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TD de Microbiologie Générale
(MBG)
Croissance, Transformation Bactérienne et
Analyse de mutants
Université de Nice Sophia-Antipolis, Faculté des Sciences, LSV2
Intervenants :
K. Mandon ([email protected])
E. Boncompagni ([email protected])
L. Dupont ([email protected])
Apporter du papier semi-log
Problème 1.
A partir d'une culture d'Escherichia coli de 24 h, on inocule, à 4%, deux erlens contenant, pour l'un 25 ml de
milieu LB stérile, et pour l'autre, 25 ml de milieu M63 glucose stérile. Les suspensions sont alors placées dans
une étuve à 37°C sous agitation constante. Le tableau résume l'évolution des densités optiques à 600 nm (DO600)
des suspensions en fonction du temps. Complétez-le.
Temps (h)
DO (LB)
0
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,02
0,04
0,28
0,6
0,75
0,85
0,9
1,0
1,0
1,0
0,02
0,02
0,04
0,08
0,14
0,22
0,35
0,48
0,63
0,7
log (DOx100)
DO (M63)
log (DOx100)
Q1. Tracez les courbes de croissance de chacune des suspensions en précisant le choix de vos ordonnées.
Q2. Décrivez-en les différentes phases et calculez les paramètres de la croissance. Commentez les résultats
obtenus.
Q3. Sachant que une unité de D.O. correspond à 100 µg de protéines/ml et que 1 mg de protéines correspond à
1010 bactéries, calculez la concentration cellulaire des suspensions en phase stationnaire.
Problème 2.
Une souche bactérienne capable d’utiliser le xylose comme seule source de carbone a été isolée. Afin de
mieux comprendre le métabolisme de ce sucre, des cinétiques de croissance sont réalisées en suivant la Densité
Optique à 600 nm en fonction du temps. Pour cela, une culture de cette souche est réalisée en milieu minimum
(MM) additionné de glucose comme seule source de carbone. Lors de la phase exponentielle de croissance, cette
suspension bactérienne sert à ensemencer 3 erlens contenant le même milieu minimum avec comme seule source
de carbone :
1) soit le glucose
2) soit le xylose
3) soit un mélange de glucose + xylose
Les résultats de la (DO600x10) en fonction du temps sont représentés dans le tableau ci-dessous :
Temps (heure)
MM+
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
0,16
0,4
0,96
2,1
2,3
2,3
2,3
2,3
2,7
3,5
5,8
9,6
16
27
33
33
0,14
0,33
0,8
1,7
1,9
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
0,14
0,14
0,14
0,16
0,2
0,3
0,52
0,86
1,4
1,6
1,7
1,7
1,7
1,7
1,7
1,7
DO600
glucose+xylose
MM+
glucose
MM+
xylose
Q1/ Tracez les 3 courbes de croissance sur le papier semi-log, sachant que 2cm=1h.
Q2/ Définir les limites des différentes phases de croissance sur les courbes MM+glucose et MM+ xylose.
Q3/ Comparez et expliquez les différences entre ces 2 courbes (existence ou non de certaines phases de
croissance, etc…).
Q4/ Calculez g et µ en MM+glucose et MM+xylose. Représentez g graphiquement.
Qu’en concluez vous ?
Q5/ Décrivez l’allure de la courbe MM+glucose+xylose.
Calculez graphiquement les temps de génération dans les deux phases linéaires de croissance de cette courbe.
Que concluez-vous quant au métabolisme de ces deux sucres dans cette souche bactérienne ?
Problème 3.
Après 4 sous-cultures successives en milieu LB d’une souche d’E. coli, 4000 colonies ont été isolées.
Parmi ces colonies, 3895 réagissaient comme le clone A, et 1 comme le clone B, 1 comme le C et 1 comme le D.
