982 Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l`Institut
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982 PROFESSEURS HONORAIRES Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l’Institut (Académie des Sciences) Embryologie cellulaire et moléculaire, 1988-2000 Les recherches effectuées au cours de l’année académique 2001-2002 ont concerné les thèmes suivants : I. Neurogenèse a) Neurogenèse et développement des organes axiaux b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés c) Différenciation des cellules de la crête neurale d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés II. Hématopoïèse et immunité a) Mise en évidence d’une fonction hématopoïétique du placenta murin b) Mise en évidence d’un nouveau marqueur des progéniteurs hématopoïétiques chez la souris c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance d) Localisation chromosomique de divers gènes dans le génome du poulet I. NEUROGENÈSE ET DÉVELOPPEMENT DES ORGANES AXIAUX a) Neurogenèse et développement des organes axiaux Chercheurs : N. Le Douarin, M.-A. Teillet, J.-B. Charrier Ingénieur d’étude : F. Lapointe ITA : B. Schuler Collaborations : D. Dhouailly et I. Olivera-Martinez (Université de Grenoble, UMR CNRS 5538), D. Duprez et F. Edom-Vovard (Université Paris 6, UMR CNRS 5538), I. Palmeirim, C. Freitas et S. Rodrigues (Institut Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal) Nous avons poursuivi nos investigations sur la genèse des organes axiaux de l’embryon des Vertébrés et leur rôle au cours du développement. Ces organes consistent dans la corde dorsale et une bande médioventrale de cellules du tube neural appelée plaque du plancher (ou floor plate). Nous avions précédemment montré que ces deux structures sont issues de l’activité prolifératrice du territoire « organisateur » situé au niveau du nœ ud de Hensen. La plaque du plancher comme la notocorde sécrète une glycoprotéine à forte activité morphogénétique appelée Sonic hedgehog (SHH) dont nous avons, au cours de l’année 2001, démontré l’activité anti-apoptotique. PROFESSEURS HONORAIRES 983 Dans un deuxième temps, nous avons démontré la nature composite de la plaque du plancher. 1. Rôle anti-apoptotique de Sonic Hedgehog dans le développement précoce du système nerveux L’apoptose, ou mort cellulaire programmée, est un phénomène naturel qu’on observe dans la plupart des organes embryonnaires dans des zones précises et à des stades précis du développement. C’est ainsi que des plages discrètes d’apoptose apparaissent dans les régions dorso-latérales et ventro-latérales du tube nerveux à 2-3 jours d’incubation chez l’embryon de poulet. Dans des expériences précédentes (Catala et al., 1996), nous avons montré que les cellules du plancher du tube nerveux, comme celles de la notocorde proviennent du nœ ud de Hensen, l’organisateur aviaire. Les cellules de la floor plate se séparent progressivement de celles de la notocorde et s’insèrent au milieu de la plaque neurale lors de la régression du nœ ud. On peut empêcher le mouvement rostro-caudal du nœ ud de Hensen et la mise en place de la notocorde et de la floor plate en excisant la partie la plus caudale du nœ ud au stade de 5-6 somites. On observe dans ces conditions une apoptose massive dans la paroi du tube nerveux qui se développe postérieurement au nœ ud. Cette apoptose qui se généralise aux tissus avoisinants aboutit rapidement à la troncation de l’embryon. Nous avons montré que la greffe d’un fragment de notocorde ou de floor plate au voisinage du tube nerveux pouvait inhiber l’apoptose de ces tissus. Ces deux structures issues du nœ ud de Hensen secrètent une protéine dite morphogène, Sonic Hedgehog (SHH). La greffe de fibroblastes génétiquement modifiés pour produire SHH mime l’effet de la notocorde et de la floor plate, montrant que SHH est suffisant pour neutraliser la mort cellulaire programmée dans le tube nerveux et contribue ainsi à la morphogenèse du système nerveux. Publication : Charrier, J.-B., Lapointe, F., Le Douarin, N. and Teillet M.-A. (2001). Anti-apoptotic role of Sonic Hedgehog protein at the early stages of nervous system organogenesis. Development 128, 4011-4020. 2. Double origine de la floor plate chez l’embryon d’oiseau En analysant les caractéristiques moléculaires de la floor plate chez des embryons de poulet chimères dans lesquels soit le nœ ud de Hensen, soit la plaque neurale postérieure au nœ ud a été remplacé par la structure équivalente prise chez un embryon de caille, nous avons observé que la floor plate est composée de deux régions distinctes : a) une aire médiane (medial floor plate ou MFP) formée de cellules du même type que celles du nœ ud de Hensen exprimant Shh, HNF3β et Netrine1 et n’exprimant à aucun moment des gènes propres à l’ectoderme neural comme Sox1 ; b) des régions latérales (lateral floor plate ou LFP) formées de cellules du même type que celles de la plaque neurale et exprimant Sox1 et d’autres gènes neuraux comme Nkx2.2. Les caractéristiques 984 PROFESSEURS HONORAIRES de la LFP apparaissent progressivement dans le tissu neural proche des cellules issues du nœ ud de Hensen. Ces caractéristiques de la LFP sont l’expression transitoire de HNF3b et une expression permanente de Shh et de Netrine1 en plus de l’expression de Nkx2.2. Bien que les cellules de la MFP aient, dans le développement normal, une origine distincte de celles de la LFP, il est cependant possible d’induire une floor plate complète (MFP+LFP) dans la paroi latérale du tube nerveux par l’action à un stade précoce d’un fragment de notocorde ou de MFP. Dans les mêmes conditions, des cellules modifiées génétiquement pour produire SHH induisent seulement une LFP. Ces résultats montrent que l’induction d’une floor plate met en jeu des facteurs produits par les tissus dérivés du nœ ud de Hensen autres que SHH, ce facteur étant seulement capable d’induire une floor plate latérale. La même structure composite de la plaque du plancher a été trouvée chez le poisson Zebrafish. Seule la région latérale de cette structure dépend de l’activité du gène Shh. Publication : Charrier, J.