PAIR-Mélanome - Institut National Du Cancer
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Séminaire National Programme d’Actions Intégrées de Recherche Sur le Mélanome (PAIR-Mélanome) Boulogne-Billancourt - 4 juillet 2012 AXE II: MELANOME: CELLULE NON AUTONOME Mieux comprendre l’importance de l’environnement, du microenvironnement en termes fondamental, d’imagerie, anatomopathologique et épidémiologique DRENO Brigitte LARUE Lionel LEBBE Céleste ROBERT Caroline ANDRE Catherine BRESSAC DE PAILLERETS Brigitte BALLOTTI Robert DAVIDSON Irwin DE LA FOUCHARDIERE Arnaud GALIBERT Marie Dominique LASSAU Nathalie MOURAH Samia NIETO Laurence VERGIER Béatrice VINCENT-SALOMON Anne CLASSIFICATION CLINIQUE DU MELANOME Mélanome Nodulaire S.S.M. Mélanome de Dubreuil Mélanome Acro Lentigineux Mélanome achromique VERS UNE CLASSIFICATION MOLECULAIRE DU MELANOME B-RAF: 50–60% QUESTIONS - c-kit: 5–10% Combien de voies de signalisation sont des cibles thérapeutiques ? Quels conséquences génétiques et moléculaires de cibler ces voies ? Corrélation avec un type clinique spécifique ? Quelle est la meilleure cible sur cette voie d’activation ? c-kit: 10–20% c-kit: 10–20% “The Melanomas”: Curtin et al, N Engl J Med 353: 2135-47, 2005 FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX ET MÉLANOME LE MACRO ENVIRONNEMENT LA VITAMINE D SNP:single-nucleotide polymorphism Cette revue systématique supporte le concept que le système endocrinien de la Vitamine D, jouerait un rôle dans la pathogénie et la progression du mélanome Risque chimique Les dérivés organochlorés pourraient augmenter le risque de mélanome Lien fort entre le taux plasmatique des diphényle poly chlorés et mélanome , indépendamment du facteur solaire Troubles nutritionnels et mélanome Des stimuli nutritionnels comme la leptine, modulent de manière physiologique l’activité de mTOR et des lymphocytes Treg contribuant à l’état de “self tolérance”. Un déficit nutritionnel peut induire une inhibition de la voie mTOR Une surcharge nutritionnelle, l’obésité, le syndrome métabolique peuvent induire une surexpression de la voie mTOR avec une dysrégulation des lymphocytes Treg et des cellules T effectrices Troubles nutritionnels et mélanome: obésité Lignées cellulaires de mélanome + Sérum patient obèse patient contrôle Lignée mélanome en culture Kushiro et al, 2011 Modèles animaux Marqueurs de l’EMT Working model ( cadhérines -, protéases +) et du potentiel migratoire des mélanomes EMT= Transition épithélio-mésenchymateuse Augmentée dans les métastases Sc injection Primary tumor TV injection Lung metastasis Génétiques (ob, db, …) ou régime alimentaire Mori et al, 2006 lean Brandon et al, 2009 obese Pandey et al, 2012 Epidémiologie Obésité facteur de risque du mélanome Laurence Nieto Médicament et et mélanome Médicament et Mélanome La relation entre « Médicament et Mélanome » reste difficile à évaluer et nécessite des investigations complémentaires Macro environnement hors UV Des questions qui demeurent…… La vitamine D joue-t-elle un rôle protecteur ? Si oui risque d’une photo protection ? Vit D et Immunité innée ? Les Médicaments inducteurs de mélanome Oui ? Mécanisme ? Quel terrain ? Les toxiques Mythe ou réalité ? Terrain ? Mécanisme? La nutrition ? Autre facteur du macro environnement hors UV …………… Stress …..La psycho immunologie …… UV et mélanomes Lentigo Malin SSM: Superficial Spreading Melanoma UV: UV: Mélanome muqueux Mélanome Acro lentigineux UV: UV: 1 From Boris Bastian UV et mélanome Rayonnements UV solaire = 1er Facteur de Risque de développement des cancers de la peau UV et Melanome => Relation Complexe Génétique (phototype, nevus…) - localisation - comportements UV et Types de mélanome >> Mélanome UV-dépendant Mélanome avec signes cutanés de photo dommage chronique: “ élastose solaire” + type et niveau de mutation Mélanome sans photo dommage chronique Mélanome Cutané : mutation BRAF : précoce chez le sujet jeune >> Mélanome Non UV-dépendant Muqueux – Acro-lentigineux … Equipes: Bastian BC - Garraway LA… UV et mélanome EFFETS NEGATIFS UVA et B => Stress Génotoxique => Altérations de l’ADN: 6-4 PP, CPD - réarrangement (Equipes: Douky T, Sage E- Garraway LA) => Inflammation, Immunomodulateur EFFETS POSITIFS => Production