Cours 6
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Partie 3 11 et 12.3.09 Rappels cours 2: régulation de la dorsalisation au stade blastula et gastrula par des facteurs de croissance famille FGF Facteur de croissance Facteur de transcription Facteurs cytoplasmiques famille TGFβ Vg1: + Activine A: +/Nodal: + Wnt: + Dsh – GSK3 – β-caténine – siamois Noggin - chordin BMP: + smad Effet antagoniste de facteurs dorsalisants (chordin, noggin) et de facteurs ventralisants (BMP4) fécondation 1 2 segmentation 3 gastrulation 4 neurulation et organogenèse 6 - Organogenèse 6.1. L’ectoderme produit l’épiderme et le système nerveux Rappel: au cours de la neurulation se différencient l’épiderme et le tube neural à partir de l’ectoderme En fin de neurulation: épiderme constitué d’une couche de cellules = épithélium unistratifié périderme Épithélium unistratifié couche germinative Plus tard au cours du développement se forment les glandes cutanées (invaginations de l’épiderme) ¾ Glandes acineuses (produisent en surface un mucus protecteur) Formation des placodes: les principales sont ¾Adénohypophysaire ¾Olfactives ¾Cristalliniennes ¾Otiques Le système nerveux dérive d’un tube creux Organogenèse selon l’axe antéro-postérieur: Région antérieure tube neural > vésicules cérébrales Région intermédiaire et postérieure tube neural > moelle épinière 6.2. Organogenèse du mésoderme Le feuillet moyen, le mésoderme, se trouve entre l’ectoderme et l’endoderme au cours de la gastrulation L’organogenèse du mésoderme s’amorce pendant la neurulation Mésoderme Région antérieure: Mésenchyme céphalique > tissu conjonctif et muscles de la face Sur l’axe dorsal antérieur – postérieur: mésoderme somitique > tissu conjonctif, os, cartilage, derme, muscles Mésoderme des pièces intermédiaires > Système urinaire et conduits génitaux Mésoderme des lames latérales > Système vasculaire, cœur, cellules sanguines, parois des cavités coelomiques, composants des membres (sauf muscles) Stage bourgeon caudal Axe dorso-ventral Coupe transversale La chorde forme l’axe A-P de l’embryon et « dirige » l’organogenèse Chorde: axe antéro-postérieur (AP) C’est autour de la chorde, qui disparaîtra, que vont s’assembler les vertèbres Les somites contribuent à la formation du squelette, des muscles et du derme Mésoderme paraxial sur toute la longueur de l’embryon Formation des somites? Où l’on retrouve des facteurs connus…! Chordin et noggin Expérience Incubation de noggin ou (chordin + FGF) avec calottes animales > marqueurs de différenciation neurale Antagonisme d’action par BMP4 Mésoderme somitique > > > Migration ¾ cellules du tissu conjonctif ¾ cellules germinales Sécrétion d’une protéine, sonic hedgehog, dont l’expression augmente au cours de la neurulation ¾ Maintien de la polarité dorso-ventrale Action antagoniste des BMP Formation des somites A > P Chaque somite est une entité structurale autonome Dermatome > derme Myotome > cellules musculaires Sclérotome > cellules à l’origine des vertèbres 6.3. Le développement des muscles squelettiques Principes généraux Pour tous les tissus, c’est toujours la même séquence: phase de prolifération suivie d’une phase de différenciation cellules des myotomes Prolifération myoblastes myocytes Différenciation fusion cellulaire myotubes myofibrilles contractiles association de myotubes et connexions nerveuses myotube myocytes Cellule satellite myoblastes prolifération différenciation Après fusion cellulaire, plusieurs noyaux par cellule (myotube) Absence de centrioles dans les myotubes, réorganisation du matériel péricentriolaire autour du noyau Myoblastes en culture DAPI TUBULINE ALP (α-Actinin associated Lim Protein) myotubes myoblastes Myofibrille La jonction neuromusculaire En cas d’altérations, renouvellement par prolifération et différenciation des cellules satellites A la périphérie des muscles, cellules non différenciées, capables de prolifération et de différenciation, les cellules satellites Quels sont les signaux proliférateurs ? Le FGF stimule la prolifération des myoblastes FGF > transduction de signaux > réplication ADN Entrée des myoblastes en différenciation: disparition des récepteurs FGF Stratégie: montrer que le facteur de croissance est capable de favoriser la croissance de cellules musculaires. Exemple: FGF6 (Fibroblast Growth Factor 6) Expérience