Tomographie par cohérence optique

Tomographie par Cohérence Optique
Arnaud Dubois
Laboratoire Charles Fabry, CNRS UMR 8501, Institut d’Optique Graduate School, Université Paris-Sud,
2 avenue Augustin Fresnel, 91127 Palaiseau Cedex, France
[email protected]
25 janvier 2011
1. Introduction
Dans le domaine biomédical, tant pour les activités cliniques qu’en recherche, des techniques d’imagerie
de plus en plus performantes sont requises, capables de fournir des images en 3 dimensions avec une
résolution atteignant l’échelle cellulaire. Plusieurs techniques, permettant d’obtenir des images
morphologiques ou fonctionnelles, sont couramment utilisées : l’imagerie par résonance magnétique (IRM),
la tomographie par rayons X, l’échographie et la microscopie optique. L’IRM peut atteindre une résolution
d’environ 10 µm en appliquant des champs magnétiques très intenses. Cette technique s’avère néanmoins
très onéreuse et pose de sérieuses difficultés pratiques. La tomographie X peut également révéler des
microstructures avec une résolution d’environ 10 µm mais nécessite alors un système de micro-focalisation
très élaboré et de complexes algorithmes de reconstruction d’images. L’échographie, avec des ondes
ultrasonores de haute fréquence (10-100 MHz), permet d’atteindre une résolution proche de 50 µm, jusqu’à
des profondeurs de quelques millimètres. Les méthodes optiques, en raison de la longueur d’onde de la
lumière beaucoup plus courte que celle des ultrasons, offrent une résolution potentielle très supérieure. La
microscopie confocale, notamment, est une technique d’imagerie tridimensionnelle de résolution submicrométrique, aujourd’hui incontournable en biologie. La profondeur accessible est toutefois limitée à
quelques centaines de micromètres dans les tissus biologiques en raison de la forte diffusion de la lumière.
En outre, l’imagerie in vivo est difficile à cause des temps d’acquisition relativement longs et de la toxicité
de certains agents de contraste. La microscopie non-linéaire, développée récemment grâce aux progrès des
lasers à impulsion ultra-brèves (10-100 femtosecondes), permet d’améliorer la profondeur accessible en
raison d’une longueur d’onde d’excitation dans le proche infrarouge, généralement autour de 800 nm, où
l’absorption des tissus est minimale. L’utilisation de marqueurs fluorescents est toutefois généralement
nécessaire.
Figure 1 : Comparatif des performances des techniques classiques d’imagerie des milieux biologiques en termes de
résolution spatiale et de profondeur accessible. Source : D. Sampson
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La tomographie par cohérence optique, communément désignée par l’acronyme anglais OCT (optical
coherence tomography), est une technique d’imagerie optique dont la première démonstration remonte à
vingt ans [Huang 1991]. L’OCT est analogue à l’échographie, à la différence que les ultrasons sont
remplacés par de la lumière. En mesurant le temps de parcours des ondes lumineuses réfléchies ou
rétrodiffusées par les structures internes d’un objet, il est possible de déterminer à quelles profondeurs se
situent ces dernières [Fercher 1996]. Des images en 2 voire 3 dimensions d’un objet semi-transparent
peuvent ainsi être obtenues en balayant le faisceau lumineux envoyé sur l’objet [Fujimoto 1995, Tearney
1996]. Le contraste des images OCT résulte des inhomogénéités de l’indice de réfraction au sein de l’objet.
La technique ne nécessite pas l’emploi d’agents de contraste. Elle est sans contact, contrairement à
l’échographie, et utilise de la lumière infrarouge inoffensive. La résolution spatiale de l’OCT, meilleure que
celle de l’IRM, de l’imagerie X, ou de l’échographie, s’approche de celle de la microscopie optique. Enfin la
profondeur d’imagerie accessible est supérieure à celle de la microscopie.
2. Principe de l’OCT
Si le concept de l’OCT est analogue à celui de l’échographie, ces deux techniques présentent toutefois
une différence fondamentale. En effet, à cause de la vitesse de la lumière, les variations de temps de parcours
ne peuvent pas être mesurées directement. En OCT, ces mesures sont effectuées de manière indirecte, par
corrélation, au moyen d’un interféromètre éclairé par de la lumière polychromatique. Le schéma du dispositif
expérimental de l’OCT classique est représenté sur la figure 1. Un interféromètre de type Michelson, à fibres
optiques, est éclairé par une source de lumière de spectre large. Cette lumière est séparée en 2 parties ; l’une
est envoyée dans le bras de référence et l’autre vers l’objet placé dans le deuxième bras de l’interféromètre.
