VINIFICA TION

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Maîtrise et intérêts de la co-inoculation
“levures-bactéries”
SIECZKOWSKI Nathalie
Martin Vialatte Œnologie, 51319 Epernay cedex
La gestion des fermentations alcoolique et malolactique est
un facteur clé de l’élaboration de vins de qualité. La
pratique du levurage et de l’ensemencement en bactéries
lactiques sélectionnées permet, par l’implantation de souches
reconnues pour leur intérêt microbiologique et œnologique,
une meilleure maîtrise des flores microbiennes et ainsi un
bon déroulement de ces deux étapes fondamentales de la
vinification.
La co-inoculation, technique consistant à ensemencer le
moût simultanément en levures et en bactéries lactiques se
développe de plus en plus. Déjà mise en pratique en
Champagne, pour l’élaboration des ferments lactiques (1),
et dans l’hémisphère sud pour l’élaboration de certains vins
primeurs, elle a démontré son efficacité au cours des deux
derniers millésimes, dans le cadre du processus d’élaboration
de vins primeurs ou de vins blancs présentant généralement
des difficultés à faire la fermentation malolactique (bas pH
notamment). Egalement, cette technique a été introduite
aux Etats-Unis et en Australie afin de faciliter la réalisation
de la fermentation malolactique sur des vins présentant un
fort degré d’alcool.
La société Martin Vialatte Œnologie a travaillé cette
technique, au cours de ces trois derniers millésimes, afin
d’en optimiser la mise en œuvre.
1
Présentation du contexte - intérêts de
la co-inoculation
V I N I F I C AT I O N
1.1- Démarrage de la fermentation malolactique :
deux cas de figures.
Le déclenchement de la fermentation malolactique est conditionné
par des facteurs intrinsèques aux conditions de vinification
(paramètres physico-chimiques, microbiologiques, technologiques…), de sorte que deux cas de figure opposés peuvent se
présenter :
• vins présentant un démarrage trop rapide de la fermentation
malolactique avant même la fin de la fermentation alcoolique
(cas notamment des pH élevés avec une forte pression
bactérienne du moût),
• vins présentant des difficultés à faire la fermentation malolactique
(pH bas, alcool élevé, température basse, teneur en SO2 élevée…).
Dans les deux cas, des conséquences dommageables sur la qualité
du vin se présentent :
• dans le premier : risque d’arrêt de la fermentation alcoolique
et de piqûre lactique, ou de déviations organoleptiques
provoquées par une flore lactique indigène indésirable
(Lactobacilles, Pédiocoques…),
• dans le deuxième : risque d’oxydation pendant la phase de
latence ainsi que de contamination par des microorganismes
indésirables (Brettanomyces, Pédiocoques, bactéries acétiques,
levures de voile…).
Toutefois, sa mise en œuvre nécessite une bonne maîtrise de la
croissance respective des levures et des bactéries lactiques, en
limitant les antagonismes possibles. Si le milieu a un impact
important sur l’évolution des flores levurienne et lactique,
l’activité fermentaire des levures influe également directement
sur la croissance bactérienne et l’adéquation avec une souche
de bactérie sélectionnée donnée peut varier d’une souche de
levure à l’autre.
1.3- Le point sur les interactions levures-bactéries
Les interactions entre levures et bactéries ont déjà été étudiées
et il est admis qu’en condition de vinification, le développement
des bactéries lactiques peut être inhibé ou stimulé par les
levures fermentaires (2).
Les travaux effectués par King et Beelman (3), Lafon-Fourcade (4, 5),
ou encore Guilloux-Benatier (6) expliquent ce phénomène par :
• d’une part, la production par les levures de métabolites inhibiteurs
des bactéries, autres que l’alcool et le SO2 (acides gras à chaîne
moyenne) et,
• d’autre part, l’appauvrissement du milieu en substrats importants
pour les bactéries (acides aminés tels que l’acide aspartique, la
sérine, la phénylalanine et l’histidine).
