CHAPITRE 2.5.11. RÉSUMÉ A. INTRODUCTION
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CHAPITRE 2.5.11. MORVE RÉSUMÉ La morve est une maladie contagieuse et mortelle des chevaux, ânes et mulets due à l’infection par la bactérie Burkholderia mallei (sa dénomination, récemment modifiée, était Pseudomonas pseudomallei et elle avait été antérieurement classée dans les genres Pfeifferella, Loefflerella, Malleomyces ou Actinobacillus). La maladie entraîne la formation de nodules et d’ulcérations dans les voies respiratoires supérieures et les poumons. Elle provoque aussi des lésions cutanées, et la maladie est alors connue sous le nom de « farcin ». Le contrôle de la morve implique de réaliser un test à la malléine chez les équidés qui présentent des symptômes suspects et de séparer les sujets apparemment normaux des sujets réagissant, qui seront éliminés. La morve se transmet à l’homme et tout matériel infecté/contaminé ou potentiellement infecté/contaminé doit être analysé dans un laboratoire qui réponde aux exigences requises pour des agents pathogènes de classe 3. Identification de l’agent pathogène : des frottis de lésions récentes peuvent révéler la présence de bacilles ne prenant pas la coloration de Gram, non sporulés et non capsulés. La présence d’une structure périphérique évoquant une capsule a été démontrée par microscopie électronique. La bactérie est aérobie et préfère les milieux contenant du glycérol. À la différence des Pseudomonas, et de la bactérie étroitement apparentée Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei n’est pas mobile. Le cobaye est hautement sensible à l’infection, et si c’est absolument indispensable, les mâles peuvent être utilisés pour isoler le germe à partir d’un prélèvement très contaminé. Les kits d’identification par tests biochimiques que l’on trouve dans le commerce manquent de sensibilité. Il existe des tests employant des anticorps monoclonaux spécifiques, une amplification en chaîne par polymérase (PCR) et une PCR en temps réel. Ces derniers tests ont été aussi essayés au cours de récents foyers de morve. Malléination et épreuves sérologiques : l’épreuve à la malléine (ou malléination) est un test sensible et spécifique de l’hypersensibilité à Burkholderia mallei. La malléine, une fraction protéique hydrosoluble de la bactérie, est injectée par voie sous-cutanée ou intradermo-palpébrale et peut être aussi déposée dans l’œil. Ceci provoque, chez les animaux infectés, un œdème cutané ou un gonflement nets de la paupière en 1 à 2 jours. La fixation du complément et la technique immunoenzymatique (ELISA) sont les épreuves sérologiques les plus valables et les plus fiables pour le diagnostic. Une épreuve d’agglutination sur lame au Rose Bengale a été récemment développée en Russie, mais elle n’a été validée actuellement que dans ce pays. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : il n'existe pas de vaccins de la morve. Un dérivé protéique purifié de la malléine peut être actuellement acheté à l’Institut central de contrôle et de recherches vétérinaires (Central Veterinary Control and Research Institute), 06020, Etlik, Ankara (Turquie). A. INTRODUCTION La morve est une maladie bactérienne des ongulés périssodactyles, c’est-à-dire d’animaux possédant un nombre impair d’onglons, qui a un fort potentiel zoonotique et qui est connue depuis l’antiquité. Elle est la conséquence d’une infection par la bactérie Burkholderia mallei (sa dénomination, récemment modifiée, était Pseudomonas pseudomallei (45) et elle avait été antérieurement classée dans des genres variés comme Pfeifferella, Loefflerella, Malleomyces ou Actinobacillus). Des cas de morve peuvent survenir également chez des félidés sauvages vivant en liberté ou dans les parcs zoologiques. La sensibilité à la morve a été en outre démontrée chez les camélidés, l’ours, le loup et le chien. Les carnivores peuvent se contaminer en mangeant de la viande infectée, mais les bovins, ovins et porcins sont résistants (22). Les petits ruminants peuvent aussi être infectés au 1006 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.11. — Morve contact étroit de chevaux morveux (42). Les formes aiguës de la maladie sont surtout décrites chez l’âne et le mulet qui présentent une fièvre élevée et une atteinte respiratoire (naseaux tuméfiés, dyspnée et pneumonie) ; la mort survient en quelques jours. Chez les chevaux, la morve s’exprime plutôt sous forme chronique, et ils peuvent survivre plusieurs années. Les animaux atteints de formes « occultes » chroniques et infracliniques constituent de dangereuses sources de contage du fait d’un portage permanent ou intermittent de la bactérie (42). Chez les chevaux, les nodules inflammatoires et les ulcères se développent sur les parois nasales, et provoquent un jetage jaune et collant. Ils