PROFESSEURS HONORAIRES 1075 JACOB, F. From night bustle to printed quietness. Treballs de la SCB, 2000, 51, 11-13. JACOB, F. Complexity and Tinkering. Annals New York Academy of Sciences, 2001, 929, 71-3. JACOB, F. Le Monde des Cellules Souches. CR Biologies, 325, 2002, 999-1002. Mme Nicole LE DOUARIN, membre de l’Institut (Académie des Sciences) Embryologie cellulaire et moléculaire, 1988-2000 Les recherches effectuées au cours de l’année académique 2002-2003 ont concerné les thèmes suivants : I. Neurogenèse a) Neurogenèse et développement des organes axiaux b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés c) Différenciation des cellules de la crête neurale d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés e) Étude des gènes Msx dans la formation du squelette superficiel : étude chez la tortue Emys orbicularis f) Analyse de l’induction de la crête neurale par le mésoderme paraxial : une étude chez l’embryon de Xénope II. Hématopoïèse et immunité a) Mise en évidence par des tests in vitro d’une fonction hématopoïétique du placenta chez la Souris b) Mise en évidence dans le placenta, par restauration de souris irradiées, de cellules restauratrices à long terme (LTR-CSH) c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance : caractérisation des cellules régulatrices chez la souris NOD I. NEUROGENÈSE a) Neurogenèse et développement des organes axiaux Chercheurs : M.-A. Teillet, J.-B. Charrier (AHR en chirurgie maxillo-faciale, Hôpital Lariboisière, étudiant en thèse) et N. Le Douarin Ingénieur d’étude : F. Lapointe Collaboration : P. Melhen et C. Thibert (Université Lyon 1, UMR CNRS 5534) 1076 PROFESSEURS HONORAIRES Nous poursuivons nos recherches sur le développement du système nerveux des Vertébrés en utilisant comme modèle l’embryon d’oiseau. Nous nous intéressons particulièrement au rôle que jouent les structures axiales (notochorde et plaque du plancher du tube nerveux ou floor plate) dans ce développement. Dans des études précédentes nous avons montré, en utilisant le système des chimères caille-poulet que la notochorde et la floor plate ont une origine commune dans le nœud de Hensen, l’organisateur de l’embryon d’oiseau, et se mettent en place grâce au recul du nœud au cours de l’allongement de l’embryon pendant la gastrulation-neurulation (Catala et al., 1996). L’excision de l’extrémité caudale du nœud au stade de 5-6 somites, qui correspond à la moitié de la gastrulation, a pour conséquence un arrêt du nœud au niveau thoracique postérieur. Cependant le tube nerveux postérieur se forme et s’allonge mais il est dépourvu de floor plate et la notochorde est absente dans cette région (Charrier et al., 1999). On observe alors un accroissement considérable de l’apoptose ou mort cellulaire programmée dans le neuroépithélium ainsi que dans les tissus avoisinants, en particulier les somites. Cette mort cellulaire massive aboutit généralement à la troncation de l’embryon. L’apoptose, qu’on met en évidence spécifiquement par la technique de TUNEL, est un phénomène naturel qu’on observe dans la plupart des organes embryonnaires dans des zones précises et à des stades précis du développement. On parle alors d’apoptose morphogène. Dans nos expériences, l’accroissement de mort cellulaire et la troncation de l’embryon après excision de la partie caudale du nœud peuvent être évitées par la greffe de fibroblastes génétiquement modifiés produisant la protéine Sonic Hedgehog (SHH) au voisinage du tube nerveux dépourvu de cellules de la ligne médiane (Charrier et al., 2001). SHH est normalement produite par la notochorde et la floor plate. On lui connaissait un rôle dans l’organisation ventro-dorsale du tube nerveux. On a mis ici en évidence un rôle anti-apoptotique qui a été retrouvé dans de nombreux autres systèmes. Nos études récentes ont consisté à rechercher les mécanismes de cette action complexe de SHH dans le développement du tube nerveux. 1. Double origine de la floor plate chez l’embryon d’oiseau En analysant les caractéristiques moléculaires de la floor plate chez des embryons de poulet chimères dans lesquels soit le nœud de Hensen, soit la plaque neurale postérieure au nœud a été remplacé par la structure équivalente prise chez un embryon de caille, nous avons observé que la floor plate est composée de deux régions distinctes : a) un territoire médian (medial floor plate ou MFP) formé de cellules provenant du nœud de Hensen et exprimant Shh, HNF3b et Netrine1 mais n’exprimant à aucun moment des gènes propres à l’ectoderme neural comme Sox1 ; b) des régions latérales (lateral floor plate ou LFP) formées de cellules appartenant à la plaque neurale et exprimant Sox1 et PROFESSEURS HONORAIRES 1077 d’autres gènes neuraux comme Nkx2.2. Les caractéristiques de la LFP apparaissent progressivement dans le tissu neural proche des cellules issues du nœud de Hensen. Ce sont l’expression transitoire de HNF3 (et une expression continue de Shh et de Netrine1 en plus de l’expression de Nkx2.2. Bien que les cellules de la MFP aient, dans le développement normal, une origine distincte de celles de la LFP, il est cependant possible d’induire une floor plate complète (MFP + LFP) dans la paroi latérale du tube nerveux par l’action à un stade précoce d’un fragment de notochorde ou de MFP. Dans les mêmes conditions, des cellules modifiées génétiquement pour produire SHH induisent seulement une LFP. Ces résultats montrent que l’induction d’une floor plate met en jeu un ou des facteurs produits par les tissus dérivés du nœud de Hensen autres que SHH. On pense à des antagonistes de BMP4 exprimé dorsalement dans le tube nerveux. Publication : Charrier, J.-B., Lapointe, F., Le Douarin, N. and Teillet, M.-A. (2002). Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development, 129, 4785-4796. 