A la sortie de l’interféromètre, des interférences se produisent à condition que la différence de longueur
optique des deux bras soit inférieure à la longueur de cohérence de la lumière. En faisant varier la longueur
du bras de référence (généralement par déplacement du miroir de référence), on peut sonder la profondeur de
l’objet. En effet, lorsque l’égalité des trajets optiques dans les 2 bras de l’interféromètre correspond à une
profondeur dans l’objet où se trouve une structure réfléchissante (ou rétro-diffusante), des interférences se
produisent (voir figure 2). En enregistrant l’amplitude des interférences au cours du déplacement du miroir
de référence, on peut accéder à la distribution des structures internes de l’objet en fonction de leur
profondeur. Ce « sondage » de la profondeur est réalisé à différents endroits dans l’objet en balayant le
faisceau lumineux. On obtient ainsi une image tomographique orientée perpendiculairement à la surface de
l’objet.
Figure 2 : Dispositif d’OCT classique. Le déplacement du miroir de référence permet de sonder la profondeur dans
l’objet tandis que le faisceau dans le bras objet est balayé. L’enveloppe du signal d’interférence détecté permet de
construire une image des structures internes de l’objet ayant réfléchi de la lumière.
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Figure 3 : Illustration du principe de l’OCT. L’interférogramme, obtenu par balayage de la longueur du bras de
référence, permet après extraction de son enveloppe, de déterminer la profondeur d’une structure réfléchissante dans
l’objet avec une résolution donnée par la longueur de cohérence de la source lumineuse.
3. OCT fréquentielle
Récemment, une autre technique d’OCT a connu un développement spectaculaire : l’OCT fréquentielle
[Wojtkowski 2002, Nassif 2004]. Expérimentalement, la différence essentielle de l’OCT fréquentielle, par
rapport à l’OCT temporelle, est que le bras de référence de l’interféromètre a une longueur fixe (voir figure
3). Au lieu de faire varier sa longueur afin d’accéder à l’information en profondeur, on analyse le spectre du
signal d’interférence (d’où l’adjectif « fréquentielle »). On obtient ensuite l’information en profondeur par
calcul de la transformée de Fourier du spectre mesuré [Fercher 1995].
Considérons une structure réfléchissante à l’intérieur de l’objet. Le spectre de la lumière à la sortie de
l’interféromètre présente une modulation à cause des interférences de la lumière réfléchie par la structure
avec la lumière réfléchie par le miroir de référence. Ces interférences sont en effet périodiquement
constructives et destructives selon le nombre d’onde (inverse de la longueur d’onde) ; on dit que le spectre
est cannelé. La fréquence de cette modulation est proportionnelle à la différence de marche dans
l’interféromètre. La profondeur de la structure (par rapport à la position correspondant à la différence de
marche nulle) est donc directement donnée par la fréquence de modulation du spectre. La transformée de
Fourier du spectre donne trois composantes ; celle correspondant à la fréquence positive (fréquence de
modulation du spectre) indique donc la position de la structure. Ce pic est similaire à celui qui serait mesuré
en OCT temporelle par extraction de l’enveloppe des franges de l’interférogramme.
En pratique, l’objet possède une multitude de structures partiellement réfléchissantes (ou rétrodiffusantes) situées à des profondeurs diverses ; le spectre mesuré présente alors une modulation complexe
résultant de la somme de modulations sinusoïdales de fréquences et amplitudes différentes. La transformée
de Fourier de ce spectre fournit la distribution en profondeur de toutes ces structures. Tout comme en OCT
temporelle, on peut sonder la profondeur de l’objet à différents endroits en balayant le faisceau lumineux et
obtenir ainsi des images tomographiques orientées selon l’axe du faisceau.
Figure 4 : Dispositif d’OCT fréquentielle à spectromètre. Le spectre du signal d’interférence, après transformée de
Fourier, fournit la distribution en profondeur des structures réfléchissantes dans l’objet.
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Le principe de l’OCT fréquentielle présente un avantage intrinsèque par rapport à celui de l’OCT
temporelle en termes de rapport signal sur bruit [Choma 2003, Leitgeb 2003]. En effet, en OCT fréquentielle
toute la lumière provenant de l’objet contribue en permanence au signal. En OCT temporelle, en revanche, à
tout instant seule une faible partie de la lumière provenant de l’objet contribue aux interférences détectables ;
cette proportion de lumière utile est d’autant plus faible que la longueur de cohérence est petite. Grâce à cet
avantage, l’OCT fréquentielle permet de produire des images à grande vitesse avec une définition supérieure.
Il est même possible de produire des images en 3 dimensions à haute cadence.
Notons qu’il existe deux méthodes pour mesurer le spectre en OCT fréquentielle. Un spectromètre à
réseau, associé à une barrette de détecteurs, permet de mesurer le spectre en parallèle. Une autre technique
consiste à balayer la longueur d’onde de la source lumineuse et d’enregistrer l’intensité du signal
d’interférence en fonction de la longueur d’onde [Yun 2003]. Le balayage de la longueur du bras de
référence de l’OCT temporelle est ici remplacé par un balayage de la longueur d’onde. Ce dernier peut
toutefois être effectué très rapidement, ce qui ne limite pas la vitesse de production des images.