Par ailleurs, il a été montré, grâce à des études portant sur
les interactions entre souches commerciales de Saccharomyces
cerevisiæ et d’Œnococcus œni, que les levures induisent une
inhibition de la croissance des bactéries lactiques (7) et que
cette inhibition dépend largement des souches utilisées (8).
Le service R&D a mis en place des essais de co-inoculation en
milieu-vin au sein de son laboratoire de microbiologie.
Ceci lui permet d’avoir aujourd’hui une meilleure connaissance
des couples levure-bactérie et de préconiser la co-inoculation
avec une meilleure maîtrise en fonction du processus de vinification
et de l’objectif de vin fixé par l’élaborateur.
2
Travaux de caractérisation des “couples
levure-bactérie” en laboratoire
L’objectif de ces expérimentations était de guider le choix des
“couples levure-bactérie” les plus compatibles, avant de les valider
à grande échelle en vinification en cave.
2.1- Matériel
1.2- Intérêts de la technique de co-inoculation
24
• Adaptation aux conditions normalement limitantes (haut degré
d’alcool surtout) avec une meilleure efficacité de l’ensemencement
bactérien,
• Démarrage rapide de la F.M.L. en fin de F.A. (limitation du
risque d’oxydation, notamment en vinification en blanc),
• Assurance d’une bonne implantation de la bactérie sélectionnée
(rapport d’ensemencement nettement en sa faveur par rapport
à la flore indigène potentiellement indésirable),
• Limitation du risque de développement de microorganismes
indésirables.
Au regard de cette situation, la co-inoculation laisse entrevoir
plusieurs intérêts :
• Réduction de la durée de la vinification (étapes de fermentation
alcoolique, F.A. et de fermentation malolactique, F.M.L.),
Moûts
• Chardonnay de Champagne,
• Sauvignon du Bordelais,
• Cabernet-Sauvignon du Bordelais,
• Carignan-Mourvèdre du Languedoc.
Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207
Les moûts ont été filtrés stérilement et complémentés en
nutriments à base de levures inactivées.
Microorganismes
Les levures et les bactéries sélectionnées sont les suivantes
(Cf. correspondances en annexe) :
• 12 souches de levures notées LSA1, LSA2, LSA3, LSA4, LSA5,
LSA6, LSA7, LSA8, LSA9, LSA10, LSA 11, LSA12,
• 2 souches de bactéries lactiques à ensemencement direct,
notées BL1 et BL2.
Ces observations sont confirmées notamment par des travaux
antérieurs effectués par King et Beelman (3), qui montraient que
la population bactérienne, dans le cadre d’un ensemencement
simultané en levures et bactéries, n’avait pas d’influence sur la
croissance de la population levurienne (figure 3).
log viable cell counts (cfu/mL)
9
8
7
6
2.2- Mode opératoire
5
Différentes modalités de micro-vinifications (triplicata, en erlenmeyer
de 100 mL) ont été mises en place sur les différents moûts.
Après préparation (filtration stérile et apport de nutriments), le
moût était inoculé en levures sèches actives au taux de 20 g/hL.
La fermentation alcoolique se déroulait à 20°C.
Pour chaque “couple levure-bactérie”, trois modalités ont été
comparées :
• inoculation en bactéries lactiques (1 g/hL) 24 heures après le
levurage : “co-inoculation”,
• inoculation en bactéries lactiques (1 g/hL) à mi F.A.: “mi F.A.” ,
• inoculation en bactéries lactiques (1 g/hL) en fin de F.A.: “fin F.A.”.
L’objectif étant d’étudier les déroulements respectifs de la
fermentation alcoolique et de la fermentation malolactique, les
paramètres suivants ont été étudiés :
• analyse physico-chimique classique du moût avant la F.A.,
• cinétique de la F.A., suivie par pesée journalière,
• cinétique de la F.M.L., suivie par dosage de l’acide malique,
• analyse physico-chimique classique du moût à la fin de la F.A.