-B., Lapointe, F., Le Douarin, N. and Teillet M.-A. (2002). Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development 129, 4785-4796. b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés Chercheurs : N. Le Douarin, G. Couly (Professeur de Chirurgie), H. Etchevers (Chercheur post-doctoral), S. Creuzet (chercheur post-doctoral), S. Bennaceur (PH, Chirurgien Hôpital Robert Debré, étudiant en thèse), B. Ruhin (Chef de clinique en chirurgie maxillo-faciale, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, étudiante en thèse), L. Benouaiche (Interne en chirurgie, Hôpital d’Amiens, étudiante en DEA) ITA : C. Vincent, A. Lehmann, M. Bontoux Le squelette de la face chez les vertébrés se différencie à partir de cellules mésenchymateuses qui ont pour origine la crête neurale diencéphalique, mésencéphalique et rhombencéphalique antérieure. Ces cellules colonisent le bourgeon nasofrontal et les arcs branchiaux. Ces cellules n’expriment aucun gène Hox et sont donc considérées comme étant Hox-négatives. Le problème posé par la morphogenèse des différentes pièces du squelette facial a été posé. Contrairement à une opinion répandue dans la littérature, les cellules des crêtes neurales ellesmêmes ne possèdent pas l’information nécessaire pour spécifier la forme et la position de chacun des os de la face. Nous avons exploré le rôle éventuel de l’ectoderme, du mésoderme céphaliques et de l’endoderme de l’intestin antérieur dans ce processus. 1. Spécification des différents éléments du squelette facial par l’endoderme de l’intestin antérieur Nous avons testé la capacité de l’endoderme à spécifier le squelette facial par des expériences de microchirurgie, en pratiquant des ablations ou des greffes de régions définies de l’endoderme chez l’embryon d’oiseau au stade neurula. PROFESSEURS HONORAIRES 985 L’ablation de régions précises de l’intestin antérieur empêche la formation sélective des différentes composantes de la capsule nasale et de la mâchoire inférieure. Réciproquement, la greffe de ces régions d’endoderme prélevées chez un embryon de caille et placées sur la voie de migration des cellules de la crête neurale qui n’expriment pas les gènes Hox chez un embryon de poulet de même stade, induit la formation surnuméraire des structures squelettiques correspondantes. Seules les cellules de la crête neurale qui n’expriment pas les gènes Hox peuvent répondre aux signaux inducteurs produits localement par l’intestin antérieur pour former les pièces du squelette facial et mandibulaire : elles se comportent alors comme un groupe d’équivalence au sein duquel des portions issues des différents niveaux de ce territoire crête neurale sont également capables de générer les éléments divers de la face et de la mâchoire. En présence de ces mêmes fragments d’endoderme, les cellules de la crête neurale qui expriment les gènes Hox sont incapables de répondre à l’information portée par le foregut et ne forment alors que des nodules cartilagineux non « patternés ». De plus, le positionnement du greffon endodermique lors de l’implantation confère aux pièces squelettiques générées leur orientation par rapport aux axes de coordonnées de l’embryon hôte. Nos travaux démontrent que l’endoderme détient l’information nécessaire à l’organisation morphologique et spatiale du squelette facial et mandibulaire : il instruit les cellules de la crête neurale tant pour la taille, la forme que la polarité de chaque composante squelettique qu’elle soit cartilage ou os de membrane. Publication : Couly, G., Creuzet, S., Bennaceur, S., Vincent, C., and Le Douarin, N.M. (2002). Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development 129, 1061-1073. 2. Les gènes Hox exercent un rôle inhibiteur sur le développement du squelette facial dérivé de la crête neurale Les cellules de la crête neurale diencéphalique, mésencéphalique et métencéphalique sont dotées de capacités squelettogéniques et dérivent du bourrelet neural qui n’exprime pas les gènes Hox. Afin d’examiner l’influence de l’expression des gènes Hox sur la morphogenèse du squelette crânien et facial, l’expression des gènes Hoxa2, Hoxa3 et Hoxb4 — dont l’activation caractérise les arcs branchiaux plus postérieurs —, combinée à l’expression de la protéine fluorescente GFP, a été sélectivement ciblée dans le bourrelet neural Hox-négatif, par électroporation in ovo avant la migration des cellules de la crête neurale chez l’embryon d’oiseau. L’expression du gène Hoxa2 inhibe la formation de la totalité du squelette facial. Chez les embryons dont on a réséqué la totalité de la crête squelettogénique Hox-négative comme chez ceux où le gène Hoxa2 est exprimé dans la crête neurale antérieure, aucune structure faciale ne se différencie : les embryons 986 PROFESSEURS HONORAIRES présentent un déficit de structure nasofrontale et se développent sans mâchoire ni supérieure ni inférieure. Les embryons soumis à l’expression forcée des gènes Hoxa3 ou Hoxb4 dans les cellules de la crête neurale diencéphalique montrent des déficits sévères des structures cartilagineuses de la face, mais partiels et distincts : l’expression forcée du gène Hoxa3 dans les cellules de la crête neurale diencéphalique permet le développement d’un septum nasal mais conduit à une absence complète du 1er arc branchial à l’origine de la mâchoire inférieure, la sur-expression du gène Hoxb4 entraîne l’absence de bec supérieur par agénésie de la capsule nasale, et l’hypoplasie du 1er arc branchial où seules les structures proximales de la mâchoire inférieure sont préservées. L’action combinée des gènes Hoxa3 et Hoxb4 transfectés simultanément conduit à l’absence totale des structures faciales, semblable à celle obtenue en présence du gène Hoxa2. Toutefois, aucun de ces gènes n’affecte la différenciation des dérivés neuraux de la crête. Ces résultats suggèrent qu’au cours de l’évolution, l’inactivation des gènes Hox à la partie antérieure des embryons dans le groupe des cordés a été essentielle pour le développement de la face, des mâchoires et du crâne, et pour celui du cerveau chez les vertébrés. Publication : Creuzet, S., Couly, G., Bennaceur, S., Vincent, C., and Le Douarin, N.M. (2002). Negative effect of Hox gene expression on the development of the neural crest-derived facial skeleton. Development 129, 4301-4313. 