Le microscope à fond noir
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Microbiologie BIOL 3253 Étude de la structure microbienne: microscopie et préparation des échantillons Les lentilles et la déviation de la lumière Quand un rayon lumineux passe d’un milieu à un autre, il est réfracté; il est dévié à l’interface entre les deux milieux par rapport à sa direction d’incidence. Indice de réfraction Mesure de combien une substance ralentit la vitesse de la lumière (par exemple, le verre a un indice de réfraction supérieur à celui de l’air). La direction et l’angle de déviation sont déterminés par les indices de réfraction des deux milieux formant l’interface. Les lentilles Une lentille convexe focalise des rayons lumineux en un point spécifique, le foyer (F). La distance entre le centre de la lentille et le foyer est appelée distance focale (f) La puissance d’une lentille dépend de la distance focale. Distance focale courte agrandit plus un objet Le microscope optique Plusieurs types: Le microscope à fond clair Le microscope à fond noir Le microscope à contraste de phase Le microscope à fluorescence Les microscopes modernes, comme ceux mentionnés ci-haut, sont tous des microscopes composés. L’image agrandie est formée par 2 lentilles Le microscope à fond clair Produit une image foncée sur un fond brillant. Possède plusieurs objectifs. Les microscopes compensateurs produisent des images qui demeurent au focus quand on change l’objectif. Le grossissement total est calculé en multipliant le grossissement de l’objectif par celui de l’oculaire. Le microscope à fond clair Le trajet lumineux dans le microscope La résolution du microscope Résolution: Capacité d’une lentille à séparer ou distinguer des petits objets qui sont près l’un de l’autre. Un facteur important dans la résolution est la longueur d’onde de la lumière utilisée. Longueur d’onde plus courte plus grande résolution d= 0.5λ n sin θ λ = longueur d’onde d = distance minimale entre 2 points n sin θ = ouverture numérique θ = ouverture angulaire L’ouverture numérique d’un microscope L’ouverture angulaire θ est la moitié de l’angle du cône de lumière qui vient de l’échantillon et pénètre dans la lentille et l’ouverture numérique est n sin θ. À droite de l’illustration, la lentille a une ouverture angulaire et numérique plus grande, sa résolution est plus grande et sa distance de travail plus petite. L’objectif à immersion L’huile à immersion possède un indice de réfraction similaire à celui du verre. En substituant l’huile à l’air, il en résulte en une augmentation de l’ouverture numérique et de la résolution. Les propriétés des objectifs du microscope La distance de travail d’un objectif est la distance entre la surface antérieure de la lentille et la surface de la lame couvre-objet (si on en utilise) ou de l’échantillon après une mise au point fine. Le microscope à fond noir Le champ qui entoure l’échantillon apparaît noir, tandis que l’objet lui-même est brillant. Utilisé pour observer des organismes vivants non colorés. Le microscope à fond noir Érythrocytes observés à l’aide d’un microscope à fond noir Le microscope à contraste de phase Transforme de légères différences d’indice de réfraction et de densité cellulaire en différences d’intensité lumineuse observables. Excellent moyen pour observer des cellules vivantes. Le microscope à contraste de phase Chlamydomonas en microscopie à contraste de phase La production de contraste dans un microscope à contraste de phase Le microscope à fluorescence On éclaire l’échantillon avec une lumière ultra-violette, violette ou bleue. Habituellement, les échantillons sont contrastés par un colorant appelé fluorochrome. Permet d’obtenir une image de l’objet résultante de la lumière fluorescente émise par le spécimen. Le microscope à fluorescence Observations au microscope à fluorescence Protozoaire flagellé Crithidia luciliae coloré à l’aide d’anticorps fluorescents pour montrer le kinétoplaste Un mélange de Micrococcus luteus et Bacillus cereus. Les bactéries vivantes ont une fluorescence vertes, les mortes sont rouges La préparation et la coloration des échantillons Augmenter la visibilité. Accentuer les particularités morphologiques spécifiques. Préserver les échantillons en vue d’études ultérieures. La Fixation Fixation: Procédé par lequel les structures internes et externes des cellules et des organismes sont conservées et fixées en place. Le micro-organisme est habituellement tué et fermement fixé à la lame porte-objet durant la fixation. Fixation à la chaleur Conserve la morphologie générale mais pas les structures intracellulaires. Fixation chimique Protège les structures cellulaires fines et la morphologie de micro-organismes plus grands et plus délicats. Les colorants et la coloration simple Colorants Rend les structures internes et externes de la cellule plus visibles en augmentant le contraste avec l’arrière-plan. Ont deux propriétés en commun: Groupes chromophores Possèdent des doubles liaisons conjuguées. Donnent la