4
2.3- Résultats
Les paramètres étudiés ont conduit à une interprétation des
résultats selon trois critères : le déroulement de la F.A., la durée
de F.A.+ F.M.L. et la teneur en acidité volatile du vin fini.
Le déroulement de la F.A.
Dans tous les cas de figure, les fermentations alcooliques ont été
régulières et complètes (ni ralentissement, ni arrêt). C’est ce qui
est observé notamment sur les deux exemples présentés sur les
figures 1 et 2.
250 Consommation des sucres (g/L)
150
1
0
0
2
3
5
8
10
15
time (days)
20
30
35
40
50
Figure 3- Influence d’un ensemencement simultané sur l’évolution des
flores levurienne et bactérienne (King et Beelman, 1986 (3))
La durée F.A.+ F.M.L.
Il s’agit du nombre de jours entre le levurage et la fin de la F.M.L.
Cette donnée constitue un paramètre très intéressant, d’autant
plus que la rapidité de réalisation des deux étapes F.A.+ F.M.L.
est un des objectifs de la co-inoculation.
Au-delà de cet intérêt, il permet de comparer les différents “couples
levure-bactérie” en terme de complémentarité.
Ainsi, par exemple, sur le moût de Carignan-Mourvèdre, il est
intéressant de noter la plus forte compatibilité de BL1 avec LSA3
que BL1 avec LSA4 (figure 4).
co-inoculation
mi F.A.
70
Durée (j)
fin F.A.
60
50
co-inoculation
30
mi F.A.
20
fin F.A.
10
0
100
50
LSA 3
Levure / BL1
LSA 4
Durée totale F.A. + F.M.L. Raisins rouges 13°
Figure 4- Comparaison des durées F.A.+ F.M.L. entre les couples LSA3 –
BL1 et LSA4 – BL1 en fonction du moment de l’inoculation en
bactéries lactiques
0
0
1
2
-50
5
6
Temps (j)
7
8
11
Figure 1- Cinétique fermentaire – caractérisation du couple LSA11 – BL2
sur moût de Chardonnay de Champagne
Consommation des sucres (g/L)
200
VF début
150
VF fin
100
témoin
50
0
0
-50
2
40
200
250
yeast
(pure culture)
yeast
(mixed culture)
bacteria
(pure culture)
bacteria
(mixed culture)
3
1
5
6
7
8
Temps (j)
9
12
13
14
16
Figure 2- Cinétique fermentaire – caractérisation du couple LSA1 – BL2
sur moût de Carignan-Mourvèdre du Languedoc
Il est important de noter que, pour tous les couples étudiés dans
les différentes conditions de moûts, la co-inoculation a permis
une durée de F.A.+ F.M.L. au moins identique, sinon plus courte
(majorité des cas) que celle observée avec le protocole classique
de vinification (ensemencement bactérien en fin de F.A.).
Toutefois des nuances sont à signaler et permettent de définir
sur ce paramètre certaines compatibilités plus fortes, qu’il
convient de rapprocher des autres paramètres analytiques du
vin fini, comme l’acidité volatile.
La teneur en acidité volatile du vin fini
Bien que les teneurs en acidité volatile observées en fin de F.M.L.
aient présenté des différences notables entre les modalités, aucun
cas de piqûre lactique n’a eu lieu. Ceci est à corréler directement
avec le bon déroulement de la fermentation alcoolique dans ces
expérimentations, permis par une gestion adéquate de la nutrition
des levures grâce à l’apport raisonné de nutriments complets.
Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207
25
Ainsi, dans ces conditions, il est logique de ne pas observer
d’augmentation importante de l’acidité volatile, ceci étant lié au
métabolisme de la bactérie, qui consomme très peu de sucre
(quelques centaines de mg/L seulement) en présence d’acide
malique.
Toutefois, pour certains “couples levure-bactérie” une production
d’acidité volatile significativement supérieure a été observée sur
les modalités en co-inoculation par rapport aux modalités avec
un ensemencement bactérien successif à l’achèvement de la F.A.