3. Contributions de la crête neurale au système vasculaire En employant la technique des chimères caille-poulet, les mouvements des cellules de la crête neurale issues des bourrelets neuraux céphaliques chez l’embryon d’oiseau ont été cartographiés. Afin de pouvoir corréler cette cartographie de la crête neurale avec les déficiences dues à des défauts de migration cellulaire, des ablations ont été effectuées aux différents niveaux du futur cerveau. Les ablations de la crête neurale diencéphalique et mésencéphalique empêchent la morphogenèse normale de la tête au niveau rostral. Ces ablations engendrent une mort cellulaire importante au niveau du prosencéphale, lui-même laissé intact par l’opération. Il manque donc des tissus qui ne sont pas directement dérivés de la crête neurale dont certains muscles, l’adénohypophyse et le prosencéphale. Sans la crête neurale, les méninges ne se développent pas et le prosencéphale meurt avant sa vascularisation, qui se produit normalement plus tard. Cette année, nous avons démontré que les vaisseaux du prosencéphale sont constitués ultérieurement de péricytes, de muscle lisse et de tissu conjonctif dérivés de la crête neurale alors que les composants des vaisseaux du cerveau postérieur sont uniquement dérivés du mésoderme. Ainsi, deux secteurs vasculaires se dessinent d’une manière ségrégée dans les différentes parties du cerveau embryonnaire. Les artères dérivées des arcs branchiaux se ramifient uniquement dans ce secteur, PROFESSEURS HONORAIRES 987 ce qui montre que deux systèmes vasculaires distincts se sont développés au cours de l’évolution des vertébrés. Publication : Etchevers, H.C., Vincent, C., Le Douarin, N.M. et Couly, G.F. (2001). The cephalic neural crest provides pericytes and smooth muscle cells to all blood vessels of the face and forebrain. Development 128, 1059-1068. c) Différenciation des cellules de la crête neurale Chercheurs : N. Le Douarin, A. Gonsalves Trentin (Professeur en année sabbatique, depuis janvier 2002), C. Real (étudiante en thèse, Université de Lisbonne) Ingénieurs de recherche : E. Dupin, P. Vaigot (CEA Génopole, Evry) ITA : C. Pardanaud-Glavieux Collaboration : A. Burns (University College London) 1. Caractérisation et auto-renouvellement des cellules pluripotentes de la crête neurale in vitro Nos études antérieures ont montré que l’action trophique et mitogène de l’endothéline 3 (EDN3) était spécifique des précurseurs gliaux et mélanocytaires de la crête neurale. La question se posait donc de savoir si ce peptide agit également sur les cellules gliales périphériques et les cellules pigmentaires différenciées, qui in vivo expriment respectivement les récepteurs EDNRB et EDNRB2. Nous avons d’abord cherché à savoir quel rôle pouvait jouer l’EDN3 à un stade tardif du développement du lignage mélanocytaire, lorsque les cellules ont migré dans la peau et se sont différenciées en cellules pigmentaires dans l’épiderme. Nous montrons que l’EDN3, via EDNRB2, exerce une importante stimulation de la prolifération en culture des mélanocytes isolés de l’épiderme d’embryons de caille. L’action prolongée de l’EDN3 modifie également le programme de différenciation des mélanocytes, induisant leur dé-différenciation progressive puis l’apparition de marqueurs gliaux dans leur descendance. En cultures clonales, la moitié environ des cellules pigmentaires traitées in vitro par l’EDN3 donne naissance à la fois à des mélanocytes et à des cellules de type glial. Ces cellules pigmentées sont donc capables de revenir à l’état de précurseurs bipotents glio-mélanocytaires, et pourraient ainsi constituer une réserve de cellules souches capables de répondre à une stimulation par l’EDN3 in vivo dans la peau. Publication : Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P. and Le Douarin, N.M. (2000). Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crestderived glial-melanocytic progenitor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 7882-7887. Afin d’étudier l’influence des endothélines sur les cellules gliales différenciées, nous avons récemment étudié l’action de l’EDN3 sur les cellules du nerf sciatique de caille. Tout comme un agent promoteur de tumeurs, le TPA, l’EDN3 induit la différenciation de mélanocytes à partir de nerfs sciatiques dissociés et cultivés in vitro. Cette réponse est observée pour les nerfs embryonnaires jusqu’à 14 jours 988 PROFESSEURS HONORAIRES d’incubation. Les nerfs contiennent donc des cellules dont la capacité mélanogénique est réprimée in situ mais peut être stimulée in vitro par l’action de signaux tels que l’EDN3. L’origine et la nature de ces cellules à potentialité mélanogénique (précurseurs mélanocytaires quiescents, cellules gliales ou cellules indifférenciées) ont été déterminées après purification par cytométrie de flux et culture clonale des cellules de Schwann exprimant la glycoprotéine de surface SMP. L’analyse des clones montre une nette augmentation de la survie et de la prolifération de cellules de Schwann SMP+ en présence d’EDN3, qui s’accompagne de l’induction du récepteur EDNRB2 puis de l’antigène MelEM (Nataf et al., 1993), tous deux caractéristiques des mélanoblastes, et à plus long terme, de la synthèse de mélanine. Cette réorientation du phénotype glial vers le phénotype mélanocytaire est obtenue pour 40 % des cellules de Schwann qui génèrent alors une descendance mixte gliale et mélanocytaire. Ces expériences mettent donc en évidence la plasticité de la différenciation des cellules dérivées de la crête neurale, plasticité qui se manifeste ici par la possibilité d’obtenir l’interconversion des mélanocytes et des cellules de Schwann embryonnaires in vitro. Publications : Dupin E, Real C and Le Douarin N (2001). The neural crest stem cells : control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. An. Acad. Bras. Cienc. 