Microscopie en champ large
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Université Paris Descartes L3 - Licence Professionnelle « Industries chimiques et Pharmaceutiques – Option Biotechnologie» Microscopie Confocale Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire Bruno SAUBAMEA EA3621 – Service de Biologie Cellulaire Service Commun d’Imagerie Cellulaire et Moléculaire Pourquoi faire de la microscopie ? Limite de résolution ~ 0.1 mm Principe de la microscopie Former une image de l’objet grâce à des photons ou des électrons Agrandir cette image grâce à des lentilles Principe de la Microscopie Microscopie en transmission Microscopie en émission Origine du contraste Différences d’absorption Origine du contraste Différences d’émission Microscopie optique traditionnelle & Transmission Electron Microscopy (TEM) Microscopie de fluorescence & Scanning Electron Microscopy (SEM) Microscopie optique Transmission Emission (fluorescence) Fond clair Champ large Fond noir Confocal Contraste de phase Grossissement et résolution en microscopie optique Grossissement Résolution λ G = γob x Goc R0 = 0.61 × Lentilles (focale de l’objectif) Lentilles (NA de l’objectif) + Rayonnement (longueur d’onde) n ⋅ sin α α n λ = 500 nm NA = n ⋅ sin α = 1.45 R0 = 210 nm Gmax ≈ 1500 Préparation des échantillons biologiques pour la microscopie optique Dégradation rapide Contraste très faible Fixation Coloration Sauf pour l’imagerie in vivo Colorants classiques Microscopie à transmission Fluorophores Microscopie de fluorescence Opacité des tissus Sectioning Coupes minces (5 à 10 µm) Microscopie en champ large Coupes épaisses (jusqu’à 100 µm) Microscopie confocale Microscopie optique en transmission Colorants classiques (Eosine, Bleu Azur, Fuchsine, ...) Coupes des tissus en paraffine (plus rarement au cryostat) Epaisseur maximum 10 µm + Idéal pour l’histologie Résolution subcellulaire faible In vivo impossible Microscopie d’émission de fluorescence Excitation S1 Emission S’1 S0 350 400 450 500 550 600 650 λ (nm) + + Très fort contraste sur un fond quasiment noir Le couplage à des sondes spécifiques (anticorps, …) permet de visualiser quasiment tous les constituants cellulaires Stabilité limitée par le photobleaching Séparation des chemins optiques Trans-illumination Epi-illumination Image Image Filtre Objectif Miroir dichroïque Iexc ≈ 106 Iem Objectif Condenseur Sélection des longueurs d’onde Transmission Cut Off Cube à fluorescence Image Filtre d’émission Dichroïque Filtre d’excitation 350 400 450 500 550 600 650 λ (nm) Réflexion Caméra CCD + Acquisition de l’image globale Microscopie en champ large Image nette du plan focal + Image floue des plans situés de part et d’autre du plan focal lampe dichroïque objectif plan focal Photobleaching de tout l’échantillon Microscopie confocale pinhole pinhole Détecteur Construction de l’image point par point + Elimination de la fluorescence issue des plans non focaux Tranche optique de moins de 500 nm Optical slicing dichroïque objectif plan focal + Excitation focalisée Slicing optique en microscopie confocale Actine F Champ large Confocal Tranches optiques de qqs centaines de nm Champ large Confocal Résolution en microscopie confocale La résolution est un peu meilleure en confocal qu’en champ large Résolution latérale Champ large (WF) Confocal R0 = 0.61 × R0 = 0.46 × λ n ⋅ sin α λ λ = 488 nm ΝΑ = 1.4 n ⋅ sin α R0 = 213 nm R0 = 160 nm L’amélioration des images provient essentiellement de l’élimination de la lumière issue des plans non focaux Section optique de moins de 500 nm Fluorescence Microscopie confocale pinhole dichroïque y-scanner Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) x-scanner objectif Fréquence de balayage jusqu’à 1000 Hz pour un galvanomètre linéaire, jusqu’à 8 kHz pour un galvanomètre résonnant Balayage de l’échantillon point par point Tension de sortie PMT DAC pinhole Em Exc Niveau de gris laser dichroïque 0 – 255 sur 8 bits 0 – 4095 sur 12 bits pinhole X OBJET XY scanner Objectif Y X 512 x 512 1024 x 1024 … IMAGE Y Zoom électronique en microscopie confocale On peut balayer une zone plus petite avec le même nombre de pixels Résolution variable La résolution reste limitée par la diffraction PMT 3 PMT 2 Multi-Colors Confocal microscopy PMT 1 PMT 4 pinhole dichroïque pinhole XY scanner Objectif Laser1 Diode bleue : 405 nm Laser 2 Ar+ : 458, 476, 488, 514 nm Laser 3 HeNe : 543 nm Laser 4 HeNe : 633 nm Détection spectrale Pinhole émission Avantages de la détection spectrale PMT 2 1. Adaptable à n’importe quel fluorophore Prisme 2. Minimisation des crosstalks PMT 1 3. Signaux plus forts 4. Mesure des spectres d’émission PMT 3 Leica Détection spectrale Avantages de la détection spectrale 1. Adaptable à n’importe quel fluorophore 2. Minimisation des crosstalks 3. Signaux plus forts 4. Mesure des spectres d’émission Leica Leica TCS SP2 Filtres d’émission Pinhole émission Pinhole excitation Dichroïques PMTs Lasers XY scanner Objectif Avantages de la microscopie confocale Obtention de coupes optiques très fines (500 nm) Elimination du flou provenant des plans situés de part et d’autre du plan focal - Reconstruction 3D Source lumineuse monochromatique (laser) Pas de filtre d’excitation – Diminution