Ce constat a permis d’en déduire les couples incompatibles :
c’est le cas notamment du couple “LSA7 – BL2” en conditions
de co-inoculation. Il est toutefois important de préciser qu’en
cas d’ensemencement bactérien “classique” en fin de F.A., la
situation est différente et que ces mêmes couples ne présentent
aucune incompatibilité.
température (°C)
35
1100 densité
densité témoin
densité fin F.A.
30
densité co-inoculation
température témoin
25
température fin F.A.
température co-inoculation
20
1090
1080
1070
1060
1050
1040
15
1030
1020
10
1010
1000
5
990
980
15/9
16/9
17/9
18/9
19/9
date
20/9
21/9
Le tableau 1 représente la synthèse des résultats de la
caractérisation des “couples levure-bactérie”. Les critères retenus
(déroulement de la F.A., durée de F.A.+ F.M.L. et acidité volatile
en fin de F.A.) ont permis de classer les couples en fonction de
leurs compatibilités apparentes dans les conditions étudiées, en
co-inoculation.
3.1.2- Durée de F.A.+ F.M.L.
Dans les deux cas, l’inoculation bactérienne (BL2) à l’encuvage
a permis un gain de temps significatif, de 11 jours (essais en
cave, figure 6) à 21 jours (essais en minicuverie, figure 7) par
rapport à la modalité où la F.M.L. est réalisée par des bactéries
indigènes.
Tableau 1- Caractérisation des “couples levure-bactérie” : degrés de
compatibilité pour la co-inoculation.
BL1
++
++
++
+
++
++
+++
++
++
BL2
+++
+++
+++
+++
+++
-++
+++
+
+++
+++
Suite à ces expérimentations de caractérisation des “couples
levure-bactérie”, des essais en grands volumes ont été mis en
place et suivis dans des caves pendant les vendanges 2002 et
2003, en conditions réelles de vinification.
Ainsi, les couples les plus compatibles sont :
• pour la vinification en rouge, et plus particulièrement l’élaboration de vins primeurs : “LSA3 – BL2”, “LSA2 – BL2” ;
• pour la vinification en blanc : “LSA9 – BL2”, “LSA11 – BL2” et
“LSA12 – BL2”.
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4 encuvage : 15/9
0,2 fin FA : 23/9
0
16-sep
5
Des essais ont été menés en Beaujolais pendant les vendanges
2002, à la fois en minicuverie et en grandeur réelle
(Etablissements Dubœuf), en collaboration avec I.T.V.-Sicarex
Beaujolais et Tecnicave (9).
3.1.1- Déroulement de la F.A.
26
Aucun impact sur le déroulement de la F.A. n’a été mis en
évidence, comme le montre la comparaison des cinétiques
fermentaires sur la figure 5.
22-sep
25-sep
28-sep
1-oct
4-oct
7-oct
acide malique g/L
Témoin
BL2 encuvage
BL2 décuvage
BL2 fin F.A.
4
3
2
encuvage : 5 sept
décuvage : 9 sept
fin F.A. : 14 sept
0
5-sep
3.1- Elaboration de vins primeurs en Beaujolais (2002)
19-sep
Figure 6- Ensemencement en bactéries lactiques à différents moments
de la vinification : essai en cave coopérative 2002. (Martin
Vialatte Œnologie / ITV-SICAREX Beaujolais).
Suivi de la dégradation de l'acide malique.
Essais en caves (vendanges 2002 et 2003)
L’objectif était de valider l’intérêt de la méthode, dans le cadre de
l’élaboration de vins rouges primeurs et de vins blancs présentant
généralement des difficultés à faire la fermentation malolactique.
témoin
BL2 fin FA
BL2 co-inoculation
acide malique g/L
1
3
0
23/9
Figure 5- Ensemencement en bactéries lactiques à différents moments
de la vinification : essai en cave coopérative 2002 – Cinétiques
fermentaires.