Figure 5 : Illustration du principe de l’OCT fréquentielle. Le spectre du signal d’interférence présente une modulation
dont la période dépend de la profondeur de la structure réfléchissante. La transformée de Fourier de ce spectre modulé
permet de connaitre la profondeur de la structure avec une résolution inversement proportionnelle à la largeur de
l’enveloppe du spectre, égale à la longueur de cohérence de la source lumineuse.
4. Résolution spatiale
L’une des particularités de l’OCT est que les résolutions transverse et axiale sont déterminées par des
paramètres indépendants : la résolution transverse est donnée par la taille du faisceau focalisé sur l’objet,
alors que la résolution axiale est déterminée par la longueur de cohérence de la lumière détectée. L’OCT
requiert donc une source lumineuse de spectre large, comme le montre la formule ci-dessous exprimant la
résolution axiale z en fonction de la largeur spectrale  et de la longueur d’onde centrale  de la lumière
de spectre supposé Gaussien, ainsi que de l’indice de réfraction n du milieu :
z 
2 ln 2   2 


n   
La source lumineuse doit en outre posséder une cohérence spatiale élevée pour que la valeur de
l’éclairement au niveau de l’objet permette un balayage rapide. Les diodes super-luminescentes, sources à
base de matériaux semi-conducteurs issues des technologies des télécommunications, sont bien adaptées pour
l’OCT ; elles offrent une résolution axiale de 10 à 15 µm au voisinage des longueurs d’onde de 800 nm ou
1300 nm typiquement. Depuis quelques années, beaucoup d’effort ont été réalisés pour améliorer la
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résolution spatiale de l’OCT. Atteindre l’échelle de la cellule est important pour de nombreuses applications,
en particulier pour détecter les modifications de l’état de cellules susceptibles de donner lieu à des cancers.
Ces travaux ont largement profité des progrès récents réalisés dans le domaine des sources lasers et de
l’optique non linéaire. En 1999, une résolution de 1 micromètre a été atteinte avec un laser à base de titane
dopé au saphir émettant des impulsions de 5 femtosecondes, un record à l’époque [Drexler 1999]. Des lasers
constitués de fibres optiques amplificatrices de lumière ont également été utilisés. Une autre catégorie de
source lumineuse prometteuse est basée sur le phénomène non linéaire de génération de supercontinuum se
produisant dans les fibres dites à cristal photonique, fibres optiques dont le cœur contient des micro-canaux
d’air s’étendant continûment le long de leur axe [Wang 2003].
3. Applications de l’OCT
Ophtalmologie
L’OCT est aujourd’hui une technique standard en ophtalmologie, disponible commercialement.
Probablement aucune autre technique d’imagerie n’a été adoptée aussi vite par le milieu médical [Swanson
1993]. Seule technique permettant de visualiser les différentes couches constitutives de la rétine humaine in
situ, l’OCT est devenue un outil indispensable pour le diagnostic et le suivi de pathologies rétiniennes telles
que la dégénérescence maculaire liée à l’âge et la rétinopathie diabétique, pathologies représentant les
principales causes de cécité dans les pays industrialisés [Nassif 2004]. Un exemple d’image tomographique
de rétine saine, obtenue par OCT fréquentielle, est présenté sur la figure 6. Les dernières technologies
d’OCT permettent également de visualiser de nombreuses zones du segment antérieur de l’œil comprenant la
cornée, l’iris et le cristallin [Trefford 2008]. L’angle irido-cornéen, mesuré par l’OCT, est un paramètre
pertinent pour le diagnostic et le suivi du glaucome.
Figure 6 : Image OCT d’une rétine humaine présentant un trou maculaire.
Figure 7 : Image OCT du segment antérieur d’œil humain.
Médecine interne
La technologie de l’OCT, à base de fibres optiques, peut être facilement couplée à des systèmes optiques
conçus pour l’imagerie médicale interne [Yun 2006].
L’OCT est capable de révéler des modifications de la morphologie architecturale des tissus généralement
associées au développement de carcinomes. Pratiquée à l’aide d’un endoscope, l’OCT permet l’examen des
tissus superficiels des parois internes de l’œsophage et du colon afin d’y déceler des anomalies [Chen 2007,
Adler 2007]. Les performances actuelles de l’OCT ne permettent malheureusement pas encore d’établir un
diagnostic suffisamment fiable pour éviter de pratiquer une biopsie suivie d’un examen histologique. L’OCT
peut s’avérer néanmoins très utile pour repérer les zones suspectes in situ, réduisant ainsi le risque de
mauvais prélèvements.
