, 1999).
Dans le cas des carcinomes de langue, des extraits de tissus et de cellules cancéreuses,
montrent que BP180 est exprimé sous sa forme clivée de 120 kDa (Parikka, J histochem
cytochem, 2003), cette forme clivée favorisant la migration des cellules cancéreuses via la
liaison des intégrines α5β1, αvβ3 et αIIbβ3 (Parikka, Exp cell res, 2006). Enfin, BP180 est
néo-exprimée dans les carcinomes papillaires de la thyroïde, qui exhibent une différenciation
squameuse (Lohi, J pathol, 1998).
BP230 est, quant à lui, augmenté dans les carcinomes squameux de la peau, de la tête
et du cou, où l’altération de son expression polarisée est associée à un fort potentiel invasif
(Herold-Mende, Cell tissue res, 2001), et également néo-exprimé dans les carcinomes
papillaires de la thyroide (Lohi, J pathol, 1998). Le rôle de cette expression altérée de BP230
est encore inconnu, mais compte-tenu de son rôle dans l’association de α6β4 avec le
cytosquelette d’actine et l’organisation de la MEC, lors de la migration des kératinocytes, on
peut penser qu’il exerce des effets similaires dans les cellules cancéreuses.
110
III CANCER DU PANCREAS
A/ Cancer du pancréas
1. Généralités
Le cancer du pancréas, bien que représentant moins de 2% des cas de cancers, est en
constante progression (plus de 216000 nouveaux cas diagnostiqués dans le monde, chaque
année), et se place au 4ème rang des cancers en terme de décès, dans les pays industrialisés. Il
est responsable de 5000 à 7000 décès par an en France, avec une mortalité qui avoisine son
incidence (rapport mortalité/incidence = 0,99). Ce cancer est considéré comme une maladie
très meurtrière, avec une survie à 5 ans inférieure à 5% et une médiane de survie d’environ 6
mois. Le seul traitement curatif actuel est l’exérèse chirurgicale, qui ne peut être envisagée
que dans 15 à 20% des cas. Pour ces patients, la survie à 5 ans atteint 15 à 20% des cas, avec
une médiane de survie de 2 ans environ. Ce pronostic très sombre s’explique par un
diagnostic tardif, dû à une absence de marqueurs moléculaires et de symptômes spécifiques, et
une invasion tumorale précoce par voie lymphatique et nerveuse. En effet, au moment du
diagnostic, 85% des patients présentent déjà un envahissement loco-régional avec souvent une
extension métastatique, rendant la chirurgie à visée curative impossible. Dans ces conditions,
la palliation des symptômes, en particulier la prise en charge de la douleur, est le principal
objectif thérapeutique. Dans ce sens, la radiothérapie est souvent utilisée, à visée antalgique
mais ne peut s’appliquer qu’à des patients dont l’état général permet de supporter
l’irradiation. En chimiothérapie, le 5-Fluoro-Uracile (5FU), s’est d’abord avéré être l’agent
chimiothérapeutique le mieux adapté, ne montrant toutefois qu’un très faible impact sur la
survie et une légère amélioration de la qualité de vie des patients. En 1997, un nouvel
analogue nucléosidique de la cytidine, la gemcitabine, a émergé (Burris, J clin oncol, 1997).
Bien que n’apportant qu’un très modeste gain de survie par rapport au 5-FU (5,6 mois vs. 4,4
mois), l’utilisation de la gemcitabine montra surtout, chez un grand nombre de patient, un
bénéfice clinique associé à une facilité d’administration et une bonne tolérance (Heinemann,
Oncology, 2001), faisant de cette molécule le traitement de référence des cancers
pancréatiques depuis 10 ans.
111
2. morphologie et origine cellulaire
Il existe plusieurs formes de cancers du pancréas [fig. 50], mais la forme la plus
courante (> 85% des cas) et la plus mortelle, est représentée par l’adénocarcinome
pancréatique canalaire ou PDAC (pancreatic ductal adenocarcinoma) (Hezel, Genes dev,
2006). Par le terme cancer du pancréas, je ferai donc référence, dans ce manuscrit, à
l’adénocarcinome pancréatique canalaire. Au niveau histo-morphologique, le cancer du
pancréas présente un phénotype glandulaire avec des structures canalaires présentant
différents degrés d’atypie cellulaire et de différenciation. Il présente une grande infiltration au
niveau des tissus environnants, notamment au niveau des ganglions lymphatiques, de la rate
ou de la cavité péritonéale ainsi que de fréquentes métastases hépatiques et pulmonaires. Il est
également associé à une très forte réaction fibreuse et inflammatoire, appelée desmoplasie.
Le phénotype canalaire des cellules cancéreuses pancréatiques laissait penser qu’une
prolifération anarchique des cellules canalaires était à l’origine de l’adénocarcinome
pancréatique. En accord avec cette idée, le cancer du pancréas est très souvent associé à des
lésions dysplasiques et hyperplasiques des canaux pancréatiques (Hruban, Am j surg pathol,
2001 ; Andea, Mod pathol, 2003). Ainsi, trois types différents de lésions pré-néoplasiques ont
été décrits : les néoplasmes pancréatiques intra-épithéliaux (PanIN), les plus fréquentes, les
tumeurs intra-canalaires papillaires et mucineuses pancréatiques (TIPMP) et les cystadénomes
mucineux (MCN) (Hruban, Am j pathol, 2000 ; Maitra, Adv anat pathol, 2005) [fig. 51].
Brièvement, les PanINs sont des lésions papillaires microscopiques observées dans les plus
petits canaux (< 5 mm) et sont classés en 4 grades : PanIN-1A, 1B, 2 et 3 qui reflètent la
progression histologique jusqu’au néoplasme invasif (Hruban, Am j surg pathol, 2001 ;
Koorstra, Langenbecks arch sur, 2008) [fig. 51]. Les PanINs sont souvent retrouvés dans les
tissus adjacents aux PDACs et de nombreux rapports documentent, chez des patients, la
présence de PanINs qui dégénèrent ensuite en cancers pancréatiques (Brat, Am j surg pathol,
1998). En outre, des études moléculaires montrent que les PanINs et les PDACs partagent des
altérations génétiques communes, avec une augmentation croissante de ces altérations au
cours des différents stades de PanINs [fig. 52] (Klimstra, Am j pathol, 1994 ; Moskaluk,
Cancer res, 1997 ; Heinmoller, Am j pathol, 2000 ; Hruban, Am j pathol, 2000 et Am j surg
pathol, 2001 ; Wilentz, Cancer res, 2000 ; Yamano, Am j pathol, 2000 ; Luttges, Am j pathol,
2001 ; Maitra, Mod pathol, 2003). Les TIPMPs sont des tumeurs épithéliales, de type
papillaire, sécrétant du mucus, très proches histo-morphologiquement des PanINs,
112
Fig.50 : principales caractéristiques et altérations génétiques associées aux différents types de
tumeurs pancréatiques humaines.
Adapté de hezel, genes dev, 2006
113
Fig. 51 : Différents types de lésions pré-cancéreuses pancréatiques.
Photos d’immunohistochimie présentant trois types de lésions précurseurs de l’adénocarcinome
pancréatique : les PanINs (pancreatic intraepithelial neoplasias) classés en trois stades, les
IPMNs (intraductal papillary mucinous neoplasm), et les MCNs (mucinous cystic neoplasms).
Certaines altérations génétiques retrouvées dans les adénocarcinomes pancréatiques sont
également retrouvées dans ces différentes lésions pré-cancéreuses, et plus particulièrement dans
les PanINs. Certains de ses évènements sont présentés ici et classés en évènements apparaissant
précocement ou plus tardivement au cours de la cancérogenèse pancréatique.
Adapté de hezel, genes dev, 2006
114
Fig. 52 : Un modèle de la progression tumorale pancréatique.
Les PanINs (pancreatic intraepithelial neoplasias) sont des lésions pré-cancéreuses pancréatiques,
représentant un modèle de progression tumorale menant à l’adénocarcinome pancréatique. Les
différents stages et caractérstiques de PanIN sont décrits au dessus des photos
d’immunohistochimie correspondantes. Certaines altérations génétiques retrouvées dans ces
différentes lésions sont détaillées, la continuité des lignes représentant la fréquence d’apparition
de ces altérations.
Adapté de Bardeesy, nat rev cancer, 2002
115
mais originaires des canaux pancréatiques principal et/ou secondaires (Hruban, Am j surg
pathol, 2004), 30% de ces lésions, macroscopiques, étant détectables par imagerie (Canto,
Clin gastroenterol hepatol, 2006). Enfin les MCNs, sont des lésions papillaires
macrokystiques sécrétant des mucines, rencontrées majoritairement chez des jeunes femmes
et caractérisées par un stroma de type ovarien. Des études d’expression de gènes ont
également montré que les PanINs, les TIPMPs et les PDACs partageaient des caractéristiques
communes (Crnogorac-Jurcevic, Oncogene, 2002 ; Sato, Oncogene, 2004 ; Prasad, Cancer
res, 2005). Enfin, il a également été montré que les PanINs, les TIPMPs et les MCNs
possédaient à la fois des caractéristiques communes mais aussi certaines différences,
suggérant que ces 3 types de lésions représentaient des variations d’un même mécanisme de
transformation maligne (Sato, Am j pathol, 2001 et 2004 ; Adsay, Am j surg pathol, 2004).
L’ensemble de ces données suggère donc que le PDAC pourrait trouver son origine dans la
prolifération anormale des cellules canalaires. De manière surprenante, cette hypothèse a été
difficile à vérifier, puisque le ciblage direct de l’oncogène K-Ras, l’altération la plus fréquente
du cancer du pancréas, dans les cellules pancréatiques canalaires murines, en utilisant le
promoteur de la cytokératine 19, n’induit pas de PanIN ou de PDAC (Brembeck, Cancer res,
2003).
En revanche, d’autres études, utilisant des modèles animaux, ont suggéré que le PDAC
pouvait dériver de cellules endocrines ou acinaires ayant subies une transdifférenciation.
L’hypothèse de l’origine endocrine est basée sur des expériences montrant que des cellules
endocrines transformées, après transplantation dans le pancréas de souris ou de hamster,
progressaient en PDAC. De plus, les cellules cancéreuses pancréatiques expriment souvent
des marqueurs des lignages endocrines (Bardeesy, Nat rev cancer, 2002 ; Pour,
Pancreatology, 2002). Toutefois, des études plus récentes ont
montré que la
transdifférenciation des cellules β ne jouait aucun rôle dans la régénération, la métaplasie ou
la carcinogenèse pancréatique (Strobel, PNAS, 2007). Ces résultats ont d’ailleurs été
confirmés par Gidekel Friedlander et ses collaborateurs, en conditions normales. Par contre,
dans un contexte inflammatoire, comme l’induction d’une pancréatite chronique par la
caeruleine, la transformation des cellules endocrines productrices d’insuline, par K-RasG12D,
induit le développement de PanINs de haut grade, pouvant aller jusqu’au stade PDAC, plus
particulièrement quand cette mutation est combinée avec la perte de p53 (Gidekel
Friedlander, Cancer cell, 2009).
116
L’hypothèse d’une origine acineuse vient de la fréquente observation de métaplasies
acino-canalaires, chez l’homme (Parsa, Cancer res, 1985) et dans des modèles de souris
utilisant des promoteurs spécifiques des cellules acineuses. En effet des souris transgéniques
Ela-TGFα (expression du TGFα, sous le contrôle du promoteur de l’élastase, spécifique des
cellules acineuses) montrent une transdifférenciation des cellules acineuses en cellules
canalaires présentant une prolifération progressive et de la dysplasie, supportant leur nature
pré-maligne (Wagner, Genes dev, 2001). De même, le modèle murin Ela-myc développe des
cancers pancréatiques dont certains sont des carcinomes acineux et d’autres des PDACs
(Sandgren, PNAS, 1991). Un peu plus tard des modèles utilisant l’oncogène K-Ras, ont
permis de progresser dan la compréhension des mécanismes de la carcinogenèse pancréatique.
En effet, l’expression conditionnelle de K-Ras muté (K-RasG12D) par un système de
recombinaison Cre-LoxP entraîne le développement de lésions de type PanINs (Aguirre,
Genes dev, 2003 ; Hingorani, Cancer cell, 2003), qui, lorsqu’elle est combinée avec des
mutations de p53 ou de Ink4A/Arf (cf. Chapitre III.A, paragraphe 3.2, p120), progresse
rapidement en PDAC (Hingorani, Cancer cell, 2005 ; Aguirre, Genes dev, 2003). Cependant,
ces études ne permettent pas de définir l’origine des cellules puisqu’elles utilisent des
promoteurs Pdx-1 ou p48-Ptf1α, qui entraînent des recombinaisons dans toutes les cellules
pancréatiques. En effet, ces deux protéines sont exprimées, au cours du développement, dans
les progéniteurs pancréatiques et ciblent donc l’ensemble des cellules pancréatiques. Plus
récemment, les groupes de Tuveson et Guerra, ont respectivement utilisé les promoteurs de
Mist-1 et de l’Elastase pour activer K-Ras dans les acini pancréatiques, induisant de la
métaplasie et de la dysplasie qui finalement progresse en cancer pancréatique métastatique,
présentant un phénotype mixte (acineux et canalaire), suggérant que les PDACs pouvaient
provenir d’une transdifférenciation des cellules acineuses (Tuveson, Cancer res, 2006 ;
Guerra, Cancer cell, 2007). Les cellules centro-acineuses ont également été proposées
comme candidats potentiels à l’origine des cancers pancréatiques, dans une étude du KO de
PTEN dans le pancréas. Il a même été suggéré que ces cellules pouvaient représenter une
population de cellules souches ou progénitrices dans le pancréas adulte (Stanger, Cancer cell,
2005).
De nouvelles théories ont émergé ces dernières années, supportant l’existence de
cellules souches cancéreuses à l’origine des cancers solides. Li et collègues ont récemment
identifié ces cellules souches cancéreuses dans les cancers pancréatiques, caractérisées par
l’expression des marqueurs de surface CD44, CD24 et ESA (Li, Cancer res, 2007). Ces
117
cellules représentent moins de 1% de la population cellulaire cancéreuse mais possèdent un
potentiel tumorigène 100 fois supérieur.
Outre le fait d’identifier l’origine des cellules
cancéreuses pancréatiques, la caractérisation de ces cellules représente un enjeu majeur dans
le traitement des cancers du pancréas. En effet, il a été pleinement démontré, dans d’autres
cancers, que ces cellules souches cancéreuses possédaient une capacité de résistance accrue
aux agents cytotoxiques conventionnels et aux radiations, qui sont également des
caractéristiques des PDACs.
3. Bases moléculaires du cancer du pancréas
3.1
Les oncogènes
L’activation de l’oncogène K-Ras est la mutation la plus fréquemment détectée dans
les cancers pancréatiques (90 à 95% des cas) (Caldas, Int j pancreatol, 1995). Ces mutations
de K-Ras sont également retrouvées respectivement dans 30%, 44% et 87% des stades précancéreux PanIN-1A, 1B et PanIN-2/3, démontrant que cette altération constitue une des
premières altérations génétiques dans la cancérogenèse pancréatique (Maitra, Adv anat
pathol, 2005). Les gènes de la famille Ras codent pour des petites protéines G, possédant une
activité GTPasique intrinsèque. Les mutations du gène K-Ras, dans les cancers pancréatiques
surviennent essentiellement au niveau du codon 12, et affecte la capacité de la protéine à
hydrolyser le GTP, entraînant un état GTP lié, constitutivement actif. L’activation de cet
oncogène dans les cancers pancréatiques, stimule entre autre les voies des MAPK et de la
PI3K ou encore NF-κB, impliquées dans la prolifération, la survie et l’invasion tumorale
(Hirano, Oncogene, 2002 ; Gysin, Cancer res, 2005 ; Agbunag, Cancer res, 2004 ; Sclabas,
Int j gastrointest cancer, 2003). Le rôle essentiel de cet oncogène dans l’initiation des cancers
pancréatiques est souligné par les nombreux modèles animaux décrits précédemment, et
démontrant que son activation est un pré-requis au développement des stades prénéoplasiques et cancéreux pancréatiques. En outre, l’extinction de K-Ras, dans des lignées
cancéreuses pancréatiques, montre qu’il est également nécessaire au maintien du phénotype
cancéreux et fait de cet oncogène une cible idéale pour des thérapies anti-cancéreuses
(Fleming, Mol cancer res, 2005). Dans cette optique, des inhibiteurs de farnésyltransférase,
empêchant la localisation membranaire de K-Ras et la transduction de signaux en aval, ont été
testés dans une étude de phase III, en combinaison avec la gemcitabine pour le cancer du
pancréas, et n’ont malheureusement montré aucun gain thérapeutique par rapport à un
traitement à la gemcitabine (Van Cutsem, J clin oncol, 2004). En effet, l’amplification des
118
voies agissant en aval de K-Ras (PI3K et MAPK) ainsi que des voies des facteurs de
croissance, coopèrent avec l’activation de K-Ras, pour promouvoir la tumorigenèse
pancréatique.
En effet, dans 1/3 des carcinomes médullaires pancréatiques (une forme héréditaire et
rare de cancer du pancréas, dues à des mutations de gènes impliqués dans la réparation de
l’ADN) [fig. 50, p113], caractérisés par un Ras sauvage, on observe des mutations de B-Raf,
activant ainsi la voie Erk, et ce malgré le contexte Ras sauvage (Calhoun, Am j pathol, 2003 ;
Ishimura, Cancer lett, 2003). La voie PI3K/Akt est également suractivée dans les cancers
pancréatiques indépendamment de l’activation de K-Ras. Il a notamment été montré une
surexpression de Akt2, l’effecteur de la PI3K, dans 10 à 20% des PDACs et son ciblage
inhibe la croissance tumorale in vitro et in vivo (Cheng, PNAS, 1996 ; Ruggeri, Mol carcinog,
1998 ; Altomare, J cell biochem, 2002 ; Schlieman, Br j cancer, 2003 ; Yamamoto, Clin
cancer res, 2004). Enfin, des mutations du gène PI3KCA (PI3K catalytic-α) sont également
retrouvées dans des TIPMPs (Schonleben, Clin cancer res, 2006), cette voie de la PI3K
représentant l’une des voies majeures impliquée dans la tumorigenèse pancréatique
(Torrisani, Bull cancer, 2008).
On observe également, dans les cancers pancréatiques, une amplification des voies des
récepteurs aux facteurs de croissance. Parmi ces récepteurs, une surexpression des récepteurs
à l’EGF (EGFR, ErbB2 et ErbB3) ainsi que de leurs ligands (EGF et TGFα) a été observée
dans une majorité de cancers pancréatiques, entraînant une boucle autocrine positive, et
impliquée dans la croissance tumorale ainsi que la diffusion métastatique (Korc, J clin invest,
1992 ; Lemoine, J pathol, 1992 ; Friess, Clin cancer res, 1995 et Ann surg, 1999 ; Dugan,
Pancreas, 1997 ; Tobita, Int j mol med, 2003). Compte tenu de la forte amplification de ces
voies dans les cancers pancréatiques, des anticorps monoclonaux humanisés anti-EGFR ou
anti-ErbB2 ont été testés en association avec la gemcitabine mais les réponses obtenues en
phase III ont été très décevantes (Moore, J clin oncol, 2007), peut-être du fait d’une
redondance entre les différents récepteurs. Actuellement, des études sont menées afin
d’évaluer l’efficacité de la combinaison des deux anticorps et montrent des résultats
encourageants sur des xénogreffes de cellules cancéreuses pancréatiques chez la souris nude,
avec des effets, sur la progression tumorale, supérieurs à ceux de la gemcitabine (Larbouret,
Ann oncol, 2010).
119
Parmi les autres facteurs de croissance identifiés, une surexpression de l’IGF-I
(insulin grouth factor) par les cellules cancéreuses pancréatique et le stroma environnant,
entraînant une suractivation de son récepteur (Stoeltzing, Am j pathol, 2003 ; Ouban, Hum
pathol, 2003). L’inhibition de cette voie, par l’utilisation d’anticorps anti-IGF-IR ou d’un
dominant négatif du récepteur, inhibe la croissance tumorale et sensibilise les cellules
cancéreuses pancréatiques à la chimiothérapie (Maloney, Cancer res, 2003 ; Min, Cancer res,
2003). De même, la voie des récepteurs au FGF a également été impliquée dans la croissance
tumorale pancréatique et également dans la réaction desmoplasique associée (Wagner,
Gastroenterology, 1998 ; Ogawa, Cancer gene ther, 2002 ; Kleeff, Pancreas, 2004 ;
Kuniyasu, Int j oncol, 2001). De nombreuses études documentent également la surexpression
du VEGF dans 90% des PDACs ainsi que de ses récepteurs, favorisant la croissance tumorale
et la survie des cellules cancéreuses, via la stimulation de l’angiogenèse (Von Marschall,
Gastroenterology, 2000 ; Hoshida, Pancreas, 2002 ; Tokunaga, Int j oncol, 2002 ; Hotz, J
gastrointest surg, 2003 ; Fukasawa, Clin cancer res, 2004) et proposant ce facteur comme
cible thérapeutique pour le cancer du pancréas. Cependant des études récentes, sur d’autres
cancers, remettent quelque peu en cause ce type de stratégies, puisque l’utilisation en
monothérapie de drogues ciblant le VEGF, montre, dans un premier temps, un ralentissement
de la croissance des tumeurs primaires mais favorise, ensuite, l’invasion et la formation de
métastases (Ebos, Cancer cell, 2009 ; Pàez-Ribez, Cancer cell, 2009). D’autres facteurs de
croissance tels que le NGF, la gastrine ou encore la Bombésine participent également à la
croissance tumorale pancréatique (Torrisani, Bull cancer, 2008).
3.2
Les gènes suppresseurs de tumeur
La perte de fonction du gène INK4A/ARF survient dans des stades précancéreux
modérément avancés et dans 80 à 90% des PDACs, par mutations, délétions ou
hyperméthylation du promoteur (Rozenblum, Cancer res, 1997 ; Hustinx, Mod pathol, 2005).
INK4A/ARF code pour 2 protéines distinctes, par l’utilisation de 2 premiers exons différents et
un décalage consécutif du cadre de lecture : p16INK4A et p19ARF (Sherr, Nat rev mol cell
biol, 2001). INK4A est un inhibiteur de CDK4/6, bloquant la phosphorylation de Rb et donc
la progression du cycle cellulaire en G1/S, alors qu’ARF stabilise p53 en inhibant sa
dégradation par Mdm2. Du fait de la juxtaposition physique de leur séquence codante, et de la
délétion fréquente du locus correspondant, on observe, dans de nombreux cancers
pancréatiques, une perte d’INK4A et d’ARF. Cependant des études récentes ont montré que
ces deux protéines pouvaient agir indépendamment.
120
Des mutations héréditaires d’INK4A sont associées au syndrome FAMMM (Familial
Atypical Mole-Maligant Melanoma), caractérisé par une forte incidence des mélanomes ainsi
qu’une augmentation de 13 fois du risque de cancers pancréatiques (Goldstein, N engl j med,
1995 ; Whelan, N engl j med, 1995). Le rôle de suppresseur de tumeur d’INK4A dans les
cancers pancréatiques est renforcé par des modèles murins montrant que des mutations
d’INK4A coopèrent avec l’activation de K-Ras dans le développement des PDACs et
accélèrent la croissance tumorale, dans un contexte p53 muté (Bardeesy, PNAS, 2006).
Compte tenu du rôle d’ARF dans la stabilisation de p53, la perte d’ARF résulte en une
atténuation de la voie p53. Cependant, la perte concomitante d’ARF et p53 n’est retrouvée
que dans 40% des PDACs humains, suggérant des fonctions indépendantes de ces deux
protéines (Heinmöller, Am j pathol, 2000 ; Maitra, Mod pathol, 2003). En effet, ARF peut
agir indépendamment de p53, et en particulier, dans le processing des ARN ribosomaux
(Rocha, Mol cell, 2003 ; Sugimoto, Mol cell, 2003 ; Qi, Nature, 2004 ; Paliwal, Mol cell biol,
2006).
Le gène suppresseur de tumeur p53 est muté dans 50% des PDACs, généralement
par des mutations affectant le domaine de liaison à l’ADN de la protéine (Rozenblum, Cancer
res, 1997). Vu le rôle de p53 dans l’inhibition de la progression tumorale, les mutations du
gène codant pour p53 apparaissent dans les stades avancés de PanINs, ayant déjà acquis des
caractéristiques dysplasiques (Boschman, Am j pathol, 1994 ; Maitra, Mod pathol, 2003).
Dans ces stades avancés de PanINs, les cellules pancréatiques accumulent des altérations
génétiques, sollicitant l’activation de p53, considéré comme le « surveillant » du génome.
Ainsi sous cet effet de pression de sélection, la perte de fonction de p53 est favorisée,
permettant aux cellules de proliférer et de survivre, malgré la présence d’aberrations
chromosomiques. En effet, les cancers pancréatiques sont caractérisés par une importante
aneuploïdie, de nombreux réarrangements chromosomiques et une grande hétérogénéité
génétique, cette grande instabilité génomique permettant la progression de la maladie et
fournissant également les bases de sa résistance aux traitements thérapeutiques (Gorunova,
Genes chromosomes cancer, 1998 ; Harada, cancer res, 2002).
Le gène « délété dans les cancers pancréatiques », DPC4/Smad4, est inactivé dans
environ 50% des PDACs (Hahn, Science, 1996), et code pour un facteur de transcription
essentiel dans la voie du TGFβ. Il est perdu dans des stades tardifs de PanINs et cette perte est
étroitement liée à son rôle dans les effets inhibiteurs de la voie du TGFβ (Wilentz, Cancer res,
121
2000 ; Iacobuzio-Donahue, Am j surg pathol, 2000). Le TGF-β est une cytokine, capable
d’activer de nombreuses voies de signalisation et possédant des rôles antagonistes,
particulièrement importants au cours de la cancérogenèse pancréatique. En effet, il agit
comme un suppresseur de tumeur dans les cellules normales et dans les premiers stades de la
cancérogenèse pancréatique, alors qu’il est un puissant promoteur de l’invasion et de la
formation de métastases dans les stades plus avancés du cancer pancréatique (Truty,
Pancreatology, 2007). Son rôle oncosuppresseur est souligné par la génération de souris
transgéniques délétées pour le récepteur au TGF-β, TGFBRII, dans le pancréas, associé à la
mutation de K-Ras, qui conduit à l’apparition de PDACs, hautement agressifs, dans 100% des
cas, alors que la mutation de K-Ras, seule, génère essentiellement des PanINs (Ijichi, Genes
dev, 2006). Cet effet anti-tumoral est dû, suite à l’activation de son récepteur, à la
translocation nucléaire du complexe de transcription Smad2/3/4, entraînant un arrêt du cycle
en G1/S, via l’activation de la transcription d’inhibiteurs de CDKs (cyclin dependant kinases)
comme p15, p21 ou p27 et à la répression de c-myc. Ainsi, de nombreuses altérations de cette
voie surviennent dans les premiers stades de la cancérogenèse pancréatique, afin de permettre
la progression tumorale et plus particulièrement une perte de Smad4. Il a notamment été
montré que la perte de Smad4 affectait spécifiquement les effets inhibiteurs du TGFß sur le
cycle cellulaire, sans compromettre ses effets dans l’EMT (transition épithéliomésenchymateuse). Ainsi, la perte de Smad4 pourrait permettre la transition d’une fonction
anti-tumorale du TGFß vers une fonction pro-tumorale et pro-invasive (Levy, Mol cell biol,
2005).
PTEN est également un gène suppresseur de tumeur fréquemment perdu dans les
cancers par mutations ou délétions. Dans les cancers pancréatiques, en revanche, sa perte
n’est que rarement liée à ce type d’altérations génétiques (Sakurada, Jpn j cancer res, 1997 ;
Okami, Cancer res, 1998). Il a notamment été montré que la diminution de son expression
était corrélée dans les cancers pancréatiques avec la surexpression du TGFβ, et que la
surexpression de ce dernier dans des lignées cancéreuses pancréatiques humaines et dans le
pancréas de souris transgéniques diminuait l’expression de PTEN (Ebert, Pancreas, 2002).
Par la suite, des expériences ont démontré qu’en condition normale, le TGFß induisait
l’expression de PTEN par une voie dépendante des Smads. L’activation de la voie Ras/Erk, au
cours de la cancérogenèse pancréatique, va alors bloquer cette voie dépendante des Smads,
inhibant ainsi l’expression de PTEN. Ce mécanisme, s’associant à la perte de Smad4, va alors
induire un « shift » de fonction du TGFß, qui va alors contribuer également à l’inhibition de
122
l’expression de PTEN via l’activation de NF-κB (Chow, Carcinogenesis, 2007 ; Chow, Am j
physiol gastrointest liver physiol, 2009). Enfin l’activation de la voie de l’IGF-I dans les
cancers pancréatiques participe également à l’inactivation de PTEN en inhibant sa
phosphorylation (Ma, J surg res, 2010). Enfin, une hyperméthylation de son promoteur a
également été observée dans les tissus humains et les lignées cancéreuses pancréatiques
(Asano, Oncogene, 2004).
Pour finir, on retrouve d’autres mutations, dans les cancers pancréatiques, affectant
des gènes suppresseurs de tumeurs comme DCC (Deleted in Colon Cancer), Gadd45a
(Growth Arrest and DNA Damage-inducible gene 45a), ou encore APC (Adenomatous
Polyposis Coli) et BRCA2 (BReast CAncer 2), ces deux dernières altérations étant
responsables, respectivement, de polyposes adénomateuses familliales et de cancers familiaux
du sein et des ovaires, et augmentant également le risque de cancers colorectaux et
pancréatiques (Schneider, Mol cancer, 2003).
3.3
Les autres altérations dans le cancer du pancréas
Les altérations génétiques décrites dans les cancers pancréatiques et plus généralement
dans les cancers, sont le fruit de mécanismes cellulaires impliquant entre autre, des
modifications de la stabilité des chromosomes, des modifications épigénétiques, ou encore des
modifications de l’expression des microARNs. L’identification et la compréhension exacte de
ces mécanismes au cours de la cancérogenèse pancréatique pourrait ainsi permettre de
déboucher sur de nouveaux marqueurs moléculaires, des facteurs de pronostic, voire de
nouvelles cibles thérapeutiques.
Des réarrangements chromosomiques sont fréquemment observés dans les cancers, et
participent à l’instablité génétique, favorisant notamment la perte de fonction de gènes
suppresseurs de tumeur ou la duplication de gènes oncogéniques. Le raccourcissement des
télomères, séquences répétées hexamériques à l’extrémité des chromosomes, participe à ces
phénomènes et sont compensés, dans les cellules saines, par l’activité des télomérases,
conférant ainsi une stabilité aux chromosomes. Au contraire, le raccourcissement des
télomères rend les chromosomes hautement « recombigéniques » et entraîne la formation de
ponts anaphasiques entre les extrémités des chromosomes au cours de la division cellulaire ;
ces phénomènes étant fréquemment observés dans les cellules cancéreuses (Gisselsson, Adv
cancer res, 2003 ; Meeker, Curr opin oncol, 2004). Il a notamment été montré que le
123
raccourcissement des télomères était une des premières altérations observées au cours de la
cancérogenèse pancréatique, survenant dans plus de 90% des cas de PanINs de faible grade
(Van Heek, Am j pathol, 2002), et permettant la création d’un environnement propice aux
réarrangements chromosomiques. Normalement, les cellules arborant de telles aberrations
sont éliminées par p53, mais la perte de ce dernier dans des stades plus avancés accentue le
phénomène. Par contre, dans les stades de cancers pancréatiques invasifs, les télomérases sont
réactivées et stabilisent alors les cellules néoplasiques (Sato, J hepatobiliary pancreat surg,
2002). Il est intéressant de noter que le raccourcissement des télomères précède les mutations
de p53, suggérant que d’autres voies pourraient être impliquées dans le « checkpoint » induit
par l’altération des télomères, et inhibées dans les premiers stades de la cancérogenèse
pancréatique. L’identification de ces voies pourrait ainsi représenter de nouvelles cibles
thérapeutiques pour le cancer du pancréas.
Des altérations épigénétiques participent également à la régulation de l’expression
des gènes au cours de la cancérogenèse pancréatique. Les principales altérations
épigénétiques décrites dans les cancers concernent la méthylation des ilots CpG, dans les
régions régulatrices en 5’ des gènes, empêchant la liaison de l’ARNpolymérase et inhibant la
transcription. Dans les cancers pancréatiques, ce « silencing » épigénétique est fréquemment
observé et concerne de nombreux gènes codant pour suppresseurs de tumeurs ou des protéines
impliquées dans l’homéostasie tissulaire, comme p16 ou la E-cadhérine (Sato, J hepatobiliary
pancreat surg, 2006). Certaines de ces hyperméthylations de promoteur sont d’ailleurs
retrouvées dès les stades pré-néoplasiques (PanIN, TIPMP et MCN) (Fukushima, Am j pathol,
2002 ; Jansen, Cancer biol ther, 2002 ; Sato, Gastroenterology, 2002).