s’accompagnent d’une adénite sous-maxillaire (nœuds lymphatiques durcis et hypertrophiés). Des cicatrices en étoile apparaissent après la guérison des ulcères. La formation d’abcès nodulaires dans les poumons s’accompagne d’une asthénie progressive, d'épisodes fébriles, de toux et de dyspnée. Une diarrhée et une polyurie peuvent aussi apparaître. Dans la forme cutanée (« farcin »), les vaisseaux lymphatiques sont tuméfiés (« cordes ») et des abcès nodulaires (« chancres ») de 0,5 à 2,5 cm se forment sur leur trajet, s’ulcèrent et laissent s’écouler un pus jaune et de consistance huileuse ou « huile de farcin ». Des nodules sont régulièrement retrouvés dans le foie et la rate. Le jetage et le pus huileux s’écoulant des voies respiratoires et des lésions cutanées sont infectieux. La transmission, facilitée par des contacts étroits entre les animaux, est généralement assurée par l’inhalation ou l’ingestion de matériel contaminé (par exemple aliments et abreuvoirs infectés) et par inoculation (par l'intermédiaire d'un harnais, par exemple). La période d'incubation peut varier de quelques jours à plusieurs mois (23, 42). La morve est transmissible à l’homme par contact direct avec les animaux malades ou du matériel infecté/contaminé. La mortalité dans les cas aigus non traités peut atteindre 95 % dans les 3 semaines (25). Les malades peuvent quand même guérir s’ils sont traités rapidement et énergiquement par divers antibiotiques systémiques (17, 33). Une forme chronique avec abcès est aussi décrite (25). Les personnes appelées à manipuler des animaux suspects ou reconnus infectés, ou des objets souillés, doivent prendre des précautions rigoureuses pour ne pas se contaminer ou transmettre de la bactérie à d'autres équidés Les prélèvements destinés au laboratoire doivent être empaquetés en tenant compte des consignes de sécurité, tenus au frais et transportés conformément au Chapitre 1.1.1., « Prélèvement et expédition des échantillons pour le diagnostic » de ce Manuel terrestre. Toutes les manipulations de matériel potentiellement infecté/contaminé doivent être effectuées dans un laboratoire qui réponde aux exigences de confinement pour des microbes pathogènes de classe 3, conformément aux indications présentées dans le Chapitre 1.1.2., « Biosécurité et Biosûreté au laboratoire de microbiologie vétérinaire et dans les animaleries », de ce Manuel terrestre. La morve a été éradiquée de nombreux pays par des mesures associant le dépistage réglementaire et l’élimination des animaux infectés ainsi que des mesures de restriction à l’importation. Elle persiste dans quelques pays asiatiques, africains et sud-américains. Elle peut être considérée comme une maladie ré-émergente, qui peut être introduite en pays indemne par des animaux de compagnie ou des chevaux de course (26). B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC 1. Identification de l’agent pathogène Le diagnostic clinique différentiel de la morve doit être fait avec les autres infections chroniques des muqueuses nasales ou des sinus, et avec la gourme (infection par Streptococcus equi), la lymphangite ulcéreuse (Corynebacterium pseudotuberculosis), la pseudotuberculose (Yersinia pseudotuberculosis) et la sporotrichose (Sporotrichium spp.). Les cas de morve doivent être clairement différentiés des cas suspects de lymphangite épizootique (causée par Histoplasma farciminosum) avec lesquels ils présentent de nombreuses similitudes cliniques. Chez l’homme, la morve doit être distinguée de la mélioïdose (infection par B. pseudomallei) qui est causée par une bactérie très proche de B. mallei (22). a) Morphologie de Burkholderia mallei Les bactéries sont assez nombreuses dans les étalements réalisés à partir de lésions récentes, mais peu abondantes dans les lésions plus anciennes (41). Elles peuvent être colorées au bleu de méthylène ou au mélange de Gram. Elles sont principalement en position extracellulaire et apparaissent sous forme de bâtonnets ne prenant pas la coloration de Gram, aux extrémités arrondies, de 2 à 5 μm de long et 0,3 à 0,8 μm de large, contenant des inclusions granulaires de tailles variées. Elles ont souvent une coloration irrégulière, n’ont pas de capsule visible au microscope ordinaire et ne forment pas de spores. La présence d’un revêtement ressemblant à une capsule a néanmoins été mise en évidence par microscopie électronique. Ce revêtement est composé de sucres neutres et sert à protéger la cellule bactérienne des facteurs défavorables du milieu. À la différence d’autres micro-organismes du groupe des Pseudomonas, et de son proche parent Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei ne possède aucun flagelle et n’est donc pas mobile (19, 31). Il est difficile d’affirmer la présence des micro-organismes dans les coupes de tissus, où ils peuvent