73, 533-545. Dupin E., Real C., Glavieux C., Vaigot P. et Le Douarin N.M. en préparation L’action puissante de l’EDN3 sur les cellules gliales et pigmentaires ainsi que sur leur précurseur commun suggère que ce facteur pourrait avoir un rôle in vivo dans des pathologies impliquant ces deux lignages cellulaires. De plus, il est possible que les précurseurs gliaux-mélanocytaires constituent une population de cellules de type souche douées d’auto-renouvellement. Ceci suppose qu’ils peuvent donner naissance non seulement à des cellules différenciées, mais également à de nouveaux précurseurs de mêmes potentialités. Des expériences de sousclonages successifs in vitro ont été conduites pour tester cette hypothèse. La descendance mixte (gliale et mélanocytaire) obtenue à partir de cellules pigmentaires épidermiques a été repiquée individuellement en présence ou non d’EDN3. En milieu contrôle, la répétition de cette procédure aboutit à un épuisement rapide du pouvoir prolifératif et une restriction vers un phénotype mélanocytaire, dès le second sous-clonage. La présence d’EDN3 permet une augmentation du nombre de repiquages productifs et le maintien de la diversité phénotypique. Bien que la vitesse de division cellulaire diminue progressivement, on obtient alors une grande majorité de clones mixtes (glie-mélanocytes) jusqu’au cinquième sous-clonage au moins. Ces données indiquent que l’EDN3 favorise la production et l’auto-renouvellement de cellules souches bipotentes gliales-mélanocytaires. 2. Développement du système nerveux entérique à partir de précurseurs dérivés de la crête neurale La plupart des neurones du système nerveux entérique proviennent de la région vagale de la crête neurale. La contribution à l’édification du système nerveux PROFESSEURS HONORAIRES 989 entérique d’une seconde région de l’axe neural, la crête neurale sacrée proposée par Le Douarin et Teillet en 1973, a été discutée pendant des années. Afin de résoudre ce problème nous avons effectué une étude spatio-temporelle de la migration et de la différenciation des crêtes neurales vagale et lombo-sacrée chez des chimères caille/poulet avec l’aide de marqueurs génétiques. Le tube digestif postérieur, région du tractus gastro-intestinal le plus souvent affecté dans les maladies du développement, est colonisé d’une manière complexe. Les cellules de la crête neurale vagale colonisent le tube digestif tout entier dans une direction rostro-caudale. Au contraire, les cellules de la crête neurale sacrée, qui colonisent le tube digestif postérieur dans une direction caudorostrale, se localisent d’abord dans la région du plexus myentérique à partir duquel elles migrent ensuite vers la sous-muqueuse. Ces cellules de la crête neurale sacrée ne migrent dans le tube digestif postérieur que lorsque les cellules provenant de la région vagale ont colonisé le tube digestif tout entier. Cette observation suggérait que les cellules sacrées peuvent nécessiter une interaction avec les cellules dérivées de la région vagale ou avec des facteurs qu’elles secrètent pour participer à la formation du système nerveux entérique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons procédé à des ablations de fragments de crête neurale vagale afin de créer un modèle de tube digestif aganglionnaire. Un échange caille/poulet de crête neurale sacrée a été ensuite effectué chez les embryons privés de crêtes neurales vagales. En l’absence des ganglions dérivés de la région vagale, les cellules de la crête neurale sacrée migrent et se différencient apparemment normalement, mais leur nombre n’est pas suffisant pour compenser le manque de ganglions entériques. Récemment, nous avons testé les capacités des cellules de la crête neurale vagale à coloniser directement le tube digestif postérieur en les greffant dans la région sacrée. Celles-ci gardent leur pouvoir de migration élevé puisqu’elles migrent en grand nombre dans le tube digestif postérieur et à des stades beaucoup plus précoces que normalement. Les cellules d’origine vagale sont alors capables de donner naissance à des neurones exprimant le gène Ret et forment des plexus entériques dans l’intestin postérieur. La greffe hétérotopique de cellules de la crête neurale vagale dans la région sacrée de l’axe neural peut donc être un moyen de réparer un phénotype aganglionnaire entérique postérieur. Publications : Burns A.J. and Le Douarin N.M. (2001). Enteric nervous system development : analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras. Anat. Rec., 262,16-28. Burns A.J., Delalande and Le Douarin N.M. (2002). In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural Crest results in extensive hindgut colonisation. Development 129, 2785-2796. 990 PROFESSEURS HONORAIRES d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés Chercheurs : N. Le Douarin, A.