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Figure 8 : Image in vivo de colon de lapin par OCT endoscopique (a), avec coupe histologique correspondante (b). On
distingue la muqueuse supérieure (cm), la muqueuse musculaire (mm), la sous-muqueuse (sm), et la propria musculaire
(me).
Figure 9 : Image in vivo d’œsophage humain par OCT endoscopique. L’image de tissus sains (en haut) révèle une
structure en couche avec un épithélium (ep) bien défini au-dessus de la propria lamina (lp). Les couches plus profondes
correspondant à la muqueuse musculaire (mm), la sous-muqueuse (sm) et la propria musculaire (mp) sont également
visibles. L’image du bas correspond à des tissus atteints du syndrôme de Barrett. L’organisation des tissus en couches
distinctes a disparu ; on remarque la présence de structures glandulaires caractéristiques.
Les syndromes coronariens aigus résultent souvent de la formation de plaques de cholestérol sur les
parois internes des artères. La rupture de ces plaques peut entraîner des occlusions déclenchant alors des
accidents vasculaires cérébraux ou des infarctus du myocarde. Ces plaques instables sont difficiles à observer
par les méthodes radiologiques classiques telles que l’angiographie. L’OCT a montré une grande efficacité
pour l’imagerie intra-vasculaire pratiquée dans les artères au moyen d’un cathéter très fin utilisant une fibre
optique [Tearney 1996].
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Figure 10 : Imagerie intravasculaire par OCT. (a) image OCT ex-vivo et coupe histologique montrant la présence de
plaques. (b) cathéter OCT à base de fibre optique. (c) image OCT par cathéter d’aorte de lapin in vivo. (d) images OCT
d’artère humaine in vivo.
Autres domaines d’application
L’OCT trouve également des applications en recherche fondamentale, pour la biologie du
développement, l’imagerie du petit animal ou encore l’ingénierie des tissus. Le caractère non-invasif de la
technique, sans avoir recours à aucun agent de contraste pour produire des images proches de celle obtenues
en histologie est ici particulièrement intéressant. Les applications de l’OCT ne se limitent pas à l’imagerie
des milieux biologiques. L’OCT peut également être utilisée pour l’étude de matériaux divers de manière
non invasive à condition qu’ils soient suffisamment transparents à la lumière [Wiesauer 2005]. On peut
mentionner notamment les applications dans le domaine des œuvres d’arts ou encore pour les recherches sur
les matériaux papiers.
Figure 11 : Images de peau humaine (in vivo) au niveau de l’ongle (haut-gauche), de la paume (haut-droite), et de
l’extrémité du doigt (bas-gauche). On distingue notamment le stratum cornéen (SC), la jonction derme-épiderme (DEJ),
l’épiderme (ED), des pores de transpiration (ED), et l’ongle (N).
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5. Extensions de l’OCT
Les images d’OCT, basées sur la mesure de l’amplitude de la lumière réfléchie ou rétrodiffusée,
apportent des informations morphologiques. Plusieurs extensions à la technique d’OCT ont été développées
afin d’offrir d’autres modes de contraste révélateurs de différentes propriétés et mettre en évidence diverses
fonctionnalités.
Ainsi, l’OCT spectroscopique permet de mesurer le spectre de la lumière en provenance de tout point de
l’objet [Morgner 2000, Leitgeb 2000, Adler 2004]. Cette technique apporte un contraste supplémentaire aux
images, permettant de mieux différencier certains composants. Les chromophores, notamment, peuvent ainsi
être imagés de manière quantitative. Des indicateurs métaboliques tels que l’hydratation ou l’oxygénation de
l’hémoglobine peuvent également être mesurés par cette technique.
La biréfringence est une propriété optique propre à certains matériaux qui se caractérise par la faculté de
modifier la polarisation de la lumière. L’OCT est capable d’imager et mesurer la biréfringence des tissus [De
Boer 1997, Jiao 2002]. Des changements au niveau de la structure du cartilage peuvent être ainsi détectés,
symptômes précoces de l’ostéo-arthrose, maladie caractérisée par une lente érosion du cartilage des
articulations. La profondeur et le degré de brûlures de la peau, ou encore l’épaisseur de la couche des fibres
nerveuses de la rétine peuvent également être caractérisés par des mesures de biréfringence.
Enfin, l’OCT « doppler » permet de mesurer des différences dans les vitesses de déplacement de certaines
parties de l’objet [Wang 1995]. Cette technique est basée sur l’effet doppler qui se traduit par une
modification de la fréquence d’une onde perçue par un détecteur en fonction de la vitesse de l’émetteur de
l’onde par rapport à ce détecteur. L’OCT doppler s’est avérée être un mode d’imagerie très performant pour
mesurer les flux d’écoulements sanguins dans les tissus irrigués. Dans le micro-système vasculaire de la
rétine notamment, des flux sanguins ont pu être mesurés en fonction du cycle cardiaque (voir figure 14). La
technique semble également prometteuse pour mesurer la densité capillaire et l’angiogénèse [Wang 2007].
