Systèmes confocaux rapides

Systèmes confocaux rapides
Tristan Piolot
Plateforme de recherche
« Imagerie des processus dynamiques en Biologie
Cellulaire et Biologie du Développement »
IFR 117 – Institut Jacques Monod
Tel: 0144275784
Mail: [email protected]
www.ijm.jussieu.fr
L’image d’un point n’est pas un point…
Confocal mono-photon
Confocal bi-photon
Video-microscopie
+déconvolution
Ajout d’un pinhole
Excitation pulsée
Traitement
mathématique
L’image d’un point n’est pas un point…
A α
Tâche d’Airy
Optique géométrique optique
ondulatoire
•Huygens: approche par ondelette
•Chaque point d’une onde peut envoyer une ondelette
•Toutes les ondelettes provenant de la même onde sont mutuellement cohérentes
->interférences
Le Pinhole
Adjustment de la taille du pinhole au diamètre de la tâche d’Airy
Résolution latérale : dxy = 0.46λ/NA (0.61 λ/NA)
Résolution axiale : dz = 1.4nλ/NA2 (2 λ/NA2)
Microscopie confocale
Illumination pinhole
Condenser lens
sample
Detection pinhole
Objective lens
detector
Principe du confocal, Minsky 1957
Microscopie plein-champs et microscopie confocale
Plein champs
Confocal
Influence du pinhole sur la résolution
Système de scanning.. Une image confocale est
faite point après point… (un seul point = monofocal)
Scan driver
Laser
Scanner
Quelques avantages et inconvénients des système
confocal monofocal monophoton conventionnel
Résolution : élevée (pinhole)
Vitesse: lente (monofocal)
Photoblanchiment: important (pinhole, monophoton)
Perte de lumière et photoblanchiment : important (pinhole, monophoton)
Le Disque Nipkow - Petran 1968
Pinholes
Le balayage laser X-Y est assuré par
le deplacement des pinhole (disque
tournant).
Une camera CCD assure l ’acquisition
de l ’image confocale.
La source d’exitation est un laser
Le trajet optique simplifié diminue les
pertes de lumières
Scanner Multi-point
Principe de Disque de Nipkow
Et du scanner double disque
70%
1
-2%
Tête confocale “Spinning”
Faisceau Laser
Disque Collecteur
Microlentilles
Caméra CCD
Disque de Pinholes
Miroir Dichroïque
Lentilles Objectif
Echantillon
Pinhole
Spinning disk, confocal monophoton multifocal
Jens Januschke
Equipe Antoine Guichet
Rab6-GFP
5 image / seconde
Spinning disk, confocal monophoton multifocal
tac-GFP
Jean-René Huynh
Equipe Lepesant
IJM
1 stack/30seconde
Spinning : confocal monophoton multifoocal
Quelques avantages et inconvénients
Résolution : élevée (pinhole, ouverture pinhole fixe, diaphonie)
Vitesse: rapide (multifocal)
Photoblanchiment et perte de lumière : assez important (pinhole, monophoton,
espacement, trajet optique simple)
Système Disque DSU (Scanning Unit)
(Olympus )
le pattern porté par le disque
tournant est constitué de
fentes.
La source d’excitation est une
lampe
L’effet confocal est obtenu par
une fente et pas un pinhole
DSU:
Quelques avantages et inconvénients des système
Résolution : moyenne (fente)
Vitesse: rapide (multi-fente !)
Photoblanchiment et perte de lumière : peu importants (fente, trajet optique
simple)
LSM 5 Live (Zeiss)
Le pinhole est remplacé par une ou plusieurs fentes,
de tailles variables :
L’acquisition s’effectue avec une ligne-CCD,
comportant 512 pixels
:
LSM 5 live : Quelques avantages et inconvénients
Résolution : moyenne (fente)
Vitesse: rapide (balayage dans une seule dimension.. )
Photoblanchiment et perte de lumière : peu importants (fente)
Confocal multi-photon
Principe de l’excitation multi-photonique
1 - photon
Absorption proportionnelle à l’intensité
2 - photons
Absorption proportionnelle au carré
de l’intensité
Laser pulsé
Ti:Sa femtoseconde
λexc = 700 – 1000 nm
Impulsions ~ 80 fs à 80 MHz
Multiphotons et imagerie en profondeur
Cellule mitrale du bulbe olfactif d’un
rat anesthésié
D’après Charpak et col., PNAS, 2001
Marqueur : Ca++ - Green –1
830 nm, z max : 450 µm
Multiphotons et préservation de l’échantillon
IR peu absorbé dans les tissus biologiques
La région imagée correspond à la région éclairée
Peu de photoblanchiment hors du plan focal
Moins de photoblanchiment en x,y
Dans certains cas, problèmes d’échauffement de l’échantillon !!