avoir un aspect perlé (21). Leur aspect dépend de l’âge de la culture et du type de Manuel terrestre de l’OIE 2008 1007 Chapitre 2.5.11. — Morve milieu employé. Ils présentent un pléomorphisme accentué dans les vieilles cultures. Des filaments branchés se forment à la surface des cultures en bouillon (26). b) Caractéristiques en cultures Il vaut mieux tenter l'isolement à partir de lésions fermées non contaminées (21). Le micro-organisme est aérobie strict et anaérobie facultatif seulement en présence de nitrates (8, 19). Sa température optimale de croissance est de 37 °C (20). Il pousse bien, mais lentement, sur milieu ordinaire de culture, et 72 h d’incubation sont recommandées ; l’enrichissement en glycérol est particulièrement utile. Quelques jours d’incubation sur gélose au glycérol permettent d’obtenir des colonies de couleur légèrement crème, lisses, humides et visqueuses. En poursuivant l'incubation, les colonies sont plus épaisses et deviennent brun foncé et fermes. Le germe pousse bien aussi sur gélose-pomme de terre glycérinée et en bouillon au glycérol, à la surface duquel se forme une pellicule visqueuse. La culture est beaucoup moins luxuriante sur gélose nutritive ordinaire, et la croissance est faible sur gélatine (34). Les cultures de B. mallei faites à partir de prélèvements recueillis dans des conditions non stériles sont régulièrement envahies par d’autres bactéries. Pour éviter l’altération des caractères de la bactérie qui peuvent survenir in vitro, il faut réaliser les réactions d'identification à partir d’isolats récents. Le lait tournesolé est légèrement acidifié par B. mallei, et peut coaguler après une longue incubation. La bactérie réduit les nitrates. Bien que quelques auteurs aient écrit que le glucose était le seul glucide oxydé (lentement et de manière inconstante), d’autres ont montré que si un milieu et un indicateur appropriés étaient utilisés, le glucose et d’autres glucides comme l’arabinose, le galactose et le mannose étaient régulièrement fermentés par B. mallei (6). L’indole n’est pas produit, le sang de cheval n’est pas hémolysé et aucun pigment n’est diffusé dans les cultures (19). Un kit de diagnostic pour les tests de laboratoire disponible dans le commerce (par exemple le système API [Analytical Profile Index]: Analytab Products, BioMerieux ou Biolog [Hayward, California]) permet de confirmer facilement que la bactérie appartient au groupe Pseudomonas. Les systèmes actuellement en vente permettent rarement d’identifier avec certitude les espèces toujours plus nombreuses du genre Burkholderia (9). L’absence de mobilité du germe devient alors particulièrement importante à rechercher. Il existe un bactériophage spécifique de B. mallei (43). Tous les milieux de culture préparés devraient être soumis à un contrôle de qualité de manière à vérifier qu’ils permettent effectivement la croissance du micro-organisme suspect à partir d’un faible inoculum. La souche de référence devrait être cultivée en parallèle avec les prélèvements suspects, afin de s’assurer de la fiabilité des épreuves. L’ajout au milieu de substances inhibant la croissance des bactéries qui prennent la coloration de Gram (par exemple le cristal violet ou la proflavine) a prouvé son utilité lorsque les prélèvements sont contaminés, de même qu’un pré-traitement de ces prélèvements à la pénicilline (1 000 unités/ml pendant 3 h à 37 °C) (22). Un milieu sélectif a été élaboré (44), qui incorpore de la polymyxine E (1 000 unités), de la bacitracine (250 unités) et de l’actidione (0,25 mg) dans de la gélose nutritive (100 ml) contenant de la glycérine (4 %), du sérum d’âne ou de cheval (10 %), et de l’hémoglobine ovine ou de la gélose tryptone (0,1 %). Hors de l’organisme, le micro-organisme est peu résistant à la dessiccation, à la chaleur, à la lumière ou aux produits chimiques, de sorte qu’il a peu de chances de survivre plus de deux semaines (25). Toutefois, dans des conditions favorables, il peut rester vivant quelques mois. Burkholderia mallei peut survivre dans l'eau du robinet pendant au moins un mois (34). Le chlorure de benzalkonium ou « roccal » (1/2 000), l’hypochlorite de sodium (500 ppm de chlore actif), l’iode, le chlorure de mercure en solution alcoolique, et le permanganate de potassium se sont avérés de très puissants désinfectants de B. mallei (20). Les désinfectants phénoliques sont moins actifs. c) Inoculation à l’animal de Laboratoire En cas de nécessité, le cobaye, le hamster et le chat ont été utilisés pour le diagnostic. Lorsque l’isolement chez l’animal de laboratoire est jugé indispensable, le matériel suspect est inoculé par voie intra-péritonéale à un cobaye mâle. Comme la sensibilité de cette technique n’est que de 20 %, il est conseillé d’inoculer au moins cinq animaux (25). L’inoculation d’un prélèvement