Proposition de sujet de thèse Ecole Doctorale ED425 : Innovation

Proposition de sujet de thèse
Ecole Doctorale ED425 : Innovation thérapeutique: du fondamental à l'appliqué
Sélection: Concours d'accès aux contrats doctoraux des établissements d'enseignement supérieur
Prise de contrôle du métabolisme cellulaire par le bacteriophage T5: une étude vers
le développement de nouveaux antibactériens
Takeover of host metabolism by bacteriophage T5: a study towards the development of new
antibacterial drugs
Directrice de thèse: Mme Pascale BOULANGER, Directrice de Recherche CNRS
Responsable de l'équipe Bacteriophage T5 au Département de Virologie de l'I2BC
Contact: [email protected], Tel: +33 (0)1 69 15 63 40
Website: http://www.ibbmc.u-psud.fr/ and http://www.i2bc-saclay.fr/
Mots clés: bactériophages, transport de l'ADN, métabolisme bactérien, complexes macromoléculaires,
agents antibactériens.
Keywords: bacteriophages, DNA transport, bacterial metabolism, macromolecular complexes,
antibacterial drugs
Profil du candidat: Biochimiste et/ou microbiologiste en cours d'obtention ou titulaire d'un Master ou
diplôme d'ingénieur, ayant une forte motivation pour l'étude des mécanismes moléculaires
fondamentaux qui contrôlent le développement des virus bactériens. Le(la) candidat(e) se formera et
développera des compétences variées en biologie moléculaire, microbiologie, biochimie et biophysique
des protéines, microscopie.
Profile of the applicant: Biochemist and/or Microbiologist in the course of obtaining or holder of a
Masters or Engineering degree, having a strong motivation to study the basic molecular mechanisms
controlling the development of bacterial viruses. The applicant should develop various skills in
molecular biology, microbiology, biochemistry and biophysics of proteins and microscopy.
Description du projet:
Les bactériophages, prédateurs naturels des bactéries, tuent leur hôte avec une grande efficacité.
C'est au tout début du cycle viral qu'ils déjouent les mécanismes de défense et réorientent le
métabolisme de leur hôte au profit de leur propre réplication. L'étude des stratégies utilisées par les
phages pour prendre le contrôle de l'hôte est encore très peu avancée, or elle est essentielle à plus d'un
titre: i) Les gènes précoces, très variables d'un phage à l'autre, n'ont pas d'homologues connus. Ils
représentent donc un réservoir de fonctions inexplorées cruciales pour la neutralisation des fonctions
bactériennes. ii) En décryptant les mécanismes moléculaires de cette mise sous contrôle de l'hôte, nous
pourrons identifier les fonctions bactériennes affectées par les phages, qui constituent des cibles
potentielles pour de nouveaux agents antibactériens.
Pour explorer les étapes précoces de l'infection, nous utilisons le phage T5 qui présente une mode
d'infection tout à fait singulier. T5, qui infecte Escherichia coli, est le seul phage connu qui injecte son
ADN en deux étapes. Après fixation de T5 à son récepteur FhuA, seulement 8% du génome pénètrent
dans la bactérie, puis le transfert est stoppé. Les protéines précoces codées par cette région du génome
sont alors exprimées et agissent sur les fonctions vitales de l'hôte: l'ADN bactérien est massivement
dégradé, la RNA polymérase est détournée vers la transcription des gènes viraux, les systèmes de
restriction/modification et de réparation de l'ADN sont inactivés. Deux des protéines précoces, A1 et
A2, sont requises pour la reprise du transfert de l'ADN, qui a lieu après quelques minutes, permettant le
déroulement complet du processus infectieux. De plus, la synthèse de A1 commande la dégradation de
l'ADN bactérien et le détournement de la machinerie de transcription. Nous disposons de phages mutés
dans les gènes A1 et A2, ce qui permet d'étudier la fonction des gènes précoces et leurs interactions avec
les protéines de l'hôte alors que le transfert de l'ADN est bloqué à la première étape. Ces propriétés de
T5 permettent d'étudier le détournement des fonctions cellulaires indépendamment des autres étapes de
l'infection (réplication du génome et assemblage de la particule virale).
Ce projet de thèse s'inscrit dans l'étude globale des mécanismes moléculaires qui contrôlent le
transfert de l'ADN en deux étapes et la neutralisation des ressources de l'hôte. Le premier objectif est de
caractériser la fonction des protéine A1 et A2. Ces protéines peuvent être surproduites et purifiées et
nous avons débuté leur caractérisation biochimique. Des mutants de T5 seront construits, codant pour
A1 ou A2 fusionnées avec des étiquettes de type "TAP-tag" afin d'identifier les protéines virales et
bactériennes partenaires de A1 et A2 au début de l'infection. Les interactions ainsi établies seront
analysées in vitro en reconstituant les complexes à partir des protéines purifiées. Si ces complexes
peuvent être obtenus de manière stable, leur caractérisation structurale sera effectuée.