Un représentant du clone A, ainsi que les clones B, C et D ont été mis en culture dans un milieu minimum M63
contenant du glucose. La croissance bactérienne est évaluée en mesurant à intervalles réguliers la densité optique
à 600 nm. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous :
Temps (h)
Souches
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
0,15
0,16
0,17
0,20
0,28
0,40
0,56
0,80
1,00
1,10
1,20
1,20
1,20
B
0,15
0,15
0,16
0,16
0,14
0,14
0,17
0,15
0,14
0,15
0,15
0,16
0,15
C
0,15
0,14
0,15
0,14
0,16
0,15
0,14
0,15
0,17
0,17
0,15
0,14
0,14
D
0,15
0,17
0,15
0,14
0,16
0,16
0,15
0,17
0,16
0,16
0,15
0,16
0,17
- Tracez les courbes de croissance de chaque clone sur papier semi-log (1h=1 cm). Déterminez graphiquement le
temps de génération de la culture A et en déduire son taux de croissance.
- A 100 µl de la culture A prélevés à t=5 h, on ajoute 2,9 ml de M63. Cette suspension est diluée 105 fois par
dilution sérielle. 200 µl sont étalés, incubés 24h à 37°C et 18 colonies sont dénombrées.
Calculez le titre de la culture et le nombre de bactéries/ml pour une DO600 nm=1.
- Quel phénomène peut expliquer les résultats obtenus pour les clones B, C et D ?
- Les souches B, C et D sont repiquées sur milieu M63 glucose additionné de 3 des 4 acides aminés suivants :
thréonine, arginine, tyrosine ou méthionine. Les résultats des croissances obtenues après 24h d’incubation sont
les suivantes :
Souches
milieu ThrMilieu ArgMilieu TyrMilieu MetB
+
+
-
+
C
+
-
+
+
D
-
-
+
+
Donnez le phénotype de ces 3 souches.
- Une nouvelle culture de la souche C est effectuée dans un milieu M63 glucose additionné d’arginine. 30 ml de
cette culture C arrivée en phase stationnaire (DO600 nm=1,2) sont prélevés et centrifugés, puis le culot bactérien est
resuspendu dans 1 ml de M63. La totalité du culot est alors étalée sur milieu gélosé M63 glucose, sans arginine.
Après 48h d’incubation, on dénombre 7 colonies.
Quelle sélection a-t-on opérée ? Déterminez le taux correspondant à ce phénomène.
Problème 4 : (suite du problème 3) :
Le plasmide pBR322 porte 2 gènes qui confèrent la résistance à 2 antibiotiques: l'ampicilline et la
tétracycline. Il est introduit dans les bactéries de la culture A selon le protocole suivant:
1- On lave 20 ml de bactéries de la culture A (TcS ; AmpS) à DO 0,8 puis on les incube dans du CaCl2
pour fragiliser les enveloppes, on centrifuge et on resuspend le culot dans 2 ml de CaCl2.
Q1. Calculer le titre de la suspension de cellules compétentes
2- A 0,1 ml de cette suspension de cellules compétentes, on ajoute 10 ng d'ADN de pBR322. Le mélange
est maintenu à 4°C pendant 1h puis la température est brutalement élevée pendant 2mn à 42°C pour favoriser
l'entrée du plasmide. Le volume est ensuite complété à 1 ml avec du milieu LB, puis la suspension est maintenue
à 37°C pendant 1h (réparation des enveloppes bactériennes, mise en route des gènes du plasmide) sans que les
bactéries se divisent.
3- Un témoin est constitué par l'application du même protocole à 0,1 ml de bactéries compétentes sans
ADN plasmidique.
Les bactéries des deux lots sont étalées sur un milieu nutritif LB gélosé contenant de la tétracycline.
Après incubation, les colonies bactériennes sont dénombrées et les résultats sont présentés ci-après.