infecté entraînera une sévère péritonite locale et une orchite (« signe de Strauss »). Le nombre de bactéries et leur virulence conditionnent la gravité des lésions. Lorsque le matériel étudié est fortement contaminé, il faut faire des passages supplémentaires (11). Le signe de Strauss n’est pas spécifique de la morve, et d’autres bactéries peuvent le provoquer. La spécificité de la réponse obtenue doit donc être confirmée par l’examen bactériologique des testicules infectés. d) Confirmation par amplification en chaîne par polymérase (PCR) et PCR en temps réel Plusieurs épreuves de PCR et de PCR en temps réel ont été proposées au cours de ces dernières années dans le but d’identifier Burkholderia mallei (2, 13, 32, 36, 38, 39), mais seule une épreuve de chaque ont été 1008 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.11. — Morve évaluées lors d’un récent foyer de morve chez le cheval (30, 37). Ce sont ces deux épreuves qui seront décrites en détail ci-après, même si leur robustesse reste à démontrer par des essais inter-laboratoires. Les lignes directrices et les précautions figurant au chapitre 1.1.5., « Validation et contrôle qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) utilisées pour le diagnostic des maladies infectieuses », de ce Manuel Terrestre doivent être prises en compte. • Préparation de l’ADN Des colonies isolées sur gélose sont transférées dans 200 µl d’un tampon de lyse (5x tampon D [PCR Optimation Kit, Invitrogen, DeShelp, Pays-Bas, dilué au 1/5 en eau ultra-pure] ; 0.5 % de Tween 20 [ICI, American Limited, Merck, Hohenbrunn, Allemagne] ; 2 mg/ml de protéinase K [Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne] ; après incubation 1 heure à 56 °C et inactivation pendant 10 min à 95 °C, 2 et 4 µl du lysat clarifié sont utilisés comme échantillon, respectivement pour la PCR et pour la PCR en temps réel. Quelques échantillons de tissus sont prélevés sur des chevaux (peau, foie, rate, poumon et conque auriculaire) inactivés dans le formol (48 h, 10 % v/v) puis découpés au scalpel en petits morceaux de 0,5 × 0,5 cm (environ 500 mg). Ces échantillons sont lavés deux fois en eau dé ionisée (10 ml), incubés une nuit en solution saline stérile à 4 °C, puis broyés au pilon dans un mortier en présence d’azote liquide. L’ADN total est obtenu à partir de 50 mg de tissus avec le QIAamp Tissue KitTM, en suivant les instructions du fabricant (Qiagen, Hilden, Allemagne). L’ADN est élué avec 80 µl d’H20, dont 4 µl sont utilisés comme matrice. • Épreuve PCR (30) L’épreuve doit éventuellement être adaptée au protocole de PCR utilisé, avec quelques petites modifications concernant les paramètres du cycle la concentration des produits chimiques. Les oligonucléotides employés par les auteurs cités en référence 30 ont été choisis sur la base des différences existantes entre les séquences fliP de B. mallei ATCC 23344T (numéros d’accès NC_006350, NC_006351) et de B. pseudomallei K96243 (numéros d’accès NC_006348, NC_006349). Les amorces Bma-IS407-flip-f (5’-TCA-GGT-TTG-TAT-GTC-GCT-CGG-3’) et Bma-IS407-flip-r (5’-CTA-GGT-GAA-GCTCTG-CGC-GAG-3’) sont employées pour amplifier un fragment de 989 pb. La PCR est réalisée avec 50 µl de mastermix (Eppendorf, Hamburg, Allemagne) prêt à l’emploi et 15 pmol de chaque amorce. Le thermo-cycleur est paramétré à 94 °C pour 30 s, 65 °C pour 30 s et 72 °C pour 60 s. Le cycle est repris 35 fois. Une étape finale d’élongation est ajoutée au processus (72 °C pendant 7 min). Les produits finaux sont observés en lumière ultra-violette après électrophorèse en gel d’agarose (1 % p/v en tampon TAE) et coloration au bromure d’éthidium. Des témoins dans lesquels l’échantillon est remplacé par de l’eau de qualité PCR et des témoins positifs contenant l’ADN de B. mallei seront introduits dans chaque cycle pour détecter la contamination par les amplicons des réactions précédentes ou pour détecter les échecs de l’amplification. La limite inférieure de détection est de 10 fg, soit l’équivalent de deux génomes. • PCR en temps réel (37) L’épreuve doit éventuellement être adaptée à la PCR en temps réel utilisée, avec quelques petites modifications. C’est ainsi que les tubes du cycle doivent être choisis en fonction des recommandations du fabricant, et qu’il faut parfois doubler la concentration des oligonucléotides ou bien modifier le type de marquage des sondes. Les auteurs ont utilisé un système de PCR en temps réel MX3000PTM (Stratagene, Amsterdam, Pays-Bas) et des plaques à 96 trous (ThermoFast 96 ABGeneTM, Rapidozym, Berlin, Allemagne). Les oligonucléotides employés par les auteurs cités en référence 37 ont été choisis sur la base des différences existantes entre les séquences fliP de B. mallei ATCC 23344T (numéro d’accès NC_006350, NC_006351) et de B. pseudomallei K96243 (numéros d’accès