Bien que l’hyperméthylation des promoteurs soit très documentée dans les cancers, de
nouvelles données suggèrent que l’hypométhylation des promoteurs joue un rôle tout aussi
important dans la progression des cancers. En effet, l’hypométhylation de nombreux gènes a
été observée dans les cancers pancréatiques et plus spécifiquement des gènes codant pour des
protéines surexprimées dans les stades cancéreux par rapport aux stades pré-néoplasiques,
comme S100A4 ou encore la mésothéline…, suggérant un rôle oncogénique de ces protéines
(Sato, Cancer res, 2003). Ceci a été particulièrement démontré pour Vav1, une RhoGEF, qui
est surexprimée dans les cancers pancréatiques par déméthylation de son promoteur et qui
bloque le phénotype malin induit par l’oncogène K-Ras lorsqu’elle est inhibée par ARN
interférence dans les lignées cellulaires cancéreuses pancréatiques, alors que sa surexpression
124
dans les tumeurs primaires pancréatiques est associée à un mauvais pronostic (FernandezZapico, Cancer cell, 2005).
Une autre altération épigénétique, identifiée dans les cancers pancréatiques et
participant à la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques, est représentée par la
désacétylation des histones par des désacétylases (HDAC, histone désacétylase). Ces enzymes
enlèvent le groupement acétyl des histones, ce qui entraîne la condensation de la chromatine
et inhibe la transcription de certains gènes (Bolden, Nat rev drug discov, 2006). Le traitement
de cellules cancéreuses pancréatiques avec des inhibiteur de HDAC, induit notamment un
arrêt du cycle cellulaire en G1 ou en G2/M (Donadelli, Mol carcinog, 2003 ; Sato, int j oncol,
2004 ; ryu, cancer lett, 2006). Il a notamment été montré que le SAHA (suberoylanilide
hydroxamic acid), inhibant les HDAC 1, 2, 3 et 6, bloquait la prolifération des cellules
cancéreuses pancréatiques en inhibant les cyclines B1, D1 et c-myc (Kumagai, Int j cancer,
2007 ; Neureiter, Scand j gastroenterol, 2007).
Ces dernières années, l’étude de l’expression et du rôle des microARNs ou miARNs a
suscité le plus grand intérêt. Ils constituent une famille de petits ARN de 18 à 24 nucléotides,
très conservés, et impliqués dans la stabilité et la régulation de la traduction des ARNm cibles
(Hwang, Br j cancer, 2006). Ils jouent ainsi des rôles importants dans la différenciation
cellulaire, la prolifération et l’apoptose et participe également à la tumorigenèse. Ainsi, de
nombreuses études ont rapporté des altérations de leur expression dans différents cancers
humains (Croce, Cell, 2005 ; Lu, Nature, 2005). De plus, les clusters de miARNs sont
retrouvés dans des zones du génome humain qui sont la cible de fréquentes amplifications,
pertes d’hétérozygotie, ou mutations et leur rôle dans certains cancers a été mis en avant. Le
miRNome du cancer du pancréas a lui aussi été très étudié dernièrement, montrant une
augmentation d’expression de certains miARN comme miR-21, miR-155, miR-221 ou miR222 alors que d’autres voient leur expression diminuée, en particulier miR-216 et 217 dont
l’expression semble spécifique du tissu pancréatique, ou encore miR-34a ou Let-7 (Volinia,
PNAS, 2006 ; Lee, Int j cancer, 2007 ; Bloomston, JAMA, 2007 ; Szafranska, Oncogene,
2007). Certaines de leurs cibles dans les cancers pancréatiques ont, par la suite, été identifiées.
Ainsi la réexpression de Let- 7 dans les cellules cancéreuses pancréatiques inhibe l’oncogène
Ras et l’activation des MAPK (Torrisani, Hum gene ther, 2009). Concernant miR-34a, sa
réexpression cible CDK6 et induit un arrêt du cycle cellulaire (Lodygin, Cell cycle, 2008).
Plus récemment, il a été montré que miR-34, dont l’expression dépend directement de p53,
semblait être perdu plus spécifiquement dans des cellules CD44+, CD133+ qui pourraient
125
représenter un pool de cellules souches cancéreuses pancréatiques et que sa réexpression, dans
ces cellules, entraînait une inhibition de leur clonogénicité, de leur pouvoir invasif et les
sensibilisait à la chimio- et la radiothérapie (Ji, Plos one, 2009). miR-155, quand a lui est
responsable de la perte d’expression de TP53INP1, une protéine pro-apoptotique induite par
p53 en conditions de stress (Gironella, PNAS, 2007). L’étude des dérégulations de miARNs
peut également mener à la découverte de nouveaux marqueurs moléculaires du cancer, voire
même d’en faire des cibles thérapeutiques par des stratégies de « knockdown » in vivo
(antagomirs) (Krutzfeldt, Nature, 2005), mais nécessite avant tout, de comprendre leur rôle
exact dans la pathologie cancéreuse, leur spécificité tissulaire, ainsi que le moment de leur
dérégulation au cours de la tumorigenèse. Enfin, l’expression de certains miARNs peuvent
représenter une valeur prédictive de la survie, comme cela a été suggéré pour miR-21 et miR196a-2 (Bloomston, JAMA, 2007 ; Dillhoff, J gastrointest surg, 2008).
B/ Cancer du pancréas et invasion tumorale
Une des caractéristiques du cancer du pancréas est sa très rapide invasion locorégionale et sa forte dissémination métastatique, en particulier au niveau du foie ou des
poumons, la formation de métastases étant la principale cause de décès chez les patients
atteints d’un cancer du pancréas. L’invasion tumorale et la formation de métastases sont des
événements complexes et les mécanismes responsables de ces phénomènes sont longtemps
restés en suspend. Pourtant ces dernières années, de plus en plus d’études, à la recherche de
nouvelles cibles thérapeutiques et de marqueurs pronostics, se sont intéressées à la
compréhension de ces mécanismes.
1. cancer du pancréas et microenvironnement tumoral
Durant des années, les études sur la cancérogenèse pancréatique se sont focalisées sur
les altérations survenant dans les cellules cancéreuses elles-mêmes. Cependant ces dernières
années, elles se sont également intéressées au microenvironnement tumoral pancréatique,
composé d’une grande variété de cellules incluant des fibroblastes, des cellules endothéliales,
immunitaires et endocrines, interagissant entre elles et avec les cellules cancéreuses de
manière complexe. Cette interface entre cellules cancéreuses et microenvironnement joue un
rôle important dans la croissance tumorale mais aussi dans l’invasion, l’angiogenèse…
126
1.1
Myofibroblastes/cellules stellaires et réaction desmoplasique
Une réaction fibreuse très importante, aussi appelée desmoplasie, représente une des
caractéristiques des PDACs et participe au phénotype très agressif des cancers pancréatiques.
Pour commencer, bien que les cellules cancéreuses soient capables de produire de nombreux
composants de la MEC, les cellules stellaires représentent le principal producteur du tissu
stromal, composé principalement, dans les cancers pancréatiques, de collagènes fibrillaires
(de type 1 et 3) et de fibronectine. Dans leur état quiescent, les cellules stellaires
pancréatiques représentent 4% de la population cellulaire du pancréas, ont une localisation
péri-acineuse, et se caractérisent par une expression de la desmine, de la protéine gliale
fibrillaire acide et stockent de la vitamine A (Apte, Gut, 1998 ; Bachem, Gastroenterology,
1998 ; Jaster, Mol cancer, 2004). Des dommages subis par le pancréas, ainsi que des
cytokines et des facteurs de croissance libérés par les cellules inflammatoires, les plaquettes et
les cellules cancéreuses peuvent activer ces cellules stellaires (Jaster, Mol cancer, 2004).
Parmi les molécules activatrices des cellules stellaires, on retrouve des cytokines : IL-1, 6 et 8
(interleukines), TNF-α (tumor necrosis factor α), des facteurs de croissance (PDGF, TGF-β) et
des espèces réactives de l’oxygène. Après activation, les cellules stellaires se transforment en
myofibroblastes, exprimant α-SMA (α-smooth muscle actin), synthétisant de grandes quantité
de MEC, et ayant perdu les gouttelettes contenant des rétinoïdes, dérivés de la vitamine-A
(Apte, Gut, 1998 ; Bachem, Gastroenterology, 1998).
Bien que cette matrice fibreuse entourant les tumeurs ait longtemps été considérée
comme une barrière limitant l’invasion, il est aujourd’hui évident qu’elle participe fortement à
la cancérogenèse. En effet, la MEC, influence la croissance, la différenciation, la survie et la
migration des cellules cancéreuses invasives, en fournissant un support de migration, mais
également parce qu’elle représente un réservoir de facteurs mitogènes (Bissell, Nat rev
cancer, 2001). En outre, les cellules cancéreuses et non cancéreuses exercent les unes sur les
autres de nombreux effets, altérant l’angiogenèse, la transition épithélio-mésenchymateuse,
l’adhérence et la réponse immunitaire. L’étude de cette interconnexion entre cellules
cancéreuses pancréatiques et myofibroblastes a conduit à la mise en place de modèles in vitro
mais aussi in vivo de cette interaction. Ainsi, il a pu être démontré que les facteurs les plus
mitogéniques et fibrogéniques étaient représentés par le PDGF, le FGF et le TGF-β, qui sont
sécrétés par les celles immunitaires, les cellules cancéreuses pancréatiques et les
myofibroblastes eux-mêmes (Bachem, Gastroenterology, 2005 ; Lohr, Cancer res, 2001). Il a
également été montré que la co-culture de cellules cancéreuses pancréatiques avec des
127
fibroblastes irradiés stimulait la croissance tumorale et l’invasion des cellules cancéreuses
pancréatiques. Cette effet est dû au relargage, par les fibroblastes irradiés, de facteurs solubles
qui vont agir sur les cellules cancéreuses, notamment en entraînant une augmentation
d’expression et une activation du récepteur à l’HGF, et participe ainsi à la résistance des
cellules cancéreuses à la radiothérapie (Ohuchida, Cancer res, 2004).
Les collagènes fibrillaires, la fibronectine et les laminines sécrétées par ces
myofibroblastes supportent la croissance tumorale, l’invasion, ainsi que la résistance aux
agents chimiothérapeutiques (Armstrong, Clin cancer res, 2004). Il n’est donc pas surprenant
de voir que des xénogreffes sous-cutanées de cellules cancéreuses pancréatiques ont une
croissance tumorale supérieure lorsqu’elles sont co-injectées avec des cellules stellaires
(Bachem, Gastroenterol, 2005). En plus de synthétiser de la MEC, les myofibroblastes
sécrètent majoritairement les gélatinases MMP-2 et 9, qui dégradent la lame basale, et plus
particulièrement le collagène de type IV, et sont associées à l’inflammation, la fibrose,
l’angiogenèse et l’invasion tumorale (Phillips, Gut, 2003).
Parmi les molécules sécrétées par les cellules stellaires, la Périostine joue un rôle
majeur dans l’invasion des cancers pancréatiques. Elle est, en effet, fortement exprimée dans
le stroma des cancers pancréatiques mais également dans celui des TIPMPs où son expression
augmente progressivement au cours de la progression vers les stades les plus invasifs
(Fukushima, Mod pathol, 2008). Elle va agir, de manière paracrine, sur les cellules
cancéreuses pancréatiques, en favorisant la croissance tumorale et la résistance des cellules
cancéreuses pancréatiques à l’hypoxie et à la déprivation, ainsi que leur migration de manière
dépendante de Akt, et de manière autocrine, en maintenant l’activation et le potentiel
fibrogénique des cellules stellaires (Erkan, Gastroenterology, 2007 ; Kanno, Int j cancer,
2008).
Ces études démontrent que, suite à l’activation des cellules stellaires pancréatiques, un
microenvironnement supportant la croissance tumorale est mis en place et pourrait donc faire
l’objet d’un ciblage thérapeutique pour le cancer du pancréas, à base de molécules antifibrogéniques. Ceci est conforté par le fait que des modifications et une activation du stroma
sont observées dès les stades PanINs et semblent s’accumuler tout au long de la
cancérogenèse pancréatique (Esposito, J pathol, 2006).
128
1.2
Cellules immunitaires et réaction inflammatoire
Le rôle du système immunitaire dans le développement du cancer du pancréas a
longtemps été débattu. En effet, les cellules cancéreuses pancréatiques expriment une grande
variété d’antigènes, potentiellement reconnus par les lymphocytes T (Kubuschok, Int j cancer,
2004 ; Schmitz-Winnenthal, Cancer res, 2005).
Il a d’ailleurs été montré que des
lymphocytes T compétents, CD4+ et CD8+, spécifiques des antigènes cancéreux étaient
activés chez les patients souffrants de PDAC, sécrétaient de l’IFNγ (interféron γ), une
cytokine caractéristique de la mise en place d’une réponse immunitaire cytotoxique, et que
ces lymphocytes T étaient également retrouvés dans le sang circulant des patients dans 50%
des cas (Schmitz-Winnenthal, Cancer res, 2005 ; Schmitz-Winnenthal, Int j oncol, 2006). En
fait, les cellules cancéreuses pancréatiques mettent en place différents mécanismes, afin
d’échapper à la réponse immunitaire, incluant, la diminution d’expression des molécules de
CMH et du récepteur Fas, le recrutement de lymphocytes T régulateurs, inhibant l’activation
des lymphocytes T effecteurs, la sécrétion de cytokines immuno-suppressives, IL-10 et TGFβ, ou encore l’expression de Fas-ligand, induisant l’apoptose des lymphocytes T infiltrant la
tumeur (Schmitz-Winnenthal, Cancer res, 2005 ; Hiraoka, Clin cancer res, 2006 ; Von
Bernstorff, Clin cancer res, 2001 ; Von Bernstorff, Surgery, 1999).
D’autre part, de nombreuses études ont fait le lien entre inflammation et progression
cancéreuse. Il a notamment été montré que la pancréatite chronique augmentait
significativement les risques de cancers du pancréas. Outre ce rôle potentiel dans l’initiation
de la cancérogenèse pancréatique, l’inflammation joue aussi un rôle dans la croissance
tumorale, l’angiogenèse et l’invasion.
L’activation du facteur de transcription NF-κB survient au cours de la réponse
inflammatoire, suite à la stimulation de cytokines et de facteurs de croissance et régule
certains mécanismes importants dans les processus de cancérogenèse incluant la modulation
de l’immunité, de l’apoptose et de l’angiogenèse. Il a notamment été observé une activation
constitutive de NF-κB dans les cancers pancréatiques (Liptay, Int j cancer, 2003), dans des
modèles animaux de cancers pancréatiques (Fujioka, Clin cancer res, 2003) ainsi que dans
des lignées cancéreuses pancréatiques, BxPC-3, PANC-1 et MiaPaCa-2 alors que cette voie
n’est pas activée dans les cellules épithéliales pancréatiques normales immortalisées
(Chandler, J surg res, 2004 ; Liptay, Int j cancer, 2003 ; Wang, Clin cancer res, 1999). NF129
κB est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation et notamment l’inhibition de
l’apoptose (Liptay, Int j cancer, 2003 ; Greten, Gastroenterology, 2002 ; Algul, Int j
gastrointest cancer, 2002 ; Trauzold, Oncogene, 2001 ; Gross, Genes dev, 1999). NF-κB
induit aussi la prolifération cellulaire en activant la transcription de la cycline D1 (Yamamoto,
J clin invest, 2001 ; Schmid, Gastroenterology, 2000), l’angiogenèse via l’augmentation
d’expression du VEGF et de l’IL8 (Shi, J interferon cytokine res, 1999 ; Xiong, Int j cancer,
2004) et la migration des cellules cancéreuses pancréatiques in vitro (Yebra, Mol biol cell,
1995). In vivo, l’effet pro-métastatique de NF-κB a clairement été démontré par injection chez
la souris nude de cellules cancéreuses pancréatiques exprimant ou non un mutant de IκB-α,
inhibant constitutivement NF-κB, et inhibant fortement la formation de métastases hépatiques
et péritonéales (Xiong, Int j cancer, 2004 ; Fujioka, Clin cancer res, 2003). Ainsi de
nombreuses drogues, inhibant l’activation de NF-κB, particulièrement en ciblant IKK, sont
actuellement testées en clinique sur de nombreux types tumoraux y compris le cancer du
pancréas et font de la voie NF-κB une cible prometteuse [fig. 53].
D’autres molécules, impliquées dans l’inflammation participent à la progression des
cancers pancréatiques comme la cyclooxygénase-2 ou COX-2. Les cyclooxygénases sont des
enzymes convertissant l’acide arachidonique en prostaglandine H2, un précurseur de
cytokines pro-inflammatoires (Prescott, BBA, 2000). COX-2 est une isoforme inductible, et
impliquée dans l’inflammation et la cancérogenèse (Williams, Oncogene, 1999). Son
expression est augmentée dans de nombreux cancers, dont le cancer du pancréas (Kokawa,
Cancer, 2001 ; Kong, J gastroenterol hepatol, 2002 ; Niijima, Cancer, 2002 ; Merati, Am j
clin oncol, 2001 ; Maitra, Am j clin pathol, 2002), l’expression de son ARNm pouvant être
augmentée de 60 fois, dans certains cas (Tucker, Cancer res, 1999 ; Okami, Clin cancer res,
1999). COX-2 est également retrouvées surexprimées dans les lésions pré-cancéreuses
TIPMPs et son expression est corrélée avec celle du VEGF (Kokawa, Cancer, 2001 ; Aoki,
Oncol rep, 2002). Au point de vue mécanistique, COX-2 inhibe l’apoptose, active la
prolifération ainsi que l’expression du VEGF, stimulant ainsi l’angiogenèse de lignées
cancéreuses pancréatiques (Ding, Anticancer res, 2000 ; Kong, J gastroenterol hepatol,
2002 ; Eibl, BBRC, 2003 ; Chu, Mol cancer ther, 2003). Des études in vitro ont montré que
l’utilisation de drogues anti-inflammatoires non-stéroïdiennes (NSAID) inhibait la
130
Fig. 53 : Les inhibiteurs de la voie NF-κB dans le cancer du pancréas.
Liste des inhibteurs de la voie NF-κB, leurs mécanismes d’action et les études cliniques en cours
utilisant ces inhibiteurs dans le cancer du pancréas.
Adapté de Holcomb, Pancreas, 2008
131
prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques exprimant COX-2 et la combinaison de
ces drogues avec la gemcitabine montre un effet supérieur à la gemcitabine seule sur la
prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques (Molina, Cancer res, 1999 ; YipSchneider, Carcinogenesis, 2000 ; Yip-Schneider, J pharmacol exp ther, 2001). In vivo, les
inhibiteurs de COX-2 montrent une inhibition de la prolifération, un arrêt du cycle cellulaire,
une inhibition de l’expression du VEGF et du potentiel métastatique des cellules cancéreuses
pancréatiques (Furukawa, Int j cancer, 2003 ; Wenger, Pancreatology, 2002 ; Tseng, J
gastrointest surg, 2002 ; Wei, Cancer res, 2004 ; Wenger, Clin exp metastasis, 2002). Des
études cliniques et précliniques ont montré d’une part, que des inhibiteurs de COX-2
sensibilisaient aux radiations (Rich, Am j clin oncol, 2003 ; Crane, Am j clin oncol, 2003), et
ont, d’autre part, tenté d’appréhender les effets de la prise de d’aspirine, un NSAID, sur les
risques de survenue d’un cancer pancréatique, mais ces dernières études ont montré des
résultats contradictoires (Anderson, J natl cancer inst, 2002 ; Jacobs, J natl cancer inst,
2004 ; Schernhammer, J natl cancer inst, 2003).
Un certain nombre de cytokines inflammatoires sont également surexprimées dans les
cancers pancréatiques comme le TNF-α, les IL-6 et 8… L’IL-8 appartient à la superfamille
des chimiokines CXC et est produite par une grande variété de cellules, incluant les
lymphocytes, les monocytes, les fibroblastes ou encore les cellules endothéliales, en réponse à
des stimuli activant la voie NF-κB (Mukaida, J leukoc biol, 1994 ; Fiedler, Am j respir cell
mol biol, 1998 ; Ott, J immunol, 1998). Dans les cancers pancréatiques, elle est
constitutivement surexprimée et son expression est majoritairement dépendante de l’activation
de la voie NF-κB (Le, J interferon cytokine res, 2000). Elle agit de manière autocrine sur les
cellules cancéreuses pancréatiques et il a été montré qu’elle stimulait l’invasion in vitro et la
formation de métastases in vivo (Takamori, Pancreas, 2000 ; Miyamoto, Cancer immunol
immunother, 1998 ; Matsuo, Pancreas, 2004 ; Shi, Clin cancer res, 1999).
1.3
Angiogenèse et lymphangiogenèse
PDAC est caractérisé par un environnement fortement hypoxique, comme rarement
observé dans les autres types de cancers, ce qui contribue au comportement très agressif de ce
cancer (Büchler, J surg res, 2004 ; Koong, Int j radiat oncol biol phys, 2000). De nombreuses
données cliniques et expérimentales montrent une surexpression de protéines jouant un rôle
clef dans l’angiogenèse et contribuant au phénotype malin des cancers pancréatiques. Une
forte expression du VEGF a été observée dans environ 90% des PDACs et est associée avec
132
la présence de métastases hépatiques et à un mauvais pronostic chez des patients atteints de
PDACs (Seo, Cancer, 2000). Cette surexpression du VEGF a également été corrélée avec une
invasion locale avancée de la maladie (Itakura, Clin cancer res, 1997). De plus, il a été
démontré que la voie VEGF/VEGFRII régulait l’angiogenèse, la croissance tumorale et
l’invasion des cancers pancréatiques et le ciblage génétique du VEGFRII a montré une
inhibition de la croissance et de la diffusion métastatique des cancers pancréatiques (Büchler,
Ann surg, 2002). Il a notamment été montré que les milieux conditionnés de cellules
cancéreuses pancréatiques induisaient une forte activité mitotique sur les cellules
endothéliales, laquelle était inhibée par la neutralisation du VEGF-A par un anticorps
bloquant (Hotz, J gastrointest surg, 2001). De manière intéressante, les récepteurs au VEGF
sont non seulement exprimés dans les cellules endothéliales, mais sont également présents et
fonctionnels à la surface des cellules cancéreuses pancréatiques. Plus particulièrement, le
VEGFRI est exprimé ubiquitairement dans les lignées cancéreuses pancréatiques, dans
lesquelles il active la migration et l’invasion (Büchler, Ann surg, 2002). Ainsi le VEGF-A agit
par autocrinie sur les cellules cancéreuses pancréatiques et par paracrinie sur les cellules
endothéliales, l’utilisation d’agents ciblant le VEGF ou ses récepteurs ayant donc une double
action sur la croissance tumorale pancréatique (Wey, Cancer, 2005).
De nombreux autres facteurs pro-angiogéniques sont également surexprimés dans les
cancers pancréatiques comme le TGF-β, dont le rôle sera abordé un peu plus tard dans le
manuscrit. Le PDGF (platelet-derived growth factor) et ses récepteurs sont également
surexprimés dans les cancers pancréatiques (Ebert, Int j cancer, 1995) et le ciblage des
PDGFRs représente une cible de choix pour diminuer l’angiogenèse et la diffusion
métastatique (Hwang, Clin cancer res, 2003 ; Baker, Int j oncol, 2006). Parmi les autres
facteurs angiogéniques surexprimés dans les cancers pancréatiques, on compte également, le
FGF, l’angiogénine, l’IL-8, ou encore les MMPs…, l’ensemble de ces facteurs pouvant être la
cible de thérapies anti-angiogéniques pour le cancer du pancréas (Saif, JOP, 2006).
La dissémination métastatique peut également passer par le réseau lymphatique qui
rejoint la circulation sanguine. La lymphangioge nèse, bien que n’ayant été que peu étudiée
dans le cancer du pancréas semble également participer à la formation de métastases (Tarbe,
Anticancer res, 2002). Il a notamment été décrit une altération des vaisseaux lymphatiques à
la périphérie des tumeurs pancréatiques, pouvant résulter d’une forte sécrétion de VEGF-C
(Padera, Science, 2002). En effet, les cancers pancréatiques expriment le VEGF-C ainsi que
son récepteur flt-4 avec une expression deux fois supérieure du VEGF-C dans les tissus
133
cancéreux par rapport aux tissus pancréatiques normaux, cette surexpression étant associée à
la formation de métastases lymphatiques (Tang, Pancreas, 2001).
1.4
Invasion nerveuse
Les cancers pancréatiques se caractérisent par une invasion nerveuse intrapancréatique ainsi que du plexus nerveux retropéritonéal, dans 80% des cas (Nakao,
Pancreas, 1996 ; Takahashi, J surg oncol, 1997). En effet, l’expression de nombreux facteurs
de croissance nerveux, comme le BDNF (brain-derived nerve growth factor), le NGF (nerve
growth factor) et leurs récepteurs commun Trk et le GDNF (glial-derivated neurotrophic
factor), dans les cancers pancréatiques, est impliqué dans l’invasion nerveuse, est associée à
une forte douleur, et est un des facteurs majeurs de récurrence (Miknyoczki, Int j cancer,
1999 ; Zhu, J clin oncol, 1999 ; Okada, Int j cancer, 1999 ; Sakamoto, Oncol rep, 2001 ;
Schneider, J histochem cytochem, 2001 ; Pour, Pancréas, 2003 ; Kayahara, Pancreas, 2007).
Le GDNF agit via un récepteur multi-moléculaire appelé GFRα (GDNF receptor α)
qui s’associe avec le récepteur tyrosine kinase RET. Il a notamment été montré que le GDNF,
sécrété par les cellules nerveuses, agissait comme un chimio-attractant pour les cellules
cancéreuses pancréatiques qui surexpriment les récepteurs GFRα et RET, induisant l’invasion
et leur migration le long des nerfs par l’activation des voies Ras/MAPK et PI3K (Veit, Cancer
res, 2004 ; Gil, J nat cancer inst, 2009).
Le NGF a également été impliqué dans l’invasion nerveuse pancréatique. Son action
est transmise par deux récepteurs de haute et faible affinité respectivement : Trk et p75NGFR.
L’interaction du NGF avec TrkA induit la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques
et leur migration (Zhu, Clin cancer res, 2001 ; Zhu, Mol carcinog, 2002) et l’utilisation d’un
inhibiteur de Trk exerce un effet anti-tumoral in vivo (Miknyoczki, Clin cancer res, 1999). Le
récepteur p75NGFR exerce des effets paradoxaux. En effet, en présence du récepteur Trk, il
participe à la formation de sites de haute affinité et augmente la réponse cellulaire au NGF,
mais en l’absence de Trk, il exerce, au contraire, des effets pro-apoptotiques (CasacciaBonnefil, Cell death differ, 1998 ; Frade, Bioessays, 1998 ; Ryden, J biol chem, 1997). Le
récepteur p75NGFR, tout comme le récepteur Trk, sont exprimés dans les cellules
cancéreuses pancréatiques et c’est le rapport entre les niveaux d’expression de ces deux
récepteurs qui détermine les effets pro-tumoraux ou, au contraire, inhibiteurs du NGF, dans
les cancers pancréatiques (Dang, J gastroenterol hepatol, 2006).
Des chimiokines, en particulier CX3CL1, a également été impliquée dans le
neurotropisme des cellules cancéreuses pancréatiques. CX3CL1 est une chimiokine soluble et
134
transmembranaire exprimée par les neurones et au niveau des terminaisons nerveuses (Bazan,
Nature, 1997 ; Pan, nature, 1997 ; Haskell, J biol chem, 2000 ; Verge, Eur j neurosci, 2004).
Il a ainsi été montré que les cellules cancéreuses pancréatiques exprimaient fortement
CX3CR1, le récepteur à cette chimiokine, entraînant l’adhésion et la migration des cellules
cancéreuses le long des neurones et participant ainsi à l’invasion neurale (Marchesi, Cancer
res, 2008).
Les cellules cancéreuses pancréatiques expriment également des molécules
d’adhérence spécifiques des neurones : NCAM (neural cell adhesion molecule) dans plus de
65% des cancers pancréatiques, contenant de nombreuses chaînes d’acides scialiques, leur
permettant d’adhérer et de migrer le long des neurones (Kameda, Cancer lett, 1999 ; Tezel,
Pancreas, 2001).
Très récemment, il a été montré que la laminine-5/332 et plus particulièrement la
chaîne γ2 jouait un rôle important dans l’invasion nerveuse. En effet, la sécrétion de laminine5/332 par les cellules cancéreuses pancréatiques, ainsi que des MMPs permettant sa
maturation, associée à la sécrétion de nidogène-1 par les cellules de Schwann, stabilisant la
MEC, permet la mise en place d’une MEC favorisant la migration des cellules cancéreuses
pancréatiques le long des neurones et l’invasion nerveuse (Mitsunaga, Int j cancer, 2009).
2. Mécanismes moléculaires
2.1
Facteurs de croissance
Nous avons vu précédemment que le TGFß possédait des rôles antagonistes, agissant
comme un facteur anti-tumoral dans les premiers stades de la cancérogenèse pancréatique et
agissant comme un facteur pro-tumoral dans les stades plus avancés. La transition de son rôle
oncosuppresseur vers un rôle pro-invasif est due à la perte de son effecteur Smad4 (cf.
chapitre III.A, paragraphe 3.2, p118). Dans les stades avancés de cancer pancréatique, le
TGF-β est surexprimé (Friess, Gastroenterology, 1993), et participe à la réaction
desmoplasique (Lohr, Cancer res, 2001), favorisant ainsi l’invasion et la formation de
métastases. Le TGF-β est progressivement surexprimé au fur et à mesure de la cancérogenèse
pancréatique et l’exposition chronique des cellules cancéreuses au TGF-β mène à un
phénotype plus agressif (Ito, Surgery, 2004). Plusieurs études ont, en effet montré, que cette
surexpression du TGFß est associée à une réduction de la survie des patients atteints de
cancers du pancréas et que les taux de TGF-β retrouvés dans le sérum des patients sont
inversement corrélés avec la survie (Friess, Gastroenterology, 1993 ; Bellone, Cancer
135
immunol immunother, 2006). Le TGF-β est sécrété par les cellules cancéreuses, mais
également les cellules du microenvironnement (Shek, Am j pathol, 2002).
Le TGF-β va, tout d’abord agir, sur les cellules cancéreuses qui surexpriment les
récepteurs au TGFß (Wagner, Pancreas, 1999), induisant une transition épithéliomésenchymateuse, via notamment la diminution d’expression de la E-cadhérine, et en
stimulant leurs capacités migratoires et invasives (Ellenrieder, Cancer res, 2001 ; Chow, Am j
physiol gastrointest liver physiol, 2009), mais va pouvoir également agir sur le
microenvironnement tumoral. Ainsi la sécrétion de TGF-β par les cellules cancéreuses
pancréatiques va induire la prolifération et l’activation des fibroblastes environnants, qui vont
en coopération avec les cellules cancéreuses, sécréter et modifier les composants de la MEC
(sécrétion de collagènes I et III et de fibronectine) (Apte, Gut, 1999 ; Vogelmann, Am j physiol
gastrointest liver physiol, 2001 ; Lohr, Cancer res, 2001 ; Armstrong, Clin cancer res, 2004).
Il va également réguler la sécrétion de MMPs et de leurs inhibiteurs, les TIMPs (Ellenrieder,
Int j cancer, 2001 ; Teraoka, Int j oncol, 2001 ; Bister, Mod pathol, 2007), qui vont favoriser
le remodelage et la dégradation de la MEC pour permettre l’invasion des cellules tumorales. Il
stimule également l’angiogenèse (Teraoka, Br j cancer, 2001) et exerce des effets
immunosuppresseurs (Wojtowicz-Praga, Invest new drugs, 2003), l’ensemble de ces effets
ayant pour conséquence d’exacerber le phénotype malin des cellules cancéreuses et de
promouvoir l’invasion.
Le rôle clef du TGF-β dans l’invasion tumorale dans les cancers pancréatiques est
supporté par des études montrant que le blocage de la voie du TGFß par des récepteurs
solubles atténue la tumorigénicité et la diffusion métastatique sur des modèles de xénogreffes,
alors que l’ajout exogène de cette cytokine favorise l’invasion et l’EMT (Rowland-Goldsmith,
Clin cancer res, 2001 et Mol cancer ther, 2002 ; Ellenrieder, Cancer res et Int j cancer,
2001).