Etudier l’effet de FGF6 sur la lignée cellulaire musculaire C2C12 (qui ne l’exprime par normalement) Comment ? on fait s’exprimer FGF6 dans la lignée C2C12 en transfectant (en introduisant dans les cellules) le gène codant pour FGF6 Résultat: nouvelle lignée cellulaire, C2CF6 On vérifie que les cellules de la lignée C2CF6 produisent bien du FGF6: mesure de FGF6 dans le milieu de culture des cellules (Western blot) Analyse morphologique des cellules J3 J3 C2C12 C2CF6 Interprétation: Quand FGF6 est synthétisé, la prolifération se poursuit. Pas de différenciation. J7 J7 C2C12 C2CF6 FGF6 stimule la synthèse de MDR1 (MultiDrug Resistance Protein 1) MDR1 est un transporteur de la famille ABC (ATP-Binding Cassette) Protéine membranaire de 1280 aa Hydrolyse l’ATP et régule l’entrée de molécules dans la cellule Le rôle physiologique de MDR1 n’est pas clairement identifié ! Hypothèse: la protéine membranaire pourrait protéger les cellules de l’apoptose (mort cellulaire programmée) Conséquence: maintien de la prolifération des cellules Les marqueurs de différenciation musculaire Rôle de la matrice extra-cellulaire Sécrétion de fibronectine par les myoblastes en différenciation Fibronectine > Récepteur α5β1 > myoblaste Cette liaison est indispensable à la différenciation des myoblastes Expression de facteurs de transcription spécifiques myotube myocytes Cellule satellite myoblastes pax7 pax3 myf5 myoD myogenin MRF4 Conclusion: expression séquentielle de facteurs de transcription pax7 semble être le premier exprimé puis pax3, myf5 et myoD (pax7 toujours exprimé) puis myogenin et MRF4 Pax7 est exprimé très précocement au cours de la régénération chez l’amphibien PCNA DAPI pax7 Revenons aux expériences sur lignées cellulaires… Expérience 1 C2C12: lignée musculaire C2CF6: transfection de FGF6 dans la lignée C2C12 Question: expression comparée de myoD et myf5 ? Expression de… Marqueurs de différenciation: les ARNm de MyoD et Myf5 sont faiblement exprimés dans les cellules C2CF6 comparativement aux cellules C2C12 Expérience 2 Incubation des cellules C2CF6 avec un inhibiteur de FGF6 (SU5402) Western blot: comparer l’expression de trois marqueurs de différenciation dans la lignée C2C12, C2CF6 et C2CF6 + SU5402 Interprétation: En présence de SU5402, les cellules expriment MyoD et Myogénine De plus, l’observation des cellules de la lignée C2CF6 + SU5402 montre la présence de myotubes Conclusion: corrélation « in vitro » entre expression de MyoD et myogenin et la différenciation musculaire pax7 Chez les souris mutantes pax7 -/- Le nombre de cellules satellites décroît rapidement après la naissance La régénération du muscle est déficiente chez les souris adultes Expérience Expression de 2 marqueurs de différenciation, myogénine et myf5, dans des souris transgéniques L’expression de myogénine et de myf5 dépend d’une signalisation noggin Souris sauvages: + Souris mutante noggin -/Souris mutante noggin -/- et possédant une seule copie du gène bmp4 (bmp4+/-) Conclusion Localisation précoce, au niveau des somites, de myf5 et myogénine En absence de noggin, pas d’expression de facteurs de transcription spécifiques de la différenciation musculaire Dans les « double mutants » (absence de noggin et présence partielle de BMP4): expression de myf5 et expression faible de myogénine Expression de gènes spécifiques des cellules musculaires Protéines de structure: - actine musculaire - autres protéines contractiles exemple: myosine, tropomyosine - protéines de filaments intermédiaires: desmine, vimentine Enzymes: - exemple: créatine phosphokinases spécifiques Expression de marqueurs de différenciation musculaire tropomyosine Plusieurs gènes codant pour des actines de fonction spécifique Expression d’une protéine cytoplasmique spécifique La tropomyosine, un marqueur de différenciation musculaire (coupes de bourgeon caudal, stade 54) Hybridation in situ (localisation de l’ARNm) 6.4. Application Réparation de muscles déficients chez l’adulte (thérapie cellulaire régénérative) Biopsie Extraction Réparation Sélection & amplification Injection Décongélation Congélation Contrôle qualité CELOGOS Vers le développement d’une médecine cellulaire? - Spécificité - Absence de toxicité (effets secondaires) - Cellules souches adultes? (exemple des cellules musculaires) - Cellules souches embryonnaires?