-H. Monsoro-Burq (MdC1, Collège de France), N. Holleville (docteur vétérinaire, étudiant en thèse) ITA : M. Bontoux Le crâne des vertébrés est formé par l’assemblage précis de pièces osseuses et cartilagineuses, destinées à protéger le cerveau, les organes des sens associés et la cavité orale. Au cours du développement embryonnaire et de la vie postnatale, la croissance du crâne est étroitement corrélée au développement du cerveau ; et cela principalement par le biais d’interactions avec la dure-mère. La croissance des plaques osseuses se fait au niveau de zones mésenchymateuses appelées zones de suture. Les études récentes réalisées chez la souris ont permis d’identifier les principaux gènes impliqués dans le développement tardif du crâne (formation de la suture, puis maintien et fermeture de celle-ci). L’analyse génétique de mutants souris présentant une fermeture précoce des sutures (craniosténose) ou au contraire un retard de cette fermeture (dysplasie cleidocraniale), ont permis d’ébaucher la description des cascades génétiques régulant la croissance du crâne et le fonctionnement des sutures. Parmi les principaux gènes identifiés, les FGFRs ont été mis en cause dans de nombreux syndromes (syndromes de Pfeiffer, de Crouzon, de Jackson-Weiss et d’Apert). L’expression des FGFRs dans les ostéoblastes varie au cours de la différenciation ; FGFR2 est particulièrement exprimé dans les précurseurs en prolifération, tandis que FGFR1 est associé aux premières phases de la différenciation des cellules osseuses. D’autres gènes tels que TWIST et les Msx ont aussi été impliqués dans le développement du crâne et associés à certaines malformations craniofaciales, mais leur rôle précis n’a pas toujours été clairement établi. Récemment, l’analyse du mutant souris Dlx5-/- a fourni un nouveau gènecandidat dans le développement du crâne. Les Dlx forment une famille comptant actuellement 6 membres. Dans cette famille, Dlx5 et Dlx6 présentent la propriété d’être exprimés dans tous les éléments squelettiques (chondrocytes immatures, périoste, os mature). Chez le mutant de souris Dlx5-/-, tous les éléments osseux du crâne sont affectés. Le pariétal et l’interpariétal sont particulièrement touchés puisqu’ils ne présentent aucune ossification. L’étude in vitro du gène Dlx5 sur lignées cellulaires a montré des résultats contradictoires, Dlx5 étant parfois associé à la différenciation des pré-ostéoblastes en activant le gène ostéocalcine, tandis que dans d’autres études la surexpression de Dlx5 induit une répression du gène codant pour l’ostéocalcine. Ces résultats suggèrent qu’un équilibre précis est nécessaire à l’action normale du gène Dlx5. Le maintien de cet équilibre pourrait faire intervenir les gènes Msx, dont les propriétés de liaison aux Dlx et d’inactivation de ces derniers ont été de nombreuses fois mises en évidence. Nous avons cherché à préciser le rôle de Dlx5 dans la mise en place du crâne de l’embryon de poulet, et tenté de replacer ce gène dans les cascades génétiques qui assurent l’ossification du crâne des Vertébrés ainsi que le fonctionnement PROFESSEURS HONORAIRES 991 des sutures. Nous avons dressé le profil d’expression du gène Dlx5 dans la zone de formation de l’os frontal du Poulet entre les stades E6 à E16. Nous montrons ainsi que l’expression de Dlx5 débute dans le mésenchyme non différencié au stade E7 et qu’il se maintient aux marges des zones de croissance osseuse jusqu’à E16, stade correspondant à la formation des sutures. L’expression de ce gène a été comparée à celles des principaux gènes impliqués dans la mise en place du crâne (Bmp-2, -4, -7, FGFRs, Msx-1, -2), à la prolifération cellulaire, ainsi qu’à la différenciation osseuse objectivée par l’expression d’un marqueur précoce des ostéoblastes, l’ostéopontine. Nous montrons ainsi que l’expression de Dlx5 est initiée et maintenue dans les cellules pré-ostéogéniques en prolifération, mais pas dans les ostéoblastes matures. Le profil d’expression de Dlx5 suggère une régulation via les voies Bmps et FGFs. Par un système de culture d’explants à court terme, nous montrons que la voie Bmp2/4 régule positivement l’expression de Dlx5, tandis que FGF4 stimule l’expression de Bmp4 dans le mésenchyme non différencié. Enfin, nous avons comparé l’expression de Dlx5 dans ce système avec celle de partenaires potentiels, et nous avons ainsi montré que Goosecoid pourrait être une cible de Dlx5. Nous avons intégré toutes ces nouvelles informations dans les cascades génétiques contrôlant le développement du crâne. Publication soumise : Quilhac, A., Holleville, N., Bontoux, M. and MonsoroBurq, A.-H. BMP signals regulate Dlx5 during early avian skull development. II. HÉMATOPOÏÈSE ET IMMUNITÉ a) Mise en évidence d’une fonction hématopoïétique du placenta murin Chercheurs : F. Dieterlen-Lièvre, J. Salaün, M. Alvarez da Silva (Professeur en année sabbatique) Différents sites d’hématopoïèse — sac vitellin, foie fœ tal, rate et moelle osseuse — sont identifiés chez l’embryon et le fœ tus de mammifère, dont les périodes d’activité se succèdent au cours du développement. Nous montrons maintenant que le placenta est également un organe hématopoïétique à l’aide de cultures in vitro et de transplantations de cellules in vivo : — En effet au 15e jour de gestation (E15), cette annexe est cinq à six fois plus riche en progéniteurs clonogéniques que le foie fœ tal ; parmi ces progéniteurs certains sont dotés d’une capacité de prolifération à long terme (HPP-CFC), alors que les progéniteurs du foie sont beaucoup plus évolués (CFU-Mix) ; les cellules adhérentes du placenta, isolées en milieu liquide, forment une couche nutritive (feeder-layer) qui exerce une activité promotrice puissante sur l’hématopoïèse des cellules médullaires (ou autres). Par ailleurs les cellules du placenta d’embryons de 15 jours de gestation injectées à des souriceaux nouveau-nés sont capables d’ensemencer en grand 992 PROFESSEURS HONORAIRES nombre