2. Patched est un récepteur à dépendance Dans une étude que nous avons réalisée cette année en collaboration avec Patrick Mehlen et Chantal Thibert de l’Université de Lyon, nous avons montré que le rôle anti-apoptotique de SHH sur le neuro-épithélium pourrait constituer un mécanisme essentiel du développement et de l’organisation du système nerveux par un phénomène jusque là inconnu (Thibert et al., 2003). On connaît la voie de signalisation classique de SHH passant par le couple récepteur Patched (Ptc)/Smoothened (Smo) responsable de la différenciation des motoneurones ventraux du tube nerveux. Nous avons mis en évidence in vivo et in vitro le fait que l’absence de SHH entraîne l’activation par Ptc d’une autre voie de signalisation impliquant les caspases et déclenchant l’apoptose. Cette découverte fait de Ptc un « récepteur à dépendance ». La notion de récepteur à dépendance est récente. Il s’agit de récepteurs dont l’action est différente selon que leur ligand est disponible ou non. En présence du ligand, ils déclenchent un processus de différenciation. En son absence, ils déclenchent un processus de mort cellulaire. L’existence de récepteurs à dépendance peut expliquer des phénomènes de différenciation différentielle dans le cas d’un gradient du ligand. D’autre part, la mutation de ces récepteurs peut entraîner une prolifération cellulaire intense et par là même la tumorigenèse. Publication : Thibert, C., Teillet, M.-A., Lapointe, F., Mazelin, L., Le Douarin, N.M. and Mehlen, P. (2003). Sonic hedgehog controls survival of the neuroepithelial cells of the developing neural tube by regulating Patched-induced apoptosis. Science, 301, 843-846. b) La crête neurale et la genèse de la tête des vertébrés Chercheurs : N. Le Douarin, G. Couly (Professeur en chirurgie maxillo-faciale pédiatrique, Hôpital Necker), H. Etchevers (chercheur post-doctoral), S. Creuzet 1078 PROFESSEURS HONORAIRES (chercheur post-doctoral), K. Mohammedi-Ladjali (chercheur post-doctoral), J. De Brito Neto (chercheur post-doctoral), B. Ruhin (P.H. en chirurgie maxillofaciale, Hôpital de la Pitié-Salpêtrière, étudiante en thèse), L. Benouaiche (Interne en chirurgie, Hôpital d’Amiens, étudiante en thèse) ITA : C. Vincent Le squelette de la face chez les vertébrés se différencie à partir de cellules mésenchymateuses qui ont pour origine la crête neurale diencéphalique, mésencéphalique et rhombencéphalique antérieure. Ces cellules colonisent le bourgeon nasofrontal et les arcs branchiaux. Ces cellules n’expriment aucun gène Hox et sont donc considérées comme étant Hox-négatives. Le problème de la morphogenèse des différentes pièces du squelette facial a été posé. Contrairement à une opinion répandue dans la littérature, les cellules des crêtes neurales elles-mêmes ne possèdent pas l’information nécessaire pour spécifier la forme et la position de chacun des os de la face. Nous avons exploré le rôle éventuel de l’ectoderme, du mésoderme céphaliques et de l’endoderme de l’intestin antérieur dans ce processus. 1. Rôle de FGF8 sur la formation des structures squelettiques dérivées de la crête neurale dans la régénération à distance des structures faciale et mandibulaire Dans un travail précédent (Couly et al., 2002), nous avons montré que l’excision de la crête neurale s’étendant du diencéphale jusqu’au rhombomère r2 — domaine où les gènes Hox ne sont pas exprimés — résulte dans l’agénésie du squelette facial et mandibulaire. Outre les déficits squelettiques associés à l’ablation de la crête neurale Hox-négative, nous avons observé des perturbations sévères du développement des vésicules céphaliques aboutissant à une exencéphalie étendue le long du territoire résequé de la crête, c’est-à-dire du prosencéphale jusqu’au métencéphale. Situées à la limite postérieure du territoire excisé, c’est-à-dire à la jonction des domaines Hox-positif et -négatif, les cellules issues de la crête neurale du rhombomère 3 (r3) subissent précocement au cours du développement normal une apoptose massive sous le contrôle des rhombomères adjacents. Ainsi, la région branchiale reçoit-elle une contribution mineure des cellules de la crête de r3 dont la participation aux structures squelettiques se limite à l’apophyse du processus rétro-articulaire dans le 1er arc (Hox-négatif) et au tiers médian du basihyal dans le 2e arc (Hox-positif). Toutefois, dans le modèle expérimental où la crête neurale du domaine Hoxnégatif est excisée, les cellules de la crête de r3 qui échappent au contrôle apoptotique environnant présentent une capacité invasive accrue et développent un statut globalement Hox-négatif. Dans ce contexte, l’implantation d’un greffon de crête neurale au niveau diencéphalique assure le maintien du bourgeon nasofrontal et le développement du prosencéphale. Parallèlement, la présence du PROFESSEURS HONORAIRES 1079 greffon antérieur stimule la colonisation du 1er arc branchial par les cellules de la crête de r3 qui sont alors capables de générer la totalité du squelette cartilagineux de la mâchoire inférieure. Nous avons cherché à identifier les mécanismes par lesquels la crête neurale placée au niveau diencéphalique stimule à distance la régénération mandibulaire par les cellules issues de r3. À l’excision des crêtes neurales Hox-négatives suivent des perturbations profondes du patron d’expression de Fgf8 qui affectent tant le neuroépithélium prosencéphalique que l’ectoderme des bourgeon nasofrontal et 1er arc branchial, mais que restaure la présence de crête neurale greffée au niveau diencéphalique. L’apport d’une source exogène de FGF8, au moyen de billes imprégnées de protéine recombinante placées au contact soit du bourgeon nasofrontal soit du 1er arc branchial, oriente sélectivement la régénération soit de la capsule nasale et du cerveau antérieur, soit des squelettes maxillaire et mandibulaire. Nos résultats montrent que i) FGF8 exerce à distance un effet trophique et attractant sur les cellules de la crête neurale, ii) la crête neurale issue du 3e rhombomère en réponse au facteur diffusible FGF8, supporte la régénération d’une partie étendue des structures squelettiques de la face, iii) la crête neurale placée rostralement exerce un effet trophique sur le développement du prosencéphale en stimulant localement l’expression de Fgf8. Publication : Creuzet et al., en préparation. 