NC_006348, NC_006349). La sonde fluor génique est synthétisée avec du 6-carboxy-fluorescéine (FAM) à l’extrémité 5’ et un black hole quencher 1 (BHQ1) à l’extrémité 3’. Les oligonucléotides utilisés sont Bma-flip-f (5’-CCC-ATT-GGC-CCT-ATC-GAA-G3’), Bma-flip-r (5’-GCC-CGA-CGA-GCA-CCT-GAT-T-3’) et la sonde Bma-flip (5’-6FAM-CAG-GTC-AACGAG-CTT-CAC-GCG-GAT-C-BHQ1-3’). Le mélange réactionnel de 25 µl est constitué de 12,5 µl 2× TaqManTM Universal MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, Etats-Unis d’Amérique), 0,1 µl de chaque amorce (10 pmol/µl), 0,1 µl de la sonde (10 mol/µl) et 4 µl d’échantillon. Le thermo-cycleur est paramétré à 50 °C pendant 2 min ; 95 °C pendant 10 min ; 45 (50) cycles à 95 °C pendant 25 s et 63 °C pendant 1 min. Les contaminants possibles, constitués par les produits d’amplification des réactions précédentes, sont inactivés au cours d’une étape d’incubation initiale utilisant l’uracile N’-glycosilase. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1009 Chapitre 2.5.11. — Morve Les auteurs suggèrent d’inclure un témoin interne d’inhibition constitué par un gène cible du bactériophage lambda (Lambda-F [5’-ATG-CCA-CGT-AAG-CGA-AAC-A-3] Lambda-R [5’-GCA-TAA-ACG-AAG-CAG-TCGAGT-3’], Lam-YAK [5’-YAK-ACC-TTA-CCG-AAA-TCG-GTA-CGG-ATA-CCG-C-DB-3’]), qui peut être titré pour déterminer les valeurs limites reproductibles du cycle. Toutefois, selon les prélèvements à analyser, un gène d’expression ubiquitaire peut aussi être utilisé en plus ou de manière alternative. Des témoins dans lesquels l’échantillon est remplacé par 4 µl d’eau de qualité PCR et des témoins positifs contenant l’ADN de B. mallei doivent être introduits dans chaque cycle pour détecter la contamination par les amplicons ou les échecs de l’amplification. L’échelle linéaire de l’épreuve a été calculée de manière à couvrir toutes les concentrations, de 240 pg à 70 fg de l’ADN bactérien/réaction. La limite inférieure de détection, définie comme la plus petite quantité d’ADN toujours détectable lors de trois cycles comportant huit mesures chacun, est de 60 fg d’ADN soit l’équivalent de quatre génomes (au seuil de probabilité 95 %). Pour chacune des réactions respectives, la variabilité intra-essai de l’épreuve PCR fliP pour 35 pg d’ADN/réaction est de 0,68 % (basée sur les valeurs Ct) et elle est de 1,34 %. pour 875 fg d’ADN/réaction. La variabilité inter-essai est respectivement pour chaque réaction de 0,89 % (basée sur les valeurs Ct) pour 35 pg d’ADN/réaction et de 2,76 % pour 875 fg d’ADN/réaction. e) Autres méthodes Le génome de la souche type ATCC 23344T de Burkholderia mallei a été séquencé en 2004 (27). Plusieurs génomes d’autres isolats l’ont été également par la suite, révélant une grande plasticité génétique. Les passages sur différentes espèces hôtes ou sur différents milieux de culture peuvent altérer considérablement les séquences génomiques (29). La perte, par mutation, de la capacité de produire les LPS et/ou les polysaccharides capsulaires suite à des passages successifs de la bactérie en culture est bien connue ; elle se traduit par une virulence réduite, voire nulle, et elle a une influence sur les réactions sérologiques (26). Plusieurs techniques de typage moléculaire ont été développées avec succès. De simples techniques moléculaires comme la PCR - Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (35) et l’électrophorèse sur gel en champ pulsé (5) peuvent être utilisées pour mieux caractériser les isolats. Le ribotypage de 25 isolats de B. mallei faisant appel aux enzymes de restriction PstI et EcoRI en association avec une sonde E. coli 18-mer rADN a révélé l’existence de 17 sérotypes distincts (12). Ces techniques restent encore réservées à certains laboratoires spécialisés, parce qu’elles doivent faire appel à une collection très importante de souches. Le typage séquentiel multiloculaire (MLST) est réalisable avec de l’ADN purifié, ce qui évite d’avoir trop de cultures bactériennes en cours ou de devoir entretenir des souches de collection. Une analyse basée sur des données disponibles sur internet peut même faciliter les diagnostics (10). Aucune caractéristique spécifique des lésions causées par B. mallei ne peut être décrite au plan anatomopathologique. Des sérums hyperimmuns de lapin spécifiques de B. mallei peuvent être utilisés pour l’analyse immunohistochimique. 