2.4- Interprétation des résultats - Synthèse
Souches
LSA1
LSA2
LSA3
LSA4
LSA5
LSA6
LSA7
LSA8
LSA9
LSA10
LSA11
LSA12
22/9
10-sep
15-sep
20-sep
25-sep
30-sep
5-oct
10-oct
Figure 7- Ensemencement en bactéries lactiques à différents moments
de la vinification : essai minicuverie 2002. (ITV-Sicarex
Beaujolais). Suivi de la dégradation de l'acide malique.
Une inoculation au pressurage permet de gagner de 11 jours (en
minicuverie, figure 7) à 13 jours (en cave, sur un autre essai non
figuré ici) également par rapport à la modalité non ensemencée
en bactéries lactiques.
Enfin, un ensemencement précoce à l’encuvage a permis de
gagner 7 à 10 jours (essais en cave et en minicuverie) par
rapport à un ensemencement traditionnel réalisé en fin de F.A.
3.1.3- Teneur en acidité volatile du vin fini
Aucune augmentation de l’acidité volatile n’a été observée ; ceci
est logique, et s’explique par le métabolisme de la bactérie, qui
Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207
consomme très peu de sucre (quelques centaines de mg/L
seulement) en présence d’acide malique.
3.1.4- Qualité organoleptique des vins
• en parallèle, la population bactérienne suit une évolution
normale avec un fort développement en fin de F.A., sans risque
de développement de piqûre lactique.
Au niveau gustatif, aucune différence significative n’a été observée
sur les vins des essais réalisés en minicuverie, même si dans le
cadre des essais en cave, le vin issu de la co-inoculation tend à
être préféré en fin d’élaboration. Ces résultats montrent donc
que la pratique de l’ensemencement précoce en bactéries
lactiques n’a aucun impact négatif sur la qualité de ce type de
vin, notamment lorsqu’il s’agit d’un vin primeur.
L’intérêt d’ensemencer précocement réside alors dans le fait que
les bactéries co-inoculées s’acclimatent progressivement aux
conditions du vin et sont donc plus efficaces et résistantes dès la
fin de F.A. que des bactéries fraîchement ensemencées. Ceci
se traduit en général par une durée F.A.+F.M.L. plus courte dans
le cas de la co-inoculation “levure/bactérie” et avec un risque
très limité de développement de contaminants indésirables
(Lactobacilles, Pédiocoques,…).
3.2- Vin blanc présentant des difficultés à faire
la F.M.L. : exemple Suisse (2003).
3.2.2- Durée de F.A.+ F.M.L.
Pendant les vendanges 2003, un essai de co-inoculation a été
mené en Suisse sur Chasselas, en vinification en blanc. Deux
modalités ont été comparées :
• une modalité “témoin” ensemencée en bactéries lactiques en
fin de F.A.,
• une modalité “co-inoculation”, ensemencée en bactéries
lactiques sur moût.
3.2.1- Déroulement de la F.A.
Sur cet essai, les fermentations alcooliques se sont déroulées
normalement sur les deux modalités, de manière complète et
régulière, comme le montre la figure 8.
21,5
Densité (°Oe)
90
Température (°C)
21
80
20,5
70
20
40
18,5
30
18
17,5
20
17
10
0
16,5
1
2
3
4
5
Densité co-inoculation
Densité témoin
6
7
8
9
10
Durée de F.A. (jours)
Temp. co-inoculation
Temp. témoin
11
12
en
blanc,
1000000
100000
10000
1000
100
10
0
1
BL1
BL2
Pop. Bact. témoin
Pop. Lev. témoin
Pop. Bact. co-inoculation
Pop. Lev. co-inoculation
populations UFC/mL
10000000
1
Annexe- Correspondances entre les codes affectés aux souches de levures
et de bactéries lactiques sélectionnées testées et leurs noms
commerciaux.