2. Rôle de FGF8 sur la formation des structures squelettiques dérivées de la crête neurale dans l’induction par contact d’une conversion phénotypique dans le 2e arc branchial À la partition entre le domaine Hox-positif et Hox-négatif des cellules de la crête neurale céphalique correspond une disparité dans la capacité à générer des dérivés squelettiques. Ainsi, la différenciation ostéogénique de la crête neurale issue du domaine Hox-négatif consiste en l’ossification endochondrale des structures squelettiques cartilagineuses, mais aussi la formation d’os de membrane — directement différenciés à partir de cellules mésenchymateuses —, alors que celle issue du domaine Hox-positif (2e arc) est strictement limité à la formation de dérivés osseux endochondraux. Nous avons testé la différenciation des cellules issues du rhombomère 3 dans le 2e arc en l’absence des cellules issues des rhombomères 4 à 6 qui le colonisent normalement. La régénération qui s’opère à partir des cellules situées aux extrémités du territoire excisé — c’est-à-dire issues de r3 antérieurement, et r7 postérieurement — conduit à la formation d’un squelette cartilagineux et osseux endochondral hyoïdien normal. Si dans ce contexte, les cellules issues de r3 sont directement placées au contact d’une source exogène de FGF8, leur différenciation conduit à la formation de pièces squelettiques ectopiques qui reproduisent 1080 PROFESSEURS HONORAIRES l’élément proximal du squelette du 1er arc branchial, le cartilage carré. De même, l’implantation d’un fragment de crête Hox-négative associé à une bille de FGF8, en remplacement de la crête excisée, mime les résultats obtenus à partir de r3 et étend la conversion phénotypique du squelette du 2e arc à la formation de cartilage de Meckel. Dans ces deux situations expérimentales, les pièces cartilagineuses ectopiques sont associées à la formation d’os de membrane. Nos résultats montrent ainsi que FGF8 exerce au contact des cellules de la crête neurale Hox-négative, avant même le début de leur migration, une influence précoce qui accroît leur capacité à répondre aux signaux endodermiques et oriente leur devenir squelettogénique vers la formation de pièces squelettiques inédites dans le 2e arc tant par leur identité (duplication de type mandibulaire), que par leur nature (différenciation d’os de membrane). Publication : Creuzet et al., en préparation. 3. Spécification du squelette viscéral par l’endoderme de l’intestin antérieur L’os hyoïde est une composante du squelette viscéral qui se forme à partir des cellules de la crête neurale rhombencéphalique issues du domaine Hoxnégatif et Hox-positif. Nous avons précédemment démontré que les cellules issues du domaine Hox-négatif se comportent comme un groupe d’équivalence auquel l’endoderme ventral de l’intestin antérieur — foregut — fournit l’information requise pour instruire la forme et l’orientation du squelette nasal et mandibulaire (Couly et al., 2002). En pratiquant des expériences d’ablations et de greffes en supplémentation, nous avons étendu notre étude à la formation de l’os hyoïde et testé la capacité de spécification des niveaux plus caudaux de l’endoderme latéro-ventral du foregut chez l’embryon de poulet. Pour cette étude, des bandes d’endoderme ont été délimitées suivant la projection des structures céphaliques correspondant au rhombencéphale moyen (rhombomères 4 et 5) et postérieur (rhombomères 6 à 8) au cours de la neurulation précoce. L’extirpation des bandes transversales d’endoderme le long de l’axe antéropostérieur empêche de façon sélective la formation de la partie postérieure du basihyal, du cératobranchial, et de l’épibranchial. Ainsi définie, l’activité squelettogénique des bandes d’endoderme a été explorée plus avant en précisant l’origine des signaux inducteurs dans leurs portions ventro-médiale et latérale. L’implantation homotopique des zones ventro-médiales du foregut sur la voie de migration des cellules de la crête neurale céphalique conduit à la formation de cartilages basihyal et basibranchial surnuméraires, alors que les zones latérales génèrent des pièces cartilagineuses supplémentaires caractéristiques du cératobranchial et de l’épibranchial. L’ensemble de nos résultats démontre que précocement au cours du développement l’endoderme ventral du foregut confère une information régionalisée à la PROFESSEURS HONORAIRES 1081 crête neurale céphalique pour construire le squelette primaire facial et viscéral dans la mâchoire et le cou. Ces données permettent d’établir une carte des territoires squelettogéniques de l’endoderme chez la neurula et révèle qu’une métamérisation du foregut préside à la formation du squelette dans les arcs branchiaux. Publication : Ruhin, B., Creuzet, S., Vincent, C., Benouaiche, L., Le Douarin, N. and Couly, G. (2003). Patterning of the hyoid cartilage depends upon signals arising from the ventral foregut endoderm. Dev. Dyn., 228, 239-246. 4. Étude du rôle de l’isthme dans l’organisation du squelette facial La région de l’isthme représente une jonction entre le mésencéphale et le rhombencéphale antérieur où s’exprime FGF8 (Fibroblast Growth Factor 8) pendant les stades précoces du développement. Des études très récentes ont montré que FGF8, en plus de son rôle comme facteur de croissance, serait le candidat pour organiser l’activité de l’isthme en réprimant l’expression des gènes Hox (Irving and Masson, 2000). Les cellules de la crête neurale qui sont donc Hoxnégatives sont à l’origine de la formation des pièces du squelette facial et mandibulaire (Couly et al., 2002). Nous pratiquons des expériences de microchirurgies de régions précises à des stades précis du développement de l’embryon très jeune pour étudier, par la suite, l’expression d’un certain nombre de gènes (FGF8, Hox, PITX, etc). Nous essayons ainsi de comprendre et démontrer l’origine exacte de l’information nécessaire à l’organisation de l’activité de l’isthme impliqué dans la