Conditions d'étalement
Milieu LB + Tétracycline
0,1 ml de la dilution 10-1
Bactéries compétentes SEULES
Bactéries compétentes+ pBR322
1
190
Q2. Calculer le nombre total de bactéries transformées TcR
Q3. Calculer le % de bactéries compétentes transformées et déterminer le nombre de bactéries transformées par
µg d'ADN
Problème 5 : Etude du catabolisme de l’histidine
I. Les bactéries utilisent parfois certains acides aminés comme source de carbone et d’énergie. On
s’intéresse à la voie de dégradation de l’histidine chez Escherichia coli. Pour cela, on dispose d’une collection de
mutants incapables de croître sur milieu minimum (MM) additionné d’histidine comme seule source de carbone.
Chacun de ces mutants est cultivés sur MM additionné d’un des différents intermédiaires de la voie de
catabolisme de l’histidine. Les résultats des croissances sont résumés dans le tableau ci-dessous.
Souches
Histidine
(AFG) Acide
formimino
glutamique
Acide
urocanique
Acide
glutamique
(AIP) Acide
imidazolone
propionique
Sauvage
mutant 1
mutant 2
mutant 3
mutant 4
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
1/ Quel protocole utiliseriez-vous pour réaliser cette expérience?
2/ Déterminez l’ordre des composés de cette voie de catabolisme. Justifiez votre réponse en indiquant à
quelle étape chacun de ces mutants est bloqué.
II- Afin de préparer des cellules compétentes du mutant 1, 10 ml d’une culture en milieu riche LB est
réalisée jusqu’à atteindre une DO600 = 0,5 puis centrifugée et resuspendue dans 2 ml de CaCl2.
Cette suspension de bactéries compétentes est diluée 105 fois et 150 µl sont étalés sur milieu gélosé. Après
incubation une nuit à 37°C, on dénombre 180 colonies.
1/ Calculez le titre de la suspension de cellules compétentes.
2/ Les cellules compétentes sont utilisées pour effectuer une transformation avec le plasmide pBSH10 qui
confère la résistance à l’ampicilline et porte le gène hutG.
- 30 ng d’ADN du pBSH10 sont ajoutés à 0,1 ml de bactéries compétentes. Après incubation dans la glace et choc
thermique, 1,9 ml de milieu riche LB sont ajoutés. Après 1 heure d’expression à 37°C, la suspension bactérienne
est lavée, resuspendue dans 2 ml de milieu minimum histidine (MMH) et diluée 10 fois avant étalement de 50 µl
sur milieu MMH gélosé. Le lendemain, 150 colonies sont dénombrées. Une seconde expérience réalisée sans
ajout d’ADN, n’a conduit à aucune colonie.
- Expliquez ces résultats. Quel pourrait être la fonction du gène hutG.
- Calculez le nombre de bactéries transformées par µg d’ADN
Problème 6.
Une mutagenèse EMS (Ethyl Méthane Sulfonate) est effectuée sur une souche d’Escherichia coli arginine–. Pour
cela, 10 ml d’une culture bactérienne réalisée en milieu minimum M63-glucose+arginine sont répartis dans 4
tubes. 30 µl de l’agent mutagène sont ajoutés dans les tubes 2, 3 et 4 pendant 5, 10 et 30 min., respectivement.
Les cellules de chaque tube sont alors lavées deux fois par centrifugation afin d’éliminer l’EMS et le dernier
culot est repris dans 1 ml de milieu M63-glucose.
1) Afin d’évaluer le taux de survie après traitement à l’EMS, 50 µl de chaque tube traité sont mélangés avec 1,95
ml de milieu riche. Après différentes dilutions sérielles précisées dans le tableau I, 50 µl de la dernière dilution
sont étalés sur milieu riche gélosé LB et les colonies dénombrées après incubation de 24 h à 37°C.
Q1. Complétez le tableau I pour chaque temps de traitement et expliquez vos calculs. Tracez le graphe du taux de
survie en fonction du temps de traitement à l’EMS et commentez.