Vitamine D et Pigmentation : miRNA TYRP1: évolution phénotypique (Zhang Z Plos-Genet 2012) => Activation des voies de signalisation : Stress-dependent p38 kinase / Module le transcriptome,secrétome… => Pigmentation protectrice “Tanning Response” Régulation via les facteurs USF1, Mitf, p53 (MD Galibert/ CR Goding / D Fisher) Phototype - variant MC1R: lien entre UV et génétique (BC Bastian) => Activation et régulation du “DNA-repair” NER, voie p53 (Nishi et al., DNA Repair 2011…) Macro environnement et UV Des questions qui demeurent…… Mélanomes UV-dépendant Génétique - Epidémiologique Décrypter les mécanismes UV dépendant Hiérarchiser le rôle des gènes et des voies de signalisation … => Nécessaire pour élaborer des stratégies thérapeutiques - Quels modèles et outils: Prélèvements - cellules – souris => Stress Oxydatif X Mélanomes Non UV-dependant Facteurs environnementaux, épidémiologiques? Les mécanismes? (cf précédentes questions) … - Autres modèles et outils: prélèvements - Chien, Cheval, Porc… (C. André,S. Vincent-Naulleau) FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX ET MÉLANOME LE MICRO ENVIRONNEMENT Réponses immunitaires antianti-mélanome et micro environnement: les challenges Immunité antitumorale: innée et adaptative Cellules immunitaires Cellules cancéreuses Définition des cibles antigéniques pertinentes Micro-environnement tumoral Régulation de la réponse anti-tumorale : équilibre entre co-stimlation et signaux inhibiteurs Objectif : Définir les conditions d’activation des lymphocytes effecteurs pour l’optimisation des essais de transfert adoptif et de vaccination anti-tumorale Nathalie Labarrière Micro environnement et Immunité innée Les cellules NK et gd Mode d’action des lymphocytes NK et gd Cytokines TCD4 gd TCR gd IFN TCD8 Activation Immunité adaptative MICA/MICB NKG2D UL16 NK Lyse cytokines MHC non classiques MICA/MICB Phospho antigènes Cellules tumorales Apoptose perforine/Granzyme/Fas-FasL/TRAIL Ligands de NKG2D: MHC class I chain-related (MIC) antigens A et B (MICA et MICB) et UL16 binding proteins: molécules induites par le stress cellulaire, la transformation maligne ou l’infection virale (CMV en particulier) L’expression de ces ligands représente un signal de danger pour les cellules de l’immunité et la destruction de la cible cellulaire anormale. Nathalie Labarrière Micro environnement et Immunité innée Les cellules dendritiques Mode d’action des cellules dendritiques Cellules cancéreuses Cytokines inflammatoires Th1 IFN, TNF, IL12 TLR2, 4, CD91… Up-régulation HLA de classe I et II, CD80, CD86 : Protéines processing et présentation de stress de l’antigène… Reconnaissance TCD4 Activation TCD8 Immunité adaptative Nathalie Labarrière Immunorégulation par molécules membranaires et solubles Enigmatic Immunoregulation by BTLA and HVEM Annual Review of Immunology 2009 Inhibition réponse immune: PD1 et BTLA (B and T lymphocyte Attenuator) Immunorégulation par molécules membranaires et solubles Immunorégulation par molécules membranaires et solubles Micro environnement, immunité innée et structure tertiaire des molécules Interactions cytokines – Récepteurs Communication cellule / cellule Microvesicules et melanomes Mélanome Cellule du stroma tumoral Microvésicules – exosome ou autres lipides Protéines Ex : MMP14, KRAS, bcatenin miARNs ARNs Ex : BRAF V600E Communication à faible distance (cellules du stroma tumoral) Communication au travers de la circulation sanguine et lymphatique Préparation de la niche métastatique Hood et al, Cancer research 2011 Laurence Nieto Micro environnement et Immunité Innée Des questions qui demeurent…… Activation des cellules de l’immunité innée Systèmes de reconnaissance du stress (MIC, HSP, TLR-2 et -4) du non-soi (pertes des molécules HLA de classe I) Induction de la réponse immunitaire adaptative cytokines et médiateurs lipidiques inflammatoires: IFN , TNF , IL-12, PGE2, IL-10, TGFβ…………….. Maturation des cellules dendritiques par la signalisation via les TLR et le TNFα Fonctions des cellules de l’ Immunité Innée Cellules NK et T : lyse par perforine / granzyme et Fas / Fas-L Macrophages activés et armés: lyse par enzymes lysosomiaux Micro environnement et Immunité Innée Des questions qui demeurent…… Les