L’HGF (Hepatocyte Growth Factor) et son récepteur Met régulent la migration
cellulaire et l’invasion dans de nombreuses tumeurs malignes (Corso, Trends mol med, 2005).
Le récepteur Met est faiblement exprimé dans le pancréas exocrine normal et son expression
est fortement augmentée dans les stades PanINs et les PDACs (Di Renzo, Cancer res, 1995 ;
Furukawa, Am j pathol, 1995). L’expression de l’HGF est, quand à elle, induite durant la
cancérogenèse pancréatique. Il est exprimé par les cellules épithéliales dans les stades PanINs
et par les cellules stromales dans les PDACs (Paciucci, Am j pathol, 1998). In vitro, l’HGF
induit la migration des cellules cancéreuses pancréatiques, associée à la délocalisation de la E136
cadhérine des jonctions cellule-cellule et à l’augmentation d’expression de u-Pa (Urokinase
Plasminogen avtivator) et l’inhibition de cette voie par l’utilisation d’un dominant négatif de
l’HGF, NK4, inhibe l’invasion et l’angiogenèse de xénogreffes (Paciucci, Am j pathol, 1998 ;
Maehara, Br j cancer, 2001). Enfin, des études récentes ont montré que les niveaux d’HGF
retrouvés dans le sérum de patients atteints de cancer du pancréas reflètent l’agressivité de la
maladie (Kemik, Bratisl lek lidty, 2009).
L’EGF, joue également un rôle important dans les propriétés invasives des cellules
cancéreuses pancréatiques, via l’activation et la sécrétion de protéases extracellulaires :
MMP-2, 9 et u-Pa et l’activation de petites protéines G de la famille Rho (Kusama, Cancer
sci, 2006 ; Hurtado, Gut, 2007 ; Binker, BBRC, 2009). Parmi les voies de signalisation
induites par l’EGF, il a été montré que les voies PI3K, Src/Rac et NF-κB jouaient des rôles
majeurs (Zhang, Pancreas, 2006 ; Binker, BBRC, 2009).
2.2
MEC et molécules d’adhérence
Au cours de la réaction desmoplasique qui a lieu dans les cancers pancréatiques, de
grandes quantités de MEC sont produites. Le TGF-β est le principal facteur induisant cette
sécrétion de MEC, qui résulte d’une signalisation croisée entre myofibroblastes et cellules
tumorales (Koninger, BBRC, 2004, Lohr, Cancer res, 2001). Cette régulation d’expression
des composants de la MEC concerne des molécules comme les collagènes de type I, III et IV,
la fibronectine, les laminines [fig. 54]. Cependant au niveau de la lame basale, qui constitue la
frontière entre les cellules épithéliale et le tissu conjonctif, on observe une diminution locale
de l’expression de laminine et de collagène IV, facilitant l’invasion tumorale (Binkley,
Pancreas, 2004 ; Shimoyama, Int j pancreatol, 1995). Il a, en outre, été montré que
l’augmentation de synthèse de MEC, dans les cancers pancréatiques, est associée à une survie
à 5 ans faible (Stein, Cancer res, 2004) et que l’adhérence des cellules cancéreuses
pancréatiques sur des matrices de collagène I, IV, fibronectine ou laminine augmentent leur
résistance aux drogues (Miyamoto, Pancreas, 2004). Parallèlement à l’augmentation de
synthèse de MEC, les cellules cancéreuses pancréatiques expriment un large panel
d’intégrines et on observe une augmentation d’expression de nombreuses intégrines dans les
cancers pancréatiques, incluant les sous-unités α1, α2, α3 et α6, et associée à une altération de
leur localisation subcellulaire (Binkley, Pancreas, 2004 ; Iacobuzio-Donahue, Cancer res,
2003 ; Linder, Hepatogastroenterology, 2001 ; Shimoyama, Int j pancreatol, 1995) [fig. 55].
137
Fig. 54 : Tableau présentant les altérations d’expression des molécules de la matrice
extracellulaire dans le cancer du pancréas.
Adapté de Grzesiak, Pancreas, 2007
138
Fig. 55 : Tableau présentant les altérations d’expression des intégrines dans le cancer du
pancréas.
Adapté de Grzesiak, Pancreas, 2007
139
Des études comparatives d’adhérence, de migration et de prolifération sur différents substrats
et utilisant différentes lignées cancéreuses pancréatiques ont montré un rôle majeur du couple
collagène I / intégrine α2β1 (Grzesiak, Br j cancer, 2006). Un des principaux effets établi par
cette interaction est la diminution des jonctions cellule/cellule dépendantes de la E-cadhérine,
induisant la migration, l’invasion et la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques
(Imamichi, Oncogene, 2007 ; Koenig, Cancer res, 2006 ; Shintani, Cancer res, 2006 ; Menke,
Cancer res, 2001). La liaison de α2β1 sur le collagène I induit, via l’activation de FAK/Src, la
diminution de la localisation de la E-cadhérine des contacts cellule/cellule et la translocation
nucléaire de la β-caténine, qui va, en coopération avec les facteurs de transcription LEF /
TCF, activer la transcription des gènes de la cycline D1 et de c-myc (Koenig, Cancer res,
2006). D’ailleurs, l’utilisation d’un inhibiteur de Src bloque ces effets (Menke, Cancer res,
2001). La voie JNK a également été impliquée dans les effets de l’intégrine α2β1 (Shintani,
Cancer res, 2006). En plus de jouer sur la localisation de la E-cadhérine, des études ont
montré que la liaison α2β1/collagène I pouvait également réguler son expression mais les
données sont contradictoires. En fait, l’expression de la E-cadhérine, dans les cancers
pancréatiques, est assez hétérogène, avec une forte diminution d’expression dans les cellules
invasives, à la périphérie de la tumeur, alors que son expression est maintenue au centre de la
tumeur (Weinel, Int j pancreatol, 1996).
La liaison de l’intégrine α5β1 sur la fibronectine, semble avoir des effets contraires
à ceux de α2β1. En effet, il a été montré, en condition de déprivation en sérum, que cette
interaction induisait la localisation de la E-cadhérine et de la β-caténine aux contacts
cellule/cellule et la diminution de la migration des cellules cancéreuses pancréatiques. Ceci
est associée à l’augmentation d’expression de la E-cadhérine, de la fibronectine, de l’IL-8…,
des molécules impliquées dans la survie cellulaire, suite à l’activation du complexe de
transcription LEF / TCF / β-caténine (Grzesiak, Int j cancer, 2005). Ainsi en fonction du
couple intégrine / MEC, le complexe LEF / TCF / β-caténine semble activer différents gènes
impliqués dans l’invasion et la prolifération (α2β1 / collagène I) ou, au contraire, la survie
cellulaire (α5β1 / fibronectine). Ce phénomène, régulé par la MEC, peut jouer un rôle
important, permettant aux cellules, en conditions de stress (comme un manque de nutriments
au centre de la tumeur, ou lors de traitements thérapeutiques), de se mettre en latence et
d’exécuter des programmes de survie cellulaire.
La liaison des intégrines possédant une sous-unité β3, liant la fibronectine, jouent
également un rôle important dans la survie des cellules cancéreuses pancréatiques en activant
140
constitutivement le récepteur à l’IGF et la voie PI3K. Ce mécanisme implique la séquestration
par les intégrines β3 de la phosphatase SHP-2, qui ne peut plus déphosphoryler l’IGFR,
entraînant l’activation constitutive de ce dernier (Edderkaoui, J biol chem, 2007).
Les laminines font partie des molécules dont l’expression est augmentée dans les
cancers pancréatiques et participe également à l’invasion. Les intégrines α3β1 et α6β1,
permettent notamment la migration des cellules cancéreuses pancréatiques sur laminine-1/111
et induisent l’expression de l’IL-8 et de CXCR4 et l’activation des protéases MMP-2 et uPA,
des molécules impliquées dans la formation de métastases (Grzesiak, Surgery, 2007 ; He, Clin
cancer res, 2007). Enfin, la liaison d’intégrine sur la laminine, induit également l’activation
de la voie FAK / Akt permettant la résistance des cellules cancéreuses pancréatiques à la
gemcitabine (Huanwen, Mol cancer, 2009). La laminine-5/332 joue un rôle particulièrement
important dans le cancer du pancréas. En effet, il a été montré que les cellules cancéreuses
pancréatiques sécrétaient de grandes quantités de laminine-332, cette sécrétion associée au
clivage de sa chaîne γ2 et à la surexpression de l’intégrine α6β4, favorisant l’invasion
tumorale (Katayama, Cancer res, 2003). Enfin, la laminine-332 et sa chaîne γ2 jouent
également un rôle important dans l’invasion nerveuse en facilitant la migration des cellules
cancéreuses pancréatiques le long des nerfs (Mitsunaga, Int j cancer, 2009).
L’interaction entre les intégrines et la MEC joue un rôle capital dans les mécanismes
d’invasion et de survie cellulaire, dans les cancers pancréatiques et met à jour de nouvelles
cibles thérapeutiques potentielles. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de l’ILK, une kinase
impliquée dans la transduction de signaux en aval des intégrines, a montré, in vivo, une
diminution de la croissance tumorale et une sensibilisation à la gemcitabine (Yau, Cancer res,
2005).
2.3
Remodelage de la MEC
Les MMPs, protéases extracellulaires, en dégradant la MEC, jouent un rôle important
dans la diffusion métastatique. En outre, elles sont impliquées dans la biodisponibilité et
l’activation de certains facteurs de croissance ou de cytokines, favorisant ainsi la croissance
tumorale, l’invasion et l’angiogenèse (Deryugina, Cancer metastasis rev, 2006). Les MMPs
sont sécrétées dans les cancers du pancréas par les cellules cancéreuses mais aussi par les
cellules stromales. MMP-1, 2, 3, 7, 9, 11, 13, 21 et 26 ainsi que MT1-MMP et les inhibiteurs
de MMPs TIMP-1, 2 et 4 (Tissue inhibitors Metalloprotéinases) ont été décrits dans au moins
141
un des compartiments cellulaires des PDACs (Yamamoto, J clin oncol, 2001 ; Shek, Am j
pathol, 2002 ; Phillips, Gut, 2003 ; Harvey, Clin cancer res, 2003 ; Kordes, Pancreas, 2005).
Mais, certaines de ces molécules ont fait l’objet d’études plus approfondies. Par exemple,
MMP-2 et 9 ont été montrées comme fortement exprimées dans les cancers pancréatiques par
les cellules tumorales ainsi que par les myofibroblastes et les macrophages et leur expression
a été corrélée avec un faible taux de survie (Koshiba, Cancer, 1998 ; Gong, J surg oncol,
2000 ; Harvey, Clin cancer res, 2003 ; Mroczko, Pancreas, 2009). Plus particulièrement, il a
été montré que des taux élevés de MMP-9, circulante dans le sang des patients, pouvait
représenter un marqueur de mauvais pronostic. En outre, MMP-9 exerce des activités proangiogéniques. L’expression de MMP-7 a également été corrélée avec un mauvais pronostic
(Yamamoto, J clin oncol, 2001 ; Nakamura, Oncol rep, 2002).
Inversement, une augmentation de l’inhibiteur de MMPs, TIMP-2 est associée à un
meilleur pronostic de survie (Giannopoulos, Anticancer res, 2008). En effet, différentes
études ont suggéré que la balance entre les MMPs et leurs inhibiteurs représentait le facteur
important dans la progression cancéreuse pancréatique et l’invasion tumorale. Par exemple, il
a été montré que l’augmentation d’expression, dans les cancers pancréatiques, de MMP-7 et
11 était corrélée et compensée par l’augmentation simultanée de TIMP-1 alors que
l’augmentation de MMP-2 et MT1-MMP associée à la diminution d’expression de TIMP-2
faisait pencher la balance en faveur des MMPs et pouvait être responsable d’un potentiel
invasif plus important (Bramhall, J pathol, 1997). En outre, l’expression de MMP-2 et TIMP1 ne se localise pas dans les mêmes zones de la tumeur, avec une expression de MMP-2 plutôt
au niveau des fronts d’invasion des tumeurs pancréatiques, et une localisation de TIMP-1
plutôt au centre des tumeurs (Bloomston, J surg res, 2002). Le rôle exact des TIMPs dans la
cancérogenèse pancréatique et dans d’autres cancers est plus compliqué. En effet, malgré leur
rôle antagoniste des MMPs, une étude a montré que TIMP-1 favorisait la croissance tumorale
et l’invasion des cellules cancéreuses pancréatiques (Bloomston, Am j surg, 2005). Ceci peut
s’expliquer, d’une part, par le fait que les TIMPs agissent également par des voies
indépendantes des MMPs (Chirco, Cancer metastasis rev, 2006 ; Cruz-Munoz, Crit rev clin
lab sci, 2008). D’autre part, la stœchiométrie entre MMPs et TIMPs est responsable de
l’activation ou au contraire de l’inhibition des MMPs. Par exemple, une faible expression de
TIMP-2 favorise l’activation de MMP-2 par MT1-MMP alors qu’une forte expression de
TIMP-2 inhibe cette activation (Nagase, Cardiovasc res, 2006).
142
Le nombre conséquent d’études associant MMPs et progression cancéreuse
pancréatique, et leur rôle très documenté dans l’angiogenèse tumorale de nombreux autres
cancers (Van Hinsbergh, Cardiovasc res, 2008), a mené à la mise en place d’essais cliniques
combinant des inhibiteurs de MMPs (Marimastat et BAY 12-9566) et la gemcitabine dans les
cancers pancréatiques, mais ne montrant, malheureusement, aucun bénéfice significatif par
rapport à la gemcitabine seule (Bramhall, Br j cancer, 2002 ; Moore, J clin oncol, 2003).
uPA (Urokinase-type Plasminogen Activator) est une sérine protéase extracellulaire
catalysant la conversion du plasminogène inactif en plasmine active. La surexpression de
l’uPA et de son récepteur uPAR est impliquée dans la croissance tumorale, l’invasion et les
métastases de nombreux cancers. Indépendamment ou via l’activation de la plasmine, l’uPA
peut dégrader la MEC, activer des MMPs, libérer des facteurs de croissance (TGF-β, VEGF,
IGF, HGF…), stimuler la migration cellulaire et l’angiogenèse (Andreasen, Int j cancer,
1997 ; Livant, Current cancer drug targets, 2005). De nombreuses études ont également
montré l’importance de l’uPA dans les cancers pancréatiques (Takeuchi, Am j gastroenterol,
1993 ; Cantero, Br j cancer, 1997 ; Harvey, Clin cancer res, 2003 ; Nielsen, J gastroenterol
hepatol, 2005). Il a notamment été montré qu’une augmentation d’expression de l’uPA était
observée dans 78% des cancers pancréatiques et que la surexpression concomitante de l’uPA
et de son récepteur était corrélée avec une diminution de la survie. Inversement, l’expression,
dans les cancers pancréatiques, de PAI2 (Plasminogen Activator Inhibitor 2), un inhibiteur
d’uPA a été suggérée comme représentant un marqueur de bon pronostic (Smith, World j surg,
2007). L’utilisation d’un anticorps monoclonal anti-uPAR a également montré chez la souris
une diminution de la croissance tumorale, de la formation de métastases hépatiques et de
l’invasion rétro-péritonéale, faisant de cette molécule une potentielle cible thérapeutique pour
le cancer du pancréas (Bauer, cancer res, 2005). Enfin, une étude récente a montré la
faisabilité d’un dosage des taux sanguins d’uPA comme un potentiel marqueur du cancer du
pancréas (Gibbs, HPB surg, 2009).
2.4
Autres facteurs
Parmi les autres facteurs jouant un rôle clef dans le pouvoir invasif et métastatique des
cancers pancréatiques, on peut noter l’expression de S100A4 ou du récepteur à la chimiokine
CXCL12.
S100A4 appartient à la famille des protéines S100 liant le calcium (Heizmann, Front
biosci, 2002). Cette protéine a initialement été identifiée comme associée aux métastases,
143
d’où son autre nom : Métastatine (Ebralidze, Genes dev, 1989). Elle est surexprimée dans de
nombreux cancers où elle participe activement à la formation de métastases (Ambartsumian,
Oncogene, 1996 ; Davies, Oncogene, 1996 ; Maelandsmo, Cancer res, 1996 ; Takenaga,
Oncogene, 1997). Différents mécanismes d’action ont été décrits, à la fois intra- et
extracellulaires. Dans un premier temps, S100A4 interagit directement avec p53 et régule son
activité transcriptionnelle. S100A4 interagit également avec la myosine-IIA, agissant ainsi sur
la migration cellulaire et plus particulièrement sur la formation de protrusions membranaires
dans le chimiotactisme. Au niveau extracellulaire, S100A4 régule l’activation de différentes
MMPs, comme MMP-13, MMP-2, MT1-MMP… participant ainsi au remodelage de la MEC
et à l’angiogenèse (Garrett, J biol chem, 2006). Au niveau pancréatique, S100A4 est
surexprimées dans 60 à 90 % des PDACs ainsi que dans les lignées cellulaires cancéreuses
pancréatiques et dans près de 45 % des stades avancés de TIPMPs, son expression étant
associée à un mauvais pronostic (Ikenaga, J gastrointest surg, 2009 ; Ai, World j
gastroenterol, 2008 ; Oida, Oncol rep, 2006 ; Rosty, Am j pathol, 2002 ; Jang, J
hepatobiliary pancreat surg, 2009). En outre, il a été montré que cette surexpression était
associée à l’hypométhylation de son promoteur (Rosty, Am j pathol, 2002). Son rôle prométastatique dans les cancers pancréatiques est associé à sa capacité à promouvoir la survie,
la prolifération et la migration des cellules cancéreuses pancréatiques, mais participe
également à la résistance à la gemcitabine (Mahon, Cancer res, 2007 ; Tabata, BBRC, 2009).
Le récepteur CXCR4 à la chimiokine CXCL12 a, quant à lui, directement été impliqué
dans le ciblage du foie et des poumons pour la formation de métastases issues de tumeurs
pancréatiques. En effet, ce récepteur est exprimé dans 70% des cancers pancréatiques et
l’activation de ce dernier, par liaison de son ligand SDF1 (stroma cell-derived factor 1), ou
CXCL12, induit la prolifération, la survie et la migration des cellules cancéreuses
pancréatiques (Koshiba, Clin cancer res, 2000 ; Mori, Mol cancer ther, 2004 ; Marchesi,
Cancer res, 2004). CXCL12 est exprimée par les cellules stromales pancréatiques, mais
également au niveau d’organes comme le foie et les poumons, et favorise ainsi la formation
de métastases préférentiellement au niveau de ces organes, par la stimulation du récepteur
CXCR4 à la surface des cellules cancéreuses pancréatiques (Saur, Gastroenterology, 2005).
144
C/ α6β4 et cancer du pancréas
L’intégrine α6β4, bien que très étudiée dans certains cancers (colon, sein, peau…), a
été relativement peu étudiée dans le cancer du pancréas. Des études immunohistochimiques
ont pourtant montré qu’α6β4 était surexprimée dans plus de 90% des PDACs. En outre, il a
été montré que cette surexpression intervenait dès les stades PanIN-1A et était associée à une
perte de localisation de l’intégrine du pôle basal des cellules épithéliales (Gleason, J
histochem cytochem, 2005 ; Cruz-Monserrate, Mod pathol, 2007). De nombreux oncogènes
connus pour coopérer avec l’intégrine α6β4 sont également suractivés dans les cancers
pancréatiques (K-Ras, EGFR, c-Met…) et peuvent expliquer la surexpression et la
délocalisation très précoce, au cours de la cancérogenèse pancréatique, de l’intégrine α6β4. Il
a plus particulièrement été montré que les kinases Fyn et PKC étaient suractivées dans les
cancers pancréatiques et participaient à la croissance tumorale et métastatique (Chen, J
gastroenterol hepatol, 2010 ; El-Rayes, Pancreas, 2008 ; Mauro, Pancreas, 2010). Or ces
kinases sont décrites pour phosphoryler la sous-unité β4, dans différents cancers, et induire la
délocalisation de l’intégrine α6β4 des hémidesmosomes, au pôle basal des cellules
épithéliales, vers les structures de migration où elle favorise la croissance tumorale et
l’invasion. En outre, de nombreuses voies activées par l’intégrine α6β4 (PI3K, NF-κB, Erk…)
ainsi que de nombreuses cibles (MMPs, S100A4, VEGF…) (cf. chapitre II.D, paragraphe 2,
p100) sont également suractivées ou surexprimées dans les cancers pancréatiques et
pourraient représenter un lien entre le rôle pro-invasif et pro-tumoral de l’intégrine α6β4 et les
cancers pancréatiques.
Plus concrètement, il a été montré que l’intégrine α6β4 supportait le potentiel
migratoire et invasif des cellules cancéreuses pancréatiques, notamment via l’activation de
Rac en réponse à l’HGF (Cruz-Monserrate, Neoplasia, 2008). En outre, l’association de
l’intégrine α6β4 avec différentes tétraspanines : D6.1A, CO-029 et CD151 et leur
relocalisation vers les fronts de migration, suite à l’activation de PKC, induit la migration des
cellules cancéreuses pancréatiques et même, dans le cas de D6.1A, la formation de métastases
hépatiques (Herlevsen, J cell sci, 2003 ; Gesierich, Clin cancer res, 2005). Enfin, il a été
montré que l’intégrine α6β4 représentait le récepteur à la Périostine à la surface des cellules
cancéreuses pancréatiques, et induisait l’invasion et la survie cellulaire suite à l’activation des
voies PI3K/Akt/FAK (Baril, Oncogene, 2007).
145
L’ensemble de ces études montrent le rôle clef de l’intégrine α6β4 dans les propriétés
invasives et métastatiques des cancers pancréatiques. De plus, la surexpression de l’intégrine
α6β4, l’altération de sa localisation très précocement au cours de la cancérogenèse
pancréatique et sa coopération avec des oncogènes tels que c-Met ou l’EGFR, suggèrent que
cette intégrine participerait également au développement et à la progression des cancers
pancréatiques et pourrait représenter une cible thérapeutique pour le cancer du pancréas. Une
étude a d’ailleurs montré que l’utilisation de butyrate de sodium, inhibait l’expression de β4 et
l’invasion des cellules cancéreuses pancréatiques (Farrow, J gastrointest surg, 2003).
146
IV. LA SOMATOSTATI NE ET SES RECEPTEURS
A/ la somatostatine et ses récepteurs
1. La somatostatine
La somatostatine ou SRIF (somatotropin release-inhibiting factor) est un peptide
ubiquitaire cyclique isolé initialement à partir d’extraits hypophysaires et inhibant la sécrétion
de l’hormone de croissance (GH) (brazeau, science, 1973 ; burgus, PNAS, 1973). Son
apparition au cours de l’évolution est très ancienne puisqu’elle est présente chez les vertébrés,
les invertébrés, les plantes et les bactéries (Tostivint, Mol cell endocrinol, 2008). Elle est
sécrétée principalement par le système nerveux central et périphérique, les cellules δ du
pancréas endocrine et le tractus gastro-intestinal (au niveau des cellules δ de la muqueuse),
mais également, de façon plus minoritaire, par la thyroïde, les glandes surrénales, la prostate,
les reins ou le placenta. Chez le rat, le tractus gastro-intestinal produit 65% de la
somatostatine totale, le cerveau 25%, le pancréas 5% et les autres organes les 5% restants
(Patel, Front neuroendocrinol, 1999).
Chez l’homme, elle est codée par le gène somatostatin 1, localisé sur le bras long du
chromosome 3 donnant naissance à un large précurseur : la pré-prosomatostatine qui est
ensuite maturé par clivage protéolytique (Warren, cell, 1984) donnant deux formes bioactives
de 14 et 28 aa. : la somatostatine 14 et la somatostatine 28, dues à une maturation différente
selon le type cellulaire [fig. 56]. La somatostatine 14 fût la première forme découverte et
prédomine dans les ilots pancréatiques, l’estomac et le système nerveux et est la seule forme
retrouvée au niveau de la rétine et des nerfs périphériques. La somatostatine 28, quand à elle,
isolée un peu plus tard à partir d’extraits intestinaux, est une forme rallongée en N-terminal
(Pradayrol, BBRC, 1978 et FEBS lett, 1980) et est principalement synthétisée par la
muqueuse intestinale mais aussi par le cerveau où elle représente 20 à 30% de la
somatostatine totale.
Plus tard, un nouveau peptide cyclique, présentant une grande homologie avec la
somatostatine (11 aa. en commun avec la somatostatine 14) a été identifié : la cortistatine (De
Lecea, nature, 1996 ; Tostivint, PNAS, 1996). Tout comme la somatostatine, la cortistatine est
synthétisée sous forme d’un précurseur, maturé ensuite pour donner deux formes : la
cortistatine 17 et 29, chez l’homme. La cortistatine proviendrait d’une duplication ancestrale
du gène de la somatostatine. Elle est également distribuée de manière très large et présente
147
Cortistatin-17
Fig. 56 : structure chimique de la somatostatine-14 et de ses analogues endogènes
(somatostatine-28 et cortistatine-17) et synthétiques (lanréotide, octréotide et RC-160).
Au niveau de la somatostatine-14, les flèches représentent des sites de clivage impliqués dans la
dégradation enzymatique de la somatostatine et expliquant la courte demi-vie (1 à 3 min) de la
molécule.
Adapté de Susini, Ann Oncol, 2006
148
des fonctions proches de la somatostatine, avec un rôle plus spécifique au niveau du système
immunitaire (Dalm, J clin endocrinol metab, 2003). Ces dernières années de nouveaux
peptides apparentés à la somatostatine ont été identifiés comme le thrittene ou la
neuronostatine, mais leurs fonctions sont encore floues (Ensinck, Endocrinology, 2002 ;
Samson, J biol chem, 2008).
La somatostatine exerce de nombreuses fonctions physiologiques variées, notamment
en inhibant les sécrétions endocrines et exocrines (Patel, Front neuroendocrinol, 1999). Au
niveau du système nerveux central, elle agit comme un neurotransmetteur agissant sur les
fonctions cognitive, locomotrice ou sensorielle. Elle inhibe la sécrétion de dopamine et de
norépinéphrine, mais également la sécrétion d’hormones telles que l’hormone de croissance,
la TSH (thyroid-stimulating hormone), la TRH (thyrotrophin-releasing hormone) ou encore
l’ACTH (Adreno CorticoTropic Hormone) et la prolactine… Au niveau du tractus gastrointestinal, elle inhibe les sécrétions endocrines d’insuline, de glucagon, de gastrine ou de
cholécystokinine… ainsi que les sécrétions exocrines de nombreuses enzymes ou sucs
digestifs (acide gastrique, pepsine, bile…), et régule la motilité intestinale ou la vidange
gastrique… Au niveau thyroïdien, elle inhibe la sécrétion des hormones thyroïdiennes T3, T4
et calcitonine, alors qu’au niveau des surrénales, elle régule la sécrétion d’aldostérone et de
catécholamines. Elle régule également négativement la sécrétion de nombreux facteurs de
croissance (EGF, IGF-1, PDGF) et de cytokines (IL-6, IFNγ). Enfin, elle induit une
vasoconstriction, en particulier au niveau de la circulation splanchnique, et régule
l’inflammation et la prolifération lymphocytaire.
2. Les récepteurs de somatostatine
Les effets de la somatostatine sont transmis par une famille de 5 récepteurs à 7
domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPG) sst1 à 5, distribués largement
au sein de l’organisme, comme le système nerveux central, l’hypophyse, le pancréas, le
tractus gastro-intestinal, les reins, la thyroïde, les poumons ou encore le système immunitaire
(Weckbecker, Nat rev drug discov, 2003) [fig. 57]. Les 5 cinq récepteurs présentent une
grande homologie entre les différents sous-types (de 39 à 57% d’homologie), mais aussi entre
espèce puisque, par exemple, 99% des aa. sont conservés entre les récepteurs sst1 humain et
murin. Le clonage et l’identification de ces récepteurs a été réalisé vers le début des années 90
(Yamada, Mol endocrinol, 1992 et BBRC, 1993) et a mis en évidence l’existence de 5 soustypes différents de 391, 369, 418, 388 et 383 aa., codés par des gènes différents localisés sur
149
receptor
subtype
binding
affinity
(IC50, nM)
hsst1
hsst2
hsst3
hsst4
hsst5
somatostatin-14
0,1-2,26
0,2-1,3
0,3-1,6
0,3-1,8
0,2-0,9
somatostatin-28
0,1-2,2
0,2-4,1
0,3-6,1
0,3-7,9
0,05-0,4
cortistatin-17
0,25-7
0,6-0,9
0,4-0,6
0,5-0,6
0,3-0,4
lanreotide
180
0,5
14
230
17
octreotide
280
0,4
7
>1000
6
RC-160
>1000
5,4
31
45
0,7
SOM-230
9,3
1
1,5
>100
0,16
gene
sstr1
sstr2
sstr3
sstr4
sstr5
chromosome
14q13
17q24
22q13.1
20p11.2
16p13.3
number of amino
acids
391
369/356
418
388
364
molecular weight
(kDa)
42,7
41,3
45,9
41,9
39,2
tissue distribution
brain,
pituitary,
pancreas,
stomach,
liver,
kidneys
Brain, pituitary,
pancreas,
lymphocytes,
vascular smooth
muscle cell,
stomach, kidneys
Brain,
pituitary,
pancreas,
T cells,
stomach
Brain,
pituitary,
pancreas,
lungs,
placenta
Lymphoid
cells,
pituitary,
pancreas,
stomach
endogenous ligands :
synthetic ligands :
properties
Fig. 57 : Affinité des différents sous-types de récepteurs pour la somatostatine et ses
analogues et principales caractéristiques.
Adapté de Susini, Ann Oncol, 2006
150
les chromosomes 14q13, 17q24, 22q13.1, 20p11.2 et 16p13.3 respectivement. Les gènes
codant pour les récepteurs sst1, 3, 4 et 5 ne possèdent pas d’introns alors que celui codant
pour sst2 possède un intron en 3’ de la région codante, qui, par épissage alternatif aboutit à 2
isoformes sst2A et B de 369 et 346 aa. respectivement (Vanetti, FEBS lett, 1992 ;
Patel, BBRC, 1993). Les 5 récepteurs sont classés phylogénétiquement en deux sous-classes :
la classe 1 qui regroupe les sst2, 3 et 5 et la classe 2 qui compte sst1 et 4. La somatostatine 14
ou 28 lie l’ensemble des récepteurs avec une affinité similaire (de l’ordre du nM), à
l’exception de sst5 qui a une affinité 10 fois meilleure pour la somatostatine 28. Du fait de la
courte demi-vie de la somatostatine (1 à 3 minutes), des analogues plus stables ont été
synthétisés dont l’octréotide (aussi appelé SMS 201-995 ou Sandostatin), le lanréotide (BIM
23014, somatuline) et le vapréotide (RC-160), qui sont déjà utilisés en clinique pour les deux
premiers, et en cours d’études cliniques pour le troisième [fig. 56]. Ces analogues lient les
récepteurs de la classe 1 avec une affinité bonne à modérée mais sont 1000 fois moins
efficaces pour les récepteurs de la classe 2 [fig. 57]. Plus récemment, un nouvel analogue de
somatostatine : le SOM230 ou Pasiréotide, un analogue « universel » de somatostatine ayant
une bonne affinité pour les récepteurs sst1, 2, 3 et 5, donne des résultats très prometteurs et est
actuellement en cours d’étude clinique pour le traitement de tumeurs endocrines (Ruan, Mol
endocrinol, 2006 ; Fedele, Clin cancer res, 2007 ; Zatelli, Endocr relat cancer, 2007 ;
Schmid, Ann endocrinol, 2008).
Les effets anti-sécrétoires de la somatostatine sont liés à l’inhibition de l’adénylate
cyclase et la régulation de canaux ioniques. En effet, les 5 récepteurs sont fonctionnellement
couplés à l’inhibition de l’adénylate cyclase via les protéines Gαi. Mais les effets antisécrétoires de la somatostatine sont également fortement liés à la diminution du Ca2+
intracellulaire. Ceci s’accomplit par l’ouverture des canaux potassiques, entraînant l’inhibition
des canaux calciques voltage-dépendants et également par l’inhibition directe de ces mêmes
canaux calciques, induits par les récepteurs de somatostatine (Tallent, Neurosci, 1996 ;
Roosterman, FEBS lett, 1998). Les récepteurs de somatostatine régulent de nombreuses autres
voies de signalisation, et notamment des kinases (MAPKs, PKA, Src), des phosphatases
(SHP-1 et 2, PTP), ou encore les phospholipases A2 et C (Guillermet-Guibert, Best pract res
clin gastroenterol, 2005) [fig. 58, p 157] ; cette partie sera plus amplement détaillée dans le
chapitre IV.B, p152.