Figure 12 : Image par OCT spectroscopique d’un embryon de zebrafish, in vivo [Adler 2004].
Figure 13 : Images par OCT en polarisation d’un échantillon prélevé de queue de boeuf. (a) image d’intensité montrant
la stucture interne de l’échantillon. (b) image de phase révélant une forte biréfringence liée à la présence de structures
fortement organisées, notamment des fibriles de colagène. Source : THORLABS, Inc
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Figure 14 : Imagerie par OCT Doppler de vaisseaux sanguins dans une rétine humaine. (a) image structurale
classique. (b) image Doppler révélant la présence de deux vaisseaux dans lesquels l’écoulement sanguin s’effectue dans
des sens opposés [Szkulmowska 2009].
5. L’OCT plein champ
Principe
Une approche alternative à l’OCT temporelle et fréquentielle a été développée récemment, dans laquelle
les images sont obtenues sans balayage de faisceau. Dans cette technique, appelée OCT plein champ, des
images tomographiques en face (orthogonales à l’axe du faisceau d’éclairage) sont produites par
combinaison d’images interférométriques acquises au moyen d’une caméra, en éclairant tout le champ imagé
avec de la lumière de faible cohérence temporelle et spatiale [Dubois 2002, Vabre 2002, Dubois 2004]. Le
principe de l’OCT plein champ est basé sur celui de la microscopie interférentielle en lumière blanche.
Le dispositif expérimental, représenté sur la figure 15, consiste en un microscope interférentiel de type
Linnik, c'est-à-dire un interféromètre de Michelson avec un objectif de microscope placé dans chacun des
deux bras. La source de lumière employée doit présenter une grande largeur spectrale, dans le proche
infrarouge, comme en OCT classique. Sa cohérence spatiale doit également être faible, contrairement à
l’OCT classique, afin de réaliser un éclairage plein champ sans interférences parasites. Diverses sources ont
déjà été utilisées telles que diode électroluminescente, lampe à filament halogène, et lampe à arc. La
fluorescence d’un cristal excité par laser constitue également une source intéressante pour l’OCT plein
champ en raison d’une luminance potentiellement très élevée. L’objet à imager est placé dans l’un des bras
de l’interféromètre, sous un objectif, tandis qu’un miroir de référence est placé dans l’autre bras, sous l’autre
objectif. En général, des objectifs à immersion à eau sont employés afin de réduire l’écart de dispersion dans
les deux bras de l’interféromètre ainsi que le défaut de mise au point au fur et à mesure que la profondeur
d’imagerie augmente. Le miroir de référence présente un coefficient de réflexion de quelques pourcents
seulement pour optimiser le contraste des interférences. Les images interférométriques sont projetées sur le
capteur d’une caméra matricielle CCD ou CMOS. En raison de la faible cohérence temporelle, seule la
lumière réfléchie par les structures de l’objet situées à une certaine profondeur contribue aux interférences.
En calculant l’amplitude du signal d’interférence, on peut donc obtenir une image tomographique en face
révélant la présence de ces structures. La méthode d’interférométrie à décalage de phase, très classique pour
produire des images de phase, est ici mise en œuvre avec un décalage de phase continu pour extraire
l’amplitude des interférences. Le miroir de référence oscille, modulant ainsi la phase du signal d’interférence.
La caméra, synchronisée avec cette oscillation, enregistre 2 ou 4 images par période de modulation selon
l’algorithme utilisé. On obtient ainsi une image tomographique en temps réel par combinaison de ces images
interférométriques déphasées [Dubois 2006, OCT Handbook 2]. En déplaçant l’objet dans la direction axiale
par pas plus petits que la résolution axiale, on peut acquérir une pile d’images tomographique, à partir de
laquelle des coupes selon des directions quelconques peuvent être calculées. Des reconstitutions
tridimensionnelles peuvent également être réalisées pour une visualisation optimale de la structure interne de
l’objet.
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Figure 15 : Schéma de principe de l’OCT plein champ. Il s’agit d’un microscope interférentiel éclairé au moyen d’une
lampe halogène. Les images tomographiques sont calculées à partir de plusieurs images interférométriques déphasées
acquises au moyen d’une caméra CCD.
Résolution spatiale
Les images tomographiques en face produites par l’OCT plein champ sont obtenues par combinaison
d’images interférométriques dont la résolution transverse est celle d’un microscope interférentiel. La
résolution transverse est théoriquement déterminée par l’ouverture numérique des objectifs de microscopes
employés et par la longueur d’onde centrale de l’éclairage. Typiquement, des ouvertures numériques de 0,3
ou 0,5 sont utilisées, conduisant à une résolution transverse théorique de l’ordre de 1 micromètre. En
pratique, la résolution transverse tend à se dégrader au fur et à mesure que la profondeur d’imagerie
augmente à cause d’aberrations optiques induites par les inhomogénéités de l’indice de réfraction de l’objet.