des crosstalks Imagerie point par point Image d’emblée digitalisée Diminution du bleaching de l’échantillon Inconvénients de la microscopie confocale Relativement lent Signal/Bruit plus faible Très onéreux Au minimum 250.000 euros Applications de la microscopie de fluorescence en biologie cellulaire La plupart des molécules constituant les cellules animales ont une fluorescence quasi nulle Marquage fluorescent des organelles ou des molécules d’intérêt Marquage fluorescent en imagerie Accumulation sélective d’un fluorophore dans un compartiment cellulaire Marqueurs nucléaires DAPI, Sytox, TOPRO, … Marqueurs des Mitochondries MitoTracker, … Marqueurs du Reticulum Endoplasmique ER tracker, … Ex : sonde nucléaire Marquage spécifique d’un compartiment subcellulaire (imagerie structurale) Marquage fluorescent en imagerie Couplage covalent d’une molécule d’intérêt à un fluorophore Extraction Purification Marquage Injection Technique lourde assez peu utilisée aujourd’hui Marquage fluorescent en imagerie Marquage spécifique d’une protéine par un anticorps fluorescent (immunofluorescence) Protéines de surface in vivo Protéines intracellulaires après fixation et perméabilisation Technique très largement utilisée pour étudier la localisation précise d’une protéine Marquage fluorescent en imagerie Fusion d’une protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente Gène X Gène GFP X GFP Gène de fusion GFPs (méduse Aequorea victoria) DsRed (anémone de mer Discosoma striata) RCFP (corail Heteractis scrispa) X GFP Protéine X fluorescente synthétisée par la cellule elle-même Technique de choix pour la localisation in vivo On peut observer des cellules fixées Fibroblastes de cerf Muntjac Marquage du cytosquelette d’actine par la phalloïdine-AF350 (bleu) Marquage des mitochondries avec un AbI dirigé contre une protéine de la chaine mitochondriale et un AbII couplé AF500 (vert) Marquage du noyau par un intercalant de l’ADN, le TOPRO3 (rouge) Cellules de peau de cerf Muntjac Marquage du cytosquelette d’actine par la phalloïdine-AF680 (gris) Marquage de l’appareil de Golgi avec un AbI anti-Golgine 97 et un AbII couplé AF488 (vert) Marquage du noyau par un intercalant de l’ADN, le DAPI (bleu clair) Spermatozoïde et ovocyte bovins (FIV) Marquage des mitochondries avec le MitoTracker Green FM (jaune) Marquage des microtubules avec un AbI anti-tubuline et un AbII couplé TMR (rouge) Marquage du noyau par un intercalant de l’ADN, le DAPI (bleu) On peut observer des cellules vivantes (maintien de conditions in vivo grâce à un incubateur à température et CO2 contrôlés) Vague calcique lors de la fécondation d’un ovocyte de Pisaster ochraceus (étoile de mer) Point de contact avec le spermatozoïde L’ovocyte a été microinjecté avec une sonde calcique, le Calcium Green-1 Dextran puis imagé toutes les 5 secondes Cellules transfectées avec un gène codant pour une fusion Tubuline - GFP Cellules transfectées avec un gène codant pour une fusion Tubuline - GFP On peut observer des tissus épais avec une haute résolution (jusqu’à 50 µm voire plusieurs centaines de µm pour les tissus transparents) impossible en microscopie en champ large Coupe d’intestin de raton (50µm) Actine F Champ large Confocal Coupe d’intestin de raton (50µm) NHERF1 Actine F ADN On peut réaliser des images en 3 dimensions faisable mais beaucoup plus difficile en microscopie en champ large Cellules CACO2 infectées par des mycoplasmes 1 plan z 1 stack en z ADN marqué par un intercalant, le TOTO-3 Marquage des astrocytes dans le cerveau de rat GFAP (Astrocytes) ADN (Noyaux) Microcapillaire Microvaisseau dans le cerveau de rat – Astrocytes périvasculaires Embryon de Cerebratulus au stade 8 cellules Marquage de l’actine (bleu) Marquage des microtubules (jaune) On peut étudier la colocalisation de deux molécules d’intérêt (dans la limite imposée par la diffraction soit environ 200 nm) faisable mais beaucoup moins précis en microscopie en champ large Cellules épithéliales bronchiques COMMD1 marquée en vert Rab 11 marquée en rouge Overlay ADN marqué en bleu PAS DE COLOCALISATION 1 protéine marquée en rouge Vésicules jaunes COLOCALISATION 1 protéine marquée en vert On peut étudier l’interaction entre deux molécules d’intérêt (sans être limité par la diffraction) faisable mais beaucoup moins précis en microscopie en champ large Transfert Résonnant d’Energie de Fluorescence (FRET) + Donneur Accepteur Association de deux protéines régulatrices de la migration cellulaire Pak + Rac Pak Rac Migration Interaction Rac/Pak uniquement au niveau des lamellipodes On peut étudier la dynamique des molécules d’intérêt faisable mais beaucoup plus difficile en microscopie en champ large Shuttling nucléocytoplasmique de STAT1 dans des cellules NIH3T3 Noyau Cytoplasme STAT1-EGFP Bleaching pendant 40s Image toute les 10 minutes Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Après stimulation par l’Interféron γ Autres développements… Spinning Disk Confocal Microscopy Acquisition en temps réel avec une cadence vidéo Confocal à 2 photons Imagerie à plusieurs centaines de µm de profondeur dans des tissus vivants Microscopie confocale résolue en temps (FLIM) Mesure in vivo de concentrations ioniques (pH, Ca2+, K+, …)