Tableau I :
N° Tube
Temps de traitement
EMS (mn)
0
1
Dilutions
10-5
Nombre de colonies
dénombrées
52
2
5
10-5
43
3
10
10-4
351
4
30
10-4
157
Titre
(bact./ml)
Taux de survie
(%)
2) Pour chaque tube issu du traitement EMS, on réalise une culture de 16 h à 37°C en milieu M63glucose+arginine. Des dilutions sérielles sont alors réalisées et 200 µl de la dernière dilution sont étalés sur
milieu M63-glucose d’une part et milieu M63-glucose+arginine d’autre part. Après 24 h d’incubation, les
colonies sont dénombrées et les résultats reportés dans le tableau I.
Tableau II:
N° tube
1
Colonies sur M63+arg
Dilutions
Nombre
-7
10
168
Titre
Colonies sur MM
(MM + arg) Dilutions Nombre
10 0
171
2
10-6
395
10-3
83
3
10-6
368
10-3
166
4
10-6
186
10-3
153
Titre
(M63)
Fréquence de
mutation
Q2. Quelle sélection a-t-on réalisée ? Quel type de mutation a-t-on obtenu dans le tube 1 d’une part et dans les
autres tubes d’autre part ?
Q3. Calculez les titres bactériens obtenus pour les deux milieux et déterminez la fréquence de mutation pour
chaque temps de traitement à l’EMS. Sur le même papier semi-log (question 1), tracez le graphe de la fréquence
de mutation en fonction du temps de traitement à l’EMS et commentez.
3) A partir du tube n°3 issu du traitement EMS, on réalise une culture de 16 h à 37°C, cette fois en milieu riche
LB. 107 bactéries sont alors étalées sur différents milieux et le résultat des dénombrements des colonies obtenues
après 24 h d’incubation sont résumés ci-dessous :
M63-glucose : 1
M63-glucose + arginine : 45000
M63-glucose +arginine+thréonine : 46000
Ces résultats étaient-ils attendus ? Donnez les phénotypes bactériens sélectionnés sur chaque milieux, comparez
et expliquez les nombres de colonies obtenus dans chaque cas.
Problème 7.
Une souche sauvage d’E. coli est utilisée pour étudier le transport du lactate et du maltose. Les cellules
sont cultivées en milieu AM (phosphate de potassium 50 mM, sulfate d’ammonium 50 mM, glucose
10mM) jusqu’en milieu de phase exponentielle de croissance. Elles sont collectées par centrifugation,
lavées dans le milieu AG dépourvu de glucose et concentrées dans ce même milieu. Leurs réserves
énergétiques sont épuisées par un traitement de 10h en présence de 2,4-dinitrophénol (DNP), agent
découplant de la chaîne respiratoire qui dissipe le potentiel de membrane. Après ce traitement, elles sont
lavées dans le milieu AG dépourvu de glucose et traitées dans les conditions suivantes avant que leur
activité de transport vis-à-vis du 14C-lactate et du 14C-maltose soit mesurée :
- Addition de glucose : incubation de 10 min en milieu AG contenant 10 mM de glucose,
- choc osmotique : traitement permettant d’éliminer une partie des protéines du périplasme. Les
cellules sont ensuite incubées en milieu AG contenant 10 mM de glucose,
- arséniate : incubation de 15 min en présence d’arséniate, inhibiteur de l’ATP synthétase, et
incubation en milieu AG contenant 10 mM de glucose,
- DNP : incubation de 10 min en présence de DNP en milieu AG contenant 10 mM de glucose.
Les résultats des mesures de transport sont les suivants :
Substrats
14
C-Lactate
14
Traitement
Vitesse de transport (nmol/min/mg de protéines)
aucun
0,02
+ glucose
9,52
+ choc osmotique
9,65
+ arséniate
9,35
+DNP
0,12
C-Maltose
aucun
0,20
+ glucose
15,02
+ choc osmotique
1,65
+ arséniate
0,35
+DNP
14,12
Interpréter les résultats présentés dans ce tableau en fonction de vos connaissances sur les différents
types de systèmes de transport.
Problème 8.