151
En outre, comme cela a déjà été décrit pour d’autres RCPGs, les récepteurs de
somatostatine (sst2, 3 et 5) peuvent s’homodimériser, mais également former des héterooligomères, ces hétero-oligomérisations pouvant affecter l’affinité des récepteurs pour leur
ligand, ou modifier la signalisation intracellulaire (Rocheville, J biol chem, 2000 ; Pfeiffer, J
biol chem, 2001 ; Sharif, Endocrinology, 2007). Il a notamment été montré que sst2 pouvait
hétérodimériser avec sst5, modifiant le trafic, la localisation membranaire du sst2 et la
désensibilisation à la somatostatine. Sst2 peut également oligomériser avec des récepteurs
d’autres familles, comme le récepteur μ-opioïde (MOR1), lorsqu’ils sont co-exprimés dans les
cellules HEK293. Dans ce cas, cette hétéro-oligomérisation entraîne une régulation croisée
de la phosphorylation, l’internalisation et la désensibilisation des deux récepteurs (Pfeiffer, J
biol chem, 2002). Enfin, les récepteurs sst2 et sst5 sont également capables d’oligomériser
avec le récepteur à la dopamine D2R, affectant l’affinité des récepteurs pour leur ligand, la
signalisation ou le trafic des récepteurs (Rocheville, Science, 2000 ; Baragli, Cell signal,
2007).
Les récepteurs de somatostatine sont, comme vu précédemment, exprimés de manière
très large au sein de l’organisme, mais sont également exprimés dans un certains nombre de
tumeurs, permettant l’utilisation d’analogues de la somatostatine pour le diagnostic et le
traitement de ces tumeurs. L’expression des récepteurs de somatostatine a été particulièrement
décrite dans les tumeurs neuroendocrines comme les tumeurs hypophysaires et gastro-entéropancréatiques, l’expression de sst2 étant la plus fréquente, suivie par l’expression des
récepteurs sst1, 3 et 5, alors que sst4 n’est que rarement exprimé (Reubi, Neuroendocrinology,
2004 ; Melmed, J clin invest, 2009). D’autres tumeurs non-endocrines expriment aussi des
récepteurs de somatostatine comme au niveau de la prostate, du sein des ovaires ou encore des
poumons (Kvols, Anticancer drugs, 2006).
B/ Effets anti-tumoraux de la somatostatine
La somatostatine exerce une activité anti-néoplasique dans un grand nombre de
modèles expérimentaux aussi bien in vitro qu’in vivo et inhibe la croissance de nombreuses
lignées tumorales d’origine gastrique, prostatique, ovarienne, cérébrales ou thyroïdiennes.
Actuellement les analogues de somatostatine Octréotide et Lanréotide sont utilisés
pour le traitement et le contrôle des symptômes hormonaux des adénomes hypophysaires, et
152
permettent de réduire voire de normaliser la sécrétion excessive de GH et d’IGF-1 associée à
l’acromégalie (Ben-Shlomo, J clin endocrinol metab, 2003). De plus, ils induisent une
réduction du volume tumoral dans 37 à 82% des patients acromégales recevant un traitement
avec des analogues de somatostatine en première intention (Bevan, J clin endocrinol metab,
2005 ; Melmed, J clin endocrinol metab, 2005 ; Maiza, Clin endocrinol, 2007), ces effets
étant attribués à l’expression des récepteurs sst2 et 5, dont l’expression est prédominante dans
ce type de tumeurs.
Plus récemment, des études ont suggéré une indépendance entre les effets
antiprolifératifs et les effets anti-sécrétoires des analogues de somatostatine (Cozzi, J clin
endocrinol metab, 2006 ; Maiza, Clin endocrinol, 2007). Par exemple, une étude sur des
carcinomes médullaires thyroïdiens a montré que, dans des cultures primaires issues d’un
groupe de patients répondant au Lanréotide en termes de sécrétion, la viabilité cellulaire
n’était pas affectée par les analogues de somatostatine, alors que, inversement, ces analogues
inhibaient la survie cellulaire mais n’avait aucun effet anti-sécrétoire pour un deuxième
groupe de patient (Zatelli, J clin endocrinol metab, 2006). Ces éléments suggèrent que les
effets anti-sécrétoires et anti-prolifératifs des analogues de somatostatine pourraient être liés à
différentes voies de signalisation activées par les récepteurs, et pourraient également être
dépendants du profil d’expression des récepteurs de somatostatine.
Le Lanréotide ou l’Octréotide sont aussi des candidats pour le traitement de tumeurs
endocrines gastro-entéro-pancréatiques. En effets, ils inhibent la sécrétion d’hormones et de
facteurs de croissance par les cellules tumorales et permettent de contrôler les symptômes liés
à l’hypersécrétion d’hormones. La diminution des volumes tumoraux est, en revanche, très
rare, et leur stabilisation n’est observée que dans 10 à 45% des cas (Arnold, Digestion, 2000 ;
Oberg, Neuroendocrinology, 2004). D’un autre côté, une étude réalisée sur des patients
souffrant de carcinoïdes intestinaux avancés, l’utilisation de fortes doses d’Octréotide ont
montré une stabilisation de la production d’hormones et du volume tumoral dans 75% des cas
(Welin, Eur j endocrinol, 2004). Enfin, plus récemment, une étude a montré une régression
complète sur des carcinomes hépatocellulaires traités par de l’Octréotide puis du Lanréotide
(Rahmi, J clin oncol, 2007).
1. Effets anti-tumoraux indirects
La somatostatine exerce de nombreux effets anti-tumoraux indirects, incluant
l’inhibition de la sécrétion de facteurs de croissance et d’hormones impliquées dans la
153
croissance tumorale, l’inhibition de l’angiogenèse tumorale et la modulation du système
immunitaire.
1.1
Effet anti-sécrétoire
Nous avons vu précédemment que la somatostatine inhibait la sécrétion de facteurs de
croissance tels que l’EGF, l’IGF-1 ou encore la gastrine, ainsi que de nombreuses hormones
telles que l’hormone de croissance. Une étude a notamment montré que les analogues de
somatostatine supprimaient l’axe GH-IGF-1, impliqué dans les symptômes des adénomes
hypophysaires sécrétant de la GH. Il a en effet été montré que les analogues de somatostatine
inhibaient la sécrétion hypophysaire de GH via l’activation des récepteurs sst2 et 5, d’une
part, ainsi que la sécrétion hépatique d’IGF-1 induite par la GH, via l’activation des
récepteurs sst2 et/ou 3, d’autre part. En outre les effets des analogues de somatostatine sur la
production d’IGF-1 implique l’activation de la phosphatase PTP (phosphotyrosine
phosphatase) qui déphosphoryle et empêche la localisation nucléaire du facteur de
transcription STAT5b, conduisant à l’inhibition de la transcription du gène codant pour l’IGF1 (Murray, J clin invest, 2004).
1.2
Effet anti-angiogénique
La somatostatine et ses analogues peuvent également agir indirectement sur la
croissance tumorale et métastatique via l’inhibition de l’angiogenèse tumorale. En effet,
l’expression du récepteur sst2 a été décrite dans les vaisseaux péri-tumoraux des carcinomes
colorectaux, rénaux, des carcinomes pulmonaires à petites cellules, des cancers du sein ou
encore dans les lymphomes malins (Reubi, Int j cancer, 1994). En effet, sst2 est exprimé par
les cellules endothéliales en prolifération, alors qu’il est absent de l’endothélium vasculaire
quiescent (Watson, Br j cancer, 2001). L’activité anti-angiogénique des analogues de
somatostatine Octréotide et RC-160, qui ont une forte affinité pour sst2, a d’ailleurs été
démontré dans des modèles cellulaires (cellules HUVEC), ainsi que dans des modèles plus
intégrés d’angiogenèse tels que la veine placentaire ou la membrane chorio-allantoïdienne de
poulet (Woltering, Cancer biother radiopharm, 2003). L’expression du récepteur sst3 dans les
cellules endothéliales et son implication dans les effets anti-angiogéniques de la somatostatine
a également été démontrée, notamment sur un modèle d’implant de matrigel chez la souris.
Ces travaux ont également montré l’implication de l’inhibition de la eNOS (nitric oxide
synthase) et de la voie des MAPK dans les effets anti-angiogéniques de sst3 (Florio,
Endocrinology, 2003 ; Arena, Mol endocrinol, 2005).
154
Enfin, la somatostatine exerce ses effets anti-angiogéniques via l’inhibition de
nombreux facteurs pro-angiogéniques et notamment du VEGF et du bFGF, dans des cellules
de gliomes, dans les cancers colorectaux ainsi que dans les adénomes hypophysaires
(Mentlein, Int j cancer, 2001 ; Cascinu, Cancer invest, 2001 ; Zatelli, Endocr relat cancer,
2007). De plus, l’expression des récepteurs VEGFR-1 et 2 est inhibée par la somatostatine
dans des cellules tumorales issues d’adénomes hypophysaires.
1.3
Modulation du système immunitaire
Le système immunitaire peut également participer à la croissance tumorale en
produisant des cytokines, des facteurs de croissance et des facteurs angiogéniques. Or la
somatostatine exerce un effet inhibiteur sur l’inflammation et la prolifération lymphocytaire
(Karalis, J clin invest, 1994 ; Aguila, Endocrinology, 1996 ; Rosskopf, Am j physiol cell
physiol, 2003). Il a par exemple été montré que la somatostatine inhibait l’infiltration
lymphocytaire en réponse à la cytokine CXCL-12 (SDF-1α) (Talme, Clin exp immunol,
2004). Parmi les mécanismes impliqués dans l’activation des lymphocytes et leur migration
vers les sites d’inflammation, l’activation de certaines intégrines, en particulier les intégrines
du groupe β2, exprimées spécifiquement à la surface des lymphocytes, jouent un rôle capital.
Des études ont mis en évidence une inhibition de l’expression de l’intégrine LFA-1 ou αLβ2 à
la surface des lymphocytes et des splénocytes, par les analogues de somatostatine, participant
ainsi aux effets anti-inflammatoires de la somatostatine (Yoon, Anticancer res, 2004 et Reg
pep, 2005). Parmi les mécanismes responsables de cet effet, la somatostatine stimule, d’une
part, la neuramidase (une sialidase impliquée, entre autre, dans la modulation de l’activité des
lymphocytes en contrôlant les niveaux d’acide sialique des gangliosides à la surface des
membranes cellulaires) et, d’autre part, inhibe l’expression de la GTPase Rap1.
Paradoxalement, une étude plus ancienne avait montré que la somatostatine induisait
l’activation des intégrines α4β1 et α5β1, stimulant ainsi l’adhésion des lymphocytes sur la
fibronectine, et participerait donc à leur recrutement lors de la réponse immunitaire (Levite, J
immunol, 1998). Ces effets antinomiques des analogues de somatostatine sur l’activation des
intégrines leucocytaires, peuvent s’expliquer par des contextes cellulaires et des situations
physiologiques différentes, aboutissant à des effets positifs ou négatifs de la somatostatine sur
l’inflammation.
155
2. Effets anti-tumoraux directs
2.1
Arrêt du cycle cellulaire
Divers mécanismes ont été impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire induit par la
somatostatine, incluant l’activation de phosphatases, la régulation des MAPKs, ou encore
l’inhibition de la nNOS (neuronal NO synthase) [fig. 58].
La phosphatase PTPη est un effecteur clef dans l’inhibition de la prolifération induite
par sst1, dans les cellules cancéreuses thyroïdiennes et les gliomes et son activation résulte
d’une activation croisée entre les phosphatases SHP-2 et PTPη et les tyrosine-kinases JAK2 et
c-Src (Florio, Mol endocrinol, 2001 ; Arena, Mol endocrinol, 2007). Le récepteur sst2, quant
à lui, transmet ses effets anti-prolifératifs via l’activation de la phosphatase SHP-1 (Lopez, J
biol chem, 1997 ; Bousquet, J biol chem, 1998). L’activation de SHP-1 par sst2 implique
notamment l’activation de la kinase c-Src et de la phosphatase SHP-2 ou de la kinase JAK2
(Hortola, J biol chem, 2003 ; Ferjoux, Mol biol cell, 2003). Il s’ensuit alors l’inhibition des
voies de signalisation induites par les facteurs de croissance, d’une part, et l’activation de la
nNOS, entraînant la production de cGMP et l’induction de l’inhibiteur du cycle cellulaire
p27KIP1, d’autre part (Lopez, FASEB J, 2001 ; Lahlou, J biol chem, 2003). Inversement, sst5
inhibe la prolifération cellulaire, en activant c-Src, qui inhibe la nNOS et la production de
cGMP, aboutissant à l’inactivation des MAPKs (Cordelier, PNAS, 1997 et J biol chem, 2006).
2.2
Effets pro-apoptotiques
La somatostatine est également capable d’induire l’apoptose dans différents types
cellulaires. Dans les cellules cancéreuses mammaires MCF-7, l’effet apoptotique de la
somatostatine implique la phosphatase SHP-1 et résulte de l’activation de la caspase-8 et de la
libération de cytochrome c (Liu, J biol chem, 2000). Le récepteur sst3 est un médiateur
important des effets apoptotiques de la somatostatine, en entraînant une up-régulation et une
activation de p53 ainsi que l’induction de Bax (Sharma, Int j cancer, 1998). Sst2, quant à lui,
induit l’apoptose de manière indépendante de p53, mais dépendante de SHP-1, dans des
lignées cancéreuses pancréatiques et leucémiques (Teijeiro, Cell physiol biochem, 2002 ;
Guillermet, PNAS, 2003). Il a notamment été montré que sst2 active l’apoptose dans les
cellules NIH3T3 en augmentant l’expression du récepteur au TNF-α, sensibilisant ainsi les
156
Transduction pathways
sst1
sst2
sst3
sst4
sst5
Adenylate cyclase
↓
↓
↓
↓
↓
Phospholipase C
↑
↑
↑
↑
↑/↓
Phospholipase A2
↓
↓
Tyrosine phosphatases
↑
↑
↑
↑
↑
↑
↑
SHP-1
SHP-2
↑
↑
↑
↑
Tyrosine kinases
c-src
↑
JAK2
Phosphatidylinositol 3-kinase
↑
↑
↑
Nitric oxide synthases
↑
Neuronal nitric oxide synthase
↓
Endothelial nitric oxide synthase
Ca2+ channels
↓
↓
K+ channels
↓
↑
Na+/H+ exchange
↓
↓
↑
↑
↓
↓/↑
↓
↑
↑
Mitogen-activated protein kinases
Extracellular signal-related kinase
↓/↑
↓/↑
↑
p38
↑
↑
c-Jun N-terminal kinase
Gap junctions
↓
↑
Fig. 58 : tableau des voies de signalisation régulées par les différents sous-types de
récepteurs à la somatostatine.
Adapté de Guillermet-guibert, Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2005
157
cellules à l’action du TNF-α, d’une part, et en activant la voie TNFα-NFkB, induisant
l’inhibition de la kinase JNK, d’autre part (Guillermet-Guibert, Cell death differ, 2007).
1.3
Inhibition de la migration et de l’invasion tumorale
La somatostatine inhibe la migration et l’invasion de plusieurs cellules tumorales, dont
les cellules cancéreuses pancréatiques, de neuroblastomes ou encore de gliomes (Benali,
PNAS, 2000 ; Cattaneo, Mol cell endocrinol, 2006 ; Pola, J biol chem, 2003). Il a notamment
été montré, dans les cellules de neuroblastomes et de gliomes, que la somatostatine inhibait
l’activation de Rac, impliqué dans la migration cellulaire, notamment via son implication dans
la formation de lamellipodes (Pola, J biol chem, 2003 ; Cattaneo, Mol cell endocrinol, 2006).
Dans les fibroblastes CCL39, la somatostatine agit, en revanche, sur Rho, inhibant ainsi la
formation de fibres de stress, impliquées dans la contraction du cytosquelette d’actine lors de
la migration cellulaire (Buchan, J biol chem, 2002). Enfin, plus récemment un conjugué entre
la camptothécine et un analogue de somatostatine, inhibe les propriétés invasives des cellules
cancéreuses prostatiques en inhibant l’activité des intégrines αVβ3 et αVβ5 et l’expression de
MMP-2 et 9, via l’inhibition de la voie PI3K (Sun, Cancer lett, 2007).
C/ sst2 et cancer du pancréas
Les travaux de notre équipe ainsi que d’autres groupes ont démontré une perte
d’expression du récepteur de somatostatine sst2 (au niveau de son ARNm) dans 90% des
adénocarcinomes pancréatiques et des lignées cellulaires qui en dérivent (Reubi,
Gastroenterolog, 1988 ; Taylor, Peptides, 1994 ; Buscail, Cancer res, 1996). Ceci peut
expliquer l’absence d’effet thérapeutique des analogues de somatostatine dans ce type de
cancer (Raderer, Br j cancer, 1999) et laisse supposer que la perte de sst2 pourrait conférer un
gain de croissance aux tumeurs. Les travaux réalisés au sein de notre équipe ces quinze
dernières années ont permis de proposer le concept selon lequel sst2 agirait comme un
suppresseur de tumeur pour le cancer du pancréas.
1. Mécanismes responsables de la perte d’expression de sst2 dans les PDACs
Plusieurs études ont tenté d’élucider les mécanismes responsables de la perte
d’expression du récepteur sst2 dans l’adénocarcinome pancréatique. Dans un premier temps,
158
aucune perte chromosomique dans la région 17q24, comprenant le gène sst2, n’a été détectée
(Mahlamaki, Genes chromosomes cancer, 1997). Mais les travaux de l’équipe ont largement
contribué à répondre à cette question.
Il a notamment été montré la présence d’un polymorphisme génétique fonctionnel
dans la région promotrice du gène sst2 (en position -57 et -83 par rapport au site d’initiation
de la transcription). Le site situé en position -83 altère l’activité transcriptionnelle du
promoteur de sst2 en créant un site de fixation pour le facteur NF-IA1.1, un inhibiteur
transcriptionnel (Torrisani, Gastroenterology, 2001). Cependant ce polymorphisme ne permet
pas d’expliquer la perte d’expression de sst2 dans la majorité des cancers pancréatiques.
D’un autre côté, la perte de fonction du facteur de transcription smad4/DPC4 dans
50% des PDACs contribue, partiellement, à la perte d’expression de sst2. En effet la
correction du déficit en Smad4 dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines BxPC-3,
rétablit l’expression du récepteur sst2 ainsi que les effets anti-prolifératifs de la somatostatine
(Puente, J biol chem, 2001).
Enfin, des modifications épigénétiques semblent également impliquées dans la perte
de sst2 dans les PDACs. En effet une hyperméthylation au niveau de deux ilots CpG, associée
à une désacétylation des histones, a été observée au niveau de la région promotrice du gène
sst2 dans les lignées cancéreuses pancréatiques humaines BxPC-3, Panc-1 et Capan-1 et
entraîne une diminution significative de l’activité transcriptionnelle du gène dans ces cellules
(Torrisani, Endocrinology, 2008).
2. Rôle anti-oncogénique du récepteur sst2 dans le cancer du pancréas
Les travaux de l’équipe ont montré que la réexpression du récepteur sst2, dans des
cellules cancéreuses pancréatiques humaines BxPC-3 et Capan-1 et de hamster PC1.0 inhibe
la prolifération, la tumorigénicité et l’invasion in vitro, ainsi que la croissance tumorale et
métastatique in vivo, après xénogreffes sous-cutanées de cellules BxPC-3 et Capan-1 chez la
souris athymique ou allogreffes orthotopiques de cellules PC1.0 chez le hamster (Delesque,
Cancer res, 1997 ; Benali, PNAS, 2000).
Cet effet anti-tumoral est dû à la mise en place d’une boucle autocrine négative, c'està-dire que l’expression de sst2 dans les cellules cancéreuses pancréatiques induit la sécrétion
de somatostatine qui va agir par autocrinie et stimuler constitutivement le récepteur sst2
(Delesque, Cancer res, 1997). Cet effet s’accompagne également d’un effet « bystander »
local et à distance. En d’autres termes, en plus d’agir par autocrinie, la somatostatine va
159
également agir par paracrinie, sur les autres cellules tumorales malgré l’absence d’expression
du sst2 dans ces dernières (Rochaix, Hum gene ther, 1999 ; Benali, PNAS, 2000) ainsi que sur
les cellules du microenvironnement tumoral. Ces mécanismes seront plus amplement détaillés
dans le paragraphe suivant.
Ces résultats ont été confortés par le transfert, en intra-tumoral, de vecteurs codant
pour sst2, dans nos modèles animaux développés chez la souris athymique et le hamster. Un
effet anti-tumoral est, en effet, observé dès 6 jours post-transfert et s’accompagne d’une
baisse de la prolifération des cellules cancéreuses pancréatiques, une stimulation de
l’apoptose et une inhibition de l’angiogenèse tumorale (Vernejoul, Cancer res, 2002 ;
Carrere, Hum gene ther, 2005).
3. Mécanismes responsables des effets anti-oncogéniques de sst2 dans le cancer du pancréas
3.1
Induction de l’apoptose
Nous avons montré que le récepteur sst2 exerçait un effet pro-apoptotique, dépendant
de SHP-1, dans les cellules cancéreuses pancréatiques BxPC-3 et les sensibilisent à l’apoptose
induite par les ligands de mort TNFα (Tumor Necrosis Factor α) et TRAIL (TNF-Related –
Apoptosis-Inducing-Ligand). Ceci implique l’activation par sst2 des caspases 3 et 8, la
diminution de la protéine mitochondriale anti-apoptotique Bcl-2 et l’augmentation
d’expression des récepteurs du TNFα (TNFR1) et de TRAIL (DR4) (Guillermet, PNAS,
2003).
Un autre mécanisme impliqué dans les effets pro-apoptotiques du sst2 consiste en
l’inhibition de la voie PI3K. En effet, nous avons montré qu’à l’état basal, sst2 interagit
directement, via sa tyrosine 71 phosphorylée au sein du motif pY71XXM, avec la sous-unité
p85 de la PI3K. La stimulation de sst2 par la liaison de somatostatine, dissocie ce complexe et
entraîne l’inhibition de la PI3K et l’induction de l’apoptose (Bousquet, EMBO J, 2006). Une
étude récente, au sein de l’équipe, a, par ailleurs, montré que la dissociation du complexe
sst2/p85 fait intervenir la liaison directe de sst2 avec la Filamine-A, qui entre en compétition
avec la sous-unité p85 (Najib S, en préparation).
3.2
Inhibition de l’angiogenèse et de l’invasion tumorale
Plusieurs études ont montré que la réexpression du récepteur sst2 dabs les cellules
cancéreuses pancréatiques inhibe l’angiogenèse tumorale in vivo. Il a notamment été montré
que l’effet anti-angiogénique de sst2 implique une diminution de la production de VEGF, une
160
augmentation de l’expression de sst3 au niveau des vaisseaux péri-tumoraux et la diminution
d’expression de la métalloprotéinase MMP-2 (Kumar, World j gastroenterol, 2004 ; Carrere,
Hum gene ther, 2005).
Récemment, nous avons également montré que sst2 stimulait, via l’inhibition de la
voie PI3K, l’expression du facteur anti-angiogénique TSP-1 (Thrombospondine-1), dans les
cellules cancéreuses pancréatiques humaines BxPC-3, entraînant une séquestration du VEGF
et l’inhibition consécutive de l’activation du récepteur au VEGF (VEGFR2) au niveau des
cellules endothéliales (Laklai, PNAS, 2009). Une autre étude a également permis de
démontrer le rôle de l’inhibition de l’activation du TGFβ1 latent sécrété par les cellules
cancéreuses pancréatiques, dans l’effet anti-angiogénique du récepteur sst2. Cet effet
inhibiteur de sst2 dépend de l’inhibition de l’expression et de l’activation de MMP-9 (Laklai,
en préparation).
Enfin, nous avons également identifié certaines cibles potentiellement impliquées dans
l’effet anti-invasif du sst2. Des résultats non publiés de l’équipe ont, en effet, montré que la
réexpression du récepteur sst2 dans les cellules cancéreuses pancréatiques inhibait
l’expression et l’activité, non seulement de MMP-9, mais également de MMP-7 et stimulait
l’expression de leurs inhibiteurs TIMP-1 et 2 (Tissue inhibitors of metalloproteinases).
3.3
Régulation de la traduction protéique
Dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines, l’expression de sst2 stimule la
transcription et la déphosphorylation de l’inhibiteur de la traduction 4EBP-1 (eIF4E binding
protein), par un mécanisme dépendant de l’inhibition de la PI3K. Comme son nom l’indique,
4EBP-1, sous sa forme hypophosphorylée, lie et séquestre le facteur d’initiation de la
traduction CAP-dépendante eIF4E. Ce mécanisme d’inhibition de la traduction CAPdépendante, n’affecte pas la synthèse protéique globale, mais altère sélectivement la
traduction d’un nombre restreint d’ARNm, possédant une extrémité 5’UTR très structurée, et
de ce fait, très sensibles aux variations de l’activité de 4EBP-1 et codant pour des protéines
impliquées dans la prolifération cellulaire, par exemple (Azar, CMLS, 2008).
Parallèlement à cette inhibition de la traduction CAP-dépendante, sst2 stimule la
traduction IRES-dépendante (Internal Ribosomal Entry Site), de protéines cibles, impliquées
dans les effets anti-tumoraux du récepteur et notamment la TSP-1 et les Connexines 26 et 43
(Lahlou, Mol cell biol, 2005 ; Laklai, PNAS, 2009). L’induction des connexines 26 et 43 par
sst2, dans les cellules cancéreuses pancréatiques, permet le rétablissement des jonctions
intercellulaires de type GAP, impliquées dans les effets anti-prolifératifs du sst2 (Lahlou, Mol
161
cell biol, 2005). En outre, le rétablissement de ces jonctions permet à de petites molécules de
signalisation de diffuser vers les cellules adjacentes et peut ainsi intervenir dans l’effet
« bystander » local observé suite à l’expression du récepteur sst2 dans les cellules cancéreuses
pancréatiques.
4. Conclusion
L’ensemble des travaux de l’équipe ont permis de mettre en évidence le rôle antioncogénique du récepteur sst2 dans le cancer du pancréas in vitro et in vivo et d’identifier
certains des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet. La mise en place d’une boucle
autocrine négative due à la sécrétion de somatostatine, entraîne une activation constitutive du
récepteur sst2 qui exerce des effets pléiotropiques : anti-prolifératif, pro-apoptotique, antiinvasif et anti-angiogénique.
L’effet « bystander » obtenu in vivo après transfert du gène sst2 a été caractérisé et
plusieurs mécanismes sont impliqués dans ce phénomène. Le rétablissement des jonctions
GAP participe à la diffusion de signaux anti-tumoraux et pro-apoptotiques entre cellules. En
outre, la sécrétion de somatostatine par les cellules cancéreuses pancréatiques après
réexpression de sst2 va agir par autocrinie sur ces cellules ré-exprimant le sst2, mais aussi sur
celles n’exprimant pas le récepteur, en activant d’autres récepteurs, comme le sst3, dont
l’expression est up-régulée après transfert in vivo de sst2 (Rochaix, Hum, gene ther, 1999).
Enfin, la somatostatine va également agir par paracrinie, en inhibant la réponse stromale,
l’angiogenèse tumorale, ou encore en inhibant l’effet mitogène des facteurs de croissance.
L’effet des analogues de somatostatine sur les myofibroblastes pancréatiques à activité protumorale et l’identification des voies de signalisation impliquées, sont d’ailleurs actuellement
en cours d’étude au sein de l’équipe.
Cet effet « bystander » très puissant constitue un atout majeur. Dans ce contexte, le
transfert du gène sst2 apparaît donc comme une alternative novatrice pour inhiber la
progression tumorale et métastatique pancréatique. Les travaux précliniques effectués dans le
laboratoire ont ainsi permis de proposer un protocole de thérapie génique chez l’homme pour
le traitement du cancer du pancréas, basé sur le transfert du gène sst2 ainsi que du gène de
fusion dck-umk codant des enzymes facilitant l’action de la gemcitabine, seul traitement
actuel pour cette pathologie.
162
RESULTATS EXPERIMENTAUX
163
164
ARTICLE :
Hemidesmosomes reassembly blocks pancreatic cancer cell invasiveness
Séverine Laval1,2, Hanane Laklai1,2,#, Marjorie Fanjul1,2,#, Mélanie Pucelle1, Henrik Laurell1,2,
Audrey Billon-Galés1,2, Sophie Le Guellec3, Marie-Bernadette Delisle3, Christiane Susini1,2,
Stéphane Pyronnet1,2, Corinne Bousquet1,2,¶
165
INTRODUCTI ON DE L’ARTICLE
Le cancer du pancréas est un cancer de très mauvais pronostic, du fait de l’absence de
symptômes spécifiques et de marqueurs moléculaires précoces, d’une invasion locale et à
distance très rapide et d’un manque de traitement efficace. Les travaux de l’équipe ont
largement contribué à démontrer que le récepteur de somatostatine sst2 agissait comme un
suppresseur de tumeur pour le cancer du pancréas. En effet, son expression est perdue dans
90% des adénocarcinomes pancréatiques, et sa réexpression dans des cellules cancéreuses
pancréatiques humaines entraîne un effet anti-tumoral et anti-métastatique. De nombreux
mécanismes impliqués dans les effets anti-prolifératifs, anti-angiogéniques ou encore proapototiques du récepteurs ont été décrits ; cependant ses effets anti-invasifs restent peu
détaillés.
Parmi les nombreuses molécules impliquées dans l’invasion tumorale, nous nous
sommes intéressés aux intégrines, qui régulent les interactions dynamiques entre la MEC
(matrice extra-cellulaire) et les cellules, et plus particulièrement à l’intégrine α6β4. Cette
intégrine présente la particularité de se localiser au pôle basal des cellules épithéliales, au sein
de structures assurant un ancrage solide de l’épithélium sur la lame basale sous-jacente : les
hémidesmosomes. Au cours du processus tumoral, la perte des hémidesmosomes représente
un des mécanismes premiers impliqués dans l’invasion, et l’intégrine α6β4 est alors
délocalisée vers des structures de migration où elle va fortement promouvoir la migration, la
survie ou l’invasion. C’est le cas dans les cancers pancréatiques, où l’on observe une
surexpression et une altération de la localisation de l’intégrine α6β4. Malgré tout, le rôle de
l’intégrine α6β4 et le devenir des hémidesmosomes au cours de la cancérogenèse pancréatique
restent encore méconnus.
L’objectif de ce travail était donc :
v
d’analyser la nature des hémidesmosomes dans le pancréas et leur devenir au
cours de la cancérogenèse pancréatique,
v
d’identifier les effets du récepteur sst2 dans la dynamique d’assemblage et de
désassemblage des hémidesmosomes et de rechercher les mécanismes moléculaires sousjacents,
166
v
de déterminer l’implication des hémidesmosomes dans les effets anti-invasifs du
récepteur sst2, dans le cancer du pancréas.
Ces résultats font l’objet de l’article qui suit. En outre, dans une deuxième partie, j’ai
présenté des résultats complémentaires, qui ne sont pas inclus dans l’article, et relatifs à
l’étude des mécanismes responsables de la déphosphorylation sur tyrosine de la sous-unité β4
par le récepteur sst2.
167
Hemidesmosomes reassembly blocks pancreatic cancer cell invasiveness
Séverine Laval1,2, Hanane Laklai1,2,#, Marjorie Fanjul1,2,#, Mélanie Pucelle1, Henrik Laurell1,2,
Audrey Billon-Galés1,2, Sophie Le Guellec3, Marie-Bernadette Delisle3, Christiane Susini1,2,
Stéphane Pyronnet1,2, Corinne Bousquet1,2,¶
1
INSERM U858, Institut de Médecine Moléculaire (I2MR), Toulouse, France
2
Université Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, France
3
Services d’Anatomie et Cytologie Pathologique of Hôpital Rangueil, Toulouse, France.
¶
Contact: Corinne Bousquet, INSERM U858, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil,
CHU Rangueil, Bât L3, 1 avenue Jean Poulhès, BP84225, 31403 Toulouse, France, Tel : 335-61-32-24-07, Fax : 33-5-61-32-24-03, E-mail : [email protected].
Additional Footnotes: # Both authors equally contributed to this work (HL and MF).
Running title : Hemidesmosomes in pancreatic cancer
168
Summary
Hemidesmosomes anchor epithelial cells to the basement membrane and are frequently lost
in carcinoma of skin or oropharyngeal origin. We surprisingly report the presence of mature
type-1 hemidesmosome-like structures, comprising the integrin a6b4 and BP180, in a simple
epithelium of digestive origin, the pancreatic ducts of human samples. Importantly,
hemidesmosomes are here shown to disassemble during pancreatic carcinogenesis.