couleur au colorant. Peuvent se lier aux cellules par interaction ionique, covalente ou hydrophobe. Les colorants et la coloration simple Coloration simple Un seul colorant est utilisé. Des colorants basiques sont souvent utilisés. Colorants avec des charges positives qui se fixent à des molécules chargées négativement (i.e. acides nucléiques et de nombreuses protéines). i. e., crystal violet, bleu de méthylène, fuchsine basique, safranine, vert de malachite. Des colorants acides sont aussi utilisés. Colorants avec des charges négatives qui se fixent à des molécules chargées positivement. i. e., éosine, rose bengale, fuschine acide. La coloration différentielle Divise les bactéries en groupes distincts basés sur des propriétés de coloration. i.e., Coloration de Gram i.e., Coloration acido-alcoolo-résistante La coloration de Gram Méthode de coloration la plus largement utilisée en bactériologie. Divise les bactéries en deux classes: Gram-négatives et Gram-positives. La coloration de Gram Premier colorant: crystal violet mordant decoloration Contre-coloration: safranine Bactéries Gram-positives Bactéries Gram-négatives Exemples de coloration de Gram Gram- Gram+ Coques gram-positives Escherichia coli – bâtonnets gram-négatifs La coloration acido-alcoolo-résistante Particulièrement utile pour identifier des espèces acido-alcoolo-résitantes du genre Mycobacterium i.e., Mycobacterium tuberculosis – cause la tuberculose. i.e., Mycobacterium leprae – cause la lèpre. Cette coloration est principalement dûe au contenu en lipides (l’acide mycolique en particulier apparaît responsable de la résistance à l’acide) très élevé de la paroi des cellules. A. B. Bactéries non acido-alcoolorésistantes (en bleu) Bactéries acido-alcoolorésistantes (en rouge) La coloration de structures spécifiques La coloration négative Technique qui révèle la présence de capsules autour de nombreuses bactéries. On utilise habituellement de l’encre de chine ou de la nigrosine afin de réaliser la coloration et permettre de visualiser la capsule. La coloration de structures spécifiques La coloration de spores Technique qui fait appel à l’utilisation de deux colorants. Les endospores apparaissent vertes ou bleues dans une cellule rose ou rouge. La coloration de flagelles Un mordant est utilisé afin d’épaissir les flagelles qui sont des structures fines. La microscopie électronique Un faisceau d’électrons est utilisé pour produire une image. La longueur d’onde d’un faisceau d’électron est plus courte que celle de la lumière, résultant en une meilleure résolution. Le microscope électronique à transmission Les électrons sont diffractés lorsqu’ils traversent l’échantillon. Le faisceau d’électron est focalisé par des lentilles magnétiques pour former une image visible agrandie de l’échantillon sur un écran fluorescent. Les régions plus épaisses de l’échantillon diffracteront plus d’électrons et apparaîtront plus sombres. Le microscope électronique à transmission Comparaison entre un microscope optique et un microscope électronique à transmission La préparation des échantillons En microscopie électronique à transmission, l’échantillon doit être coupé en une couche mince de 20 à 100 nm d’épaisseur. Les échantillons sont chimiquement fixés et colorés à l’aide de produits opaques aux électrons. D’autres méthodes de préparation des échantillons Ombrage métallique L’échantillon est enduit d’une fine couche de métaux lourds. Cryodécapage Des échantillons congelés sont fracturés le long des lignes de plus grande fragilité (i.e., le milieu des membranes internes) La technique du cryodécapage Le microscope électronique à balayage Produit une image à partir des électrons réfractés par la surface de l’objet plutôt qu’à partir des électrons transmis. Produit une image tridimensionnel de la surface du micro-organisme avec une grande profondeur de champs. Le microscope électronique à balayage Les nouvelles techniques en microscopie Microscopie confocale et microscopie à balayage de sonde. Possèdent une résolution très élevée. Peuvent être utilisées pour observer des structures très petites, et ce, jusqu’au niveau atomique. La microscopie confocale Un rayon laser focalisé touche un point de l’échantillon. Un ordinateur compile les images générées par chaque point afin de reconstruire une image tridimensionnelle. La microscopie confocale La microscopie à balayage de sonde Microscope à balayage et effet tunnel Détermine les caractères de surface en balayant la surface de l’objet avec une sonde ponctuelle. Il peut atteindre des grossissements de 100 millions et permet de voir les atomes à la surface d’un solide. Surface de silicone La microscopie à balayage de sonde Microscope atomique Déplace une sonde effilée à la surface de l’échantillon tout en maintenant constant la distance entre la pointe de la sonde et cette surface. Au contraire du microscope à balayage et effet tunnel, le microscope atomique peut servir à l’étude de surfaces qui ne conduisent pas bien l’électricité. Molécule d’ADN