Une expérience utilisant le tube d’Adler est réalisée sur une suspension bactérienne d’Escherichia coli. Au
temps T0, le capillaire de volume connu et contenant une solution de glucose, est plongé par une extrémité
dans une suspension bactérienne maintenue dan une solution tamponnée de pH 7,0 et ne contenant aucun
substrat organique (Fig. 1). Après deux heures de contact, les bactéries ayant pénétré dans le tube sont
dénombrées.
a. Dans la 1ère expérience, une souche sauvage d’E. coli est utilisée et la concentration en glucose
dans le capillaire est croissante (Fig. 2). Interprétez les résultats.
b. Dans la 2ème expérience, on utilise la souche sauvage et deux mutants. Le nombre de bactéries
dans le capillaire contenant 1 mM de glucose et l’activité de transport du glucose sont mesurés.
Les résultats sont les suivants :
Nombre de bactéries/tube
Transport (nmoles/min/mg protéine)
Sauvage
750000
15
Mutant 1
1 000
16
Mutant 2
10000
0,5
Lorsque le capillaire contient une solution tamponnée (pas de glucose), le nombre de bactéries par tube est
d’environ 1000.
c. Dans la 3ème expérience, le mutant 1 est mis en suspension dans un milieu contenant du fructose1-phosphate. Le nombre de bactéries retrouvées dans le capillaire contenant 1 mM de glucose est
alors de 700000.
Interprétez les résultats des expériences 2 et 3. Quelles sont les caractéristiques possibles des
mutants 1 et 2 ? Expliquez.
Problème 9.
Rôle et transport de la proline chez Escherichia coli
1) Effet de la proline sur la croissance bactérienne
Chez E. coli, la proline peut être utilisée comme source de carbone et d’énergie par la cellule.
Q1/ Décrivez le type et la composition du milieu de culture qui vous permettraient de démontrer cette
aptitude ?
On cherche également à évaluer le rôle de la proline lors d’un stress osmotique. Pour cela, des cinétiques
de croissance de la souche sauvage dans un milieu minimum + glucose (MM) à faible (0 M NaCl) et
forte osmolarité (0.5 M NaCl) en présence ou non de proline exogène dans le milieu de culture sont
réalisées (graphe ci-dessous) :
2,0
MM 0 M NaCl
MM 0,5M NaCl
MM 0,5M NaCl+proline 1 mM
1,0
DO 600nm
0,5
0,1
0
1
2
3
4
5
Temps (h)
Q2/ Qu’en concluez-vous ?
2) Etude des transporteurs de proline
La souche sauvage d’E. coli est utilisée pour étudier le transport de proline. Les cellules sont cultivées
en milieu minimum + glucose jusqu’en milieu de phase exponentielle de croissance. Après lavage dans
le milieu MM dépourvu de glucose, les réserves énergétiques des cellules sont épuisées par un traitement
de 10h en présence de 2,4-dinitrophénol (DNP), agent découplant de la chaîne respiratoire qui dissipe le
potentiel de membrane. Après ce traitement, elles sont lavées dans le milieu MM dépourvu de glucose en
absence ou en présence de NaCl à 0,5 M final. Les 2 lots de cellules ainsi obtenues sont traités comme
indiqué dans le tableau ci-dessous, puis leur activité de transport vis-à-vis de 14C-proline est mesurée.
Osmolarité du milieu
Vitesse de transport de 14C-Proline
NaCl (M)
(nmol/min/mg de protéines)
_________________________________________________________________________________
– glucose
0
0,02
+ glucose (15 min)
0
7,52
+ arséniate* (10 min) puis glucose (15 min)
0
7,36
+DNP (10 min) puis glucose (15 min)
0
0.11
Traitement
– glucose
0,5
0,03
+ glucose (15 min)
0,5
17.56
+ arséniate* (10 min) puis glucose (15 min)
0,5
7,42
+DNP (10 min) puis glucose (15 min)
0,5
10,12
______________________________________________________________________
*L’arséniate est un inhibiteur de l’ATP synthase.
Une expérience complémentaire est réalisée : les protéines périplasmiques, extraites de cellules cultivées
en MM+ glucose en absence ou en en présence de NaCl 0,5 M, sont incubées 15 min avec de la 14Cproline, puis soumises à une électrophorèse non dénaturante qui est ensuite autoradiographiée (figure cidessous).