Malgré cette dégradation, la résolution transverse des images d’OCT plein champ est très supérieure à celle
des images obtenues par OCT à balayage. Dans cette technique, il est nécessaire de disposer d’une
profondeur de champ égale à la profondeur totale sondée, ce qui limite la résolution à typiquement 10-20
micromètres en raison de la faible focalisation du faisceau. En OCT temporelle il est toutefois possible
d’ajuster la mise au point au cours du balayage de la profondeur et de focaliser alors davantage le faisceau,
mais la vitesse de fonctionnement est alors réduite. Cet ajustement de la mise au point n’est en revanche pas
possible en OCT fréquentielle. Signalons que des images tomographiques en face peuvent être produites par
OCT à double balayage de faisceau. Cette technique, appelée OCM (Optical cohérence microscopie), est à la
fois un microscope convoqua et un interféromètre. La résolution transverse est alors comparable à celle de
l’OCT plein champ. Néanmoins, le balayage du faisceau selon deux directions augmente considérablement le
temps d’acquisition des images, aussi cette technique est-elle peu répandue.
La résolution axiale des images d’OCT plein champ est déterminée par la longueur de cohérence de la
source de lumière, tout comme en OCT à balayage temporelle ou fréquentielle. Il est donc nécessaire
d’utiliser une source de grande largeur spectrale. D’autres paramètres sont également à considérer comme la
longueur d’onde centrale, la forme du spectre, le bruit, la stabilité et la puissance. En outre, l’OCT plein
champ requiert une source de faible cohérence spatiale pour réduire les phénomènes d’interférences parasites
entre différents point du champ. Les meilleures résolutions axiales sont obtenues avec une lampe halogène ;
une lumière thermique présente en effet un spectre extrêmement large, de forme régulière proche d’une
gaussienne, dénué de tout pic ou rebond. Le flux lumineux est très stable, peu bruité et la cohérence spatiale
est très faible. Le spectre effectif obtenu à partir d’une source halogène est en pratique déterminé par la
réponse spectrale de la caméra. Avec une caméra CCD à base de silicium telle que la DALSA 1M15, la
résolution axiale au voisinage de la surface d’un objet d’indice de réfraction égal à celui de l’eau, est de 0.7
µm. La résolution axiale se dégrade au fur et à mesure que la profondeur d’imagerie augmente à cause
notamment de l’écart de dispersion entre les deux bras de l’interféromètre qui ne peut être compensé
aisément en raison des inhomogénéités de l’objet. Le phénomène de diffusion multiple entraine également
une dégradation progressive de la résolution axiale. Ces limitations sont inhérentes à toute technique d’OCT,
mais elles sont d’autant plus sévères que le spectre effectif est large.
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Dynamique et sensibilité
Aux longueurs d’onde comprises typiquement entre 600 nm et 1300 nm, la lumière pénètre facilement
dans les milieux biologiques, car l’absorption y est faible. En revanche, sa propagation est très perturbée à
cause du phénomène de diffusion provoquée par une multitude de structures de tailles diverses, notamment
les cellules et leurs constituants (noyaux, mitochondries, membranes, etc.). Le libre parcours moyen l, défini
comme la distance moyenne parcourue par un photon entre deux événements de diffusion successifs qui le
font changer de direction, est de l’ordre de 100 microns. Le nombre de photons balistiques - photons qui ne
subissent pas de diffusion - décroît exponentiellement avec l’épaisseur traversée e comme exp(-e/l). Le
nombre de photons balistiques devient donc insignifiant après une propagation dans les tissus sur une
distance de l’ordre du millimètre. Or, les techniques d’imagerie optique à haute résolution sont basées sur la
détection des photons balistiques. En OCT plein champ le flux lumineux utile, correspondant aux
interférences, est très faible par rapport au flux lumineux total détecté par la caméra. La dynamique de
détection doit donc être suffisamment élevée pour résoudre ce signal interférométrique noyé dans un signal
constant beaucoup plus important. La dynamique est donc un paramètre crucial qui va déterminer la
profondeur d’imagerie maximale accessible. Dans le cas d’objets peu diffusants comme la rétine, le flux
lumineux renvoyé par l’objet est certes plus faible, mais la proportion de flux utile reste très petite. La
dynamique d’une caméra est déterminée par la capacité de charge de ses pixels. Ce paramètre est donc
particulièrement important dans le choix de la caméra. En pratique, il est nécessaire d’augmenter la
dynamique par accumulation d’images ou (et) par regroupement de pixels.