les différents organes hématopoïétiques et le sang, ceci en l’absence de tout traitement myéloablatif des receveurs. Les cellules des donneurs sont prélevées sur des embryons transgéniques pour le gène d’une protéine fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP), ce qui permet d’identifier leur descendance. La GFP sert également de marqueur en culture pour distinguer les cellules clonogéniques par rapport aux feeder layers. Parmi les croisements que nous exploitons, le plus favorable est celui où les placentas GFP+ sont issus de mères GFP-, ce qui atteste que les progéniteurs identifiés proviennent de la composante embryonnaire du placenta. Nos expériences ne permettent pas à l’heure actuelle de conclure à l’origine extrinsèque ou intrinsèque des progéniteurs présents dans le placenta. En tout état de cause le placenta se révèle être un organe hématopoïétique très actif, dont le rôle n’a pas été décrit jusqu’à présent (seul un article de F. Melchers, (1979), y a rapporté la présence de progéniteurs lymphoïdes B) ; les progéniteurs que nous révélons dans le placenta sont très probablement ceux que l’on retrouve dans le sang du cordon, et qui sont considérés comme une intéressante alternative aux cellules de moelle osseuse transplantées chez l’homme dans le but de soigner différentes pathologies. b) Mise en évidence d’un nouveau marqueur des progéniteurs hématopoïétiques chez la souris Chercheurs : C. Corbel, J. Salaün Ingénieur de Recherche : P. Vaigot ITA : P. Belo-Diabangouaya, A. Lehmann L’intégrine αIIb est une molécule d’adhésion cellulaire exprimée en particulier par les mégakaryocytes. Chez le poulet les travaux de Ody et al. (1999) ont démontré que l’intégrine αIIbβ3 est exprimée par les progéniteurs hématopoïétiques de différents lignages. Nous nous sommes intéressés à l’étude de l’expression de cette molécule chez la souris. Nous avons donc recherché l’expression de la molécule αIIbβ3 par des cellules hématopoïétiques multipotentes. Nous montrons ainsi que des progéniteurs myéloïdes, érythroïdes et mixtes peuvent se différencier à partir des cellules αIIb+c-kit+ de la moelle osseuse adulte et du foie fœ tal (E13-14). Ces cellules αIIb+c-kit+ sont capables de coloniser l’épithélium thymique dépourvu de cellules hématopoïétiques (E10) et de se différencier en lymphocytes T CD4+CD8+. Les progéniteurs exprimant αIIb et c-kit du foie fœ tal, après leur différenciation intrathymique, sont capables de migrer à la périphérie pour y poursuivre leur maturation dans les organes lymphocytaires secondaires. Les cellules αIIb+c-kit+ injectées à une souris adulte irradiée se différencient et donnent toutes les lignées, myéloïdes et lymphocytaires (B et T). Cependant elles sont dépourvues PROFESSEURS HONORAIRES 993 de la capacité d’autorenouvellement et ne représentent donc pas les CSH primitives. Publication : Corbel, C. and Salaün, J. (2002). αIIb integrin expression during development of the murine hemopoietic system. Dev. Biol. 243, 301-311. c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance Chercheurs : N. Le Douarin, J. Salaün Ingénieur de Recherche : P. Vaigot ITA : P. Belo-Diabangouaya Collaborations : A. Bandeira, R. Araujo (Institut Pasteur, Paris), A. Coutinho (Institut Gulbenkian, Portugal) Nous poursuivons l’étude des phénomènes de régulation qui interviennent dans l’établissement de la tolérance vis-à-vis du soi. Le rôle de l’épithélium thymique EpT dans la sélection de cellules T régulatrices a été démontré grâce à la réalisation de thymus chimères. En effet, nos expériences de reconstitution de souris athymiques nude par la greffe d’EpT ont démontré la capacité de l’EpT à induire la tolérance in vivo, chez la souris. Le transfert des cellules T périphériques des souris ainsi restaurées à des souris nude naïves, nous a permis de montrer que cette tolérance est le résultat de la sélection positive par l’EpT, de lymphocytes T CD4+ ayant des propriétés régulatrices et qui contrôlent l’activité de cellules T effectrices. La persistance de cellules T autoréactives, normalement contrôlées par des mécanismes de régulation, peut aboutir, en cas de défaillance de ces mécanismes régulateurs, à l’autoimmunité pathologique. Le diabète insulinodépendant en est un exemple caractéristique avec la destruction des îlots de Langerhans du pancréas par des infiltrations lymphocytaires. La souris « non obese diabetic » (NOD) représente le modèle le plus utilisé de diabète insulinodépendant spontané. Nous nous sommes plus particulièrement consacrés à l’étude des phénomènes régulateurs intervenant dans l’établissement du diabète chez la souris NOD. Nous avons développé un nouveau modèle expérimental dans lequel des souris NOD, conservant intact leur propre thymus, reçoivent en greffe mésentérique un thymus de nouveau-né NOD au sein duquel on a inoculé des îlots pancréatiques prélevés sur des souris normales BALB/c. La fréquence de l’apparition du diabète chez les souris NOD ainsi greffées est comparée à celle observée sur des souris NOD contrôles, d’une part, et sur des souris NOD greffées avec un thymus de NOD nouveau-né mais ne contenant pas d’îlots, d’autre part. Nous observons une importante diminution du nombre de souris développant la maladie chez les animaux greffés avec le thymus NOD + îlots pancréatiques par rapport aux deux types de témoins. En effet 24 % des animaux greffés deviennent diabétiques, contre 72 % des contrôles et 69 % des souris recevant seulement le thymus 994 PROFESSEURS HONORAIRES ectopique. L’analyse immunohistologique du pancréas des souris expérimentales montre que cet organe est sain avec de nombreux îlots produisant de l’insuline. La présence de cellules produisant de l’insuline est également mise en évidence dans le greffon thymus + îlots. Ces résultats suggèrent