Comparaison photoblanchiment sur confocaux
monophoton et multiphotons, acquisition de 100
piles de 10 images
Photoblanchiment de l'EGFP en monophoton et
multiphotons
Dynamique (niveau de gris)
120
100
80
confocal monophoton
60
confocal multiphotons
40
20
0
0
20
40
60
80
100
nombre de piles
Proportion de photoblanchiment observée sur
l’image 5 de la piles 100
monophoton : 60%
multiphoton : 12%
Microscopie multi-photons :
Quelques avantages et inconvénients
En multiphotons:
Possibilité d’aller en profondeur dans l’échantillon
Peu de photoblanchiment
Mais :
Difficulté de mise en œuvre
Risque d’échauffement de l’échantillon
Séparation des fluorophores plus difficile
TriMscop
Multiphoton-multipoints
M
Un
faisceau
M
M
M
M
N faisceaux
1 ou 2 lignes
Fenêtre de balayage
M M
Multiplicateur
de faisceau
En sortie
sans le scanner
En sortie
avec le scanner
Source Marc Tramier, IJM
Excitation : laser pulsé (multi-photons)
Une camera CCD assure l ’acquisition de l ’image confocale.
Excitation multi-photonique par balayage d’une ligne de 64 faisceau
Idéal pour le suivi temporel avec peu de
photoblanchiment !!
Tau-GFP en cellules ND7
Multiphotons multifocal
(TriMscop)
Marc Tramier, Christiane
Durieux, Maïté Coppey,
IJM)
TriMscop: confocal multifocal multi-photons
Quelques avantages et inconvénients des système
Résolution : bonne (multi-photon, diaphonie)
Vitesse: rapide (multi-focal)
Photoblanchiment et perte de lumière : peu importants (pas de pinhole, multiphoton)
Sytème Leica Sp2-RS ou SP5 RS
Scanners résonnants jusqu’à 8000
hertz et 16000 Hz en bidirectionnel
100 images secondes
Format: 512 x 265, bidirectional scan,
zoom 1.5, 4 frames per second, twofold
line average:
Leica SP2-RS ou SP5-RS:
Confocal monofocal mono ou multiphotons
Quelques avantages et inconvénients des système
Résolution : bonne (pinhole ou multi-photon,)
Vitesse: rapide (scanner resonnant)
Photoblanchiment et perte de lumière
en mono photon: importants (pinhole, temps de rémanence faible..)
en multi-photon: peu important (pas de pinhole)
ILLUMINATION STRUCTUREE:
Principe:
• Projection de l’image d’une grille
pendant l’illumination de l’objet
• Acquisition de 3 images
correspondant à 3 positions de la
grille
• Algorithme: élimination de la
lumière hors plan focal.
Epifluorescence
ApoTome
Illumination structurée
Avantages :
entretien peu coûteux !
résultat direct (pas de déconvolution)
Simple d’utilisation
Idéal pour criblage
Inconvénients :
Photoblanchiment très important
Lenteur des acquisitions
Incompatibilité avec observations dynamiques
Préservation
échantillon
résolution
rapidité Multi-couleurs Échantillon épais
Microscope confocal
monofocal monophoton
-
++
-
++
+
Microscope confocal
monofocal biphoton
++
++
-
+
++
Vidéo-microscopie
++
+
++
+
-
+
++
++
+
+
Microscope confocal
multifocal biphoton
(TriMscope)
++
++
++
+
+
Illumination
structurée
-
+
-
+
+
Microscope confocal
multifocal monophoton
(Spinning)