Vitesse de fonctionnement
L’OCT plein champ utilise une caméra pour détecter des images fournies par un microscope
interférentiel. Contrairement à l’OCT à balayage, tout le champ d’observation est illuminé et tous les pixels
de la caméra détectent simultanément le signal. Cette technique présente l’avantage d’une détection parallèle,
sans avoir recours à un système de balayage du faisceau d’une source spatialement cohérente. La dynamique
des caméras étant très inférieure à celle des mono-détecteurs utilisés en OCT à balayage, l’acquisition
parallèle ne permet toutefois pas un gain en vitesse d’acquisition, car une accumulation d’images est
nécessaire. Dans l’OCT à balayage, le temps d’acquisition du signal pour chaque position du faisceau est très
court, ce qui permet de s’affranchir des artéfacts liés aux mouvements de l’objet. En OCT plein champ le
temps d’acquisition de chaque point de l’image, identique au temps d’acquisition de l’image entière est
beaucoup plus long. Tout mouvement de l’objet pendant ce temps d’acquisition entraîne une perte du signal
utile et l’apparition d’un signal parasite [Sacchet 2010]. A temps d’acquisition par image similaires, l’OCT
plein champ et l’OCT temporelle n’ont donc pas la même sensibilité aux mouvements éventuels de l’objet.
Ces derniers restent problématiques pour l’OCT plein champ alors qu’ils n’entraînent qu’une déformation de
l’image en OCT temporelle qui peut être corrigée par du traitement d’image après l’acquisition. L’OCT
fréquentielle permet actuellement un fonctionnement nettement plus rapide que celui de l’OCT temporelle et
de l’OCT plein champ. L’intérêt majeur de l’OCT plein champ réside dans sa très haute résolution spatiale,
possible à partir d’une source de lumière aussi simple qu’une lampe halogène, ce qui permet d’obtenir des
images proches de coupes histologiques à condition que l’objet reste immobile pendant un temps
d’acquisition actuellement de l’ordre d’une seconde.
Applications
L’OCT plein champ est une technique qui s’avère particulièrement performante pour l’imagerie
tridimensionnelle à très haute résolution d’objets quasi-statiques. Nous donnons dans ce paragraphe quelques
exemples d’images obtenues par OCT plein champ pour illustrer les potentialités de la technique pour
diverses applications.
L’OCT plein champ a été utilisée pour mener des études in vitro du développement embryonnaire chez la
souris et la grenouille. On peut voir sur la figure 16 des images réalisées dans le têtard de grenouille africaine
Xenopus Laevis, modèle des batraciens pour la biologie du développement. Trois images en coupe d’une
zone située dans la tête sont représentées. Diverses structures sont révélées telles que l’épiderme (coupe YZ),
le canal olfactif (coupe XZ) et une couche de cellules mésenchymateuses (sur les 3 coupes). La résolution
11
spatiale isotrope de 1 micromètre permet la visualisation de structures sub-cellaires telles que les membranes
et noyaux. Différents stades de la mitose cellulaire peuvent être observés.
Figure 16 : Images tomographiques orthogonales dans la tête du têtard de grenouille Africaine (Xenopus Laevis) in
vitro obtenues par OCT plein champ. Le rectangle en rouge indique la zone où les images ont été enregistrées.
L’OCT plein champ a été utilisée, en association avec la microscopie confocale, pour une étude de
l’apopthose (la mort cellulaire) chez la plante [Boccara 2007]. On peut voir sur la figure 17 des images de
feuille de tabac utilisées pour cette étude. On distingue parfaitement les cellules épidermiques de forme
polygonale, les cellules palisadiques en forme de batônnets, et le parenchyme spongieux. On peut également
noter la présence de stomates.
100 µm
XZ
100 µm
XZ
Figure 17 : Image de feuille de tabac obtenues, in situ, par OCT plein champ.
Les tissues oculaires prélevés peuvent également être imagés par OCT plein champ avec un très bon
contraste sans aucune fixation ni coloration [Grieve 2004]. On peut voir par exemple sur les figures 18 des
images réalisée à partir de différents tissus d’un œil de rat, in vitro. Dans les images de cornée (figure 18.a),
on distingue différentes couches : l’épithélium, la stroma, et les membranes de Bowman et de Descemet. Les
deux images en-face (XY), montrent les cellules épithéliales et la structure de la stroma. Dans les images du
cristallin (figure 18.b), la capsule, la couche des cellules épithéliales et les fibres corticales sont clairement
visibles. La structure très organisée des fibres du cristallin est clairement révélée. Enfin dans la rétine (figure
18.c), toutes les couches sont discernables. L’image en-face (XY) montre la couche des fibres nerveuses.
12
Figure 18.a : images de la cornée d’un œil de rat (in-vitro). A gauche : coupe (XZ). Le flêches indiquent la
position des coupes en-face (XY) : dans la couche des cellules épithéliale (droite haut) et dans la stroma (droite
bas).
Figure 18.b : images du cristallin d’un œil de rat (in-vitro). A gauche : coupe (XZ) du cortex antérieur du
cristallin. A droite : image en coupe à l’intérieur du cortex antérieur.