3
5
7
9
Jours après levurage
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
Vitilevure‚
BC
Primeur
LB Rouge
Syrah
MT
Grenache
58W3
KD
DV10
Albaflor
Chardonnay
CH
Pour les 2 souches de bactéries lactiques sélectionnées :
Figure 8- Essai de co-inoculation en vinification
sur Chasselas, 2003 : cinétiques fermentaires.
100000000
Les vins des deux modalités présentaient en fin de F.M.L. des
acidités volatiles comparables. Par ailleurs, au niveau gustatif,
aucune différence significative n’a été mise en évidence.
LSA1
LSA2
LSA3
LSA4
LSA5
LSA6
LSA7
LSA8
LSA9
LSA10
LSA11
LSA12
50
19
3.2.3- Teneur en acidité volatile des vins finis et qualité
organoleptique
Pour les 12 souches de levures sélectionnées :
60
19,5
La co-inoculation a permis un gain de temps notable par rapport
au protocole classique d’ensemencement en bactéries lactiques
en fin de F.A. : 20 jours sur la modalité “co-inoculation” contre
35 jours sur la modalité “témoin”.
11
13
15
Figure 9- Essai de co-inoculation en vinification en blanc, sur Chasselas,
2003 : suivi des populations levurienne et bactérienne.
Les populations levurienne et bactérienne ont été suivies par
dénombrement après ensemencement sur des milieux de culture
spécifiques. La figure 9 montre qu’aucun impact sur la croissance
de la population levurienne n’a été observé. En effet :
• les levures se développent à des niveaux de population
normaux comme dans le cas d’une fermentation classique
sans co-inoculation,
Vitilactic‚ D MBR
Vitilactic‚ F MBR
CONCLUSION
Ces expériences de terrain ont confirmé l’intérêt de la pratique
de la co-inoculation “levure/bactérie” en début de fermentation alcoolique dans le cadre de l’élaboration de vins
primeurs ou de vins présentant habituellement des difficultés
à réaliser la fermentation malolactique.
Que ce soit dans les essais présentés ici, ou dans le cadre
d’autres expérimentations menées notamment sur des
moûts de thermovinification en Languedoc et en Côtes du
Rhône, ou encore sur des moûts issus d’autres cépages
blancs en Côtes du Rhône et dans le Gers, aucune déviation
organoleptique n’a été observée. De plus, la co-inoculation
a toujours permis un gain de temps d’intérêt notable pour
ce type de vinification.
Dans tous ces essais, le choix du “couple levure-bactérie” a
été raisonné, de même que l’apport de nutriments en fonction
de la teneur du moût en azote assimilable ou encore de la
turbidité pour ce qui est des vinifications en blanc. En effet,
il est primordial d’assurer un bon déroulement de la
fermentation alcoolique pour la pratique de la co-inoculation.
Un autre paramètre important, et plus particulièrement en
vinification en blanc, est la teneur en SO2. En effet, des essais
complémentaires menés en laboratoire, ont montré la
nécessité de décaler l’ensemencement en bactéries lactiques
de 24 heures au moins par rapport au moment du levurage.
Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207
27
En conclusion, la pratique de la co-inoculation doit, pour être
efficace, être raisonnée et adaptée au processus de vinification.
Elle implique dans tous les cas le respect de certaines règles :
• une bonne maîtrise de l’hygiène,
• un bon choix du “couple levure-bactérie”,
• une bonne gestion de la nutrition de la levure,
• un bon suivi des fermentations alcoolique et malolactique.
Si tous ces paramètres sont maîtrisés, la co-inoculation
levure/bactérie en début de F.A. présente des intérêts forts
pour le vinificateur : gain de temps, réduction des risques de
contaminants indésirables, implantation assurée de la bactérie
ensemencée, réalisation de la F.M.L. dans des conditions
difficiles grâce à l’acclimatation progressive des bactéries
aux conditions du vin.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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28
Revue Française d’Œnologie - juillet/août 2004 - N° 207
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