2. Malléination et épreuves sérologiques a) La malléination (Épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Le dérivé protéique purifié (PPD pour Purified Protein Derivative) de la malléine, qui est disponible sur le marché, est une solution de fractions protéiques solubles dans l’eau obtenues en traitant B. mallei par la chaleur. L’épreuve repose sur la détection de l’hypersensibilité à la malléine des chevaux infectés. Des résultats peu concluants peuvent être observés dans les formes cliniques avancées chez les chevaux et les formes aiguës chez les ânes, nécessitant le recours à des méthodes de diagnostic complémentaires (1). • Le test intradermo-palpébral C’est l’épreuve la plus sensible, la plus fiable et la plus spécifique de détection de la morve chez les ongulés périssodactyles (solipèdes) infectés, et il a largement supplanté les tests ophtalmiques et sous-cutanés (3). Un volume de 0,1 ml de malléine PPD concentrée est injecté par voie intradermique dans la paupière inférieure, et la réaction est recherchée 24 h et 48 h après. Une réaction positive est caractérisée par un œdème marqué de la paupière, éventuellement accompagné d’un écoulement purulent du cul-de-sac conjonctival ou de la conjonctive. Cette réaction locale est habituellement accompagnée d’une élévation de la température. Lorsque la réaction est négative, on ne constate habituellement aucun changement, ou tout au plus un léger gonflement de la paupière inférieure. • Le test ophtalmique Ce test est moins fiable que le test intradermo-palpébral. Quelques gouttes de malléine sont déposées dans l’œil au niveau du cul-de-sac conjonctival. Chez un animal infecté, on observe habituellement un gonflement des paupières s’étendant parfois sur la joue, éventuellement associé à un léger écoulement oculaire. La réaction peut également se produire, mais moins marquée, sur l’œil opposé. 1010 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.11. — Morve • L’épreuve sous-cutanée Cette épreuve interfère avec le diagnostic sérologique et on lui préfère donc les deux méthodes de malléination précédentes, d’autant plus qu’elle peut ne pas être autorisée dans certains pays. La température du cheval doit être inférieure à 38,8 °C le jour précédant l’épreuve, au moment de l’injection, et 9, 12 et 15 h après l'injection. Une zone de peau de 10 cm2 est tondue et désinfectée au milieu de l’encolure; 2,5 ml de malléine diluée sont injectés par voie sous-cutanée au centre de cette zone. Lorsque le test est positif, la température du cheval s’élève à 40,0 °C (104°F) ou au-dessus pendant les 15 premières heures, et une tuméfaction ferme et douloureuse à bords surélevés se développe dans les 24 h au site de l'injection. Chez les chevaux non infectés, on n’observe aucune réaction locale, ou seulement un petit œdème local et transitoire. En cas de réaction douteuse, l’épreuve peut être recommencée 14 jours plus tard avec une double dose de malléine. b) Épreuve de la fixation du complément (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Bien qu’elle ne soit pas aussi sensible que la malléination, l’épreuve de la fixation du complément (FC) constitue un test sérologique valable, qui a été utilisé durant de nombreuses années pour diagnostiquer la morve (3). Ce test est considéré comme fiable à 90-95 %, la réaction sérologique devenant positive moins d’une semaine après l’infection et le demeurant en cas de réveil du processus chronique (34). Toutefois, sa spécificité a été récemment mise en doute (26). • Préparation de l’antigène (16) i) Des flacons contenant un bouillon de viande additionné de 3 % de glycérol sont inoculés avec une culture de B. mallei en phase de croissance exponentielle et incubés à 37 °C pendant 8 à 12 semaines ; ii) Les cultures sont inactivées en exposant les flacons à la vapeur naissante (100 °C) pendant 60 min ; iii) Le surnageant clair est décanté et filtré. Le filtrat est de nouveau plongé 75 min dans un bain de vapeur, pendant trois jours consécutifs, et clarifié par centrifugation ; iv) Le produit clarifié est concentré au dixième de son volume original par évaporation dans un bain de vapeur ou d'eau chaude ; v) L’antigène concentré est versé dans des flacons de verre brun afin d’être protégé de la lumière, et conservé à 4 °C. Il a été démontré que l’antigène, une fois concentré, restait stable pendant au moins 10 ans ; vi) Les lots d'antigène sont préparés en diluant l'antigène concentré au 1/20e dans une solution saline stérile contenant 0,5 % de phénol. L’antigène dilué est réparti dans des ampoules de verre brun et stocké à 4 °C. La dilution finale de travail est déterminée par un titrage en échiquier. La dilution finale se fait extemporanément, au moment de la réalisation de la FC ; L'antigène préparé est principalement un lipopolysaccharide (LPS). Une technique alternative de préparation de l’antigène consiste à employer des cultures jeunes : l’agent est mis en culture pendant 12 h sur des géloses inclinées glycérinées, qui sont ensuite rincées avec une solution saline. La suspension obtenue est chauffée pendant 1 h à 70 °C et c’est cette suspension bactérienne chauffée qui est utilisée comme antigène. L’inconvénient de cette méthode de préparation de l’antigène est qu’il contient tous