Ce projet intégrera également l'identification d'autres gènes précoces impliqués dans la neutralisation
des fonctions bactériennes. Différentes données génétiques indiquent que seulement 5 gènes, en plus de
A1 et A2, sont essentiels pour l'arrêt immédiat de la croissance de l'hôte et le détournement de son
métabolisme. La fonction et les partenaires de ces protéines précoces seront explorés par des approches
génétiques et biochimiques.
Project description:
Bacteriophages, the natural predators of bacteria, can kill their host with high efficiency. In the early
stages of infection phages defeat bacterial defenses and exploit specific cellular functions to serve their
needs and propagate in their host. The strategies by which phages take over the host cell resources
remain obscure and have been studied in a very limited number of phages. An up to date investigation
of these mechanisms is essential for the main following reasons: i) The early-expressed genes are highly
diverse from one phage to another and most of them have no assigned function. They thus represent a
library of novel genes whose functions are crucial for host neutralization. ii) By deciphering the
mechanisms of host takeover, we expect to identify host factors targeted by phage, which constitute
attractive targets for new antimicrobial drugs.
We use the Escherichia coli phage T5 as a model system to investigate the early stages of phage
infection. T5 uses a unique two-step DNA delivery strategy that controls the timing of host function
diversion. After binding of T5 to its host receptor FhuA, only 8% of the genome enters the bacterial cell
before injection temporarily stops. Early proteins encoded by this region of the genome are then
expressed and affect vital host functions: the bacterial DNA is degraded, the RNA polymerase is
redirected towards the transcription of viral genes, the systems of restriction/modification and of DNA
repair are inactivated. Two of early proteins, A1 and A2, are required for resuming the DNA transfer,
which takes place after a few minutes, allowing the completion of the infectious process. Moreover the
synthesis of A1 controls the onset of bacterial DNA degradation and transcription machinery hijacking.
As we have T5 mutants of the A1 or A2 proteins, we can “freeze” infection just after the first step
transfer of the viral genome. This gives us the opportunity to investigate the mechanism of host takeover
independently of the further steps of phage replication and assembly.
This PhD project is part of a global study of the molecular mechanisms, which control the two-step
DNA transfer and the neutralization of host resources. First, it aims at characterizing the function of A1
and A2 proteins. These proteins can be overproduced and purified and we have undertaken their
biochemical characterization. New mutants of T5 will be constructed, encoding tag fusion proteins A1
or A2 (type “TAP-tag”) in order to identify the viral and bacterial partners of A1 and A2 at the onset of
infection. The interactions established in this way will be analyzed in vitro by reconstituting the
complexes starting from purified proteins. If stable complexes can be obtained, their structural
characterization will be carried out.
This project will also include the identification of other early genes involved in the neutralization of
bacterial functions. Genetic data indicate that only 5 genes, besides A1 and A2, are essential for the
immediate diversion of the bacterial metabolism. The functions and partners of these early proteins will
be investigated by genetic and biochemical approaches.
Thématique: Détournement du métabolisme bactérien par les phages
Domaine:
Virologie bactérienne
Objectif: Ce projet vise à décrire le réseau d'interactions qui s'établit immédiatement après l'entrée des
8% de l'ADN, entre les protéines précoces du phage T5 et les fonctions vitales de la bactérie. Un des
objectifs principaux est de caractériser la fonction des protéines A1 et A2, qui programment la deuxième
étape du transport et la dégradation du génome bactérien. Les partenaires de ces deux protéines seront
identifiés parmi les autres protéines précoces et les protéines bactériennes.
Contexte: L'augmentation des infections dues à des bactéries pathogènes multi-résistantes aux
antibiotiques, combinée à la diminution des nouveaux antibiotiques mis sur le marché durant ces dernières
années, constitue un problème majeur de santé publique. Une voie encore peu exploitée pour élaborer de
nouvelles molécules antibactériennes repose sur le décryptage des mécanismes moléculaires qui, au cours
du cycle de développement des bactériophages, conduisent au remodelage du métabolisme bactérien et à la
mort de l'hôte. T5 est un modèle privilégié pour ce type d'étude qui se situe en amont du développement de
nouveaux outils thérapeutiques basés sur les stratégies d'infections utilisées par les phages.
Méthodes: Biologie moléculaire: clonages des gènes de T5 et construction de phages T5 mutants par
recombinaison homologue. Identification des complexes protéiques par chromatographie d'affinité
"TAP-tag" et spectrométrie de masse. Production, purification et caractérisation biochimique des
protéines d'intérêt. Caractérisation biophysique des interactions protéine-protéine (ITC, PTSA, SPR).
Microscopie électronique (immunomarquage des protéines virales dans les bactéries infectées) et de
fluorescence (suivi de la dégradation de l'ADN bactérien in vivo).
Financement: Appels à Projets – Contrat doctoral d'établissement
Références bibliographiques:
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