NB : la 14C-proline sous forme libre n’est pas détectée dans les conditions présentées ici.
MM+ glucose
- NaCl
+ NaCl 0,5M
Q3/ Interpréter les résultats présentés dans le tableau et l’autoradiographie.
LSV2 – Microbiologie Générale -TD de Génétique Bactérienne
Exercice 1.
Cinq souches Hfr, A - E, sont obtenues au départ d'une même souche F+. Le tableau ci-dessous reprend
les temps d'entrée des cinq premiers marqueurs transférés dans une souche F - par chacune des Hfr lors
d'une expérience de croisement interrompu.
A
B
C
D
E
___________________________________________________________________________
mal+ (1)
ade+ (13)
pro+ (3)
pro+ (10)
his+ (7)
strS (11)
his+ (28)
met+ (29)
gal+ (16)
gal+ (17)
+
+
+
+
ser (16)
gal (38)
xyl (32)
his (26)
pro+ (23)
ade+ (36)
pro+ (44)
mal+ (37)
ade+ (41)
met+ (49)
+
+
S
+
his (51)
met (70)
str (47)
ser (61)
xyl+ (52)
1. Dessinez une carte de la souche F+ en indiquant la position de tous les gènes et les distances en
minutes qui les séparent.
2. Indiquez le point d'insertion et l'orientation de F dans chaque souche Hfr.
Exercice 2.
Dans le croisement Hfr aro+ arg+ eryR strS X F- aro - arg - ery S strR , les marqueurs sont transférés dans
l'ordre indiqué (aro+ entrant en premier). Les exconjugants sont étalés sur un milieu contenant de la
streptomycine (str), de l'erythromycine (ery), de l'arginine (arg) et des acides aminés aromatiques (aro).
L'analyse de 300 colonies apparues sur ce milieu donne les résultats suivants: 263 souches croissent sur
ery, 264 croissent sur ery + arg, 290 sur ery + aro et 300 sur ery + arg + aro.
1. Etablissez une liste des différents génotypes et indiquez le nombre d'individus correspondants.
2. Calculez les fréquences de recombinaison.
Exercice 3.
Dans une expérience de transduction généralisée avec le phage P1, la souche donneuse d'Escherichia
coli est trpC + pyrF - trpA - et la souche receveuse est trpC - pyrF+ trpA+ . Les transductants TrpC+ sont
selectionnés et analysés pour la présence d'autres marqueurs. Les résultats suivants sont obtenus:
Génotype
trpC + pyrF - trpA trpC + pyrF + trpA trpC + pyrF - trpA +
trpC + pyrF + trpA +
Nombre de colonies
548
579
3
90
1. Quel est l'ordre des gènes ?
2. Quelles sont les fréquences de cotransduction de trpC et pyrF, trpA et pyrF, et de trpC et trpA ?
Exercice 4.
On croise une souche Hfr arg+ bio+ leu+ avec une F- arg - bio - leu - . Une expérience de croisement
interrompu montre qu'arg+ est le dernier marqueur transféré dans la F -. Les recombinants arg+ ,
selectionnés sur un milieu contenant de la biotine (bio) et de la leucine (leu), sont analysés pour la
présence des allèles bio+ et leu+. Les résultats suivants sont obtenus pour chaque classe phénotypique:
arg+ bio+ leu+
320
+
+
8
arg bio leu
0
arg+ bio - leu+
+
arg bio leu
48
Quel est l'ordre des gènes ?
Quelles sont les distances génétiques ?
Epreuve de Microbiologie Générale- Janvier 2006 – Durée 1h
Isolement d’une souche de Bacillus subtilis productrice d’antibiotique
La résistance croissante des germes pathogènes aux divers antibiotiques couramment utilisés dans le domaine médical, motive la
recherche de nouveaux antibiotiques plus efficaces. Pour cela, vous vous proposez d’isoler, à partir d’échantillons du sol, des
souches bactériennes à Gram positif douées d’une activité anti-microbienne.