formation du squelette facial et mandibulaire. Mécanisme de la formation des arcs aortiques L’hypoxie induit la construction de nouveaux vaisseaux sanguins et régule la croissance des tissues par l’activation de la sous-unité alpha du facteur de transcription « hypoxia-inducible factor 1 ». Le patron d’expression de HIF1 (a été analysé dans des structures épithéliales et mésenchymateuses de l’embryon de poulet au cours des 7 premiers jours de développement. On trouve le transcrit de HIF1 (d’une manière diffuse au sein du neuroépithélium, du bourgeon du membre et dans le mésenchyme céphalique et puis, plus spécifiquement, dans la partie ventriculaire du système nerveux central. Plus surprenante est l’expression de HIF1 (dans l’endoderme de la poche de Sessel et dans l’ectoderme de la poche de Rathke ainsi que dans le premier arc branchial jusqu’à la disparition de la membrane bucco-pharyngée. Cette localisation pourrait indiquer un rôle de HIF1 (dans la formation des arcs aortiques autour de la poche de Sessel au cours de l’embryogenèse précoce. Publication : Etchevers, H. (2003). Early expression of hypoxia-inducible factor 1 in the chicken embryo. Mech. Dev., 3, 49-52. 1082 PROFESSEURS HONORAIRES c) Différenciation et plasticité des lignages cellulaires issus de la crête neurale Chercheurs : N. Le Douarin, A. Gonçalves-Trentin (Université de Fioranopolis, Brésil, Professeur en année sabbatique), C. Real (étudiante en thèse, Université de Lisbonne), G. Calloni (Université de Fioranopolis, Brésil, boursier Égide) Ingénieurs de recherche : E. Dupin, P. Vaigot (CEA Génopole, Evry) ITA : C. Pardanaud-Glavieux L’étude de cellules individuelles isolées en culture in vitro a révélé que la crête neurale (CN) est composée de précurseurs variés, la majorité étant pluripotents à des degrés divers. Chez la caille, une cellule « totipotente » est capable de donner naissance aux différents lignages issus de la CN céphalique (glial, neuronal, mélanocytaire et chondrocytaire) par des restrictions progressives subies au cours du développement. Chez le rat, des cellules pluripotentes capables d’auto-renouvellement ont été mises en évidence dans la CN troncale ainsi que dans certains de ses dérivés nerveux. Les données acquises dans les deux systèmes ont largement contribué depuis à la connaissance du rôle de certains facteurs extrinsèques dans le développement des différents lignages issus de la CN. BMP2, neuréguline et TGFb(agissent respectivement sur le choix de la différenciation en neurones, cellules gliales et fibroblastes tandis que l’endothéline 3 (ET3) favorise l’émergence des phénotypes mélanocytaire et glial (Lahav et al., 1996, 1998 ; Dupin et al., 2000). Ces données ouvrent la voie à une analyse plus approfondie des propriétés des cellules pluripotentes ou de type souche au cours de la mise en place des dérivés de la CN. Des questions importantes restent posées à ce sujet : Quels types de précurseurs sont doués de la capacité de s’auto-renouveler ? Comment évolue la population de cellules souches au cours du développement ? Quels sont les facteurs qui contrôlent leur capacité de se reproduire et de se différencier ? Pour aborder ces questions, nous avons testé in vitro la capacité d’auto-renouvellement des cellules de la CN aviaire et analysé le rôle de l’ET3 dans ce processus. L’étude a porté sur les cellules de la CN native d’origine céphalique et troncale, ainsi que sur la descendance de cellules différenciées gliales et pigmentaires. 1. Répertoire phénotypique et auto-renouvellement des cellules souches de la crête neurale aviaire Au début de la migration, la CN contient des cellules multipotentes ou bipotentes douées de capacités de différenciation et de prolifération hétérogènes. Au niveau més-métencéphalique, des cellules nerveuses, pigmentaires et de l’ectomésenchyme (cartilage) se différencient in vitro à partir d’un précurseur commun, ce qui suggère qu’une cellule totipotente de type souche est à l’origine des nombreux lignages de la CN céphalique. Une telle cellule par définition doit PROFESSEURS HONORAIRES 1083 posséder un pouvoir d’auto-renouvellement, c’est-à-dire la propriété de donner naissance à la fois à des cellules différenciées et à de nouvelles cellules souches. Afin de déterminer quels sont les progéniteurs capables d’auto-renouvellement, des expériences de sous-clonages successifs de cellules de CN ont été réalisées in vitro. On s’attend alors à ce que ces progéniteurs de type souche génèrent dans leur descendance non seulement des cellules différenciées, mais également de nouveaux progéniteurs de mêmes capacités de développement. Ces expériences montrent que la propagation des cellules de CN de caille est possible au cours de plusieurs sous-clonages si les cellules sont cultivées en présence d’ET3. Ces conditions favorisent notamment l’auto-renouvellement d’un précurseur commun aux mélanocytes et aux cellules gliales, qui est maintenu à long terme dans la population des cellules de CN d’origine céphalique et troncale. Dans la CN céphalique, nous montrons également l’existence de précurseurs communs à la glie, aux mélanocytes et à des cellules de type myofibroblastiques. Ces précurseurs ont une capacité de se maintenir plus faible et indépendante de la présence d’ET3 dans le milieu. Article en préparation : A. Gonçalves-Trentin, E. Dupin, C. Glavieux-Pardanaud et N. Le Douarin 2. Analyse de la plasticité des phénotypes mélanocytaire et glial Au cours du développement, l’émergence de cellules différenciées est traditionnellement considérée comme la conséquence de lignages hiérarchisés et unidirectionnels établis par des restrictions géniques irréversibles. Cette vue est cependant contredite au cours des processus de transdifférenciation (Blau et al., 2001). Il est donc possible que des cellules de différents degrés de différenciation soient recrutées pour jouer le rôle de cellules souches, comme c’est le cas pour les précurseurs oligodendrocytaires (Kondo and Raff, 2000). Dans la CN, la plasticité de