Underlying mechanisms involve the cleavage of BP180, which is PI3K- and MMP-9dependent, associated with the tyrosine-phosphorylation and delocalization of the integrin
a6b4 to the leading edges of migrating cells where it paradoxically promotes pro-invasive
signals through S100A4 activation. Inactivation of the PI3K-MMP-9 pathway blocks BP180
cleavage, assembles hemidesmosomes and inhibits pancreatic cancer cell invasion whereas
its specific reactivation rescues the invasive behavior through hemidesmosome breakdown.
Significance
Given the failure of conventional chemo- (i.e. gemcitabine) and bio-therapies (i.e. antiangiogenic), a major challenge in pancreatic cancer research is to identify critical events that
initiate invasion. One priming step requires epithelial cell detachment from the basement
membrane and disruption of the corresponding hemidesmosome anchoring structures, as
described in carcinoma of stratified epithelia. In this study, we describe for the first time the
presence of mature type-1 hemidesmosome-like structures, comprising the integrin a6b4 and
BP180, in pancreatic ducts of human samples, a simple digestive epithelium. We provide
molecular evidences that disruption of these adhesive structures and cleavage of BP180
promotes pancreatic cancer cell invasion. Conversely, forcing hemidesmosome reassembly
blocks pancreatic carcinogenesis, thereby unravelling a novel mechanism for promising
therapeutic targeting.
169
Highlights:
-
Mature hemidesmosomes exist in the simple pancreatic duct epithelium of human
origin;
-
Breakdown of hemidesmosomes during pancreatic carcinogenesis promotes
invasion;
-
Breakdown of hemidesmosomes is primed by PI3K-MMP-9-dependent cleavage of
BP180;
-
Forcing hemidesmosome reassembly by inhibiting PI3K blocks pancreatic cancer
invasion
170
Introduction
The ability of cancer cells to undergo migration and invasion is a prerequisite for lymphovascular and/or perineural dissemination and metastasis. To migrate and invade, the cell
body must modify its shape and stiffness to interact with the surrounding tissue structures.
Hereby, the extracellular matrix provides the substrate, as well as a barrier towards the
advancing cell body. Cell migration and invasion through tissues result from a continuous
cycle of interdependent steps. One critical step requires epithelial cell detachment from the
basement membrane (BM) and acquisition of a motile phenotype (Friedl and Wolf, ; Friedl
and Wolf, 2003).
Hemidesmosomes (HDs) are specialized multiprotein complexes that provide stable
adhesion of basal epithelial cells to the underlying BM. Mature type-1 HDs are composed of
the integrin a6b4, plectin, the bullous pemphigoid (BP) antigens 180 (also called BPAG2 or
type XVII collagen) and 230 (BPAG1), and tetraspanin CD151. Integrin a6b4 and BP180
bind with high and low affinity, respectively, to laminin-332 in the BM, and intracellular HD
stabilization occurs via their association with keratin intermediate filaments through the two
plakins, plectin and BP230, thus creating a stable anchoring complex (de Pereda et al.,
2009a; de Pereda et al., 2009b). These mature type-1 HD structures have been described in
(pseudo-) stratified and certain complex epithelia, but only in the simple epithelium of
mammary origin (Wilhelmsen et al., 2006; Bergstraesser et al., 1995). Indeed, simple
epithelium adhesiveness to the underlying BM is generally described to rather involve
immature type-2 HDs that contain only the integrin a6b4 and plectin (Fontao et al., 1999).
HDs are highly dynamic structures that can quickly disassemble under conditions in
which (partial) detachment from the BM is required, including during normal epithelial cell
division, differentiation, or migration. Furthermore, breakdown of HDs represents a critical
step toward invasion of cancer cells, not only because it facilitates cell de-adhesion, but also
because certain hemidesmosomal components, including the integrin a6b4, are hijacked
171
from their primary “cell-anchoring” function to facilitate cancer cell migration and invasion
(Margadant et al., 2008; Raymond et al., 2007).
The precise mechanisms that lead to HD disassembly in cancer cells remain obscure.
Whereas the expression of the hemidesmosomal integrin a6b4 is decreased at the basal
cell-substratum surface early during carcinogenesis (Allen et al., 1998; Yang et al., 2009), it
is overall overexpressed and delocalized to invasive fronts of the tumors (Margadant et al.,
2008). This misexpression and/or mislocalization has been described in many invasive and
metastatic carcinomas, including breast, colon, thyroid, gastric, bladder, SCC and pancreatic
tumors (Bon et al., 2009; Cruz-Monserrate et al., 2007; Wilhelmsen et al., 2006). The integrin
a6b4 delocalization is at least partially triggered by, and dependent on, growth factorstimulated phosphorylation of its b4 subunit, thereby facilitating its dissociation from plectin,
and from the BP antigens (BP180 and BP230) in type-1 HD-containing epithelia (Germain et
al., 2009; Margadant et al., 2008; Wilhelmsen et al., 2007). Under this phosphorylated form,
the integrin a6b4 is no longer concentrated at the basal surface but is translocated and
clustered to the leading edges of migrating cells where it promotes motility by reorganizing
cytoskeletal actin, as well as proliferation, survival and invasion in cancer cells by
cooperating with growth factor receptors (Streuli and Akhtar, 2009).
Whereas the dual role of the integrin a6b4 in promoting either the formation of stable
and rigid adhesive structures in normal epithelia or invasion in carcinoma is well established
(Raymond et al., 2007), the fate and function of BP180 in non-hemidesmosomal structures
during
epithelium
carcinogenesis
is
poorly
documented.
BP180
is
a
specific
hemidesmosomal component thought to be exclusively present in mature type-1 HDs of
(pseudo-) stratified epithelia. Studies in squamous cell carcinoma (SCC) of skin and
oropharyngeal origin have demonstrated BP180 mislocalization to the cancer cell cytoplasm
as well as sometimes to the adjacent tumor stroma (Parikka et al., 2003). Furthermore,
BP180 cleavage into a soluble BP120 form, released from SCC cells, has been reported to
172
promote cell migration (Parikka et al., 2003; Parikka et al., 2006). Nevertheless, the
promoting role of this cleavage for HD disruption during carcinogenesis is largely unknown.
Our data report for the first time the presence, in the simple exocrine pancreatic
ductal epithelium, of type-1 HDs containing BP180. Importantly, these structures are
disrupted during pancreatic carcinogenesis, associated with the cleavage of BP180 into
BP120 and integrin a6b4 delocalization to migration structures. To identify the underlying
molecular mechanisms for this HD breakdown, we characterized and used an elegant human
pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell model, where the assembly of mature type-1
HDs can be switched on / off by playing on the cleavage of BP180 into BP120 through the
phosphoinositide 3-kinase (PI3K) – matrix metalloprotease MMP-9 pathway.
173
Results
Hemidesmosomes are disassembled during pancreatic carcinogenesis, associated
with the cleavage of BP180
Whereas it has been recently described that the b4 subunit of the integrin a6b4 is
overexpressed in human PDAC (Cruz-Monserrate et al., 2007), its function in the normal
pancreas as an HD component remains to be investigated. We here describe that although
the pancreatic ducts are organized in a simple non-stratified epithelium, normal pancreatic
ducts of human samples (Fig. 1A: N, upper panel) as well as human pancreatic ductal HPDE
cells (Fig. 1A, lower panel) express the BP180 protein, in addition to the integrin a6b4.
Integrin a6b4 and BP180 are concentrated at cell–substrate contact sites, as demonstrated
in ducts of normal human pancreas (Fig. 1B: N, arrowheads), as well as in the normal human
pancreatic ductal HPDE cell line (Fig. 1C). The staining pattern in patch-like structures
observed in immunofluorescence is typical of HD-like structures (Fig. 1C). This is of critical
importance since mature HD-like structures comprising BP180 have not been described thus
far in simple epithelia except for the mammary epithelium (Bergstraesser et al., 1995). These
structures are commonly observed for example in cultured HaCaT keratinocytes, and
disassemble in cells treated with EGF where the integrin a6b4 is translocated to the leading
edges and BP180 diffuses to the cytoplasm (Fig. 1C).
Similar pattern of integrin a6b4 and BP180 delocalization is observed in human
PDAC samples (Fig. 1B: T, note the strong expression of both integrin a6b4 and BP180, and
their delocalization to the lateral sides of the cell membrane or to the cytoplasm (arrows),
respectively), as well as in the human pancreatic cancer BxPC-3, as compared to HPDE,
cells (Fig. 1C). Importantly, delocalization of the BP180 protein in human PDAC samples and
pancreatic cancer BxPC-3 cells is associated with the cleavage of this transmembrane
protein in a 120-KDa form (BP120) (Fig. 1A: T, upper panel, and BxPC-3, lower panel),
whereas the full-size BP180 form is expressed in the normal human pancreas and in HPDE
cells (Fig. 1A: N, upper panel, and HPDE, lower panel), as demonstrated by western-blot.
174
175
These results indicate that disassembly of HD-like structures correlates with pancreatic
carcinogenesis, suggesting a putative role in PDAC invasiveness. Cleavage of BP180 might
be one original mechanism driving this HD disruption in PDAC.
Activation of the somatostatin sst2 receptor: an original pharmacological way to
reassemble HDs in human pancreatic cancer cells as well as in proliferating
keratinocytes
Surprisingly, when exploring comparatively the presence of HD-like structures in BxPC-3
cells transfected with the somatostatin sst2 oncosuppressor receptor (BxPC-3/sst2 cells),
which present a reduced tumorigenicity and a more differentiated phenotype as compared to
their parental mock-transfected BxPC-3 cells (Bousquet et al., 2006), HD-like structures
comprising the integrin a6b4, plectin as well as BP180, are rescued in sst2-expressing
cancer cells (Fig. 2A, arrowheads).
To study the role and mechanisms of disassembling HDs during pancreatic
carcinogenesis, we therefore used this BxPC-3/sst2 cell model as an interesting tool to
switch on the assembly of HD-like structures in human pancreatic cancer cells, and
characterized further this model. Consistently, as shown by immunofluorescence, whereas
the integrin a6b4 colocalizes in lamellipodia of BxPC-3 cells with the focal complexassociated protein paxillin, it is present in HD-like structures colocalized with BP180 in BxPC3/sst2 cells (Fig. 2B). Activation of the sst2 receptor relies on an autocrine loop whereby
transfection of the sst2 receptor in BxPC-3 cells, which do not express endogenously this
receptor, induces the expression and secretion of the sst2 ligand somatostatin, which in turn
continuously activates its receptor (Bousquet et al., 2006). Interestingly, knocking-down
somatostatin expression using a specific siRNA (siSomato), which blunts this autocrine loop
(Laklai et al., 2009), abrogates HD assembly in BxPC-3/sst2 cells, and induces integrin a6b4
delocalization to the leading edges of the cells, as visualized by immunofluorescence using
an anti-b4 antibody (Fig. 2C, compare left and middle panels). Inversely, rescuing
176
177
somatostatin expression by challenging BxPC-3/sst2 cells (previously transfected with
siSomato) with 10-9 M of a specific sst2 agonist, BIM23197, restores HD-like structures,
indicating that the assembly of HDs in these cells depends on the autocrine somatostatinsst2 loop (Fig. 2C, compare middle and right panels).
Importantly, to investigate for the presence of HDs in vivo, transmission electron
microscopy has been performed on tumors resulting from the subcutaneous xenograft of
BxPC-3 or BxPC-3/sst2 cells. It reveals the presence of mature type-1 HDs in low-growing
sst2-expressing tumor xenografts, but not in fast-growing mock BxPC-3 tumors (Fig. 2D)
(Bousquet et al., 2006). These structures are defined as membrane-associated plaques
appearing as triangular focal densities on the basal plasma membrane. They are
characterized by the presence of a sub-basal dense plate, which associates extracellularly
with anchoring filaments, extending through the lamina lucida (LL) into the lamina densa
(LD), and intracellularly with intermediate filaments (IF) through visible inner and outer
plaques. Immediately beneath the epithelium, anchoring fibrils extend from the LD to
subjacent amorphous deposits of type IV and VII collagen known as anchoring plaques,
securing the LD to the underlying connective tissue matrix.
Scanning electron microscopy reveals the presence of membrane protrusions, also
called dorsal ruffles, rippling on the surface of the BxPC-3 cell membrane and giving rise to
extended cellular processes including filopodia and lamellipodia (Fig. 3A, top and middle left
panels). These images are indicative of an active migratory activity, as confirmed by the
distribution of F-actin, visualized by phalloidin and displaying a cortical pattern of expression
at the lamellipodia spreading at the front edges (Fig. 3A, lower left panel, arrows).
Furthermore, actin-rich retraction fibers radiating from the rear edge of a migrating BxPC-3
cell are visible (arrowhead). Conversely, in BxPC-3/sst2 cells, F-actin organizes into a
polygonal actin network characteristic of non-motile cells. Consistently, migratory and
invasive properties of BxPC-3/sst2 cells are drastically reduced as compared to BxPC-3
cells, as demonstrated in vitro (by 59.6 ± 0.9 % and by 95.2 ± 1.1 %, respectively) (Fig. 3B),
and in vivo using the chick chorioallantoic membrane model (CAM) where BxPC-3/sst2 cell
178
179
tumor growth is significantly reduced (6.6 ± 1.9 mm3 in BxPC-3/sst2 vs. 30.1 ± 8.3 mm3 in
BxPC-3) (Fig. 3C). Interestingly, the BxPC-3 cell tumor xenografts display invasive fronts of
migrating cells into the CAM whereas tumors expressing the sst2 receptor remain small and
localized (Fig. 3D).
To investigate whether the decreased migratory and invasive activity of BxPC-3/sst2
relies on sst2-induced assembly of HDs, we forced disassembly of HDs in these cells by
transfecting a specific siRNA targeting BP180 (siBP180). BP180 protein expression (Fig.
4B), as well as HD assembly as visualized by immunofluorescence using an anti-b4 antibody
(Fig. 4A), are abrogated in siBP180-transfected BxPC-3/sst2 cells, although small
reminiscent HD plaques persist in the cell periphery. Cell migration is enhanced by 199.4 ±
36.1 % in siBP180 vs. siCTR-transfected control cells (non-targeting siRNA) (Fig. 4C).
Importantly, CAM xenografts of BxPC-3/sst2 cells transfected with the siBP180 invade more
efficiently the CAM as compared to control xenografts, displaying larger volume (28.9 ± 9.1
mm3 vs. 2.8 ± 1.9 mm3, respectively) (Fig. 4D) and deeper penetration into the CAM (Fig.
4E). These results indicate that restoration of mature type-1 HD assembly in pancreatic
cancer cells reduces their migratory and invasive potential, whereas forcing the disassembly
of HDs enhances this potential.
To potentially confirm and extend to another cell model the role of HD assembly in
cell migration, the HaCaT keratinocytes, which are widely used to study the dynamic of
assembly of HDs, are challenged to EGF and somatostatin analog treatments. These cells
express, at a comparable level as the control melanoma IC8 cells, the somatostatin sst2
receptor (Fig. S1A) which is functional because transducing the dose-dependent inhibitory
growth signal of the somatostatin analog RC-160 (87 ± 12 % of decrease at 10-7 M) on EGFtreated HaCaT cells (EGF induces HaCaT proliferation by 1.4 ± 0.03 -fold) (Fig. S1B). EGF is
known to disassemble HDs in keratinocytes, as visualized here by immunofluorescence
revealing the delocalization of both the integrin a6b4 to migrating structures and of BP180 to
the cytoplasm (Fig. S1C). Conversely, cell co-treatment with the somatostatin analogs RC160 or BIM23197 reverses these EGF-induced delocalizations, thereby forcing the assembly
180
181
of HDs, as visualized by the presence of these patch- or cauliflower-like structures (Fig.
S1C). Scanning electron microscopy reveals a migratory phenotype of EGF-treated HaCaT
cells displaying membrane protrusions extending into filopodia and lamellipodia, whereas
untreated or EGF + RC-160 co-treated cells flatten onto the dish, displaying extensive cellcell contacts (Fig. S2A). Consistently, in conditions where EGF does not stimulate
proliferation (kinetic of treatment inferior than the HaCaT cell doubling-time), EGF enhances
migration of HaCaT cells by 6.5-fold ± 2.1, whereas the somatostatin analogs RC-160 or
BIM23197 significantly decrease EGF pro-migratory action by 55.5 % ± 7.3 or 56.6 % ± 8.5,
respectively (Fig. S2B). Consistently, the b4 subunit is phosphorylated on tyrosine upon EGF
treatment, whereas RC-160 treatment significantly decreases this phosphorylation (Fig.
S2C). Knocking-down BP180 expression using the siBP180 (Fig. S3A) abrogates HD
assembly in HaCaT cells, as visualized by immunofluorescence using an anti-b4 antibody
(Fig. S3B). As a consequence, neither basal nor EGF-induced cell migration is enhanced in
siBP180- vs. siCTR- transfected cells but, importantly, the inhibitory action of the
somatostatin analogs is abrogated (Fig. S3C). These results demonstrate that the peptide
hormone somatostatin is able to induce, in several cell systems representative of different
physiopathological conditions such as would healing or cancer, the assembly of HDs, which
accounts for its inhibitory action on migration and invasion.
Molecular mechanisms underlying HDs disassembly in human PDAC
Our results indicate that BP180 is cleaved into a BP120 form in both human tumor PDAC cell
extracts and in the human pancreatic cancer BxPC-3 cells, whereas the full-size BP180
protein is exclusively expressed in human normal pancreatic cell extracts as well as in the
human normal pancreatic ductal HPDE cells (Fig. 1A). Surprisingly, switching on HDs
assembly by expressing the sst2 receptor in BxPC-3 cells potently increases the expression
of BP180 while reducing its cleavage into its BP120 form (Fig. 5A). This is associated with
the increased expression of the other hemidesmosomal component BP230 (Fig. 5A), as well
as of the cytokeratins 5 and 14 (Figs. S4A and S4C), which is consistent with a marked
182
183
densification of the network of cytokeratins in BxPC-3/sst2, as compared to BxPC-3, cells, as
revealed by transmission electron microscopy (Fig. S4C). Interestingly, a decreased
expression of the three chains (a3, b3 and g2) of the BM substrate laminin-332 (Fig. S4B) is
also observed in BxPC-3/sst2, as compared to BxPC-3, cells.
Molecular mechanisms underlying the upregulation by sst2 of the expression of the
hemidesmosomal BP180 and BP230 protein expression were investigated. An increased
expression of BP230, but not of BP180, mRNA is observed in BxPC-3/sst2 cells (by 1.62 ±
0.12 -fold), as compared to mock cells (Fig. 5B). A post-transcriptional mechanism rather
explains sst2-dependent induction of BP180 protein expression. This mechanism is here
shown to rely on the inhibition of the phosphoinositide (PI3K) activity by sst2, as
demonstrated using the BxPC-3 cells that express a mutant sst2 protein (Y71F), which is no
longer able to inhibit PI3K (Bousquet et al., 2006). This sst2 mutant restores the cleavage of
BP180 into its BP120 form, similar to the one observed in the BxPC-3 cells (Fig. 5A), which
is correlated with the breakdown of HDs in these BxPC-3/sst2Y71F cells, as visualized by
immunofluorescence using an anti-b4 antibody (Fig. 5C). Conversely, sst2 inhibitory role on
PI3K does not account for BP230 mRNA upregulation, as levels of BP230 mRNA and protein
are comparable in sst2- and sst2Y71F-expressing BxPC-3 cells (Fig. 5A and 5B).
BP180 cleavage into the BP120 form has been described to occur extracellularly,
releasing the BP120 protein in the extracellular matrix. When comparing BxPC-3/sst2 vs.
BxPC-3 cells (Fig. 6A), or when challenging BxPC-3 cells with the PI3K inhibitor LY294002
(Fig. 6B), BP180 expression is increased in cell extracts while expression of the cleavage
product BP120 is decreased in cell-conditioned media (CM), suggesting that PI3K inhibition
reverses BP180 cleavage. Because we demonstrate that sst2 decreases the expression of
the matrix metalloprotease MMP-9 (Fig. 6A), which is well expressed and positively regulated
by the PI3K pathway in BxPC-3 cells (treatment with LY294002 decreases its expression)
(Fig. 6B), we hypothesize that MMP-9 is able to cleave BP180 on its extracellular domain.
Consistently, down-regulating MMP-9 expression using a RNA interference approach
(siMMP-9) in BxPC-3 cells decreases BP180 cleavage, as shown by the increased
184
185
expression of BP180 in cell extracts and decreased expression of BP120 in CM (Fig. 6C).
Conversely, challenging BxPC-3/sst2 cells with a recombinant active MMP-9 (rMMP-9)
increases BP120 cleavage, as shown by the increased expression of BP120 in the CM (Fig.
6D). Importantly, whereas inhibiting MMP-9-dependent BP180 cleavage in BxPC-3 cells
(using the siMMP-9) is not sufficient to restore HD assembly (Fig. 6E), as visualized by
immunofluorescence using an anti-b4 antibody, inducing BP180 cleavage by challenging
BxPC-3/sst2 cells with the rMMP-9 is sufficient to prime HD disassembly in these cells (Fig.
6F). The role of MMP-9 in the cleavage of BP180 into BP120 is here confirmed in the SCC
HSC-3 cells (Fig. S5), which have elsewhere been shown to express a cleaved BP120 form
(Parikka et al., 2003). When transfected with the siMMP-9, these cells also display an
increased expression of BP180 in cell extracts while BP120 expression is decreased in the
CM (Fig. S5).
Switching on HD assembly by expressing sst2 in PDAC reverses cell invasiveness by
impacting of the integrin a6b4 pro-invasive signaling pathway
When delocalized at the invasive fronts, the b4 subunit of the integrin a6b4 is phosphorylated
on tyrosine residues, thereby initiating survival and invasive signaling pathways (Dutta and
Shaw, 2008). Forcing HD assembly in BxPC-3/sst2 cells not only relocalizes integrin a6b4 to
HD structures but also induces its dephosphorylation on tyrosine (Fig. 7A). This
dephosphorylation is associated with the drastic decreased expression of the integrin a6b4
target S100A4, which has pro-invasive functions (Fig. 7B) (Chen et al., 2009; Kim et al.,
2009). Interestingly, sst2-dependent inhibition of S100A4 expression is transcriptional (Fig.
7C) and depends on the inhibition of the PI3K pathway by sst2, as S100A4 expression is
rescued in BxPC-3 expressing the mutant sst2Y71F receptor (Fig. 7D). Consistently, inhibiting
PI3K (LY294002) in BxPC-3 cells also abrogates S100A4 expression (Fig. 7E). Furthermore,
transfecting S100A4 in BxPC-3/sst2 cells reversed sst2 inhibitory action of in vitro cell
invasion (Fig. 7F).
186
187
Discussion
Our data describe, for the first time, type-1 HDs containing BP180 in the simple exocrine
pancreatic ductal epithelium. Importantly, we reveal that BP180 is cleaved into a BP120
form, specifically during pancreatic carcinogenesis. This cleavage represents one of the
priming events that disassembles HDs, subsequently promoting invasion. Remarkably, the
use of our original pancreatic cancer cell model, where the reassembly of HDs is induced by
expressing the oncosuppressor sst2 somatostatin receptor, facilitates the study of the
dynamic of these structures.
Phosphorylation on serine and/or tyrosine of the b4 subunit by diverse growth factor
signalings, that are potently activated in carcinoma, is recognized to drive HD disassembly
(Margadant et al., 2008). Our data demonstrate that inducing the cleavage of BP180 by
challenging sst2-expressing cells, that present mature type-1 HDs, with the recombinant
MMP-9, is sufficient to prime HD disruption. MMP-9 is a critical protease, triggering the
angiogenic switch and promoting pancreatic tumor progression (Bergers et al., 2000;
Nakamura et al., 2007). Conversely, inhibiting MMP-9 expression in pancreatic cancer cells
that are devoid of HD is able to reduce BP180 cleavage into BP120 (also confirmed in a
tongue SCC cell line), but however, is not sufficient to induce HD reassembly, suggesting
that additional mechanisms are required. Interestingly, expressing sst2 in PDAC cells
upregulates the expression of other hemidesmosomal proteins than BP180, including BP230
and the cytokeratins 5 and 14, as well as induces the dephosphorylation on tyrosine of the
b4 subunit. We therefore suggest that these events, in addition to inhibition of BP180
cleavage, are required for reassembling HDs. Other proteases than MMP-9, that are
activated during pancreatic carcinogenesis, may participate in this cleavage since inhibition
of MMP-9 only partially rescued BP180 expression in pancreatic cancer cells. However
mechanisms underlying BP180 cleavage in carcinoma have not been documented yet.
Whereas a neutrophil-derived MMP-9 has been shown to be involved in this cleavage during
the autoimmune bullous pemphigoid skin blistering disease (Liu et al., 1998; Shimanovich et
188
189
al., 2004), it can be induced by ADAMs in normal primary keratinocytes (Franzke et al.,
2009). Proteolytic cleavage of BP180 occurs within the extracellular non-collagenous (NC)
16A domain, adjacent to the cell membrane (Hirako et al., 2003). It results in HD
disassembly by destabilizing the BP180 interactions in the cytoplasm with the integrin b4
subunit and BP230, and extracellularly with the integrin a6 subunit (Hirako et al., 2003).
Abrogating BP180 expression by RNA interference in sst2-expressing BxPC-3 cells results in
disassembly of HDs, and promotes pancreatic cancer cell migration and invasion. We
however do not exclude that immature type-2 HDs (integrin a6b4 + plectin), that are not
incompatible with cell migration (Germain et al., 2009), persist in these cells since small HD
plaques are still present at the cell periphery (Fig. 4A). Notably, this result demonstrates that
disrupting the adhesive type-1 HD structures in the pancreas is sufficient for the cells to
acquire an invasive phenotype. This was demonstrated in vivo in our highly reproducible
model of early invasion of PDAC cells on the CAM, that we have recently developed and
characterized (Dumartin et al., 2010). Following their grafting on the intact CAM epithelial
surface, BxPC3 cells adopt an invasive behavior and infiltrate the adjacent connective tissue
to form tumors. Importantly, switching on or off the assembly of HDs in these cells, by
expressing sst2 or abrogating BP180 expression in sst2-expressing cells, inhibits or rescues
this invasive phenotype, respectively.
We have introduced several years ago that sst2 expression is lost during pancreatic
carcinogenesis. When reexpressed in pancreatic cancer cells, this receptor has
oncosuppressive activity for PDAC, acting via the autocrine sst2-somatostatin loop on both
cancer cells and their microenvironment to inhibit tumor growth and angiogenesis (Bousquet
et al., 2006; Guillermet et al., 2003; Laklai et al., 2009). Unravelling that sst2 acts as well at
the cell / ECM interface to inhibit migration and invasion, by promoting the reassembly of
HDs in PDAC cells, is original because it is the first demonstration of an inducible peptide /
receptor system able to regulate positively the dynamic of assembly of these structures. It
also suggests that sst2 loss of expression in PDAC is at least partly responsible for the
190
breakdown of HDs. Interestingly, somatostatin-activated sst2 is here shown to also induce
the reassembly of HDs (or to inhibit EGF-induced HD breakdown) in the migrating
immortalized HaCaT keratinocytes challenged with EGF, suggesting an interesting
pharmacological role of somatostatin in wound healing processes. However, the underlying
molecular mechanisms may differ in these two models. In BxPC-3 cells, inhibition of the PI3K
pathway, which results in decreased MMP-9 expression and in a subsequent reduction of
BP180 cleavage, represents a critical, although not sufficient, event for somatostatinactivated sst2 to drive reassembly of HDs. Indeed, BP180 is an essential component of sst2induced HDs, as demonstrated in BxPC-3/sst2 cells where abrogation of BP180 expression
(RNA interference) induces the disassembly of HDs. In addition, sst2 is not able anymore to
force the assembly of HDs in BxPC-3 cells when it can not transduce the inhibition of the
PI3K pathway (in BxPC-3/sst2Y71F cells). Sst2 is also recognized to inhibit growth factorinduced signaling by activating various tyrosine as well as serine / threonine phosphatases
(Pyronnet et al., 2008). Consistently, we here describe the tyrosine-dephosphorylation,
induced by sst2, of the b4 subunit, which may transduce sst2 inhibitory action on invasion by
transcriptionally repressing the expression of the pro-invasive protein S100A4. This
dephosphorylation also probably represents, in addition to inhibition of the PI3K-MMP-9dependent cleavage of BP180, an essential event authorizing the reassembly of HDs at the
basement membrane of these cancer cells. In keratinocytes, because sst2 drives the
reassembly of HDs in EGF-treated cells within 10-20 min, post-translational events are rather
suspected to be involved. Dephosphorylation of EGF-induced tyrosine phosphorylation of b4
by sst2 also occurs within this time frame in keratinocytes, suggesting that it may play a
critical role. Whereas inhibition of tyrosine phosphatases using orthovanadate is able to
disrupt HDs by inducing the phosphorylation on tyrosine of b4 (Dans et al., 2001), the
opposite has not been demonstrated. Exploring whether the dephosphorylation of b4 on
tyrosine is sufficient to induce the reassembly of HDs in migrating keratinocytes, and
identifying on which residue(s), is a question that could be investigated in the future using our
191
original sst2-somatostatin inducible model. Nevertheless, the b4 subunit contains about 15
serine and tyrosine phosphorylation sites, but no individual phosphorylation site has been
shown by itself to be able to achieve the complete disassembly of HD, and each seems to
need the cooperation of additional sites to produce the effect. We therefore do not exclude
that sst2 also dephosphorylates serine, in addition to tyrosine, residues, critical for HD
assembly (Germain et al., 2009; Wilhelmsen et al., 2007).
PDAC is a particularly challenging malignancy, given its usually advanced stage at
diagnosis and its rather limited treatment options. This cancer’s lethal nature indeed stems
from its propensity to rapidly disseminate to the lymphatic system and distant organs. Even
the smallest primary lesions commonly exhibit perineural and lympho-vascular invasion. A
better understanding of the molecular pathways involved in early PDAC invasion is clearly
warranted with the goal of optimising treatment outcomes (Stathis and Moore, 2010).
Interestingly, the integrin a6b4 is dramatically overexpressed during PDAC progression
(Gleason et al., 2005; Logsdon et al., 2003). Whereas it is expressed only at the basal
surface of ductal cells in normal pancreas and chronic pancreatitis, it displays altered
localization to the lateral sides of the cell membrane, at the earliest stages of carcinogenesis,
thus representing an early event in PDAC progression (Cruz-Monserrate et al., 2007). Such
delocalization of the integrin a6b4 at the invasive fronts was shown to support migration and
local neural invasion through its interaction with ligands (Kariya et al., 2009; Marinkovich,
2007; Tsuruta et al., 2008), such as periostin and the g2 chain of laminin-332 respectively,
that are specifically secreted by pancreatic cancer cells in the peritumoral stroma (Baril et al.,
2007; Katayama et al., 2003; Mitsunaga et al., 2009). Consistently, this pattern of expression
is especially noted in pancreatic cancer that had invaded into the peripheral nerves or lymph
nodes. Our data also describe the secretion of the three chains of laminin-332 by BxPC-3
cells, which is dramatically reduced when expressing the sst2 receptor, further explaining
how integrin a6b4-mediated migration and invasion is inhibited in these cells (Kariya et al.,
2009). Interestingly, cleavage of BP180 extracellular domain releases the BP120 fragment
192
from the cell surface. This soluble fragment has been shown by itself to promote SCC cancer
cell migration specifically via the integrins a5b1, avb3 and aIIbb3 (Parikka et al., 2006), and
to be distributed in tumor invasive fronts or adjacent stroma (Parikka et al., 2003; Stelkovics
et al., 2008), or in normal epithelial tissue areas presenting high mitotic activities (Hirako et
al., 2003). Interestingly, our results also indicate the presence of a strong anti-BP180
immunoreactivity in pancreatic cancer cells as well as in surrounding stroma (not shown).
Whether this immunoreactivity corresponds to the soluble BP120 form released from cancer
cells is a question which will have to be addressed using a dedicated antibody (Hirako et al.,
1998) because commercial antibodies can not discriminate between the BP180 and BP120
forms. It could however suggest an alternate role of BP180 or of its cleaved BP120 fragment
as factor(s) promoting invasion and metastasis.
In summary, we provide molecular explanations for early invasive behavior of
pancreatic cancer cells involving the breakdown of type-1 HDs, adhesive structures that are
here shown to be present in the normal human pancreatic ducts (Fig. 8). High PI3K activity in
pancreatic cancer cells activates MMP-9 which cleaves BP180, thereby unravelling an
original mechanism for disrupting HDs. As consequences, migration and invasion are
promoted at least through integrin a6b4 delocalization to migratory structures where it is
phosphorylated on tyrosines and stimulates expression of the pro-invasive S100A4 protein.