les composants cellulaires de la bactérie. L'innocuité de la préparation antigénique doit être contrôlée par sa mise en culture sur gélose au sang. • Protocole (24) i) Le sérum est dilué au 1/5 dans du tampon véronal (barbiturique) salin contenant 0,1 % de gélatine ou du diluant pour fixation du complément (CFD pour Complement Fixation Diluent – disponible en comprimés) sans gélatine ; ii) Le sérum dilué est inactivé pendant 30 min à 56 °C. Dans le protocole de FC utilisé par le Département de l’Agriculture des États-Unis (USDA), l’inactivation dure 35 min (24). Le sérum des équidés autres que des chevaux doit être inactivé à 63 °C pendant 30 min ; iii) Des dilutions de 2 en 2 des sérums sont préparées dans des plaques de microtitrage à 96 trous à fond arrondi ; iv) Le complément de cobaye est dilué dans le tampon choisi ; 5 (ou éventuellement 4) unités de complément lysant 50 % des globules rouges (CH50) sont employées ; v) Les sérums, le complément et l'antigène sont répartis dans les plaques et incubés pendant 1 h à 37 °C (Il on peut aussi laisser la plaque à 4 °C pendant une nuit) ; Manuel terrestre de l’OIE 2008 1011 Chapitre 2.5.11. — Morve vi) On ajoute une suspension de globules rouges de moutons à 2 %, lavés et sensibilisés. Dans le protocole du Département de l’Agriculture des États-Unis les réactions positives doivent être confirmées dans un tube à essai contenant des globules rouges de moutons à 3 % (24). vii) Les plaques sont incubées pendant 45 min à 37 °C, et ensuite centrifugées pendant 5 min à 600 g. Une hémolyse de 100 % à la dilution du 1/5 est considéré comme un résultat négatif. Le résultat est douteux si on observe 25 à 75 % d’hémolyse, et il est positif si aucune hémolyse (100 % de fixation) n’est observée à cette même dilution du sérum analysé. Malheureusement, des résultats faussement positifs peuvent se produire, et B. pseudomallei et B. mallei, qui présentent des réactions croisées, ne peuvent être différentiés par sérologie (3, 25). Des chevaux sains peuvent aussi présenter une réaction de FC faussement positive pendant une période variable après une malléination par voie intradermique. c) Épreuve immuno-enzymatique Des épreuves immuno-enzymatiques (ELISA) en plaque et sur membrane (blot) ont été utilisées dans le diagnostic sérologique de la morve, mais aucun de ces procédés n’a permis de différencier sérologiquement B. mallei et B. pseudomallei. Des tentatives de détection des anticorps basées sur leur interaction avec un antigène fixé sur un support ont été réalisées en imprégnant une zone délimitée de languettes (ou de bâtonnets) avec les antigènes (« antigen-dotted dipsticks ») ensuite immergées dans le liquide contenant les anticorps ou par western blot en faisant appel à des antigènes préalablement séparés par électrophorèse et transférés sur un support (14, 40). Un ELISA de compétition utilisant un anticorps monoclonal antipolysaccharide non caractérisé a aussi été développé, et il s’est montré aussi performant que la FC (15). Le développement permanent de réactifs anticorps monoclonaux spécifiques des antigènes de B. mallei est très prometteur pour la mise au point prochaine de tests ELISA plus spécifiques, qui aideront à résoudre les résultats incertains des épreuves pratiquées pendant la quarantaine des chevaux importés (4, 7, 18, 25). Actuellement, aucun de ces tests n’a été validé. d) Autres épreuves sérologiques Un dot-ELISA avidine-biotine a été décrit (40), mais n'a pas encore été très utilisé, ni validé. L'antigène est constitué d’une culture bactérienne inactivée par la chaleur qui a été concentrée et purifiée. Un petite tache de cet antigène est ensuite déposée sur une languette de nitrocellulose (dipstick) qui est utilisée pour rechercher la présence d’anticorps contre B. mallei dans le sérum équin. L’épreuve peut être réalisée en une heure environ, en utilisant les dipsticks pré-bloqués sur lesquels a été déposé l’antigène. Du sérum ou du sang total peut être utilisé dans cette épreuve, et une hémolyse partielle ne donne aucune coloration de fond dans la zone de nitrocellulose imprégnée par l’antigène. Une nouvelle technique à puce ADN (microarray) utilisant le lipolysaccharide, semblerait prometteuse car plus sensible (28). Une épreuve d’agglutination sur lame au Rose Bengale (RBT pour Rose Bengal plate agglutination Test) a été décrite pour le diagnostic sérologique de la morve chez le cheval et autres animaux sensibles ; cette épreuve n’a été validée qu’en Russie. L’antigène utilisé est une suspension bactérienne inactivée par la chaleur et colorée avec du Rose Bengale. La validité des autres épreuves d’agglutination et de précipitation n’est pas suffisamment établie pour qu’elles soient employées dans des programmes de contrôle. Les analyses réalisées sur des chevaux atteints de morve chronique et des chevaux en mauvais état donnent des résultats négatifs, ou ininterprétables. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Il n’existe pas de vaccin contre la morve. La malléine PPD pour usage intradermo-palpébral et ophtalmique est produite et commercialisée par l’Institut central de contrôle et de recherches vétérinaires(Central Veterinary Control and Research Institute), 06020, Etlik, Ankara (Turquie). C’est l’institut ID-Lelystad en Hollande qui a fourni les informations suivantes sur les spécifications relatives à la malléine PPD. 1012 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.5.11. — Morve 1. Gestion des semences bactériennes Trois souches de Burkholderia mallei sont utilisées dans la production de la malléine PPD, à savoir la souche Bogor (originaire d’Indonésie), la souche Mukteswar (Inde) et la souche Zagreb (Croatie). Le matériel de semence est représenté par un stock de cultures lyophilisées. Les souches sont cultivées sur gélose au glycérol à 37 °C pendant 1 à 2 jours. Elles peuvent être passées sur cobayes afin de maintenir leur virulence et leur pouvoir antigène. 2. Méthode de fabrication Le milieu de Dorset & Henley, enrichi d’oligo-éléments, est employé pour la production de la malléine PPD. Ce milieu est inoculé avec une suspension épaisse en solution saline du produit de raclage d’une culture de B. mallei sur gélose glycérinée. Le milieu de production est incubé à 37 °C pendant environ 10 semaines. Les bactéries sont ensuite tuées par action de la vapeur pendant 3 h dans un stérilisateur de Koch. Le liquide est alors filtré sur une couche d'ouate pour éliminer les amas bactériens. Le liquide trouble ainsi obtenu est clarifié par filtration sur membrane, et une partie d'acide trichloracétique à 40 % est immédiatement ajoutée à 9 parties de filtrat de culture. Après une nuit de repos, il se produit un précipité clair brun-grisâtre. Le liquide surnageant, prélevé à la pipette, est éliminé. Le précipité est centrifugé 15 min à 2 500 g et le culot est lavé au moins trois fois dans une solution de NaCl à 5 %, pH 3, jusqu'à ce que le pH atteigne 2,7. Le précipité est dissous par agitation dans un minimum de solvant alcalin. Le liquide est brun foncé et doit avoir un pH de 6,7. Cette malléine concentrée doit être longuement centrifugée et le surnageant dilué avec une quantité égale d'une solution glucosée tamponnée. Avant qu’il soit réparti en ampoules et lyophilisé, la teneur en protéines du produit est évaluée par la méthode de Kjeldahl. 3. Contrôles en cours de fabrication Les flacons sont fréquemment observés en cours d’incubation, afin de déceler toute contamination éventuelle et les flacons suspects sont écartés. Une culture typique de B. mallei se caractérise par un trouble et un sédiment. Il se produit aussi une légère culture en surface, dont une partie à tendance à couler, et un anneau orangé bien visible se forme sur ses bords. 4. Contrôle des lots Chaque lot de malléine PPD subit un contrôle portant sur sa stérilité, son innocuité, les agents de conservation, sa teneur en protéines et son activité. Les épreuves de stérilité sont exécutées selon les directives de la Pharmacopée Européenne. Les contrôles d’innocuité sont réalisés sur 5 à 10 chevaux en bonne santé, qui sont soumis à une malléination intradermo-palpébrale. L’œdème qui en résulte au point d’inoculation doit être, sinon nul, du moins à peine détectable et transitoire et il ne doit être accompagné d’aucun écoulement conjonctival. Les préparations auxquelles du phénol a été ajouté comme agent de conservation ne doivent pas contenir plus de 0,5 % (p/v) de ce produit. La teneur en protéines ne doit pas être inférieure à 0,95 mg/ml, ni supérieure à 1,05 mg/ml. Les contrôles d’activité sont effectués sur des cobayes et des chevaux. Les animaux sont sensibilisés par inoculation sous-cutanée d’une suspension concentrée dans de l’huile de paraffine ou de l’adjuvant incomplet de Freund de B. mallei tuées par la chaleur. Des bovins peuvent aussi être utilisés à la place des chevaux. Le lot de production est comparé à une malléine PPD de référence, les doses de 0,1 ml injectées par voie intradermique étant administrées de manière totalement aléatoire. Chez les cobayes, les différentes zones d’érythème sont mesurées après 24 h. Chez les chevaux, l'augmentation de l'épaisseur de la peau est mesurée avec un cutimètre (pied à coulisse). Les résultats sont évalués statistiquement, en utilisant des méthodes statistiques de régression du parallélisme. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1013 Chapitre 2.5.11. — Morve RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. ALLEN H. (1929). The diagnosis of glanders. J. R. Army Vet. Corps, 1, 241–245. 2. 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