la différenciation cellulaire est connue. En particulier, nous avons montré que les cellules pigmentaires isolées de l’épiderme de caille peuvent être conduites à se dé-différencier et à adopter un phénotype glial sous l’action mitogénique de l’ET3 (Dupin et al., 2000 ; Dupin et Le Douarin, 2003). Récemment, la transdifférenciation inverse, de cellules gliales en mélanocytes a été obtenue in vitro en traitant par l’ET3 des cellules de Schwann purifiées à partir de nerfs sciatiques embryonnaires et cultivées individuellement (Dupin et al., 2003). Dans ces conditions, la conversion réciproque des cellules gliales et pigmentaires s’effectue par l’intermédiaire d’une réversion des cellules différenciées vers l’état bipotent de leur précurseur commun. Cette reprogrammation de cellules différenciées suggère qu’une réversion de la hiérarchie des précurseurs pourrait être assez générale dans la CN. Nous avons donc examiné l’étendue de la flexibilité des phénotypes dérivés de la CN, et en particulier dans quelle mesure les cellules pigmentaires peuvent fonctionner 1084 PROFESSEURS HONORAIRES comme des cellules souches. Les mélanocytes isolés de l’épiderme ont été clonés puis leur descendance sous-clonée in vitro. En milieu contrôle, la répétition de cette procédure aboutit à un épuisement rapide du pouvoir prolifératif et une restriction vers un phénotype mélanocytaire, dès le second sous-clonage. La présence d’ET3 permet une augmentation du nombre de repiquages productifs et le maintien de la diversité phénotypique. Bien que la vitesse de division cellulaire diminue progressivement, on obtient alors une grande majorité de clones mixtes (glie-mélanocytes) jusqu’au cinquième sous-clonage (Real et al., en préparation). Ces expériences révèlent également la présence d’une potentialité de différenciation myofibroblastique dans la descendance des mélanocytes. Les cellules pigmentaires embryonnaires peuvent donc reverser vers des précurseurs plus en amont dans la hiérarchie des cellules de CN et se comporter comme des cellules souches. Publications : Dupin, E., Real, C., Glavieux-Pardanaud, C., Vaigot, P. and Le Douarin, N.M. (2003). Reversal of developmental restrictions in neural crest lineages : transition from Schwann cells to glial-melanocytic precursors in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5229-5233. Dupin, E. and Le Douarin, N.M. (2003). Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene 22, 3016-3023. d) Étude du gène Dlx5 dans l’ossification du crâne des vertébrés Chercheurs : N. Le Douarin, A.-H. Monsoro-Burq (MdC1, Collège de France), N. Holleville (docteur vétérinaire, étudiant en thèse) ITA : M. Bontoux Le crâne des vertébrés est formé par l’assemblage précis de pièces osseuses et cartilagineuses, destinées à protéger le cerveau, les organes des sens associés et la cavité orale. Au cours du développement embryonnaire et de la vie postnatale, la croissance du crâne est étroitement corrélée au développement du cerveau ; et cela principalement par le biais d’interactions avec la dure-mère. La croissance des plaques osseuses se fait au niveau de zones mésenchymateuses appelées zones de suture. Les études récentes réalisées chez la souris ont permis d’identifier les principaux gènes impliqués dans le développement tardif du crâne (formation de la suture, puis maintien et fermeture de celle-ci). L’analyse génétique de mutants souris présentant une fermeture précoce des sutures (craniosténose) ou au contraire un retard de cette fermeture (dysplasie cleidocraniale), ont permis d’ébaucher la description des cascades génétiques régulant la croissance du crâne et le fonctionnement des sutures. Parmi les principaux gènes identifiés, les FGFRs ont été mis en cause dans de nombreux syndromes (syndromes de Pfeiffer, de Crouzon, de Jackson-Weiss et d’Apert). L’expression des FGFRs dans les ostéoblastes varie au cours de la différenciation ; FGFR2 est particulièrement exprimé dans les précurseurs en prolifération, tandis que FGFR1 est associé aux premières phases de la différenciation des cellules osseuses. D’autres gènes PROFESSEURS HONORAIRES 1085 tels que TWIST et les Msx ont aussi été impliqués dans le développement du crâne et associés à certaines malformations craniofaciales, mais leur rôle précis n’a pas toujours été clairement établi. Récemment, l’analyse du mutant souris Dlx5-/- a fourni un nouveau gènecandidat dans le développement du crâne. Les Dlx forment une famille comptant actuellement 6 membres. Dans cette famille, Dlx5 et Dlx6 présentent la propriété d’être exprimés dans tous les éléments squelettiques (chondrocytes immatures, périoste, os mature). Chez le mutant de souris Dlx5-/-, tous les éléments osseux du crâne sont affectés. Le pariétal et l’interpariétal sont particulièrement touchés puisqu’ils ne présentent aucune ossification. L’étude in vitro du gène Dlx5 sur lignées cellulaires a montré des résultats contradictoires, Dlx5 étant parfois associé à la différenciation des pré-ostéoblastes en activant le gène ostéocalcine, tandis que dans d’autres études la surexpression de Dlx5 induit une répression du gène codant pour l’ostéocalcine. Ces résultats suggèrent qu’un équilibre précis est nécessaire à l’action normale du gène Dlx5. Le maintien de cet équilibre pourrait faire intervenir les gènes Msx, dont les propriétés de liaison aux Dlx et d’inactivation de ces derniers ont été de nombreuses fois mises en évidence. Nous avons cherché à préciser le rôle de Dlx5 dans la mise en place du crâne de l’embryon de poulet, et tenté de replacer ce gène dans les cascades génétiques qui assurent l’ossification du crâne des Vertébrés ainsi que le fonctionnement des sutures. Nous avons dressé le profil d’expression du gène Dlx5 dans la zone de formation de l’os frontal du Poulet entre les stades E6 à E16. Nous montrons ainsi que l’expression de Dlx5 débute dans le mésenchyme non différencié au stade E7 et qu’il se maintient aux marges des zones de croissance osseuse jusqu’à E16, stade correspondant à la