Importantly, reexpressing sst2 in pancreatic cancer cells blocks PI3K activity and
subsequently inhibits MMP-9 expression, thereby reversing BP180 cleavage, restoring HD
assembly and relocalizing integrin a6b4 to HD at the cell basal membrane under a tyrosinedephosphorylated form. As consequences, pancreatic cancer cell migration and invasion are
repressed. Sst2-expressing cells served here as unprecedented tools to identify molecular
mechanisms required for restoring HD assembly in pancreatic cancer cells, and which could
be targeted for early anti-invasive therapeutic strategies.
193
Experimental Procedures
Pancreatic ductal adenocarcinoma samples
For BP180 immunoblotting, normal pancreatic and PDAC protein extracts were purchased
from BioChain (CliniSciences s.a., France). For BP180 and b4 immunohistochemistry,
human normal pancreas and PDAC samples were obtained from the Pathology Department
of the Rangueil Hospital, Toulouse, France. This study was approved by the ethic committee
of the institution.
Cells and reagents
Human pancreatic cancer BxPC-3 cells were maintained in DMEM (1g/L glucose, LONZA)
with 7,5% FCS at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. BxPC-3 cells have
previously been stably transfected with the human wild-type or mutated Y71F sst2 cDNA, or
with mock vector, selected using 400 µg/ml of geneticin and characterized (Bousquet et al,
2006). Human spontaneously immortalized HaCaT keratinocytes were cultured in DMEM
(1g/L glucose) with 10% FCS. Tongue squamous carcinoma HSC-3 cells were cultured in
DMEM:F12 with 10% FCS. The HPDE cell line (HPV-16E6E7-immortalized normal human
pancreatic ductal epithelial cells, a generous gift from Dr. Tsao, University of Toronto,
Canada) was cultured in keratinocyte-SFM supplied with 5 ng/mL epidermal growth factor
(EGF) and 50 g/mL bovine pituitary extract (Invitrogen). To stimulate hemidesmosomes
formation, HPDE cells were grown to 80% of confluency and then cultured for 24h in calcium
rich medium (HAM-F12/DMEM 1:3, 10% FCS). All media were supplemented with
amphotericin B, and antibiotics (LONZA).
Recombinant MMP-9 and the PI3K inhibitor LY294002 were purchased from
Calbiochem. EGF was purchased from R&D Systems. Somatostatin analogue RC-160 was
purchased from American Peptide and BIM23197 was a generous gift from Dr. Culler
(IPSEN). Normal and tumoral pancreatic extracts (n=3) were purchased from BioChain.
194
Immunohistochemistry
For IHC, paraffin-embedded normal and tumoral pancreas sections were deparaffinized in
xylene and rehydrated in ethanol. Sections were then incubated with citrate buffer (0,1mol/L
pH 6,0) and heated in a microwave for 3 x 5 min. Non-specific binding sites were blocked
(protein block, DAKO) and the specimens were incubated overnight at 4°C with anti-BP180
(Abcam, Ab28440) or anti-β4 (Santa Cruz, SC-9090) antibodies at dilution of 1/100 in an
antibody-diluent reagent (DAKO). Endogenous peroxidase was inactivated with 10%
methanol and 3% H2O2 in PBS. Sections were then incubated with peroxidase-conjugated
secondary antibodies (DAKO). AEC was applied as a chromogen (AEC high sensitivity
substrate chromogen, DAKO). Sections were finally counterstained with Mayer hemalun and
observed under a light microscope (Nikon E400).
Immunofluorescence
Cells were fixed with 4 % paraformaldehyde for 20 min at 4°C and permeabilized with 0,3 %
Triton X-100, 5 min at room temperature. For cytokeratin staining, cells were fixed and
permeabilized with 95 % methanol and 5 % acetic acid, 10 min at -20°C. Non-specific
binding sites were blocked for 1 h with 0,1 % BSA/PBS and selected proteins were assessed
using the following antibodies and dilutions, for 2 h at room temperature : mouse anti-β4,
1/100 (Chemicon, MAB2058) ; rat anti-α6, 1/50 (Chemicon, MAB 1378) ; mouse anti-CK14,
1/100 (Chemicon, MAB3232) ; mouse anti-panCK, 1/100 (Chemicon, MAB1636) rabbit antipaxillin 1/200 (Santa Cruz, sc-5574) ; mouse anti-BP180, 1/100 ; mouse anti-BP-230, 1/100
and mouse anti-plectin, 1/100 (from Dr. Owaribe, Nagoya University, Japan). After 3 PBS
washes, samples were incubated for 1 h at room temperature with the following fluorescent
secondary antibodies: anti-mouse-alexa488, anti-rabbit-alexa647 and anti-rat-alexa647
(1/1000, molecular probes). For actin staining, samples were incubated for 1 h with TRITCphalloïdin (1/1000, SIGMA). Finally, coverlips were washed 3 times in PBS and mounted in a
fluorescent-mounting medium (DAKO). Cells were visualized using a Zeiss LSM510 laser
scanning confocal microscope (obj: 63x /1,4 oil ; Carl Zeiss Inc, Germany). All laser
195
intensities used to detect the same immunostained markers from different cell treatments
were identical. For immunodetection of hemidesmosmal components, images were obtained
from horizontal sections (x-y plane) taken at the basal side of the cells. Images are
representative of at least 5 different fields in at least 3 independent experiments.
CAM assay
Fertilized chicken eggs (Morizeau, France) were incubated at 37°C and 80 % humidified
atmosphere. On day 4 of development, a window was cut out in the egg shell. On day 10,
3.106 cells resuspended in 50 µL PBS were deposited onto the CAM. On day 17, tumor
volumes were estimated by the equation V = 4/3 r3, with r =1/2 √(d1xd2). Tumors were then
embedded in OCT compound (Tissue-Tek, Euromedex) and 10 µm cryosections were
stained with hematoxylin and eosin. Pictures of CAM were taken under a stereomicroscope
(Nikon SMZ800) using a digital camera (Nikon Coolpix 950).
Transmission electron microscopy (TEM)
Sample was fixed with 2 % glutaraldehyde in Sorensen buffer ( 0.1 M, pH = 7.4) for 1 h,
washed with the Sorensen phosphate buffer (0.1 M) for 12 h. Then, they were post-fixed with
1 % OsO4 in Sorensen buffer (Sorensen phosphate 0.05 M, glucose 0.25 M, OsO4 1 %) for
1 h.
Samples were dehydrated in an ascending ethanol series until ethanol 100° and then
with propylene oxyde. Sample was embedded in epoxy resin (Epon 812). After 24h of
polymerization at 60°C, ultrathin sections (70 nm) were mounted on 100 mesh collodioncoated copper grids and post-stained with 3 % uranyl acetate in 50 % ethanol and with 8.5 %
lead citrate before being examined on a HU12A Hitachi electron microscope at an
accelerating voltage 75 KV.
Scanning electron microscopy (SEM)
Samples were fixed with 2 % glutaraldehyde in Sorensen buffer (0.1 M, pH = 7.4) for 1 h,
washed with the Sorensen phosphate buffer (0.1 M) for 12 h. After dehydration and critical
196
point drying, samples were mounted on microscope stubs, followed by gold sputtering.
Specimens were examined on a S450 Hitachi scanning electron microscope at an
accelerating voltage 15 KV.
Statistical analysis
Statistical analyses were performed by unpaired t test. All values are mean ± SEM.
Additional experimental procedures are available in the Supplemental Information.
197
Acknowledgments
This work was supported by ARC (grant n°5000, Association pour la Recherche Contre le
Cancer), LNCC (Ligue Nationale Contre le Cancer RAB09006BBA), the Canceropole Grand
Sud-Ouest (RMA04002BPA), the ANR (Agence Nationale pour la Recherche, project
n°R06423BS), and the University Paul Sabatier of Toulouse (CR27 A01BQR-2007). S.L. is
recipient of a fellowship from LNCC (2006-2009). H.L. is recipient of a fellowship from
INSERM-Région Midi-Pyrénées. M.P. was contracted by the RTRS-RITC (Toulouse).
198
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201
SUPPLEMENTAL INFORMATIONS
Supplemental Experimental Procedures
In vitro migration and invasion assays:
Migration assays were performed using 12-well plates transwell inserts, 8 µm pore size (BD
falcon). Cells were seeded on the upper chamber at 200000 cells/mL and allowed to adhere
for 4 h before over night deprivation. Chemoattractant was added (10 % serum for BxPC-3
cells and 10 nM EGF for HaCaT cells) to the lower chamber. BxPC-3 cells were allowed to
migrate for 20 h and HaCaT for 8 h at 37°C and 5% CO 2.
For in vitro invasion assays, 6-well plates transwell inserts, 8µm pore-size (BD falcon) were
coated with Matrigel (BD Falcon), for 2h at 37°C and 5 % CO 2. Cells were then seeded on
Matrigel coated inserts at a concentration of 100000 cells/mL in 5 % FCS DMEM, whereas
10% FCS DMEM was added to the lower chamber and allowed to migrate through the
Matrigel for 72 h at 37°C and 5 % CO 2.
For both assays, at the end of incubation, cells that had not migrated from the upper surface
of the membrane were removed using cotton swabs and the remaining cells on the lower
side of the membrane were fixed with 4 % paraformaldehyde, washed with PBS, and stained
with a 0.2 % solution of crystal violet in 20 % methanol. Cells were examined under 4× phase
contrast field microscopy and photographed. Migration was analyzed by quantification of
membrane surface area covered by cells (Morpho Expert software, Explora Nova). The cells
that moved in serum-free (i.e. no chemoattractant) controls was considered background and
was subtracted from the samples containing chemoattractant.
Protein extractions and Western Blots
Hemidesmosomal components expression: proteins were extracted with a buffer containing
0.4 % SDS, 10 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 and supplemented with 2 mM
orthovanadate and a protease inhibitor cocktail (Roche) for 20 min, sonicated and then
202
boiled before adding Triton X-100 to a final concentration of 1 %. Samples were then
resolved by SDS-PAGE (7,5 %) and immunoblotted with the following antibodies and
dilutions : rabbit anti-BP180, 1/500 (Abcam, ab28440) ; rabbit anti-BP230, 1/200 (from Dr.
Owaribe, Nagoya University, Japan) ; mouse anti-CK14, 1/500 (Chemicon, MAB3232) ;
rabbit anti-CK5, 1/500 (Upstate, 04-587) ; mouse anti-CK18, 1/500 (BD Biosciences,
550508). Immune complexes were detected using anti-mouse or anti-rabbit secondary HRPconjugated antibodies (Pierce) and visualized by enhanced chemiluminescence (Pierce).
β4 tyrosine-phosphorylation: proteins were extracted using a buffer containing 1 % Tween40, 1 % deoxycholate, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 and
supplemented with 2 mM orthovanadate and protease inhibitor cocktail (Roche) for 10 min at
4°C. The samples were immunoprecipitated with a β4-specific monoclonal antibody
(Chemicon, MAB1964), resolved by SDS-PAGE (7,5%), first immunoblotted with a phosphotyrosine specific antibody (Upstate, 05-1050, 1/500) and then reblotted with a polyclonal antiβ4 antibody (Santa Cruz, sc-9090, 1/200).
Sst2 expression: proteins were extracted with a buffer containing 1,5 % CHAPS, 50 mM
Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 100 mM NaF, 2 mM
orthovanadate, and a protease inhibitor cocktail (Roche), for 30 min at 4°C upon agitation.
Lysates were then centrifugated at 13000 rpm for 20 min at 4°C, and supernatants were
harvested, and resolved by western blot with a rabbit anti-sst2 antibody (generated in our
laboratory in rabbits immunized with peptides corresponding to the C-ter of human sst2 (18)).
S100A4 expression: proteins were extracted with a buffer containing 50 mM Tris-HCl pH 7,4,
100 mM KCl, 10 % glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 % Triton and a protease inhibitor
cocktail, and by repeating several cycles of freezing / thawing. Lysates were then
centrifugated at 10000 rpm for 10 min at 4°C, and supernatants were harvested and resolved
by western blot using a rabbit anti-S100A4 antibody (DAKO, A5114, 1/4000).
Extracellular protein expression: cell media were concentrated using 30 kDa centricons
(Millipore, UFC803024) and submitted to western blot analysis using the following antibodies
203
and dilutions: anti-BP180, 1/500 (Abcam, ab28440); anti-MMP-9, 1/250 (Millipore,
MAB3309); anti-MMP-2, 1/500 (Millipore, AB6003).
RTqPCR
Total RNA were isolated from BxPC-3 cells using RNeasy kit (Qiagen). After a DNase I
treatment (BD Biosciences-Clontech), total RNA were reverse transcribed by using random
hexamers and Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). Resulting cDNAs were used
to perform quantitative analysis of BP180, BP230 and S100A4 mRNA expression by realtime PCR using a Gene Amp 5700 Sequence Detection System and SYBR green as a dye
(Applied
Biosystems).
The
primers
were
as
follows:
BP180:
forward:
5'-
TCCACCCGATGGACAGAATT-3', reverse: 5'-CGATCGACTCCCCTTGAGC-3' ; BP230:
forward: 5’-GAGCCGGTTAGTCCCCA AG-3’, reverse: 5’-GCCAATACCCTGCAACAGGA-3’,
S100A4:
forward:
5’-AAGTTCAAGCTCAACAAGTCAGAACTA-3’
;
reverse:
5’-
TCATCTGTCCTTTTCCCC AAGA-3’. PCR efficiencies were measured by preparing a
standard curve for each primer pair (efficiency >90%). Target gene expression was
normalized by using GAPDH housekeeping gene expression as an internal control. Samples
incubated without reverse transcriptase were used as negative template controls.
SiRNA transfection
Human siRNAs for BP180, somatostatin and MMP-9, control siRNA and DharmaFECT-1
transfection reagent were purchased from Dharmacon. A mixture of 4 designed siRNA
targeting each gene was used (Dharmacon). Control siRNA were pool of 4 siRNA with at
least 4 mismatches to any human gene (Dharmacon). 10 nM of BP180 and MMP-9 siRNA
transfections and 100 nM of somatostatin siRNA transfections were performed according to
the manufacturer’s instructions. After 24 h of incubation, medium was removed and replaced
with complete medium. For immunofluorescence, migration and CAM assays, 24h after
siRNA transfection, cells were trypsinized and reseeded on coverlips, boyden chambers or
deposited onto the CAM respectively. For CAM assays, part of the cells were reseeded on
204
100 mm dishes, and BP180 expression was checked at the end of the experiment to verify
that BP180 was effectively knock down 8 days after siRNA transfection.
Construction and stable expression of S100A4 cDNA:
Human S100A4 cDNA was first amplified by PCR using the following primers: forward: 5’TGCTGTCGACGCGTGCCCTCTGGA GAAGGCC-3’,
reverse:
5’-
AGAGGATCCTTCATTTCTTCCTGGGCTGC -3’ (underlined sequences represent SalI and
BamHI sites which were inserted in the primers design). The amplified cDNA was first cloned
into a pCMX vector containing the FLAG-tag encoding sequences using the SalI, BamHI
sites. And the S100A4-FLAG cDNA was then subcloned into the pcDNA3-hygro(+)
expression vector using HindIII and BamHI sites. BxPC-3/sst2 cells were stably transfected
with mock or S100A4-FLAG encoding vectors using Exgen 500 transfection reagent
(Euromedex), and clones were selected with 250µg/mL of HygromycinB.
205
206
207
208
209
210
DISCUSSION DE L’ARTICLE
Ces travaux ont tout d’abord permis de mettre en évidence une expression de la
protéine hémidesmosomales BP180, et donc la présence d’hémidesmosomes de type I, au
pôle basal des canaux pancréatiques normaux ainsi que dans la lignée pancréatique canalaire
normale HPDE. Cependant, ces hémidesmosomes sont perdus au cours de la cancérogenèse
pancréatique, ce qui se traduit par l’altération de la localisation basale de α6β4 et BP180. Ceci
a également été confirmé dans la lignée cancéreuse pancréatique humaine BxPC-3, dans
laquelle on observe une localisation diffuse de BP180 et une délocalisation de l’intégrine
α6β4 au niveau de structures de migration, associée à la phosphorylation sur tyrosine de sa
sous-unité β4. De manière surprenante, malgré la perte des hémidesmosomes, l’expression de
BP180 est maintenue, voire augmentée, et cette protéine se présente sous une forme de 120
kDa, dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines ainsi que dans des extraits
protéiques de pancréas tumoraux ; cette forme correspond à un clivage extracellulaire de
BP180 suite à l’activation de la PI3K et de la métalloprotéinase MMP-9, et est impliquée dans
le désassemblage des hémidesmosomes. L’implication de la MMP-9 dans le clivage de BP180
en BP120, a d’ailleurs été vérifiée dans un modèle cellulaire de carcinome squameux : les
cellules HSC-3.
Par ailleurs, la réexpression du récepteur de somatostatine sst2, et son activation
constitutive dans les cellules cancéreuses pancréatiques humaines BxPC-3, induit la formation
d’hémidesmosomes matures, comme le démontre les photos de microscopie électronique
obtenues à partir de xénogreffes sous-cutanées chez la souris athymique de cellules BxPC3/sst2. Ceci est également associé à la relocalisation de l’intégrine α6β4 des structures de
migration vers les hémidesmosomes, ainsi qu’à la diminution de la signalisation de l’intégrine
α6β4 impliquée dans ses effets pro-invasifs ; ce qui se traduit par la diminution significative
de l’expression de S100A4, une cible connue de l’intégrine α6β4. Parmi les mécanismes
responsables de ces effets, nous avons démontré que sst2 entraînait une déphosphorylation sur
tyrosine de la sous-unité β4, associée à une augmentation d’expression des protéines
hémidesmosomales : cytokératines 5 et 14, BP230 et BP180. Alors que la régulation par sst2
de l’expression de BP230 se situe au niveau transcriptionnel, la régulation de BP180 est posttraductionnelle, sst2 inhibant le clivage de BP180 en BP120 en inhibant la PI3K et
l’expression de MMP-9. Enfin, nous avons également montré que sst2 inhibait la sécrétion,
211
par les cellules cancéreuses pancréatiques, de lamine-332, connue pour favoriser la survie et
l’invasion de nombreux modèles cancéreux.
Nous avons également pu démontrer que le fait de forcer l’assemblage de
hémidesmosomes, via la réexpression du récepteur sst2, représente un mécanisme original et
efficace inhibant le potentiel migratoire et invasif des cellules cancéreuses pancréatiques,
aussi bien in vitro qu’in vivo, sur le modèle de la membrane chorio-allantoïdienne de poulet.
Afin de généraliser ces résultats, nous avons également travaillé sur des kératinocytes
immortalisés humains HaCaT, un modèle cellulaire de choix pour l’étude de la dynamique
des HDs, et exprimant le récepteur sst2 de manière endogène. Nous avons montré que les
analogues de somatostatine, inhibent la migration des cellules HaCaT, préalablement
stimulées par l’EGF, en favorisant la formation des HDs.
Concernant la nature des hémidesmosomes présents dans le pancréas sain, il s’agit là
de la première étude décrivant la présence d’hémidesmosomes de type I, dans les canaux
pancréatiques. Généralement, dans les épithéliums simples, des structures hémidesmosomales
de type II, comprenant seulement α6β4 et la plectine, sont observées (Fontao, Exp Cell Res,
1999).
Cependant,
il
existe
d’autres
cas
d’épithéliums
simples
possédant
des
hémidesmosomes de type I, comme au niveau de l’épithélium amniotique ou mammaire
(Robinson, J Invest Dermatol, 1984 ; Bergstraesser, Am J Pathol, 1995).
La perte des hémidesmosomes pourrait être considérée comme un des premiers
évènements intervenants au cours de la cancérogenèse pancréatique. En effet, la délocalisation
de l’intégrine α6β4 du pôle basal des cellules épithéliales pancréatiques vers les structures de
migration est observée dès le stade PanIN-1A (Gleason, J Histochem Cytochem, 2005). Nous
avons confirmé cette délocalisation de l’intégrine α6β4 sur des coupes de pancréas tumoral
mais également dans des cellules cancéreuses pancréatiques BxPC-3, où nous avons observé
sa localisation au niveau des structures de migration de type lamellipodes et filopodes. Dans
ces cellules, la délocalisation est associée à la phosphorylation sur tyrosine de la sous-unité β4
et à l’activation de voies de signalisation impliquées dans les effets pro-invasifs de l’intégrine
α6β4. En effet, nous pouvons observer dans les cellules BxPC-3, une forte expression de
S100A4, un puissant facteur pro-invasif, dont l’expression est régulée par l’intégrine α6β4 (cf
chapitre (cf chapitre II.D, paragraphe 2.1, p104 de l’introduction bibliographique). La
phosphorylation de la sous-unité β4 est décrite, dans de nombreux types cellulaires cancéreux,
comme étant responsable du désassemblage des hémidesmosomes. Cependant le rôle exact de
la phosphorylation sur tyrosine de β4, fait encore débat, et il est plutôt suggéré qu’elle serait
212
impliquée dans l’activation des voies de signalisation pro-mitogènes et pro-invasives. D’un
autre côté, la phosphorylation sur sérine de β4 est clairement impliquée dans le désassemblage
des hémidesmosomes. Il serait donc intéressant d’étudier la phosphorylation sur sérine de β4,
dans notre modèle cellulaire. Malheureusement les anticorps commerciaux anti-phosphosérines sont peu spécifiques. En revanche certains groupes, comme celui de Rabinovitz, ont
généré des anticorps phospho-spécifques de sérines phosphorylées de la sous-unité β4
(Germain, Mol Biol Cell, 2009). L’utilisation de ces anticorps pourrait ainsi apporter une
réponse claire quant à la phosphorylation sur sérine de la sous-unité β4 dans les cancers
pancréatiques, mais également nous permettre de savoir si le récepteur sst2, en régulant ce
type de phosphorylations, peut réguler la localisation de l’intégrine α6β4.
Même si nous n’avons pas réalisé d’étude systématique sur l’expression et la
délocalisation de BP180 dans les différents stades de PanINs, nos résultats montrent
clairement, tout comme pour l’intégrine α6β4, une altération de sa localisation dès les
premiers stades de la cancérogenèse pancréatique. Cette délocalisation de BP180 du pôle
basal des cellules cancéreuses pancréatiques, est associée au clivage de son domaine
extracellulaire, consécutif à l’activation de la PI3K et d’un de ses effecteurs : MMP-9. Ce
clivage de BP180 en BP120 a déjà été observé dans d’autres modèles cancéreux, comme dans
les cellules de carcinomes squameux de langue HSC-3 et SCC-25, et est associé à la
progression tumorale (parikka, j histochem cytochem, 2003). En outre, ce même groupe a
montré que cette forme clivée extracellulaire de BP180, et plus particulièrement le domaine
col15, stimulait la migration des cellules cancéreuses via la liaison des intégrines α5β1, αvβ3
et αIIbβ3 (parikka, exp cell res, 2006). Ces intégrines sont d’ailleurs exprimées par les
cellules cancéreuses pancréatiques et impliquées dans la survie cellulaire (edderkaoui, j biol
chem, 2007).
Outre ce rôle connu de BP120 dans la migration des cellules cancéreuses, nous avons
également montré que le simple fait d’induire le clivage de BP180 en traitant les cellules
BxPC-3/sst2 avec de la MMP-9 recombinante est corrélé avec un désassemblage, au moins
partiel, des hémidesmosomes. Ces données sont confortées par une autre étude montrant que
le clivage de BP180 pourrait induire un désassemblage des hémidesmosomes (Hirako, J
Biochem, 2003). En effet, le site de clivage de BP180 est localisé au niveau du domaine juxtamembranaire NC16A de la protéine. Cette région étant également impliquée dans l’interaction
de BP180 avec la sous-unité α6 de l’intégrine α6β4, son clivage pourrait, en déstabilisant la
liaison α6/BP180, induire le désassemblage des hémidesmosomes. Cependant, des
expériences complémentaires peuvent être envisagées afin de prouver que le clivage de
213
BP180 est directement responsable du désassemblage des hémidesmosomes et notamment la
transfection de nos cellules avec un mutant non clivable de BP180.
Cependant le clivage de BP180 coopère probablement avec d’autres mécanismes pour
induire une destruction complète des hémidesmosomes. En effet, dans les cellules BxPC3/sst2 traitées avec de la MMP-9 recombinante, la perte des hémidesmosomes n’est que
partielle et des structures hémidesmosomales, de taille réduite, restent visibles, en particulier,
à la périphérie des cellules. Parmi les mécanismes complémentaires assurant une destruction
complète des hémidesmosomes, la phosphorylation de la sous-unité β4 sur tyrosine et/ou sur
sérine joue très certainement un rôle.
Un dernier mécanisme, impliqué dans la perte des hémidesmosomes, stimulant le
potentiel pro-invasif des cellules cancéreuses pancréatiques, et inhibé par le récepteur sst2, est
la sécrétion de laminine-332. En effet, il a été montré que les cellules cancéreuses
pancréatiques sécrétaient de grandes quantités de laminine-332, cette sécrétion associée au
clivage de sa chaîne γ2 et à la surexpression de l’intégrine α6β4, favorisant l’invasion
tumorale (Katayama, Cancer res, 2003). Il serait d’ailleurs intéressant d’analyser plus en
détail, les effets du récepteur sst2 sur le clivage protéolytique et la maturation de laminine332, qui est étroitement liée à la régulation des hémidesmosomes (cf fig. 48, p101 de
l’introduction).
Nous avons également montré l’implication de MMP-9 dans le clivage de BP180 dans
les cellules cancéreuses pancréatiques BxPC-3 mais aussi dans les cellules de carcinome
squameux HSC-3. Ce rôle de MMP-9 dans le clivage de BP180 a également été observé dans
les maladies auto-immunes pemphigoïdes bullleuses où des auto-anticorps dirigés contre les
protéines hémidesmosomales, induisent une réaction inflammatoire au cours de laquelle la
sécrétion et l’activation de MMP-9 est impliquée dans la destruction des hémidesmosomes (cf
chapitre I.A, paragraphe 2.2, p14 de l’introduction). Cependant MMP-9 n’est probablement
pas la protéase clivant directement BP180. En effet, dans ces maladies auto-immunes, il a été
montré que le clivage direct de BP180 était dû à l’élastase neutrophile, elle-même activée par
MMP-9. D’un autre côté, dans les kératinocytes normaux, un équilibre existe entre la forme
pleine taille et la forme clivée de BP180. Dans ce contexte, il a été montré que le clivage
direct de BP180 impliquait les ADAMs 9 et 10 (Franzke, J Biol Chem, 2009).
Alors que nos résultats suggèrent que le clivage de BP180 représente une des
premières étapes dans la perte des hémidesmosomes au cours de la cancérogenèse
pancréatique, l’inhibition de ce clivage n’est pas suffisante pour induire un réassemblage des
hémidesmosomes. En effet, l’assemblage des hémidesmosomes est un mécanisme complexe
214
et séquentiel, nécessitant la présence et la fonctionnalité de tous les partenaires
hémidesmosomaux (cf chapitre II.A, p82 de l’introduction). Grâce à notre modèle original de
cellules cancéreuses pancréatiques, dans lequel l’assemblage des hémidesmosomes est induit
par la réexpression du récepteur sst2, nous avons pu identifier certains des mécanismes
impliqués dans cet assemblage, incluant l’augmentation d’expression des protéines
hémidesmosomales BP230 et cytokératines 5 et 14, la déphosphorylation de la sous-unité β4
et l’inhibition du clivage de BP180. Enfin, nous avons montré que la perte des
hémidesmosomes est une étape clef de l’invasion tumorale pancréatique et qu’en forçant leur
réassemblage, on peut significativement inhiber le potentiel pro-migratoire et pro-invasif des
cellules cancéreuses pancréatiques.
215
216
RESULTATS SUPPLEMENTAIRES
217
INTRODUCTI ON
Nous avons vu, dans l’article précédent, que la somatostatine, en activant le récepteur
sst2, induisait l’assemblage des hémidesmosomes, dans les cellules cancéreuses pancréatiques
humaines BxPC-3 et dans les kératinocytes humains immortalisés HaCaT. Ce phénomène est
notamment accompagné de la relocalisation de l’intégrine α6β4 des structures de migration
vers les hémidesmosomes mais également de la déphosphorylation sur tyrosine de sa sousunité β4. Il est connu que la phosphorylation sur sérine, mais aussi sur tyrosine, de la sousunité β4 induit le désassemblage des hémidesmosomes (chapitre II.B, p47 de l’introduction).
Ainsi l’intervention de phosphatases semble être un pré-requis à la formation des
hémidesmosomes. En outre, différentes études ont montré que l’utilisation de vanadate, un
inhibiteur
de
phospho-tyrosine
phosphatases,
induisait
le
désassemblage
des
hémidesmosomes dans les kératinocytes. Cependant les phosphatases impliquées dans la
déphosphorylation de la sous-unité β4, n’ont, à ce jour, pas été identifiées.
Une partie de mes travaux de thèse, non présentée dans l’article, a donc consisté à
tenter d’identifier les mécanismes impliqués dans la déphospho rylation sur tyrosine de
la sous-unité β4 par le récepteur sst2.
Les travaux de l’équipe ont permis de mettre en évidence le rôle clef de l’activation
des phospho-tyrosine phosphatases SHP-1 et SHP-2 (SH2 domain-containing protein tyrosine
phosphatase-1 et 2) dans les effets anti-oncogéniques du récepteur sst2 (chapitre IV.B,
paragraphe 2.1, p96 de l’introduction). En outre, nous avons mis en évidence que certaines
tyrosines phosphorylées de β4 sont localisées au sein de domaines ITIMs (immunoreceptor
tyrosine-based inhibition motif, séquence consensus : I/L/VxYxxL/V), connus pour interagir
avec les domaines SH2 de ces phosphatases. Il nous paraissait donc intéressant de tester le
rôle de SHP-1 et 2 dans la déphosphorylation sur tyrosine de la sous-unité β4, induite par
l’activation du récepteur sst2.
Ainsi, durant ma thèse, j’ai pu mettre en évidence l’existence, in vitro, d’une
interaction directe entre le domaine cytoplasmique de la sous-unité β4 et SHP-2. Cette
interaction a été vérifiée in cellulo et les domaines impliqués ont été identifiés.
218
RESULTATS
L’analyse de la séquence protéique de la partie cytoplasmique de la sous-unité β4 nous
a permis d’identifier la présence de deux domaines ITIMs « vrais », comprenant les tyrosines
Y1257 et Y1494, et d’un domaine « ITIM-like », comprenant la Y1690 (fig. 1A). Ces
domaines ITIMs, lorsqu’ils sont phosphorylés sur tyrosine, sont impliqués dans l’interaction
avec les domaines SH2 de nombreuses protéines dont les phospho-tyrosine phosphatases
SHP-1 et SHP-2. Nous avons donc testé, in vitro, par résonance plasmonique de surface,
l’interaction entre des protéines recombinantes GST-SHP-1 et GST-SHP-2 et des peptides
correspondants aux domaines ITIMs de la sous-unité β4, sous forme phosphorylée ou non sur
tyrosine. Alors que la GST ou la GST-SHP-1 ne montrent aucune interaction, une interaction
spécifique et dose-dépendante est observée entre les ITIMs 2 et 3, comprenant les tyrosines
phosphorylées Y1494 et Y1690 de la sous-unité β4, et la protéine recombinante GST-SHP-2
(fig. 1B, C et D).
Afin de vérifier, tout d’abord, cette interaction in cellulo, et de comprendre, ensuite,
son rôle dans les effets du récepteur sst2 sur la déphosphorylation de la sous-unité β4, nous
avons utilisé deux modèles cellulaires, traités ou non avec de l’EGF (10-8M) seul ou en
présence de RC-160 (10-8M), un analogue stable de somatostatine : les cellules HaCaT,
exprimant α6β4 et sst2 de manière endogène, et les cellules Cos-7 co-transfectées avec des
vecteurs codant pour le récepteur sst2, d’une part, et la sous-unité β4, d’autre part. Nous
avons vérifié, dans un premier temps, l’expression de sst2 et de β4 dans les cellules Cos-7
après transfection (fig. 2A et B). En outre, dans ce modèle cellulaire, un traitement à l’EGF
induit une phosphorylation sur tyrosine de la sous-unité β4 et cet effet est inhibé après
activation du récepteur sst2 par le RC-160 (fig. 2C). Ces résultats concordent avec ceux
obtenus sur les cellules HaCaT (cf article, figure supplémentaire S2), avec une différence,
entre les deux modèles cellulaires, au niveau des temps de traitement nécessaires pour
observer la phosphorylation / déphosphorylation de β4 (traitement de 20 min dans les HaCaT
et de 1 min seulement dans les Cos-7). Enfin, nous avons pu montrer que, dans ces deux
modèles cellulaires, une légère interaction entre SHP-2 et β4, existe à l’état basal (NT) et est
fortement stimulée en présence de RC-160 (10-8M) (fig. 2D et F). La mutation des tyrosines
1494 et 1690 de la sous-unité β4 en phénylalanine, empêchant leur phosphorylation (β4Y1494F-Y1690F), dans les cellules Cos-7, inhibe fortement cette interaction en présence de
219
A.