qu’une population de cellules T, différenciées dans le thymus ectopique au contact d’îlots pancréatiques, supprime l’activité des cellules effectrices. Il est à souligner de plus, que les îlots greffés proviennent de souris allogéniques, et qu’ils sont capables de produire de l’insuline même plusieurs mois après la greffe, et alors que les souris hôtes ont conservé leur thymus. Ces résultats confirment que le thymus représente un site immunologique privilégié, et soulignent l’importance des mécanismes de régulation dans l’induction de la tolérance au soi. Publication : Salaün, J., Simmenauer, N., Belo, P., Coutinho, A. and Le Douarin, N.M. (2002). Grafts of supplementary thymuses injected with allogeneic pancreatic islets protect nonobese diabetic mice against diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 874-877. d) Localisation chromosomique de divers gènes dans le génome du poulet Chercheur : K. Ladjali-Mohammedi (chercheur post-doctoral) Collaborations : C. Corbel (Institut Cochin), T. Jaffredo (Université Paris 6, Paris) Les intégrines αv et α8 Les intégrines αv et α8 participent à la mise en place du système hématopoïétique. Les gènes aviaires ont été clonés par Bossy and Reichard, 1990 ; Bossy et al., 1991. Ce sont des gènes qui appartiennent à une famille du complexe α. Chez l’homme, tous les gènes du complexe α se trouvent sur le chromosome 16 et dérivent d’un même motif ancestral, de nombreuses fois dupliqué. Chez le poulet, les intégrines αv et α8 ont été localisées sur le chromosome 1 et sont donc insérées sur la même région chromosomique. Nous décrivons ainsi une nouvelle région de conservation entre le chromosome 16 humain et le chromosome 1 du poulet. Par ailleurs, l’étude de l’expression de αv au cours du développement embryonnaire est réalisée par Catherine Corbel. Les gènes GATA Ces gènes constituent une famille de facteurs de transcription à doigts de zinc. Chez les vertébrés, on décrit 6 gènes GATA (de GATA1 à GATA6). GATA1, GATA2 et GATA3 sont impliqués dans la différenciation hématopoïétique et/ou neurale. GATA4, GATA5 et GATA6 sont plutôt impliqués dans la différenciation tissulaire. Chez le xénope, GATA4 et GATA6 sont responsables de la différencia- PROFESSEURS HONORAIRES 995 tion endodermique. L’équipe de Thierry Jaffredo étudie l’expression de GATA1, GATA2 et GATA3 chez l’oiseau au cours de la différenciation du système hématopoïétique (sang, sac vitellin, l’aorte et l’allantoïde). Cette famille de gènes pourrait être divisée en groupes fonctionnels. Il serait intéressant de connaître l’organisation de cette famille de gènes dans le génome du poulet. Les gènes GATA 1, 2 et 3 ont été clonés par le groupe de Doug Engen et les gènes GATA 4, 5 et 6 ont été clonés par le groupe de Todd Evans. Les premiers résultats de ce travail montrent que GATA1 et GATA5 sont localisés sur la même région du chromosome 3 du poulet. LISTE DES PUBLICATIONS 2001 BURNS, A.J. and LE DOUARIN, N.M. (2001). Enteric nervous system development : analysis of the selective developmental potentialities of vagal and sacral neural crest cells using quail-chick chimeras. Anat. Rec., 262, 16-28. LE DOUARIN, N.M. (2001). Early neurogenesis in Amniote vertebrates. Int. J. Dev. Biol., 45, 373-378. ETCHEVERS, H.C., VINCENT, C., LE DOUARIN, N.M. and COULY, G.F. (2001). The cephalic neural crest provides pericytes and smooth muscle cells to all blood vessels of the face and forebrain. Development 128, 1059-1068. LADJALI-MOHAMEDI, K., GRAPIN-BOTTON, A., BONNIN M.-A. and LE DOUARIN, N.M. (2001). Distribution of Hox genes in the chicken genome reveals a new segment conservation between human and chicken. Cyto. Cell Genet., 92, 157161 MONSORO-BURQ, A.-H. and LE DOUARIN, N.M. (2001). BMP4 plays a key role in left-right patterning in chick embryos by maintaining Sonic Hedgehog asymmetry. Mol. Cell, 7, 789-799. CHARRIER, J.-B., LAPOINTE, F., LE DOUARIN, N.M. and TEILLET, M.-A. (2001). Anti-apoptotic role of Sonic hedgehog protein at the early stages of nervous system organogenesis. Development 198, 4011-4020. DUPIN, E., REAL, C. and LE DOUARIN, N.M. (2001). The neural crest stem cells : control and neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. An. Acad. Bras. Cienc., 73, 533-545. LE DOUARIN, N.M. (2001). Developmental Biology : novel trends and prospects. In Science and the Future of Mankind : Science for Man and Man for Science, Pontificia Academia Scientarum, Cité du Vatican, pp. 266-287. 996 PROFESSEURS HONORAIRES DUPIN, E. (2001). Embryogenesis of neuro-epithelial interactions. Exp. Dermatol. 10, 356-357. CHARRIER, J.-B., BENNACEUR, S. and COULY, G. (2001). Hemifacial microsomia. Embryological and clinical approach. Ann. Chir. Plast. Estheth., 46, 385-399. OLIVERA-MARTINEZ, I., THÉLU, J., TEILLET, M.-A. and DHOUAILLY, D. (2001). Dorsal dermis development depends on a signal from the dorsal neural tube, which can be substituted by Wnt1. Mech. Dev., 100, 233-244. FREITAS, C., RODRIGUES, S.K, CHARRIER, J.-B., TEILLET, M.-A. and PALMEIRIM, I. (2001). Evidence for medial/lateral specification and positional information witrhin the presomitic mesoderm. Development 128, 5139-5147. DIETERLEN-LIÈVRE, F., PARDANAUD, L., CAPRIOLI, A. and JAFFREDO T. (2001). Non-yolk sac hematopoietic stem cells : the avian paradigm. In : Hematopoiesis : a developmental approach. L. Zon ed. Oxford University Press, New York, pp. 201-208. DIETERLEN-LIÈVRE, F. (2001). Embryogenèse du système sanguin. Thérapie, 56, 377-378. CUMANO, A., GODIN, I., DELASSUS, S., DIETERLEN-LIÈVRE, F. and BARRETO, V. (2001). Changes in lymphoid populations during mammalian development. In Hematopoiesis : a developmental approach. L. Zon, ed. Oxford University Press, New York, pp. 218-228. DIETERLEN-LIÈVRE, F. (2001). Transgressions de lignages par des cellules pluripotentes issues de l’adulte. J. Soc. Biol., 195, 39-46. CAPRIOLI, A., MINKO, K., DREVON, C., EICHMANN, A., DIETERLEN-LIÈVRE, F. and JAFFREDO, T. (2001). Hemangioblast commitment in the avian allantois : cellular and molecular aspects. Dev. Biol., 238, 64-78. ETCHEVERS, H., VINCENT, C., and COULY, G. (2001). Neural crest and pituitary development. In Hypothalamic-Pituitary Development : Genetic and Clinical Aspects. R. Rappaport ed., S. Kärger AG, Bâle, Suisse, pp. 13-29. 