formation des sutures. L’expression de ce gène a été comparée à celles des principaux gènes impliqués dans la mise en place du crâne (Bmp-2, -4, -7, FGFRs, Msx-1, -2), à la prolifération cellulaire, ainsi qu’à la différenciation osseuse objectivée par l’expression d’un marqueur précoce des ostéoblastes, l’ostéopontine. Nous montrons ainsi que l’expression de Dlx5 est initiée et maintenue dans les cellules pré-ostéogéniques en prolifération, mais pas dans les ostéoblastes matures. Le profil d’expression de Dlx5 suggère une régulation via les voies Bmps et FGFs. Par un système de culture d’explants à court terme, nous montrons que la voie Bmp2/4 régule positivement l’expression de Dlx5, tandis que FGF4 stimule l’expression de Bmp4 dans le mésenchyme non différencié. Enfin, nous avons comparé l’expression de Dlx5 dans ce système avec celle de partenaires potentiels, et nous avons ainsi montré que Goosecoid pourrait être une cible de Dlx5. Nous avons intégré toutes ces nouvelles informations dans les cascades génétiques contrôlant le développement du crâne. Publication : Holleville, N., Quilhac, A., Bontoux, M. and Monsoro-Burq, A.-H. (2003) BMP signals regulate Dlx5 during early avian skull development. Dev. Biol. 257, 177-189. 1086 PROFESSEURS HONORAIRES Nous avons poursuivi ces recherches en construisant un vecteur d’expression eucaryote codant pour le gène Dlx5 de Poulet. Nous avons sur-exprimé ce vecteur dans un système de culture primaire de jeune calvaria de Poulet pour rechercher les gènes cibles-potentiels de Dlx5 dans ce système. Nous avons identifié un certain nombre de gènes candidats, dont le gène-maître de la différenciation osseuse, CBFA1. Nos résultats montrent que Dlx5 initie la différenciation osseuse dans des cellules dérivées de la crête neurale exprimant déjà un certain nombre de gènes comme FGFR2 ou Twist. Nous discutons ces résultats, obtenus au niveau des cellules du futur crâne, par comparaison avec la situation observée lors de la différenciation osseuse de la mandibule. Nous avons pour cela réalisé l’ensemble des patrons d’expression des gènes étudiés dans notre première étude, dans la mandibule de Poulet à E9. Publication en préparation : Holleville, N., Bollerot, K., Bontoux, M. and MonsoroBurq, A.-H. Dlx5 initiates membrane bone differentiation in chick calvaria. e) Étude des gènes Msx dans la formation du squelette superficiel : étude chez la tortue Emys orbicularis Chercheurs : N. Le Douarin, A.-H. Monsoro-Burq (MdC1, Collège de France), ITA : C. Vincent, M. Bontoux Collaboration : C. Pieau (Institut Jacques Monod Paris) Nos études précédentes ainsi que celles d’autres groupes ont montré le rôle de la voie de signalisation BMP-Msx dans la formation de la partie dorsale de la vertèbre et d’autres structures squelettiques superficielles comme le crâne, les côtes ou la scapula. Nous avons examiné la participation de cette voie dans une structure squelettique qui se développe en position superficielle, la carapace de la tortue, en utilisant des embryons de tortue européenne, Emys orbicularis. Nous avons pour cela cloné un fragment d’ADNc codant pour une homéoboite de type Msx et analysé l’expression des gènes Msx au cours de l’embryogenèse de E. orbicularis. Nous avons concentré notre étude sur les étapes précédant la condensation des cellules du derme dorsal formant la carapace, par analogie avec d’autres systèmes où l’expression des gènes Msx est présente dans les précurseurs squelettiques non différenciés mais disparaît des cellules en cours de condensation et de différenciation. Nous avons aussi examiné l’expression des gènes Msx lors de la formation de la crête de la carapace ou « carapacial ridge, CR », structure analogue à la crête apicale ectodermique du bourgeon de membre « AER ». Nos résultats montrent que i) l’expression générale des gènes Msx au cours du développement précoce de la tortue est similaire à ce qui est observé dans d’autres embryons modèles ; ii) les gènes Msx sont présents dans la CR, selon une expression similaire à fgf10 ; iii) l’expression des gènes Msx n’est pas détectée avant et lors de la formation des condensations dermiques de la carapace dorsale. Ces résultats suggèrent que la carapace de la tortue, une nouveauté PROFESSEURS HONORAIRES 1087 évolutive, spécifique des Chéloniens, n’a pas recruté des mécanismes identiques à ceux utilisés pour la formation d’autres structures squelettiques superficielles. Publication en révision : Vincent, C., Bontoux, M., Le Douarin, N.M., Pieau, C. and Monsoro-Burq, A.-H. Msx gene expression in the carapacial ridge of turtle embryos : a study of the european pond turtle, Emys orbicularis. Development, Genes and Evolution. f) Analyse de l’induction de la crête neurale par le mésoderme paraxial : une étude chez l’embryon de Xénope Chercheur : A.-H. Monsoro-Burq (séjour sabbatique à UC Berkeley) Collaborations : Richard Harland, Russel Fletcher (UC Berkeley) L’intérêt que je porte à la voie de signalisation de BMP4 dans l’embryogenèse précoce, est lié à mon désir d’étudier le développement précoce de la crête neurale. Néanmoins, l’embryon d’oiseau n’est pas le modèle de choix pour une analyse moléculaire et génétique de ces jeunes stades. Je suis donc partie en janvier 2002, acquérir une formation dans un autre modèle vertébré, l’embryon de Xénope, permettant à la fois une analyse des stades précoces, une approche génétique et moléculaire poussée, et dont les mécanismes de formation de la crête neurale connus à l’heure actuelle sont conservés avec l’oiseau. C’est pourquoi j’ai rejoint le laboratoire du Professeur Richard Harland à Berkeley, en souhaitant, à mon retour, de combiner ces deux modèles complémentaires dans l’analyse du développement de la crête neurale. Le laboratoire de Richard Harland a montré de longue date son intérêt pour l’induction neurale et la régulation de la neurulation. L’initiation de la crête neurale est étroitement liée à ces phénomènes. J’ai donc naturellement trouvé une place dans les thématiques de