Figure 18.c : Rétine de rat (in-vitro). A droite : images des fibres nerveuses. A gauche : coupe longitudinale de la rétine
(NFL: nerve fiber layer, GCL: ganglion cell layer, IPL: inner plexiform layer, INL: inner nuclear layer, OPL: outer
plexiform layer, ONL: outer nuclear layer, ELM: external limiting membrane, PRL: photoreceptor layer).
13
Dans le domaine médical, l’OCT plein champ pourrait jouer un rôle majeur en anatomopathologie pour
la dermatologie et pour l’aide au diagnostic per-opératoire. Les examens anatomopathologiques pendant
l’opération, pour aider les chirurgiens à apprécier les marges des tumeurs ou l’état des ganglions sentinelles,
pourraient être réalisés par la technique d’OCT plein champ, sans avoir recours aux techniques classiques
d’histologie. Les tissus des pièces opératoires doivent être observés sur de grands champs (de l’ordre du cm2)
avec une résolution voisine de celle du microscope, l’outil de travail des anatomopathologistes. A ce jour,
seule l’OCT plein champ permet d’atteindre une telle résolution dans les 3 dimensions de l’espace avec une
profondeur de pénétration suffisante sans aucune préparation de l’échantillon. En juxtaposant plusieurs
images prises à des endroits différents, on peut reconstituer une image de taille très supérieure à celle limitée
par le champ de l’objectif. Ainsi, les figures 19 et 20 montrent des images de haute résolution sur de grands
champs de tissus sains et cancéreux du colon, ainsi que la comparaison avec des coupes histopathologiques
nécessitant une longue préparation. La déstructuration des tissus cancéreux est révélée par l’OCT plein
champ, de manière aussi flagrante qu’en histologie.
Figure 19 : Images de tissus de colon sains obtenues par OCT plein champ (en bleu) et en histologie (en rose). L’image
à droite est un agrandissement d’une partie de l’image composite OCT. Source : LLTECH
Figure 20 : Images de tissus de colon cancéreux obtenues par OCT plein champ (en bleu) et en histologie (en rose).
Source : LLTECH
La pertinence de la méthode a été confirmée sur une large variété de tissus excisés. A titre d’exemple, on
peut observer sur la figure 21 une image en OCT plein champ de la structure d’un canal galactophore,
présentant une excroissance suspecte de cellules membranaires confirmée par l’histologie. L’intérêt est ici de
pouvoir aider anatomopathologistes et chirurgiens à affiner leur diagnostic pendant l’opération sans attendre
le résultat de l’examen systématique de la tumeur qui, après l’opération, est fixée, imprégnée de paraffine,
colorée puis découpée en tranche de quelques micromètres d’épaisseur avant d’être examinée au microscope
optique. Ce dernier examen peut prendre quelques jours et il conduit souvent (entre 10% et 40%) à une
décision de ré-opération pénalisante pour les patientes et qui augmente les coûts de santé.
Un travail de recherche et de développement est toujours en cours pour améliorer les performances de
l’OCT plein champ en ce qui concerne la vitesse d’acquisition des images, trop lente actuellement pour la
plupart des applications d’imagerie sur tissus vivants in situ. La technique gagnerait alors en intérêt, surtout
si elle pouvait être couplée à un endoscope pour l’imagerie à l’intérieur du corps. L’optimisation du
traitement des données doit également progresser, compte-tenu de la quantité d’information requise lorsque
des images en trois dimensions sont souhaitées.
14
Figure 21 : Images de tumeur du sein et comparaison avec l’histologie. Une portion de l’ordre de 1 mm2 a été isolée
dans la zone d’un canal galactophore présentant des excroissances suspectes révélées également dans la coupe
histologique. Source : LLTECH
Conclusion
L’OCT est une technique d’imagerie qui a connu, depuis sa première démonstration il y a 20 ans, un
développement spectaculaire. L’OCT permet la visualisation de structures internes dans les milieux
biologiques, sans aucune préparation. L’étude non destructive de matériaux relativement transparents est
également possible avec cette technique. La résolution spatiale de l’OCT, pouvant atteindre le micromètre,
est très proche de celle de la microscopie optique. Dans le domaine médical, l’OCT est d’un intérêt évident
lorsque les biopsies sont impossibles à pratiquer ou qu’elles sont risquées. Dans les autres cas, l’OCT est
également utile pour repérer les tissus suspects dont le prélèvement et l’analyse par les méthodes
conventionnelles permettront ensuite d’établir un diagnostic fiable. A terme, on peut espérer que l’OCT
puisse remplacer certains examens histologiques standards, lorsque les profondeurs mises en jeu sont
inférieures à quelques millimètres, ce qui éviterait tout prélèvement et permettrait un gain de temps
considérable.
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