1/ Milieu de culture.
Décrivez le milieu et le protocole expérimental que vous utiliseriez pour sélectionner des souches bactériennes à Gram positif à
partir du sol.
2/ Criblage de souches productrices.
Vous avez isolé 200 souches bactériennes G+ différentes et vous souhaitez maintenant cribler celles qui produisent un
antibiotique actif contre une bactérie à Gram négatif et /ou à Gram positif ou bien contre un champignon microscopique. Si l’on
suppose que l’antibiotique, s’il est produit, est sécrété dans le milieu de culture, expliquez la stratégie expérimentale retenue pour
votre crible.
3/ Croissance bactérienne et production d’antibiotique.
Bravo ! Vous avez isolé une souche de Bacillus subtilis productrice d’un antibiotique original et actif contre les bactéries G+ et G-.
Malheureusement, la production naturelle de cet antibiotique étant très faible, vous souhaitez l’améliorer en vue d’une
commercialisation économiquement rentable.
3-1/ Effet du milieu de culture
Vous réalisez une cinétique de croissance de votre souche sauvage dans un milieu minimum contenant ou du glucose ou du fructose
comme source de carbone et vous suivez en parallèle la quantité d’antibiotique produit (mg/Litre de culture).
Temps (h) :
DO 600 nm
mg antibiotique /L
MM+fructose
DO 600 nm
mg antibiotique /L
MM+glucose
0
0,1
0
0,1
0
5
0,32
0
0,11
0
10
1,2
1
0,32
2
15
3,2
2
0,9
5
20
5
10
1,7
18
23
5
26
1,9
33
25
5
28
2
42
30
5
7
2
44
35
5
3
2
20
Trac
ez
les
cinét
iques de croissance et de production d’antibiotique sur papiers semi-log et millimétré, respectivement.
- Calculez g et µ dans les deux milieux.
- Commentez l’ensemble des résultats.
3-2/ Effet d’un agent mutagène.
Afin d’améliorer la production de l’antibiotique, vous décidez de réaliser une mutagenèse aléatoire de votre souche productrice
par irradiation aux U.V.
i) Détermination de la relation DO600 nm = 1 x bactéries/ml
* Vous disposez d’une culture de la souche sauvage sur laquelle vous réalisez une mesure de DO (voir ci-dessous) et une dilution
sérielle. Après étalement de 200 µl des dilutions 10-5, 10-6 et 10-7 sur un milieu riche et culture 24h à 37°C, vous obtenez les
résultats suivants :
10-5 : 7500 colonies
10-6 : 820 colonies
10-7 : 73 colonies.
Déterminez le titre de la culture.
* Sachant que 100 µl de cette même culture diluée dans 2 ml de milieu donne une DO600nm = 0,23, calculez le titre bactérien
attendu pour une DO600nm=1 pour votre souche de B. subtilis.
ii) Taux de survie et de mutation
- A l’issue de la mutagenèse aux UV d’une culture à DO600=0,8, vous étalez 50 µl de la suspension bactérienne diluée 105 fois sur
un milieu riche et vous dénombrez 163 colonies.
Quel est le taux de survie ?
- En utilisant votre méthode de criblage (cf 2/), vous obtenez, à partir d’1 ml de la suspension bactérienne ayant subie la
mutagenèse, 14 colonies présentant une production d’antibiotique supérieure à la souche de départ.
Quel est le taux de mutation ?
- Sachant que la production d’antibiotique est 102 fois plus importante dans une des souches mutantes sélectionnées et d’après les
résultats obtenus en 3-1/, proposez des conditions optimales pour la production de votre antibiotique.
10
LSV2 Examen TP/TD de Microbiologie Générale et Génétique
– Juin 2006 – Durée 1h.
A la suite du naufrage d’un pétrolier de « l’ Essex Valdon Compagny », des prélèvements de terrain ont été
effectués sur les côtes du Nord Canadien. Des souches de bactéries Gram- du genre Pseudomonas ont ainsi été
isolées, et leurs caractéristiques analysées.