l’équipe, et j’ai commencé par analyser les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’induction de crête neurale par le mésoderme paraxial. La formation de la crête neurale chez l’embryon est contrôlée par des signaux issus des tissus adjacents, l’ectoderme et le mésoderme. Des études, réalisées chez le Poulet et le Xénope, ont montré que l’ectoderme agit par une signalisation Wnt. Les mécanismes d’induction par le mésoderme restaient inconnus. Nous avons caractérisé l’induction de crête neurale par le mésoderme, in vivo et in vitro et analysé le rôle des Wnts et des FGFs dans l’induction de crête neurale par le mésoderme paraxial, en bloquant chacune de ces voies séparément et en contrôlant simultanément 1) la polarisation antéro-postérieure du tissu neural et 2) la formation du mésoderme. Cette étude montre que l’activité inductrice du mésoderme nécessite une signalisation FGF, et que la signalisation par les Wnt n’est pas nécessaire dans ce système. Nous avons mis en évidence la capacité de FGF8 à induire de la crête neurale, sans addition d’antagonistes aux BMPs, ce qui diffère de l’activité des Wnts. Cette induction est transitoire, découplant ainsi pour la première fois la phase d’induction de la phase de maintien de 1088 PROFESSEURS HONORAIRES l’induction de la crête neurale. Ceci montre un contrôle multifactoriel de l’induction de la crête neurale et de gènes comme Slug ou FoxD3. In vivo, la sur-expression ou le blocage des voies Wnt modifie la polarisation antéro-postérieure de la plaque neurale et la formation du mésoderme, les modifications de la formation de la crête neurale seraient donc consécutives à ces premières perturbations. Nous avons mis en évidence cependant, une hétérogénéité dans l’activité de différents FGFRs in vivo, dans la polarisation neurale et l’induction de crête neurale. Publication : Monsoro-Burq, A.-H., Fletcher, R. and Harland, R. (2003). Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development, 130, 3111-3124. II. HÉMATOPOÏÈSE ET IMMUNITÉ a) Mise en évidence par des tests in vitro d’une fonction hématopoïétique du placenta chez la Souris Chercheurs : F. Dieterlen-Lièvre, J. Salaün, M. Alvarez da Silva (Université de Fioranopolis, Brésil, Professeur en année sabbatique) Collaboration : C. Corbel (INSERM, Institut Cochin, Paris) ITA : M.-C. Malidor Au cours du développement des Vertébrés, la détermination des cellules souches hématopoïétiques (CSH) d’une part, leur multiplication et leur engagement dans une des voies de différenciation possibles d’autre part ont lieu dans des sites distincts. Le sac vitellin, premier des organes hématopoïétiques de l’embryon, est le seul où ces deux fonctions coexistent. Les organes hématopoïétiques successifs identifiés à l’heure actuelle sont le foie fœtal (chez les Mammifères) et la moelle osseuse, le thymus, la rate et la bourse de Fabricius (chez les Oiseaux). Le sac vitellin a d’abord été tenu pour le site où apparaissaient les CSH destinées à assurer le renouvellement des cellules sanguines pendant la vie entière d’un individu. Nos travaux antérieurs ont mis en évidence : — l’existence, chez les Oiseaux, d’un deuxième puis d’un troisième site de détermination de CSH, respectivement l’aorte, puis l’allantoïde ; — chez la Souris, une production de CSH par l’aorte, comme chez les Oiseaux. Nos travaux actuels se focalisent sur les capacités à cet égard du placenta chorio-allantoïdien de la Souris. À l’aide de cultures clonogéniques in vitro, nous démontrons la présence de progéniteurs abondants dans le placenta entre E9 et E17. Ces progéniteurs sont plus fréquents dans le placenta que dans le foie fœtal, ils y apparaissent 24 heures plus tôt, et présentent un pourcentage plus important de progéniteurs très immatures. Ces caractéristiques nous mènent à la conclusion PROFESSEURS HONORAIRES 1089 que le placenta est un organe hématopoïétique très actif (manuscrit soumis pour publication). Nous émettons par ailleurs l’hypothèse que ces progéniteurs pourraient se déterminer dans cet organe et sommes en train de la tester à l’heure actuelle (collaboration avec Catherine Corbel, Institut Cochin, Paris). b) Mise en évidence dans le placenta, par restauration de souris irradiées, de cellules restauratrices à long terme (LTR-CSH) Chercheurs : F. Dieterlen, J. Salaün Collaborations : H. Mikkola, C. Gekkas et S. Orkin (Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA) ITA : M.-C. Malidor L’« étalon-or » de la CSH est la possibilité pour ce type de cellule de s’installer de manière durable (6 mois ou plus) dans la moelle osseuse d’une souris adulte irradiée et de contribuer de manière significative à l’hématopoïèse de l’hôte. Il y a bien dans le placenta murin des LTR-CSH, mais leur évolution est un peu différente de celle des progéniteurs clonogéniques (voir ci-dessus) : les cellules souches à long terme présentent un pic de fréquence à E12, diminuent fortement à E15 et ont disparu du placenta à E18. En revanche elles sont abondantes à ce stade dans le foie. Ces expériences permettent de conclure que le placenta a un rôle important dans l’hématopoïèse embryonnaire, que sa contribution est probablement tout à fait critique pour la mise en place correcte du système hématopoïétique. Le déroulement chronologique de cette fonction par rapport à celui des activités du foie et de l’aorte nous incite à penser que le placenta produit des cellules souches hématopoïétiques, collaborant donc avec la région de l’aorte. Ce point important fait l’objet de nos recherches actuelles. Le rôle du foie, comme passage obligé permettant l’amplification de la population de CSH avant la colonisation de la moelle osseuse, tel qu’il est conçu jusqu’à présent, est conforté par nos résultats. c) Phénomènes de régulation dans l’induction de la tolérance : caractérisation des cellules régulatrices chez la souris NOD Chercheurs : N. Le Douarin, J. Salaün ITA : P. Belo-Diabangouaya Collaborations : V. Thomas-Vaslin (CERVI-Pitié-Salpêtrière, Paris), A. Coutinho (Institut Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal) Nos expériences de greffes de thymus surnuméraires, préalablement inoculés avec des îlots pancréatiques de souche de souris normales, chez la souris NOD (Non Obese Diabetic) suggèrent que des cellules régulatrices, sélectionnées dans ces thymus ectopiques contrôlent la réactivité des cellules effectrices différenciées dans le thymus endogène du receveur. Notre but est d’isoler et de caractériser 1090 PROFESSEURS HONORAIRES ces cellules régulatrices (Salaün et al., 2002). Pour cela nous analysons les cellules T périphériques des souris NOD protégées par la greffe ectopique de thymus + îlots pancréatiques. Leur phénotype est étudié par immunofluorométrie par marquage membranaire permettant d’identifier les cellules T régulatrices exprimant généralement CD4, CD25, CD62L, CD45RB. L’activité suppressive des cellules est testée par leur transfert à des souris NOD « naïves » pour tenter de prévenir le diabète chez ces receveurs. Ce travail est actuellement en cours. LISTE DES PUBLICATIONS 2002 DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. (2002). The avian embryo, a model for the role of cellular interactions in development ; the example of neural crest-derived pigment cells. Proceedings of the International Congress on Bird Reproduction, Tours, September 1999. Avian Poult. Biol. Rev., 13, 155-167. CHARRIER, J.-B., LAPOINTE, F., LE DOUARIN, N. and TEILLET, M.-A. (2002). Dual origin of the floor plate in avian embryo. Development, 129, 4785-4796. LE DOUARIN, N.M. (2002). La crête neurale : une structure pluripotente de l’embryon des vertébrés. Bull. Soc. Roy. Sci. Liège, 71, 87-117. ETCHEVERS, H.C., COULY, G. and LE DOUARIN, N.M. (2002). Morphogenesis of the branchial vascular sector. Trends Cardiov. Med., 12, 299-304. FREITAS, C., RODRIGUES, S., CHARRIER, J.-B., TEILLET, M.-A. and PALMEIRIM, I. (2002). Horloge moléculaire et segmentation des vertébrés : qui fait quoi ? Méd. Sci., 18, 883-887. 2003 ETCHEVERS, H. (2003). Early expression of hypoxia-inducible factor 1 in the chicken embryo. Mech. Dev., 3, 49-52. HOLLEVILLE, N., QUILHAC, A., BONTOUX, M. and MONSORO-BURQ, A.-H. (2003). BMP signals regulate Dlx5 during early avian skull development. Dev. Biol., 257, 177-189. DUPIN, E., REAL, C., GLAVIEUX-PARDANAUD, C., VAIGOT, P. and LE DOUARIN, N.M. (2003). Reversal of developmental restrictions in neural crest lineages : transition from Schwann cells to glial-melanocytic precursors in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5229-5233. PROFESSEURS HONORAIRES 1091 DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. (2003). Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene, 22, 3016-3023. THIBERT, C., TEILLET, M.-A., LAPOINTE, F., MAZELIN, L., LE DOUARIN, N.M. and MEHLEN, P. (2003). Sonic hedgehog controls survival of the neuroepithelial cells of the developing neural tube by regulating Patched-induced apoptosis. Science, 301, 843-846. RUHIN, B., CREUZET, C., VINCENT, C., BENOUAICHE, L., LE DOUARIN, N.M. and COULY, G. (2003). Patterning of the hyoid cartilage depends upon signals arising from the ventral foregut endoderm. Dev. Dyn., 228, 239-246. Sous presse LE DOUARIN, N.M. and DUPIN, E. (2003). Multipotentiality of the neural crest. Curr. Op. Gen. Dev. DIETERLEN-LIÈVRE, F., CREUZET, S. and SALAÜN, J. (2003). In vivo methods to analyze cell origins, migrations, homing, and interactions in the blood, vascular, and immune systems of the avian and mammalian embryo. Methods in Molecular Medicine, Baron M. ed., Humana Press. DUPIN, E. and LE DOUARIN, N.M. Influence of endothelin 3 on the development of pigment cells from the neural crest. In Proceedings of the International Workshop on Molecular Mechanisms of Tanning. Ortonne, J.-P. ed., Martin Dinitz Ltd, London, DISTINCTIONS ET ACTIVITÉS DIVERSES Distinction 2002 ● Grand Officier dans l’Ordre National de la Légion d’Honneur. Congrès et Colloques 2002 ● ● 2003 ● ● Conférence au Colloque de la Fondation des Treilles (Centre d’Études du Bassin Méditerranéen) « The body plan », organisé par E. De Robertis et D. Duboule, du 20 au 25 septembre. Conférence à l’Hôtel d’Assezat, Toulouse, le 3 octobre, Invitation : Pr Anne-Marie Duprat. Conférence au XVe Colloque de l’IFSBM « Cellules souches et Thérapie cellulaire », le 28 avril. Séminaire à l’Université de Rome « La Sapienza », le 22 mai, Invitation : Pr Gabrielle Augusti-Tocco et Pr Paolo Amati. 1092 PROFESSEURS HONORAIRES Organisation de symposium 2003 « Immunité Innée. De la Drosophile à l’Homme », Académie des Sciences, Institut de France, Paris, 19-20 mai. Thèse 2003 Jean-Baptiste Charrier. « Rôles respectifs des mouvements morphogénétiques et de l’induction dans la formation de la floor plate : étude expérimentale chez l’embryon d’oiseau ». Université Paris VII — Denis Diderot (11 juin 2003). M. Jean LECLANT, membre de l’Institut (Académie des Inscriptions et Belles-Lettres) Égyptologie, 1979-1990 Missions et activités Secrétaire perpétuel de l’Académie des inscriptions et belles-lettres. Vice-président de la Commission nationale française de l’UNESCO, président du Hautcomité des Célébrations nationales, président d’honneur de la Société asiatique et de la Société internationale des études nubiennes, ancien président de la Société française d’égyptologie. Participation à des colloques et conférences (Rome, Florence, Strasbourg, Caen, Paris, Grenoble). Publications — CDRom, L’écriture méroïtique (avec Claude Rilly), L’aventure des écritures, Bibliothèque nationale de France et Réunion des Musées Nationaux, 2002. — Avec Claude Rilly : Lingua y escritura en el reino de Meroe, catalogue de l’exposition organisée à Barcelone en 2003 par la Fundación « la Caixa » : Nubia, Los reinos del Nilo en Sudán, pp. 76-79, 3 fig. — Sur les relations de l’Académie des Inscriptions et Belles-Lettres et de l’Académie des Sciences au XVIIIe siècle, Actes du Colloque « Règlement, usages et services dans la France de l’absolutisme », Paris, Juin, 1999, 2002, pp. 95108.