S1356
S1360
S1364
S1424
Ligands utilisés :
ITIM 1 EITAYEVC(p)Y1257GLVNDDNR
ITIM 2 LQGYSVE(p)Y1494QLLNGGEL
ITIM 3 LFQHPLQSE(p)Y1690SSITTTHT
RU 100
B.
CS
FNIII-1 FNIII-2
CalX
β4 ITIM1 P hosphorylé / GST
β4
FNIII-3 FNIII-4
Y1422
Y1494
Y1440
Y1526
Y1257
Y1642 Y1690
β4 ITIM2 P hosphorylé / GST
β4 ITIM3 P hosphorylé / GST
0
0
80
R 60
es
p.
Di 40
ff.
20
Injections GST :
100nM, 300nM, 1 mM, 3 mM
0
-20
-100
R
U
D.
0
100 200 300 400 50 -100
0
Time (s)
β4 ITIM1 P hosphorylé /
GST-SHP1 totale
100
100 200 300 400 500 -100
Time (s)
100 200 300 400 500
Time (s)
β4 ITIM3 P hosphorylé /
GST-SHP1 totale
β4 ITIM2 P hosphorylé /
GST-SHP1 totale
80
Injections GST-SHP1 :
1nM, 3nM, 10nM,
30nM,100nM, 300nM, 1 mM
R
es
p.
Di
ff.
60
40
20
0
-20
100
RU
C.
0
100 200 30
0
Time (s)
400 500 100
0
β4 ITIM1 P hosphorylé /
GST-SHP2 totale
1150
100 20 30
0
0
Time
(s)
40
0
50
0
-100
0
100 200 300 400 500
Time (s)
β4 ITIM3 P hosphorylé /
GST-SHP2 totale
β4 ITIM2 Phosphorylé /
GST-SHP2 totale
950
Injections GST-SHP2 :
1nM, 3nM, 10nM, 30 nM,
100nM, 300nM
R 750
es
p. 550
Di
ff. 350
KD= 9.8e-9 M
KD= 1.08e-8 M
KD= 1.2e-8 M
150
-50
-100
0
100 200 300 400 500 -100
Time (s)
0
100 200 300 400 500 -100
Time (s)
0
100 200 300 400 500
Time (s)
Fig. 1 : Interaction directe in vitro entre SHP-2 et le domaine cytoplasmique de β4.
A. Représentation des peptides, correspondants aux séquences ITIMs de la sous-unité β4, utilisés
pour tester in vitro l’interaction avec les phosphatases SHP-1 et 2. A gauche, est représenté le
domaine cytoplasmique de la sous-unité β4 et ses principaux sites de phosphorylation. Les
tyrosines, au sein des domaines ITIMs testés, sont indiquées en rouge.
B, C et D. Courbes d’association des protéines recombinantes GST (B, contrôle négatif), GSTSHP-1 (C) et GST-SHP-2 (D) avec les différents domaines ITIMS de la sous-unité β4. Les
courbes représentent la réponse différentielle d’interaction entre des quantités croissantes de
protéines recombinantes (indiquées à gauche des graphes) et les différents domaines ITIMs de
β4, phosphorylés sur tyrosine vs le peptide correspondant à l’ITIM1 non phosphorylé.
220
RC-160, démontrant que SHP-2, interagit bien avec ces deux tyrosines phosphorylées de la
sous-unité β4, in cellulo, en réponse à l’activation du récepteur sst2 (fig. 2E).
Par ailleurs, les travaux précédents de l’équipe ont largement contribué à démontrer le
rôle clef du recrutement et de l’activation de SHP-2 par le récepteur sst2, et l’implication de
ce mécanisme dans les effets anti-prolifératifs et anti-oncogéniques du récepteur. Nous avons
donc testé l’hypothèse selon laquelle l’intégrine α6β4, pourrait être recrutée au niveau d’un
complexe comprenant le récepteur sst2 et la phosphatase SHP-2, facilitant ainsi la
déphosphorylation de la sous-unité β4 par sst2. Nous avons ainsi pu montrer, dans les cellules
HaCaT, l’existence d’une interaction entre le récepteur sst2 et la sous-unité β4, cette
interaction étant inhibée par un traitement à l’EGF et au contraire stimulée en présence de
RC-160 (fig. G).
221
222
DISCUSSION
Ces résultats complémentaires démontrent l’existence d’une interaction directe entre la
tyrosine phosphatase SHP-2 et les tyrosines phosphorylées 1494 et 1690 de la sous-unité β4,
aussi bien in vitro qu’in cellulo, après stimulation du récepteur sst2 par un analogue de
somatostatine, le RC-160. En outre, cette interaction est concomitante avec l’association entre
la sous-unité β4 et le récepteur sst2, dans les cellules HaCaT, ainsi qu’avec la
déphosphorylation sur tyrosine de β4, dans les cellules HaCaT et Cos-7, après traitement par
des analogues de somatostatine. Ces résultats suggèrent que le récepteur sst2, après
stimulation par son ligand, pourrait interagir avec la sous-unité β4, permettant ainsi la
formation d’un complexe α6β4/sst2/SHP-2, la déphosphorylation sur tyrosine de la sous-unité
β4, et la relocalisation de l’intégrine α6β4 au sein des hémidesmosomes.
Malheureusement, au cours de notre étude, un autre groupe a publié l’existence d’une
interaction entre la sous-unité β4 et SHP-2 et régulée positivement l’HGF (bertotti, j cell biol,
2006). Cependant, ce groupe n’a pas identifié tout à fait les mêmes résidus tyrosine sur la
sous-unité β4 impliqués dans l’interaction avec SHP-2. En effet, tout comme nous, ils ont
montré que la Y1257 ne jouait pas un rôle majeur dans cette interaction, alors que la Y1494
au contraire était nécessaire. Par contre, ils ont montré que la Y1440 pouvait également lier
SHP-2. Ils ont également montré que le recrutement de SHP-2 sur les tyrosines phosphorylées
1440 et 1494 de la sous-unité β4 était impliqué dans les effets pro-invasifs de l’HGF, en
activant Src et la voie Erk. Ceci va à l’encontre de nos résultats qui suggèrent plutôt un rôle de
l’interaction SHP-2/β4 dans la formation des hémidesmosomes et non pas dans l’activation
des effets pro-invasifs de l’intégrine α6β4. Cependant, ces deux mécanismes ne sont pas
forcément incompatibles. En effet, nous avons identifié une autre tyrosine, la Y1690, qui,
lorsqu’elle est phosphorylée, peut interagir avec SHP-2. La tyrosine 1494, semble être le
pilier de cette interaction, mais on peut imaginer que des changements conformationnels au
niveau de la sous-unité β4 pourraient faciliter la liaison du deuxième domaine SH2 de SHP-2,
soit avec la Y1440, soit avec la Y1690. Il est intéressant de noter que la Y1690 est localisée
dans la queue C-terminale de β4, alors que la Y1494 est localisée au niveau du domaine
FNIII-3. Dans ce contexte, la liaison de SHP-2 sur les Y1494 et Y1690, nécessiterait le
rapprochement de ces deux régions de la sous-unité β4. Or un repliement du domaine Cterminal sur le segment connecteur de la sous-unité β4 a déjà été décrit et semble plutôt en
223
faveur de l’assemblage des hémidesmosomes, en permettant le rapprochement des domaines
d’interaction de β4 avec le domaine plakine de la plectine. (cf fig.41, p85 de l’introduction).
Afin de concilier ces différents résultats, on pourrait
imaginer que les
phosphorylations sur sérines et tyrosines de la sous-unité β4 induites par les facteurs de
croissance, favorisent une conformation du domaine cytoplasmique de β4 permettant
l’interaction de SHP-2 avec les tyrosines 1440 et 1494, et l’activation de voies de
signalisations impliquées dans la prolifération, la migration ou encore l’invasion. En présence
de somatostatine, en revanche, l’interaction entre sst2 et β4 pourrait induire un changement de
conformation qui favoriserait au contraire l’interaction de SHP-2 avec les tyrosines 1494 et
1690 et l’assemblage des hémidesmosomes. L’existence de tels mécanismes pourrait
représenter une régulation originale de la dynamique d’assemblage et de désassemblage des
hémidesmosomes mais nécessite des investigations plus poussées.
De questions persistent donc : après interaction avec les Y1494 et Y1690 de la sousunité β4, SHP-2 induit-elle une déphosphorylation d’autres résidus tyrosine de β4 ? Cette
interaction sert-elle à favoriser une conformation de la sous-unité β4 facilitant l’interaction
avec la plectine ? Pour répondre à ces questions, le modèle des cellules Cos-7 semble peu
indiqué. En effet, ces cellules n’expriment que la plectine, mais pas les autres composants des
hémidesmosomes. En outre, dans mes expériences, seule la sous-unité β4 de l’intégrine α6β4
a été transfectée. Ces défauts expliquent peut-être le fait que les effets observés dans les
cellules Cos-7 soient très transitoires ainsi que la différence de cinétiques de phosphorylation
et d’interactions de la sous-unité β4 entre les cellules Cos-7 et HaCaT (1 min vs. 20 min). Des
kératinocytes de type PA-JEB (Pyloric Atresia Associated with Junctional Epidermolysis
Bullosa), déficients en β4, issus de patients souffrant d’épidermolyses bulleuses, pourraient
représenter un bien meilleur modèle.
L’interaction entre sst2 et la sous-unité β4 demande aussi à être confirmée dans
d’autres modèles cellulaires. On peut également se demander si elle est directe. Si oui, quels
domaines des deux protéines sont impliqués et si non, comment pourraient-elles interagir ?
On pourrait envisager l’intervention d’autres partenaires ou encore la localisation des deux
protéines dans les mêmes microdomaines membranaires, d’autant plus qu’on sait que la sousunité β4 est palmitoylée et que sa localisation au sein de rafts lipidiques est nécessaire pour
son interaction avec des kinases de la famille Src et sa phosphorylation (gagnoux-palacios, j
cell biol, 2003).
224
Enfin, nous avons également tenté d’analyser par spectrométrie de masse, après
extraction et purification de la sous-unité β4 à partir de cellules HaCaT traitées avec de l’EGF
seul ou en présence d’analogues de somatostatine, les résidus tyrosine déphosphorylés par la
somatostatine. Malheureusement, ce type d’analyse demande de purifier de grandes quantités
de β4, de manière à obtenir, après analyse par spectrométrie de masse, un recouvrement le
plus complet possible de la protéine afin d’analyser le statut de chaque tyrosine. Malgré un
recouvrement d’environ 40% de la protéine, nous n’avons pas encore pu obtenir de résultats
quant aux résidus phosphorylés par l’EGF et déphosphorylés par la somatostatine et ces
investigations méritent donc d’être poursuivies.
En conclusion, ces résultats, bien que partiels, restent très intéressants d’un point de
vue fondamental, dans le sens où ils ouvrent de nouvelles questions et de nouvelles
hypothèses quant à la régulation de la phosphorylation de la sous-unité β4 et de la dynamique
d’assemblage / désassemblage des hémidesmosomes.
225
MATERIEL ET METHODES
Lignées cellulaires et réactifs utilisés :
Les cellules rénales de singe, transformées par l’antigène T du SV-40, Cos-7 et la lignée de
kératinocytes humains, spontanément immortalisés, ont été cultivées dans du DMEM (1g/L de
glucose, LONZA) contenant respectivement 5 et 10% de sérum de veau fétal.
L’EGF est fourni par R&D, et l’analogue de somatostatine RC-160 par American Peptide. Le
BIM23197, a été donné généreusement par le Dr. Culler (IPSEN).
Vecteurs et transfections :
Les cellules Cos-7 ont été transfectées, par la méthode DEAE-dextran/chloroquine, avec 5µg
de vecteur pRc/CMV-hsst2-Flag (Bousquet, EMBO J, 2006) codant pour le récepteur sst2
humain possédant une étiquette Flag et 5µg de vecteur pRc/CMV-hβ4wt (donné par le Dr.
Gagnoux-Palcios,
INSERM U634, Nice, France – Dans, J Biol Chem, 2001) ou muté,
codants respectivement pour la sous-unité β4 humaine, sauvage (wt) ou possédant des
substitutions des tyrosines 1494 et 1690 en phénylalanines (Y1494F-Y1690F). Les vecteurs
vides correspondants (MOCK) ont été utilisés comme contrôle pour chaque transfection.
Le vecteur pRc/CMV-hβ4-Y1494F-Y1690F a été construit par PCR en utilisant les amorces
suivantes :
Y1494F, sens : 5’-CTGCAGGGCTACAGTGTGGAATTCCAGCTGCTGAACGGCGGT-3’,
antisens : 5’-ACCGCCGTTCAGCAGCTGGAATTCCACACTGTAGCCCTGCAG-3’
Y1690F, sens : 5’-CAGCACCCGCTGCAAAGCGAATTCAGCAGCATCACCACCACC-3’,
antisens : 5’-GGTGGTGGTGATGCTGCTGAATTCGCTTTGCAGCGGGTGCTG-3’.
Extractions protéiques et immunoprécipitations et western blot :
·
Phosphorylation de β4 et interaction avec SHP-2 : les protéines ont été extraites avec
un tampon contenant 1% de Tween-40, 1% de deoxycholate, 10 mM de NaCl, 2 mM de
MgCl2, 20 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 2mM d’orthovanadate et un cocktail d’inhibiteurs de
protéases (ROCHE), pendant 10 min à 4°C. Les échantillons ont été immunoprécipités avec
un anticorps monoclonal de souris anti-β4 (Chemicon, MAB1964), et analysés par western
blot avec les anticorps suivants : anticorps monoclonal de souris anti-phospho-tyrosine
226
(Upstate, 05-1050, 1/500), anticorps monoclonal de souris anti-SHP2 (BD Biosciences,
610622, 1/500) et anticorps polyclonal de lapin anti-β4 (Santa Cruz, sc-9090, 1/200).
·
Interaction sst2/β4 : les protéines ont été extraites avec un tampon contenant 1,5% de
CHAPS, 50mM d’Hepes pH 7,4, 150mM de NaCl, 10mM d’EDTA, 10mM de Na4P2O7,
100mM de NaF, 2mM d’orthovanadate, et un cocktail d’inhibiteurs de protéases (Roche), 30
min à 4°C, sous agitation, puis centrifugés à 13000 rpm pendant 20 min à 4°C. Les
surnageants ont été prélevés et immunoprécipités avec un anticorps polyclonal anti-sst2
(généré dans notre laboratoire après immunisation de lapins avec des peptides correspondant à
l’extrémité C-terminale du récepteur sst2 humain) et analysés en western blot avec l’anticorps
polyclonal de lapin anti-β4 et l’anticorps polyclonal de lapin anti-sst2.
Production et purification des protéines recombinantes GST-SHP1 et GST-SHP2 :
Les protéines de fusion GST-SHP1 et GST-SHP2 ont été générées à partir des cDNA murins
de SHP1 et SHP2 (Ferjoux, Mol Biol Cell, 2003). Leur expression a été induite chez E. Coli
DH5α, avec 1mM d’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, pendant 3 h à 37°C. Les bactéries
ont ensuite été lysées dans un tampon contenant 50mM de Tris pH 7,4, 1mM d’EDTA,
100mM de NaCl, 10% de glycérol, 1% de NP-40, 1mM de DTT et des inhibiteurs de
protéases. Après sonication, les lysats ont été centrifugés à 13000 rpm, pendant 45 min à 4°C.
Les protéines GST- ont ensuite été purifiées à l’aide de billes de glutathione sépharose et
éluées dans un tampon Hepes à 50mM pH 8, contenant 10mM de glutathione réduite.
Résonnance plasmonique de surface :
L’analyse des interactions en temps réel, entre les protéines recombinantes GST-SHP1 ou
GST-SHP2 et les peptides correspondants aux domaines ITIMs de la sous-unité β4, a été
réalisée à l’aide d’un biosenseur BIAcore 3000 (BIAcore, AB). Les résultats sont quantifiés
en terme d’unité de résonnance (RU) (1000RU = 1ng de protéine lié par mm2 de surface).
Une puce de dextrans carbxyméthylés recouverte de streptavidine, contenant 4 canaux, à été
utilisée pour fixer 150 RU des peptides biotinylés suivants : le peptide de référence
EITAYEVCYGLVNDDNR
a
été
EITAYEVC(p)Y1257GLVNDDNR,
immobilisé
sur
le
canal
1
et
les
LQGYSVE(p)Y1494QLLNGGEL,
peptides
et
LFQHPLQSE(p)Y1690SSITTTHT, correspondants aux différents domaines ITIMs de β4,
phosphorylés sur tyrosine, ont été immobilisés sur les canaux 2, 3 et 4 respectivement. Des
concentrations croissantes, allant de 1nM à 3µM, des protéines recombinantes GST, GSTSHP1 et GST-SHP2 ont été injectées avec un débit de 20 µl/min à 25°C. Après chaque
227
injection, les canaux ont été régénérés par de rapides lavages avec 5µL de SDS 0,01%. Les
graphes représentent la liaison des différentes protéines recombinantes GST- avec les peptides
correspondants aux ITIMs phosphorylés sur tyrosine de β4, corrigée par la liaison sur le
peptide de référence (non phosphorylé). Les constantes d’affinité ont été calculées à partir des
courbes de titration, grâce au programme BIAevaluation 3.1 fourni par BIAcore.
228
CONCLUSI ON GENERALE ET PERSPECTIVES
229
CONCLUSI ON GENERALE ET PERSPECTIVES
L’objectif premier de ce travail était d’identifier les mécanismes moléculaires
impliqués dans l’effet anti-invasif du récepteur de somatostatine sst2, dans le cancer du
pancréas. En effet, le cancer du pancréas se caractérise par une rapide invasion locale et une
importante dissémination métastatique, responsables d’une mortalité très élevée. Les travaux
de l’équipe ont largement contribué à démontrer que le récepteur sst2, dont l’expression est
perdue dans la majorité des adénocarcinomes pancréatiques, agit comme un suppresseur de
tumeur pour ce type de cancer et de nombreux mécanismes impliqués dans ses effets antioncogéniques ont été identifiés. Cependant l’effet anti-invasif du récepteur était peu
caractérisé. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que la réexpression du récepteur sst2,
dans
les
cellules
cancéreuses
pancréatiques
humaines,
induisait
la
formation
d’hémidesmosomes et que ce mécanisme jouait un rôle majeur dans l’action anti-invasive du
récepteur. En effet, l’inhibition de l’assemblage des hémidesmosomes, via l’extinction
d’expression de BP180 par siRNA, bloque complètement les effets anti-migratoires et antiinvasifs du récepteur sst2, comme le démontrent les expériences d’invasion in vivo sur le
modèle de la CAM. Ces travaux renforcent ainsi l’utilité de la mise en place d’un protocole de
thérapie génique chez l’homme, basé sur la réexpression du récepteur sst2, pour le cancer du
pancréas.
Parmi les mécanismes impliqués dans ces effets anti-invasifs, nous avons pu montrer
que sst2 entraînait la relocalisation de l’intégrine α6β4 des structures de migration vers les
hémidesmosomes. Ceci est associé à la déphosphorylation sur tyrosine de la sous-unité β4 et à
l’inhibition des voies de signalisation impliquées dans les effets pro-invasifs de l’intégrine
α6β4, comme l’inhibition de sécrétion du facteur pro-invasif et pro-métastatique S100A4.
Compte-tenu du rôle clef de l’intégrine α6β4 dans l’invasion tumorale de nombreux autres
cancers, en particulier dans les carcinomes squameux, (cf chapitre II.D, p51 de l’introduction
bibliographique), l’utilisation d’analogues de somatostatine pourrait fournir de nouvelles
options thérapeutiques, sous réserve, bien entendu, de l’expression des récepteurs de
somatostatine par ces cellules cancéreuses.
Nous avons également montré que le récepteur sst2 inhibait le clivage de BP180,
impliqué dans le désassemblage des hémidesmosomes, en inhibant l’expression de MMP-9.
Un mécanisme similaire est notamment retrouvé dans des maladies auto-immunes de type
pemphigoïdes bulleuses. Là encore, l’utilisation d’analogues de somatostatine, pourrait être
230
envisagée, d’autant plus que les kératinocytes expriment des récepteurs de somatostatine et
plus particulièrement sst2 (Hagströmer, Exp Dermatol, 2006).
Mais bien au-delà de la caractérisation des effets anti-invasifs du récepteur sst2,
l’étude de la régulation des hémidesmosomes, par sst2, nous a permis, d’une part, d’identifier
certains évènements clefs impliqués dans l’invasion cancéreuse pancréatique et, d’autre part,
de démontrer que le réassemblage des hémidesmosomes constituait un moyen d’action
original et très efficace pour inhiber le pouvoir invasif des cellules cancéreuses pancréatiques.
Nous avons décrit pour la première fois la présence de la protéine BP180 et donc de
structures hémidesmosomales de type I, au niveau de l’épithélium simple canalaire
pancréatique. Généralement, dans les épithéliums simples, des structures hémidesmosomales
de type II, comprenant seulement α6β4 et la plectine, sont observées (Fontao, Exp Cell Res,
1999).
Cependant,
il
existe
d’autres
cas
d’épithéliums
simples
possédant
des
hémidesmosomes de type I, comme au niveau de l’épithélium amniotique ou mammaire
(Robinson, J Invest Dermatol, 1984 ; Bergstraesser, Am J Pathol, 1995).
Nous avons également montré que la perte des hémidesmosomes, caractérisée par la
perte de localisation basale de BP180 et de l’intégrine α6β4, représentait un des premiers
évènements intervenants au cours de la cancérogenèse pancréatique. En effet, la surexpression
et la délocalisation de l’intégrine α6β4 du pôle basal des cellules épithéliales pancréatiques a
été observée par d’autres groupes et intervient très précocement, dès le stade PanIN-1A, dans
la cancérogenèse pancréatique (Gleason, J Histochem Cytochem, 2005 ; cruz-monserrate,
mod pathol, 2007). Concernant BP180, même si nous n’avons pas réalisé d’étude
systématique sur l’expression et la délocalisation de cette protéine dans les différents stades
de PanINs, nos résultats montrent clairement, tout comme pour l’intégrine α6β4, une
altération de sa localisation dès les premiers stades de la cancérogenèse pancréatique.
Cette dérégulation très précoce des jonctions d’ancrage des cellules épithéliales
pancréatiques sur la lame basale, pourrait ainsi représenter un évènement initiateur de
l’invasion cancéreuse pancréatique et permettre d’identifier de nouveaux marqueurs
diagnostiques ou pronostiques du cancer du pancréas. Dans ce sens, il a été montré que les
cellules cancéreuses pancréatiques sécrètent de grandes quantités de laminine-332 et que le
clivage de sa chaîne γ2, dont les fragments protéolytiques peuvent être détectés dans la
circulation sanguine, peut représenter un marqueur de malignité (Katayama, Cancer res,
2003). En effet, la sécrétion de laminine-332 par les cellules cancéreuses, via l’activation de
l’intégrine α6β4 et de la voie PI3K-Rac, permet la survie et l’invasion tumorale, notamment
231
en rendant les cellules cancéreuses indépendantes du milieu environnant (zahir, j cell biol,
2003). En outre, le clivage protéolytique de la laminine-332, et plus particulièrement de sa
chaîne γ2 par des métalloprotéinases, induit le désassemblage des hémidesmosomes et la
relocalisation de l’intégrine α6β4 vers les structures de migration où elle stimule l’invasion,
notamment dans les cellules de carcinomes squameux (Marinkovich, Nat Rev Cancer, 2007).
Enfin, la laminine-332 et sa chaîne γ2 jouent également un rôle important dans l’invasion
nerveuse en facilitant la migration des cellules cancéreuses pancréatiques le long des nerfs
(mitsunaga, int j cancer, 2009).
Nous avons également démontré le rôle clef de l’activation de la voie PI3K dans
l’invasion cancéreuse pancréatique. En effet, l’activation de cette voie dans les cellules
cancéreuses pancréatiques stimule l’expression de MMP-9, impliquée dans le clivage de
BP180, le désassemblage des hémidesmosomes et la délocalisation de l’intégrine α6β4 vers
des structures de migration. Ainsi délocalisée, l’intégrine α6β4 exerce une forte activité proinvasive, notamment en activant la voie PI3K. Il se met alors en place une boucle
d’amplification puissante, stimulant l’invasion tumorale. L’inhibition de la PI3K, par le
récepteur sst2, et donc l’inhibition de cette boucle d’amplification, peut ainsi expliquer les
effets drastiques qu’exerce le récepteur sst2 sur l’invasion tumorale pancréatique. Le clivage
de BP180 joue un rôle d’autant plus important que sa forme clivée extracellulaire, BP120, est
capable également d’induire la migration de cellules de carcinomes squameux, en servant de
ligand pour les intégrines α5β1, αvβ3 et αIIbβ3 (parikka, exp cell res, 2006) ; ces intégrines
étant, par ailleurs, exprimées par les cellules cancéreuses pancréatiques et impliquées dans la
survie cellulaire (edderkaoui, j biol chem, 2007).
Pour finir, l’intégrine α6β4, lorsqu’elle est délocalisée au niveau des structures de
migration, est un puissant facteur pro-invasif, dans de nombreux cancers. Pourtant, le rôle de
l’intégrine α6β4 dans le cancer du pancréas a été peu étudié durant de nombreuses années et
ce n’est que récemment que les données bibliographiques dans ce domaine sont apparues. De
nombreux oncogènes connus pour coopérer avec l’intégrine α6β4 sont suractivés dans les
cancers pancréatiques (K-Ras, EGFR, c-Met…) et peuvent expliquer la surexpression et la
délocalisation très précoce, au cours de la cancérogenèse pancréatique, de l’intégrine α6β4. Il
a notamment été montré que les kinases Fyn et PKC étaient suractivées dans les cancers
pancréatiques et participaient à la croissance tumorale et métastatique (chen, J Gastroenterol
Hepatol, 2009 ; el-rayes, pancreas, 2008 ; mauro, pancreas, 2010). Or ces kinases sont
décrites pour phosphoryler la sous-unité β4, et induire la délocalisation de l’intégrine α6β4
des hémidesmosomes, au pôle basal des cellules épithéliales, vers les structures de migration
232
où elle favorise la croissance tumorale et l’invasion. Ces données sont cohérentes avec nos
résultats montrant que la délocalisation de l’intégrine α6β4 vers les structures de migration,
dans les cellules BxPC-3, est associée à la phosphorylation sur tyrosine de sa sous-unité β4 et
à l’augmentation d’expression du facteur pro-invasif et pro-métastatique S100A4. Il a, par
ailleurs, été montré que l’intégrine α6β4 était impliquée, d’une part, dans les effets proinvasifs de l’HGF sur les cellules cancéreuses pancréatiques (cruz-monserrate, neoplasia,
2008) et que l’activation de PKC, d’autre part, entraînait sa délocalisation vers les structures
de migration, où elle favorise la migration des cellules cancéreuses pancréatiques et la
formation de métastases hépatiques (herlevsen, j cell sci, 2003 ; gesierich, clin cancer res,
2005). Enfin, de nombreuses voies activées par l’intégrine α6β4 (PI3K, NF-κB, Erk…) ainsi
que de nombreuses cibles (MMPs, VEGF…) sont également suractivées ou surexprimées
dans les cancers pancréatiques. Ceci vient renforcer l’idée que l’intégrine α6β4 joue un rôle
clef dans l’invasion tumorale pancréatique et fait de l’intégrine α6β4 une cible thérapeutique
potentielle.
Le ciblage thérapeutique des intégrines en général, dans les cancers et dans le cancer
du pancréas plus particulièrement, représente une perspective prometteuse, car ces molécules
se situent à « des carrefours de signalisation ». En effet, leur nom, intégrines, vient de leur
capacité à intégrer et à coordonner l’ensemble des signaux intra- et extracellulaires. Dans ce
sens, l’inhibition, par ARN interférence ou par un inhibiteur spécifique, de l’ILK, une kinase
directement reliée à l’activation des intégrines, inhibe la croissance tumorale pancréatique et
sensibilise les cellules cancéreuses pancréatiques à la gemcitabine (Yau, Cancer res, 2005 ;
Duxbury, Clin Cancer res, 2005). Enfin, le concept de thérapies « anti-adhésives », ciblant les
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269
270
ANNEXE
271
Thrombospondin-1 is a critical effector
of oncosuppressive activity of sst2 somatostatin
receptor on pancreatic cancer
Hanane Laklaia,b, Séverine Lavala,b, Laurent Dumartinb,c,d, Philippe Rochaixc,e, Martin Hagedornb,c,d, Andreas Bikfalvib,c,d,
Sophie Le Guellecd,f, Marie-Bernadette Delisled,f, Andrew V. Schallye,g, Christiane Susinia,b, Stéphane Pyronneta,b,
and Corinne Bousqueta,b,1
aInstitut
National de la Santé et de la Recherche Médicale U858, I2MR, bUniversité Toulouse III Paul Sabatier and Services d’Anatomie et Cytologie
Pathologique of fHôpital Rangueil and of eInstitut Claudius Regaud, 31432 Toulouse, France; cInstitut National de la Santé et de la Recherche Médicale
U920, dUniversité Bordeaux I, 33405 Talence, France; and gVeterans Affairs Medical Center and University of Miami Miller Medical School, Miami, FL 33136
Contributed by Andrew V. Schally, August 25, 2009 (sent for review May 5, 2009)
angiogenesis 兩 chick chorioallantoic membrane model 兩
IRES-dependent translation
S
omatostatin (SRIF, Somatotropin Release-Inhibiting Factor) is a neuropeptide with broad inhibitory effects on
endocrine and exocrine secretion of pituitary, pancreatic, and
gastrointestinal hormones, as well as on intestinal motility,
absorption of nutrients and ions, and vascular contractility. SRIF
also functions as a neurotransmitter produced by normal endocrine, gastrointestinal, immune, and neuronal cells, and by
certain tumors (1). Attention has recently focused on the role of
SRIF in the progression and control of neoplastic disease. SRIF
displays potent antitumor activity in several human cancers in
vitro and in vivo (2). It acts directly on tumor cells (inhibiting
their survival and/or invasiveness), or indirectly on normal cells
of the host affecting tumor microenvironment (2). The biological
activities of SRIF are mediated through five different high
affinity G protein-coupled receptor subtypes (sst1–5) whose
expression is cell- and organ-specific. Most importantly, ssts, and
especially sst2, are overexpressed in a large variety of tumors (3).
Because SRIF has a short half-life, numerous stable derivatives
have been synthesized (1). Two decades of medical use have
documented that SRIF octapeptide analogs, which are predom-
www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0908674106
inantly sst2-preferring binding peptides, are excellent agents for
diagnostic evaluation and tumor-localization by scintigraphy.
These analogs, as therapeutic molecules, can often cure hormonal symptoms associated with pituitary and endocrine tumors, and concurrently induce marked shrinkage of the tumors
(2). We and others have shown that anti-neoplastic activity of
SRIF is not restricted to endocrine tumors, but also occurs in
pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), indicating that sst2
behaves as a tumor suppressor for PDAC (4–8). The expression
of sst2 is lost in 90% of PDAC and their metastases (7). Its
re-expression in pancreatic cancer cells results in an autocrine
loop whereby sst2 induces the expression of SRIF, which in turn
constitutively activates the sst2 receptor (4). Apoptosis is thus
induced, and pancreatic cancer cell proliferation, tumorigenesis,
metastasis, and angiogenesis are inhibited (4–6, 9, 10).
Tumor angiogenesis is essential for tumor growth, invasion,
and metastasis (11). SRIF and SRIF analogs inhibit the proliferation and migration of endothelial cells by interacting with sst2
in vitro and in vivo (2). Sst3 and sst5 could also be involved. An
upregulation of sst2 expression has been observed during the
angiogenic switch from resting to proliferating endothelium (12,
13). This suggests a critical inhibitory role for SRIF during the
initial steps of cancer progression. The overexpression of peritumoral vascular somatostatin receptors, mostly sst2, has been
reported in some human carcinomas and malignant lymphomas
(13, 14). This could represent a host defense mechanism against
tumor angiogenesis. This angioinhibitory action of SRIF on
tumors also relies on its ability to abrogate the secretion and/or
activity of angiogenic factors, including the main proangiogenic
factor, VEGF, as has been primarily observed in vivo using
intratumor sst2 gene transfer (9). In this study, we document a
mechanism underlying the angioinhibitory action of SRIF in
tumors involving a sst2-dependent upregulation of expression of
the potent inhibitor of angiogenesis thrombospondin-1 (TSP-1).