1. Deux isolats de Pseudomonas sp. sont testés pour leur croissance en milieu minimum en présence de glucose,
mannitol, ou naphtalène comme source de carbone. Dans tous les cas (et dans la suite de l’énoncé), du NH4 est
utilisé comme source d’azote. Les résultats obtenus sont présentés sur le graphe 1 ci-dessous.
1a : Complétez le graphe et délimitez les phases de croissance pour les cultures en milieu
minimum/glucose. Comparez la croissance des isolats dans les différents milieux.
1b : Un prélèvement de l’isolat 1 cultivé en milieu minimum/glucose est effectué au temps t = 10h, il est
alors dilué 106 fois, et 200 µl sont étalés sur milieu riche gélosé. Après 48h de croissance à 30°C, 48 colonies
sont dénombrées. Calculez le titre de la culture à DO600= 1.
Naphtalène.
2. Un plasmide présent naturellement dans l’isolat 2 a pu être purifié, a été nommé P2, et a été introduit par
transformation à l’isolat 1, qui n’en contenait aucun. Afin de préparer les bactéries compétentes, 50 ml de culture
milieu minimum/glucose de l’isolat 1 sont prélevés à t = 15h, centrifugés et sont resuspendus dans 2 ml de
CaCl2.
2a : Quel est le titre de la solution de bactéries compétentes ?
2b : 150 ng de plasmide P2 sont mélangés à 100 µl de bactéries compétentes. Après incubation de 10
min. dans la glace, un choc électrique est réalisé, puis 0,9 ml de milieu minimum/naphtalène sont ajoutés. Le
mélange est alors placé 2h à 30°C, avant d’étaler 100 µl du mélange de transformation non dilué ou concentré 5
fois sur le milieu naphtalène/gélosé. Après 48h à 30°C, 14 colonies sont obtenues sur la boite issue de
l’étalement direct et 120 colonies sont obtenues sur la boite issue de l’étalement concentré. Une seconde
expérience est réalisée sans apport d’ADN plasmidique et aucune colonie n’a été dénombrée.
2c : Expliquez le principe de sélection des transformants.
2d : Déterminez le pourcentage de bactéries transformées et le nombre de transformants par µg d’ADN.
Expliquez vos calculs.
2e : Les bactéries transformées sont testées pour leur croissance et les résultats obtenus pour leur capacité
à croître sur milieu minimum/mannitol (□) et milieu minimum/naphtalène (▲) sont reportés sur le graphe 1.
Que pouvez-vous conclure de ces résultats.
3. Après mutagénèse EMS du plasmide P2, les plasmides issus de la mutagénèse sont transférés à l’isolat 1 et les
bactéries transformées étalées sur milieu gélosé minimum/naphtalène ou l’un des 4 dérivés possibles du
naphtalène comme précisé sur le tableau ci-dessous. Les transformants isolés sont alors testés pour leur capacité
à croître (+) ou non (-) sur les dérivés du naphtalène. Finalement, 4 types de transformants distincts ont été isolés
et leur phénotype résumé dans le tableau ci-après.
3a : Expliquez le principe de sélection de ces différents types de transformants
3b : Donnez l’ordre, en vous expliquant, des 4 dérivés de la voie d’utilisation du naphtalène.
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4. Question subsidiaire : Si les côtes de Bretagne sont à nouveau contaminées par « un Erika », utiliseriez-vous le
plasmide P2? Si oui, de quelle façon ? Justifiez votre réponse.
Milieu
Souches
Isolat1
Catéchol
dihydrodiol
Ac.
salicylique
Ac. 2-4
hydroxypentanoïque
naphtalène
-
-
-
-
-
Isolat1 + P2
Transfo type 1
+
+
+
+
+
+
Transfo type 2
-
Transfo type 3
+
+
+
+
+
+
+
Transfo type 4
-
-
+
+
-
-
12
-