2002 SALAÜN, J., SIMMENAUER, N., BELO, P., COUTINHO, A. and LE DOUARIN, N.M. (2002). Grafts of supplementary thymuses injected with allogeneic pancreatic islets protect nonobese diabetic mice against diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 874-877. LE DOUARIN, N.M. (2002). Embryologie Cellulaire et Moléculaire. In Annuaire du Collège de France 2000-2001. Résumé des Cours et Travaux. 101e année. Paris, pp. 969-992. COULY, G., CREUZET, S., BENNACEUR, S., VINCENT, C., and LE DOUARIN, N.M. (2002). Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the PROFESSEURS HONORAIRES 997 foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head. Development 129, 1061-1073. BURNS, A.J., DELELANDE, J.-M. and LE DOUARIN, N.M. (2002). In ovo transplantation of enteric nervous system precursors from vagal to sacral neural crest results in extensive hindgut colonisation. Development 129, 2785-2796. CORBEL, C. and SALAÜN, J. (2002). αIIb integrin expression during development of the murine hemopoietic system. Dev. Biol. 243, 301-311. CREUZET, S., COULY, G., BENNACEUR, S., VINCENT, C., and LE DOUARIN, N.M. (2002). Negative effect of Hox gene expression on the development of the neural crest-derived facial skeleton. Development 129, 4301-4313. EDOM-VOVARD, F., SCHULER B., BONNIN, M.-A., TEILLET, M.-A. and DUPREZ, D. (2002). Fgf4 positively regulates scleraxis and Tenascin expression in chick limb tendons. Dev. Biol. 247, 351-366. CHARRIER, J.-B., LAPOINTE, F., LE DOUARIN, N. and TEILLET M.-A. (2002) Dual origin of the floor plate in avian embryo. Development 129, 4785-4796. Sous presse LE DOUARIN, N.M. (2002). La crête neurale : une structure pluripotente de l’embryon des vertébrés. Bull. Soc. Roy. Sci. Liège. DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. (2002). Influence of endothelin 3 on the development of pigment cells from the neural crest. In Proceedings of the International Workshop on Molecular Mechanisms of Tanning. Ortonne, J.-P. ed., Martin Dinitz Ltd, London. LE DOUARIN, N. (2002). La crête neurale et l’évolution des vertébrés. Bull. Mém. Acad. Roy. Méd. Bel. DISTINCTIONS ET ACTIVITÉS DIVERSES Nouvelle fonction publique et universitaire 2002 ● Membre de l’Académie des Sciences Brésilienne. Conférences honorifiques 2001 ● ● Conférence Plénière au Colloque Annuel de la Société Française de Biologie du Développement (SFDB), Marseille, 31 août. The Grass Foundation Lecture at the American Society for Neurosciences 31st Annual Meeting, San Diego, California, USA, 10-14 novembre. 998 PROFESSEURS HONORAIRES ● ● 2002 ● ● Journées Internationales de Biologie, Journées de Lariboisière, Paris, 16 novembre. Conférence à la Séance Solennelle de l’Académie des Sciences, Institut de France, Paris, 26 novembre. Keynote Address at the Keystone Symposia, Keystone, Colorado, USA, 17-20 mars Conférence au Musée de la Science de la Fondation Caixa, Barcelone, Espagne, 11 avril. Congrès et Colloques 2001 ● ● ● ● ● ● ● ● ● 2002 ● ● ● ● ● Workshop on « Common molecules in development and carcinogenesis ». Instituto Juan March de Estudios e Investiganciones. Madrid, Espagne, 26 février. « La crête neurale : une structure pluripotente de l’embryon de vertébrés ». Remise des prix quinquennaux 1995-2000 de la Fondation du 150e anniversaire de la Société Royale des Sciences de Liège, 9 mai. Pasteur-Gulbenkian Meeting, Institut Gulbenkian de Ciência, Arrabida, Setubal, Portugal, 17-19 mai. NIH Fogarty Scholar at National Institute of Child Health. 15 juillet15 août, visite officielle. Colloque annuel de la Société Française de Biologie du Développement, Marseille, 31 août-2 septembre. « Generating Cell Diversity in the Nervous Synstem », International Institute of Genetics and Biophysics, CNR, Naples, Italie, 20-23 octobre. « Les Journées Internationales de Biologie », CNIT, Paris, 15-16 novembre. « The Challenges of Science : Education for the Twenty-First Century », Pontificia Academia Scientiarum, Cité du Vatican, 18-21 novembre. « La crête neurale et l’évolution des vertébrés. » Séance de l’Académie Royale de Médecine de Belgique, Bruxelles, 14 décembre. « Relationships between endodermal signals and Hox-genes in patterning of the facial skeleton ». Instituto de Neurociencias, Facultad de Medicina, Université d’Alicante, Espagne, Pr. Salvador Martinez, 7-8 janvier. Académie des Sciences en région, Université de Montpellier, 11-13 mars. Forum des auteurs. 22e Salon du Livre, Prix « Le Monde de la Recherche Universitaire », Porte de Versailles, Paris, 22 mars. Conférence au Colloque « Stem cells », symposium à l’Institut de France, Académie des Sciences, Institut de France, 25-27 mars. Séminaire au Meeting au Gulbenkian de Ciencia Institute’s Scientific Advisory Board, 9-10 mai. PROFESSEURS HONORAIRES ● ● ● ● 999 International Balzan Symposium « Meeting the Challenges of the Future — A discussion between “ The Two Cultures ” » , Londres, 1314 mai. Séminaire à l’Institut Curie « Association des Doctorants de l’Institut Curie », 23 mai. Conférence à la « Journée Scientifique Organon : La Congélation », au Pré Catelan, 7 juin. Jubilé André Capron, Lille, 13-14 juin. Organisation de symposium 2002 ● « Cellules souches et thérapie cellulaire » « Stem cells and cell therapy », Académie des Sciences, Institut de France, Paris, 25-27 mars.