TSP-1 acts by sequestering and consequently inactivating angiogenic activity of VEGF. TSP-1 is therefore identified here as a
critical effector of sst2 tumor-suppressive activity on pancreatic
tumor growth and angiogenesis.
Results
SRIF-Activated sst2 Upregulates the Expression of the Angioinhibitory
Factor Thrombospondin-1 (TSP-1). From differential gene profile
analysis in the human pancreatic cancer BxPC-3 cells expressing
Author contributions: H.L., M.H., A.B., C.S., S.P., and C.B. designed research; H.L., S.L., P.R.,
L.D., and C.B. performed research; S.L.G., M.-B.D., and A.V.S. contributed new reagents/
analytic tools; H.L., S.L., P.R., S.L.G., M.-B.D., C.S., S.P., and C.B. analyzed data; and H.L.,
A.V.S., C.S., S.P., and C.B. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
1To
whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected].
This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/
0908674106/DCSupplemental.
PNAS 兩 October 20, 2009 兩 vol. 106 兩 no. 42 兩 17769 –17774
CELL BIOLOGY
The somatostatin receptor subtype 2 (sst2) behaves as a tumor
suppressor when expressed and stimulated by its ligand somatostatin in pancreatic cancer. We reveal a mechanism underlying
oncosuppressive action of sst2, whereby this inhibitory receptor
upregulates the expression of the secreted angioinhibitory factor
thrombospondin-1 (TSP-1), as demonstrated in exocrine BxPC-3
and endocrine BON pancreatic cancer cells. The sst2-dependent
upregulation of TSP-1 occurs through the inhibition of the PI3K
pathway. It depends on transcriptional and translational events,
involving a previously undescribed IRES in the 5ⴕ-UTR of TSP-1
mRNA. Chick chorioallantoic membrane was used as an in vivo
model to demonstrate that TSP-1 is a critical effector of the
inhibitory role of sst2 on the neoangiogenesis and oncogenesis
induced by pancreatic cancer cells. TSP-1 reduced in vitro tubulogenesis of endothelial cells when grown in conditioned medium
from pancreatic cancer cells expressing sst2, as compared to those
expressing the control vector. TSP-1 inhibited tumor cell-induced
neoangiogenesis by directly sequestering the proangiogenic factor
VEGF, and inactivating the angiogenesis initiated by VEGFR2 phosphorylation in endothelial cells. Using human pancreatic tissuemicroarrays, the expression of both sst2 and TSP-1 was shown to
be correlated during the pancreatic neoplastic program. Both
proteins are nearly undetectable in normal exocrine pancreas and
in most invasive cancer lesions, but their expression is strikingly
upregulated in most preinvasive cancer-adjacent lesions. The upregulation of both sst2 and TSP-1 tumor suppressors may function
as an early negative feedback to restrain pancreatic carcinogenesis.
B
mock
sst2
A
mock
sst2
***
BxPC-3
sst2 sst2
wt
Y71F
TSP-1
100
50
SL1
R-luc
0
-
+
60
***
siCTR
20
BON
BxPC-3 / sst2
-
-
RC160
TSP-1
TSP-1
MMP-2
MMP-2
siSRIF
E
sst2
Fig. 1. sst2 upregulates the expression of the angioinhibitory factor TSP1.(A) Quantification by qRT-PCR of TSP-1 mRNA in BxPC-3/mock and/sst2 cells,
as normalized with mRNA quantified in mock cells. (B, D, F) Immunoblots with
an anti-TSP-1 (Upper), or an anti- MMP-2 antibody (Lower, loading control)
using CM from BxPC-3/mock and/sst2 cells, and densitometric analyses (B,
bottom), or from BxPC-3/sst2 cells transfected with a control (siCTR) or SRIF
(siSRIF) siRNA and treated or not with 10⫺8 M RC-160 for 72 h (D), or from BON
cells treated or not with 10⫺8 M RC-160 for 72 h (F). Expression of MMP-2 was
used as an internal loading control. (C) SRIF expression assessed by ELISA in CM
from BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR or siSRIF, and normalized with
SRIF quantified in siCTR-transfected BxPC-3/sst2 cells. (E) Immunohistochemistry using an anti-TSP-1 antibody on mock- or sst2-expressing tumors issued
from the s.c. xenograft of corresponding cells in athymic mice. Results are
representative of three independent experiments, and are presented as the
mean ⫾ SEM.
sst2 (BxPC-3/sst2) or not (BxPC-3/mock), we have shown an
upregulation by 3.38 ⫾ 0.44-fold of the mRNA for the angioinhibitory factor thrombospondin-1 (TSP-1). This result was confirmed by real-time quantitative RT-PCR as well as by Western
blot, showing a 2.81 ⫾ 0.05 and a 9.40 ⫾ 2.82 fold-increase in
TSP-1 mRNA (Fig. 1A) and its protein (Fig. 1B) expression,
respectively. BxPC-3/sst2 cells exhibit an autocrine loop whereby
the production and secretion of SRIF continuously activates sst2
independently of addition of exogenous SRIF (4). Blocking this
autocrine loop by transfecting BxPC-3/sst2 cells with a specific
siRNA targeting SRIF downregulated SRIF expression by 57 ⫾
1% (Fig. 1C), and decreased secreted TSP-1 protein expression,
which was rescued when cells were treated with 10 nM somatostatin analog RC-160 (Fig. 1D). This indicates that TSP-1 is
directly regulated by the autocrine sst2-SRIF loop. Consistently,
tumors resulting from BxPC-3/sst2 cell s.c. xenografts in athymic
mice, presented a significant decrease in volume progression, as
previously described (4, 15), and a potent upregulation of TSP-1
expression, as shown by immunohistochemistry (Fig. 1E), compared to BxPC-3/mock-derived tumors. The regulation of TSP-1
protein expression by SRIF-activated sst2 was then extended to
another human cell model, the endocrine pancreatic cancer
17770 兩 www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0908674106
pGL3-TSP-1
pSL2-TSP-1S
200
100
10
+ RC160
0
BxPC-3 / sst2
mock
5’UTR F-luc
pSL2- TSP-1AS
F
D
SL2
CMV
D
siCTR
siSRIF
CpSL2- TSP-1S
MMP-2
pGL3-TSP-1
0
***
IRES activity
(fold-induction of F-luc / R-luc)
TSP-1
mock
sst2
*
F-luc (fold-induction)
100
C
Somatostatin expression
(% of siCTR)
Mock
MMP-2
200
0
100
B
MMP-2
Protein expression
(% of mock)
mRNA expression
(% of mock)
TSP-1
300
BxPC-3 / mock
LY294002
+
TSP-1
pSL2-TSP-1AS
pSL2-TSP-1S
***
5
0
mock
sst2
IRES activity
(fold-induction of F-luc / R-luc)
A
2
***
1
0
pSL2TSP-1S
Fig. 2. PI3K- and IRES-dependent translational upregulation of TSP-1 by sst2.
(A and B) Immunoblots with an anti-TSP-1 (Upper), or anti- MMP-2 antibody
(Lower) using CM from BxPC-3/mock cells treated or not with 25 ␮M LY294002
(A), or from BxPC-3/mock,/wt sst2 or/mutated sst2-Y71F cells (B). (C) Bicistronic
constructs containing the two luciferase reporters, Renilla (R-luc) and firefly
(F-luc) are described (Left). The gray arrow represents the CMV promoter and
the black arrow the TSP-1 5⬘ UTR cloned forward (TSP-1S) or backward
(TSP-1AS). (D) Quantification of F-luc activity in BxPC-3/mock cells transfected
with either pGL3-TSP-1 or pSL2-TSP-1S (Left); quantification of TSP-1 IRES
activity as the ratio of F-luc/R-luc activities in BxPC-3/mock cells transfected
with pSL2-TSP-1AS or pSL2-TSP-1S (Middle), or in BxPC-3/mock and/sst2 cells
transfected with pSL2-TSP-1S (Right), and normalized with the F-luc/R-luc ratio
quantified in mock cells with pSL2-TSP-1AS (Middle), or with pSL2-TSP-1S
(Right).
BON, which endogenously expresses the sst2 receptor. Strikingly, challenging these cells with 10 nM RC-160 also upregulated TSP-1 protein expression by 1.82 ⫾ 0.44-fold (Fig. 1F).
Molecular Mechanisms for sst2-Dependent Upregulation of TSP-1
Expression. Excess activation of the Ras/PI3K pathway is a
hallmark of pancreatic cancer (16). We have previously demonstrated that sst2 inhibits PI3K activity through a mechanism
depending on a direct interaction between sst2 and the regulatory p85 subunit of PI3K (15). Upon treatment with SRIF, the
sst2/p85 association is disrupted resulting in a subsequent inactivation of PI3K activity (15). The possible involvement of PI3K
in TSP-1 regulation was therefore investigated in BxPC-3 cells
either treated with the PI3K inhibitor LY294002, or transfected
with the wild-type (wt) or, mutated Y71F, sst2. Mutating Y71 of
sst2 to F impedes the direct interaction between sst2 and p85,
thereby abrogating sst2-mediated inhibition of PI3K activity
(15). Interestingly, LY294002-mediated inhibition of PI3K activity in BxPC-3/mock cells stimulated TSP-1 expression, therefore mimicking sst2 action (Fig. 2A). More importantly, reverting
sst2-dependent inhibition of PI3K activity in BxPC-3/sst2-Y71F
cells decreased TSP-1 expression, as compared in BxPC-3/sst2wt
cells (Fig. 2B), demonstrating that sst2 increases TSP-1 expression by inhibiting the PI3K pathway.
Surprisingly, sst2 regulated TSP-1 mostly posttranscriptionally
since TSP-1 protein was upregulated to a greater extent by sst2
than mRNA for TSP-1 (9.40 ⫾ 2.82-fold vs. 2.81 ⫾ 0.05-fold,
respectively) (Fig. 1 A and B). We have previously demonstrated
that the inhibitor of cap-dependent translation 4E-BP1 is activated in BxPC-3/sst2 cells, sst2 increasing both its transcriptional
expression, and its activity by repressing PI3K activity (17, 18).
Furthermore, treatment of BxPC-3 cells with the mTOR inhibitor, rapamycin, which inhibits 4E-BP1 activity, does not affect
Laklai et al.
TSP-1 Inhibits Pancreatic Cancer Cell-Induced Angiogenesis by Sequestering VEGF. TSP-1 is known to inhibit endothelial cell migration
and/or to induce endothelial cell apoptosis, putatively acting by
affecting the bioavailability of proangiogenic factors including
VEGF in the extracellular matrix (21). Tubulogenesis assays,
using the human microvascular endothelial HMEC cells, showed
Laklai et al.
B
D
C
BxPC-3/sst2
siCTR
siTSP-1
Tumor Volume
(% of mock)
100
mock
sst2
60
20
***
300
200
100
0
E
0
siCTR
siCTR
siTSP-1
*
400
Tumor Volume
(% of siCTR)
sst2
BxPC-3 / sst2
siTSP-1
TSP-1
MMP-2
sst2
sst
2
BxPC-3
mo
ck
Surface of intervascular spaces
(% of mock)
H
mock
F
G
CK 19
lectin
SNA-lectin
merge
merge
400
mock
sst2
***
300
200
100
0
I
100
siCTR
siTSP-1
75
50
***
25
0
BxPC-3 / sst2
Fig. 3. TSP-1 inhibits the growth and angiogenesis of pancreatic tumors
xenografted onto the chick CAM. (A–D and F–I). Xenograft on the CAM of
BxPC-3/mock or/sst2 cells (A and F) or of BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR
or siTSP-1 (C and G). CAM pictures at day 4 using a stereomicroscope (A and C).
Histograms of tumor volumes 4 days postimplantation (B and D). Results are
expressed as normalized with volumes quantified in mock cells (A and B), or in
BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR (C and D). Confocal microscope analyses of the peritumoral CAM immunostained with a CK19 antibody or a
SNA-lectin recombinant protein. White arrows point to the intercapillary
spaces (F and G). Histograms of intercapillary space surfaces (H and I). Results
are expressed as normalized to the intervascular space surfaces quantified in
mock cells (F and H), or in BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR (G and I). (E)
Immunoblot of TSP-1 using CM of BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR or
siTSP-1. Results are presented as the mean ⫾ SEM of at least three independent
experiments.
a potent reduction (54 ⫾ 2%) of HMEC cell tube formation
when grown in conditioned media (CM) from sst2-, as compared
to mock-, expressing cells (Fig. 4 A and B). Conversely, abrogating TSP-1 expression in BxPC-3/sst2 cells partially reversed
sst2-mediated inhibition of HMEC cell tube formation, increasing cell tubulogenesis by 163 ⫾ 5% (Fig. 4 C and D). Apoptosis
was then quantified at the level of the executioner caspase-3
activation. A significant increase of HMEC cell apoptotic activity
(by 151 ⫾ 16%) was observed when these cells were grown in the
presence of CM from sst2-, as compared to mock-, expressing
BxPC-3 cells, which was then decreased (by 25 ⫾ 8%) while
TSP-1 expression was abrogated in BxPC-3/sst2 cells (Fig. 4E).
Interestingly, BxPC-3 cells express and secrete VEGF, but its
mRNA and protein expression is not affected by sst2 in these
cells (Fig. 4F). However TSP-1, secreted in BxPC-3/sst2 cell CM,
coimmunoprecipitates with VEGF (Fig. 4G), suggesting that
TSP-1 might inhibit VEGF-induced angiogenesis by sequestering this angiogenic factor. HMEC VEGFR2 tyrosine phosphorylation, which reflects its level of activation, was consistently
increased when HMEC cells were grown in CM, as compared to
PNAS 兩 October 20, 2009 兩 vol. 106 兩 no. 42 兩 17771
CELL BIOLOGY
the role for TSP-1 in tumor-suppressive and angioinhibitory
activity of sst2, the chick chorioallantoic membrane (CAM) was
used as an experimental in vivo model (19). Upon xenografting
tumor cells onto the CAM, the chick host provides the essential
living environment for cancer cells, including pancreatic, to
induce neoangiogenesis and to form tumors (19, 20). BxPC-3/
mock cells spread onto the CAM survived and proliferated to
form a solid cellular mass, while expression of sst2 abrogated
tumor growth by 81 ⫾ 7% (Fig. 3 A and B), confirming tumor
suppressor activity of sst2 in this animal model. Strikingly, CAM
surrounding the BxPC-3/mock-derived tumors showed a dense,
tortuous and tumor-like capillary network, as evidenced by lectin
immunostaining, where BxPC-3 cells form proangiogenic nodules, as visualized by anti-CK19 immunostaining (Fig. 3F, Upper). The density of this tumor-derived capillary network was
dramatically reduced when sst2 is expressed in BxPC-3 cells, as
quantified using the mean of the intervascular space surfaces,
indicated by white arrows, which was increased by 323 ⫾ 24%
(Fig. 3 F Lower, and H). This result indicated that the expression
of sst2 in pancreatic cancer cells potently inhibited tumorinduced angiogenesis in this in vivo model. To explore the role
for TSP-1 in sst2 angio-inhibitory action, BxPC-3/sst2 cells were
transfected with a siRNA targeting TSP-1 (siTSP-1), which
abrogated TSP-1 expression in BxPC-3/sst2 cell CM, as compared to control siRNA (siCTR) (Fig. 3E). The extinction of
TSP-1 partially reversed sst2-mediated inhibition of tumor
growth, as evidenced by an increase of sst2-expressing tumor
growth onto the CAM by 303 ⫾ 83% (Fig. 3 C and D). Moreover,
abrogating TSP-1 in BxPC-3/sst2 cells also completely reestablished tumor angiogenesis of the CAM surrounding sst2expressing tumors where the surface of the intervascular spaces
was decreased by 59 ⫾ 5% (Fig. 3 G and I). These results
indicated that TSP-1 is critical for tumor suppressor activity of
sst2 with both autocrine inhibitory effect on pancreatic cancer
cell growth and paracrine angio-inhibitory activity.
BxPC-3
mock
Surface of intervascular spaces
(% of siCTR)
Upregulation of TSP-1 Expression Is Required for SRIF-Activated sst2
to Inhibit Pancreatic Tumor Growth and Angiogenesis. To investigate
A
BxPC-3/sst2
siCTR
siTSP-1
siTSP-1
siCTR
TSP-1 expression, suggesting a cap-independent process in the
control of TSP-1 mRNA translation. In the search for the
presence of a cap-independent internal ribosome entry site
(IRES) in TSP-1 mRNA, its 5⬘ UTR has been inserted between
two reporter genes (Renilla and firefly luciferases) of a bicistronic CMV-based expression vector in a sense (pSL2-TSP-1S)
or antisense (pSL2- TSP-1AS) orientation, as described in Fig.
2C. To exclude the possibility that the TSP-1 5⬘ UTR possesses
an intrinsic promoter activity that could induce a bias in data
interpretation, an additional bicistronic vector carrying the
TSP-1 5⬘ UTR, but without CMV promoter (pGL3-TSP-1), was
also created. No significant firefly activity was detected with the
pGL3-TSP-1 vector (lacking CMV promoter) as compared with
pSL2-TSP-1S (containing CMV promoter), indicating that
TSP-1 5⬘ UTR does not contain a cryptic promoter (Fig. 2D,
Left). A 5.7 ⫾ 0.3-fold increase of the normalized firefly/Renilla
luciferase activity was then observed after transfecting BxPC-3/
mock cells with the pSL2-TSP-1S, as compared with the pSL2TSP-1AS, vector (Fig. 2D, Middle), indicating the existence of an
IRES in the TSP-1 5⬘ UTR which is active in BxPC-3 cells.
Interestingly, IRES activity in TSP-1 5⬘ UTR was enhanced
(1.56 ⫾ 0.04-fold) in cells that express sst2 as compared to mock
cells (Fig. 2D, Right).
A
B
BxPC-3
sst2
siTSP-1
Normal
***
20
0
180
**
140
siCTR
siTSP-1
100
60
20
0
G
*
34 µm
BxPC-3
mock sst2
100
60
20
0
mock
sst2
BxPC-3/sst2
VEGF
H
BxPC-3
mock sst2
NT
VEGF mock sst2
BxPC-3/sst2
siCTRsiTSP-1
TSP-1
P-Y
VEGF
VEGFR-2
ip VEGFR-2
Fig. 4. Mechanisms for TSP-1-mediated inhibition of angiogenesis. (A–D)
Endothelial cell tubulogenesis assay using HMEC cells seeded on top of a
matrigel and incubated with CM from BxPC-3/mock or/sst2 cells (A), or from
BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR or siTSP-1 (C). Histograms as quantified
by counting number of HMEC cell tube branchings, and as normalized to the
number of branchings quantified in mock cells (A and B), or in BxPC-3/sst2 cells
transfected with siCTR (C and D). (E) Executioner caspase activity assayed in
HMEC cells treated with CM from BxPC-3/mock- or/sst2 cells (Left), or from
BxPC-3/sst2 cells transfected with siCTR or siTSP-1 (Right), and as normalized
with caspase activity measured in mock cells (Left), or in BxPC-3/sst2 cells
transfected with siCTR (Right). (F) Expression of VEGF mRNA (Left) or protein
(Right) in BxPC-3/mock or/sst2 cells assessed by qRT-PCR or immunoblot using
an anti-VEGF antibody, and as normalized to VEGF mRNA quantified in mock
cells (Left). (G) Co-IP of TSP-1, assessed by Western blot using an anti-TSP-1
antibody, with VEGF in anti-VEGF antibody immunoprecipitates using CM
from BxPC-3/mock or/sst2 cells (Upper). VEGF immunoblot to control equal
VEGF IP (Lower). (H) VEGFR-2 tyrosine phosphorylation analysis by Western
blot using an anti-tyrosine phosphorylation antibody in anti-VEGFR-2 antibody immunoprecipitates from HMEC cells treated with VEGF, or with non-CM
(NT), or with CM from BxPC-3/mock or/sst2 cells, or from BxPC-3/sst2 cells
transfected with siCTR or siTSP-1 (Upper). VEGFR-2 immunoblot to control
equal VEGFR-2 IP (Lower). Results are presented as the mean ⫾ SEM and are
representative of three independent experiments.
non-CM, from BxPC-3/mock cells (Fig. 4H). This was seen also
in HMEC cells treated with 30 ng/mL of VEGF, indicating that
BxPC-3-secreted VEGF is active on HMEC cells. More importantly, treatment of HMEC cells with CM from sst2-expressing
BxPC-3 cells, as compared to mock-expressing, resulted in a
decrease of tyrosine phosphorylation of VEGFR2. This was
completely reversed when TSP-1 expression was silenced in
BxPC-3/sst2 cells. These results demonstrated that TSP-1 is a
critical effector of angioinhibitory action of sst2 acting by
decreasing bioavailability of VEGF.
Correlation and Biphasic Pattern of sst2 and TSP-1 Expression during
the Pancreatic Neoplastic Process. After identifying TSP-1 as a
critical effector of sst2 tumor-suppressive activity in human
17772 兩 www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0908674106
Adenocarcinoma
ip VEGF
TSP-1
MMP-2
20
0
B
VEGF
60
Normal
100
100
mRNA expression
(% of mock)
140
F
siCTR
siTSP-1
20
0
BxPC-3/sst2
Cancer-adjacent tissue
« pancreatitis »
DEVDase activity
(% of mock)
180
mock
sst2
**
DEVDase activity
(% of siCTR)
E
60
Adenocarcinoma
Tube ramifications
(% of siCTR)
siCTR
60
Cancer-adjacent tissue
« PanIN »
D
BxPC-3/sst2
mock
sst2
Cancer-adjacent tissue
« pancreatitis »
C
sst2
100
Tube ramifications
(% of mock)
mock
Cancer-adjacent tissue
« PanIN »
A
34 µm
C
Normal duct
Cancer-adjacent
tissue
Adenocarcinoma
negative
9/9 (100%)
3/10 (30%)
32/50 (64%)
positive
0/9 (0%)
7/10 (70%)
18/50 (36%)
negative
9/9 (100%)
0/10 (0%)
positive
0/9 (0%)
10/10 (100%)
sst2
32/50 (64%)
TSP-1
18/50 (36%)
Fig. 5. Expression of sst2 and TSP-1 proteins. (A–C) Immunohistochemistry
using anti-sst2 (A) or anti-TSP-1 (B) antibody on high-density pancreatic
tissue-microarrays including triplicate cores of 60 cases of pancreatic tumors
and of nine cases of normal pancreas.
pancreatic cancer cells, we explored expression of both proteins
during human pancreatic neoplastic process. A good correlation
between sst2 and TSP-1 expression was observed during the
evolution of the cancerous lesions, as demonstrated using pancreatic tissue-microarrays (Fig. 5 A–C). Both sst2 and TSP-1 are
not expressed in ducts and are only faintly detectable in normal
pancreatic acinar cells (n ⫽ 9), whereas they are strongly
expressed in Langerhans islets. Interestingly, both proteins are
strongly expressed in nearly all cancer-adjacent pancreatic tissues (70–100%), but absent in most of pancreatic adenocarcinomas (64%), from involved patients (n ⫽ 60). The pancreatic
cancer-adjacent tissues present lesions of chronic pancreatitis
and precancerous lesions of PanIN (pancreatic intraepithelial
neoplasia), which stained positive for both sst2 and TSP-1. These
results suggest a biphasic pattern of sst2 and TSP-1 expression
during the pancreatic neoplastic process with an increase in the
Laklai et al.
Discussion
We have herein revealed a mechanism underlying sst2 oncosuppressive and angioinhibitory actions in pancreatic cancer involving the upregulation of a critical inhibitor of angiogenesis, TSP-1.
Knocking-down TSP-1 consistently abrogated in vivo sst2 antineoplastic activity.
Tumor progression is a multistep process that requires that
tumor cells acquire sustained neoangiogenesis. The net balance
of angiogenic factors versus inhibitors defines the final angiogenic phenotype of the tumor. A disturbance in this dynamic
balance determines whether the angiogenic switch does or does
not occur in the tumor microenvironment. Interestingly, downregulation of TSP-1 expression represents a common event
characterizing the switch of several dormant tumors to fastgrowing angiogenic tumors (22), highlighting the critical role of
this multifunctional matrix protein in tumor progression. TSP-1
is a 450-kDa homotrimeric glycoprotein and the first naturally
occurring angiogenic inhibitor to be discovered (21). TSP-1 acts
directly on endothelial cells, through CD36, CD47, and/or
integrin receptors. It also acts indirectly by affecting the bioavailability of angiogenic factors, including VEGF, in the extracellular matrix, subsequently inhibiting or inducing endothelial
cell migration or apoptosis, respectively (21). Our results clearly
demonstrate that, by upregulating TSP-1 expression, SRIFactivated sst2 affects the organization of endothelial cell into a
capillary network and apoptosis. We also showed that TSP-1 acts
by sequestering VEGF secreted by tumor cells (21). These
findings reveal an indirect mechanism for SRIF-mediated inhibition of VEGF action, in addition to its previously described
direct effect on the inhibition of VEGF expression (9).
The demonstration of increased TSP-1 expression induced by
SRIF-activated sst2 was shown in two human pancreatic cancer
cell models expressing sst2 either endogenously (BON cells) or
upon transfection (BxPC-3 cells). Because BON cells also endogenously express sst3 and sst5, which present high bindingaffinities (nM range) for RC-160, we cannot exclude that TSP-1
expression is increased through activation of one or both of these
other ssts, in addition to sst2. Surprisingly, sst2-dependent upregulation of TSP-1 expression occurs through partially transcriptional but mostly translational events, involving a previously
undescribed IRES in the 5⬘-UTR of the TSP-1 mRNA. IRESdependent translation may represent an alternate mechanism for
sst2 to upregulate expression of antiangiogenic or growthinhibiting proteins. These may include TSP-1 and connexins, as
sst2 blocks cap-dependent translation (17, 18). Interestingly,
posttranscriptional TSP-1 gene regulation has been previously
demonstrated to depend on RNA turnover of TSP-1 (23), thus
emphasizing the diversity of posttranscriptional mechanisms that
can control TSP-1 expression. In addition to sst2-dependent
upregulation of TSP-1, TSP-1 expression is negatively or positively regulated by numerous oncogenes or tumor suppressor
genes, including Ras, Myc, c-jun, p53, PTEN, and Smad4, thus
further strengthening its role as an inhibitor of tumor growth
(21). In addition, our demonstration that sst2-dependent inhibition of PI3K activity is required for sst2 to upregulate TSP-1
is consistent with the dependence on PI3K activation of Ras to
inhibit TSP-1 (21). By inhibiting PI3K activity (15), sst2 may
affect both transcriptional- and/or IR ES translationaldependent regulation of TSP-1.
The observation that sst2 and TSP-1 expression is simultaneously upregulated in epithelial pancreatic cells during the
preneoplastic stages of human pancreatic cancer development,
and is then lost in most cases of PDAC, reveals a good correlation of expression of both tumor suppressor proteins during
pancreatic carcinogenesis. This could be interpreted as a mechLaklai et al.
anism of host defense against tumor neoangiogenesis and metastasis. Recently, the tumor-suppressive role of TSP-1 has also
been demonstrated to rely, in cervical carcinogenesis, on the
inhibition of the fibroblastic stroma reaction (24), thus creating
a permissive environment for tumor progression. High TSP-1
levels in early PDAC lesions could therefore impede the dialogue between epithelial cancer and stromal cells, thus preventing the development of a stromal reaction favorable to tumor
development. A biphasic pattern of TSP-1 expression has been
also described in skin carcinogenesis, with a high TSP-1 expression in early neoplastic lesions, followed by the loss of TSP-1
expression, observed in malignant invasive cutaneous squamous
cell carcinoma, resulting in tumor vascularization and malignant
progression. Knock-out of TSP-1 has been consistently shown to
accelerate dysplasic changes during early stages of tumor initiation in a genetic intestinal carcinogenesis model (21). In
addition, an upregulation of sst2 expression has been observed
in peritumoral veins (3). This may also represent a negative
feedback against tumor neoangiogenesis and metastasis. Loss of
sst2 and TSP-1 expression in epithelial cancer cells in late stages
of pancreatic carcinogenesis most probably results from genetic
and epigenetic events, which have been specifically described in
PDAC, and include sst2 promoter hypermethylation (25), and a
gain/loss of function of several oncogenes/tumor suppressors
that regulate TSP-1 expression [including Kras/p53 or Smad4
(21), respectively]. Interestingly, TSP-1 has been shown here to
be poorly expressed in the abundant fibroblastic reaction that
surrounds PDAC (Fig. 5B). Consistently, fibroblast-derived expression of TSP-1 has been demonstrated to be strongly decreased when fibroblasts are exposed to the soluble factors
derived from epithelial cancer cells that specifically harbor an
activating mutation of Kras (26). This provides an elegant
mechanism whereby cancer cells modulate the properties of their
adjacent normal stroma to foster neoangiogenesis. Kras is
mutated in 90% of pancreatic cancer cells (16), which may
explain our observation that TSP-1 expression is absent in PDAC
stroma.
Our hypothesis is that early genetic alterations and inflammation that occur in preneoplastic pancreatic epithelial and
stroma cells, respectively, result in upregulation of the expression
of sst2, as it has previously been reported in endothelial cells and
monocytes upon activation (12, 27), and subsequently of its
target TSP-1. This may serve as negative feedback to restrain
carcinogenesis. Similarly, a potent upregulation of sst2 expression by estrogens has been observed in breast cancer that express
estrogen receptor, which has been interpreted as a negative
regulatory control on estrogen-induced cell growth (28). An
understanding of how inflammatory processes and key cancer
pathways, including sst2 and its targets, may shape tumor stroma
ontogeny in preinvasive lesions of pancreatic cancer may reveal
therapeutic options for this deadly malignancy. Furthermore,
identifying the TSP-1/VEGF axis as a target of sst2 offers a
rationale for the use of sst2-preferring analogs and also of
SRIF-analogs for the treatment of angiogenic tumors that
express sst2, including pancreatic endocrine tumors.
Materials and Methods
Capillary-Like Structure Formation. Tubulogenesis was assessed in Matrigel (BD
Biosciences) using HMEC cells grown (18 h) in the presence of CM collected
from BxPC-3 cell cultures. Angiogenic activity was quantified by counting the
number of endothelial cell tube branchings in each well.
Executioner Caspase Activity Assay. Executioner caspase activity was assayed
using HMEC cells grown (24 h) in the presence of CM collected from BxPC-3 cell
cultures with the Quantipak kit (Biomol International).
CAM Assay. Fertilized chicken eggs (Morizeau, France) were incubated at 37 °C
and 80% humidified atmosphere. On day 4 of development, a window was cut
out in the eggshell. On embryonic day 10, 2 ⫻ 106 cells in 30 ␮L were deposited
PNAS 兩 October 20, 2009 兩 vol. 106 兩 no. 42 兩 17773
CELL BIOLOGY
expression during the early precancerous stages, and then a loss
of expression at the late stages of in situ or invasive carcinoma.
onto the CAM. On day 14, tumor volumes were estimated by the equation V ⫽
4/3r3, with r ⫽ 1/2公(d1⫻d2). CAMs were fixed in situ with paraformaldehyde,
and areas surrounding tumors were cut out for analysis by immunohistochemistry. Pictures of CAM were taken under a stereomicroscope (Nikon SMZ800)
using a digital camera (Nikon Coolpix 950).
Immunohistochemistry. Fixed CAMs were incubated successively with biotinylated lectin SNA (Vector Laboratories), cytokeratin-19 antibody (Abcam),
and, finally secondary streptavidin Alexa Fluor 488 and 647 antibodies (Molecular Probes). Sections were examined under a Zeiss laser scanning confocal
microscope LSM510. TMA contain triplicate cores of 60 cases of pancreatic
tumors and nine cases of normal pancreas (US Biomax). Tumor xenografts
were started with the s.c. inoculation of BxPC-3/mock or/sst2 cells into athymic
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female mice. Deparaffinized tissue sections of TMA or of tumor xenografts
were placed in citrate buffer, pH 6.0, heated in microwave oven for 3 ⫻ 5 min,
probed with TSP-1 (NeoMarkers) or sst2 antibody (generated in our laboratory), and then with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody
(Dako). A solution of 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) was used as chromogen
(Dako), and sections were counterstained with hematoxylin.
For a list of reagents and sources, and methodological details, see SI Text.
ACKNOWLEDGMENTS. This work was supported by Association pour la Recherche Contre le Cancer Grant 3899, Ligue Nationale Contre le Cancer Grant
RAB09006BBA, Canceropole Grand Sud-Ouest Grant RMA04002BPA, Agence
Nationale pour la Recherche Project R06423BS, and University Paul Sabatier of
Toulouse Grant CR27 A01BQR-2007. H.L. is recipient of a fellowship from
INSERM-Région Midi-Pyrénées. S.L. is recipient of a fellowship from LNCC.
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