molécules à cibler pour optimiser les fonctions des lymphocytes T impliqués dans l’immunité adaptative Les moyens de les cibler AC agonistes, antagonistes Modèles de souris Knock out ……… Micro environnement et Immunité adaptative Les thérapies immunitaires ciblées Cellules de mélanomes Système immunitaire LYSE HELP T CD8+ T CD4+ TC R MELANOME HLA Activation des LT spécifiques par vaccination Transfert adoptif de LT spécifiques (ACT) Blocage de molécules inhibitrices de l’activation T : antiCTLA4, anti PD1… Micro environnement et Immunité adaptative Les thérapies immunitaires ciblées Propriétés essentielles de l’antigène ciblé Immunogénicité Micro environnement et Immunité adaptative Des questions qui demeurent…… Définir des AG pertinents par des études rétrospectives Cohortes, bio banques Micro environnement 80% of metastasis disseminate angiogenèse, lymphangiogénèse through the lymphatic system et mélanome Extension of peri tumoral lymphangiogenesis is prognostic factor for metastasis Alitalo & al, Oncogene 2011; Dadras & al, Am J pathol 2003 Antagonists or neutrelizing antibodies to CXCL12 and CXCR4 reduce metastasis of melanoma cells VEGF VEGF C VEGF D FGF Drury & al PNAS 2011 VEGFC and VEGFD expression • correlates with lymphatic vessel density in primary melanoma and lymph node metastatsis • promotes tumor angiogenesis in certain types of melanoma Rinderknecht & al, J of cellular physiology 2008 VEGFR-2 VEGFR-3 FGFR Notch • Overexpression of Notch ligand Dll1 in melanoma cells reduces tumor growth VEGF and bFGF over expressed by melanoma cells Zhang & al, Cancer letter 2011 Streit & al, Oncogene 2003 Deletion of the endothelial Bmx tyrosine kinase decreases tumor angiogenesis Genetic ablation of SOX18 function suppresses tumor lymphangiogenesis and metastasis of melanoma Angiogenesis Lymphangiogenesis Sox18 Duong & al, Cancer Research 2012 Holopainen & al, Cancer Res 2012 Pubmed Angiogenesis , Lymphangiogenesis & melanoma: 1865 papers Melanoma progression & metastasis An anti angiogenic therapy targeted against human CD160 receptor Chabot et al J Ex Med 2011 Samia Mourah Micro environnement Hypoxie et Mélanome O2 v Hypoxie Normoxie HIF 1 est dégradée par le protéasome Snail-1 EMMPRIN, IGPR-1, Bcl-2 - HIF: facteurs induits par l’hypoxie Hypoxia up-regulates Snail-1 expression and leads to increased metastatic capacity and drug resistance Shujing & al, Am J Path 2011 HIF 1 HIF 2 EMMPRIN promotes melanoma invasion and progression by stimulating VEGF/VEGFR-2 IGPR-1 regulates capillary tube formation in vitro B16F melanoma cells engineered to express IGPR-1 displayed extensive angiogenesis in the mouse Matrigel angiogenesis model BCL-2 protein promotes HIF-1alpha/VEGF-mediates melanoma angiogenesis Bougatef al, Plos One 2010 Rahimi & al, Molecular Biology of the cell 2012 Trisciuoglio & al, Plos One 2010 Pubmed Hypoxia & melanoma: 417 papers HIF 1 Bhlhb-2 MITF Hypoxic micro environment decreases MiTF expression and increases metastatic properties of melanome cells HIF 2 VEGFA EPO SLC2A1 PKM2 RORt Greer & al, EMBO journal 2012 Cheli & al, Oncogene 2011 Blocking hypoxia-induced autophagy in tumors restores cytotoxic T-cell activity and promotes regression. Noman & al, Cancer Res 2011 Melanoma progression & metastasis Samia Mourah Micro environnement, stress oxydatif et mélanome UVA Mélanine Cassures ADN ROS Modifications Protéines et Activités Mitf - Hif1 - USF1… Hypoxie Autres.. - Favorise la croissance tumorale - Modifier le microenvironnement … Mécanismes Exactes : Acteurs et Voies ? Régulations? Biologie de la tumeur: Initiation - Progession… ? Lien avec la clinique? Micro environnement, stress oxydatif et mélanome Micro environnement et immunité innée Molécules membranaires et solubles: les antigènes de mélanome TAM: Tumour Melanoma Antigen Micro environnement, angiogenèse, lymphangiogénèse, lymphangiogénèse, hypoxie, stress oxydatif des questions qui demeurent…… Les voies de signalisation reliant stress oxydatif, hypoxie et: Angiogenèse Lymphoangiogenèse Les cytokines impliquées par l’hypoxie et le stress oxydatif Les cibles thérapeutiques potentielles des voies de l’angio/ Lymphangiogenèse et de l’hypoxie VEGFR-3 Emmprin, CD160, Sox-18, Snail-1… Place des molécules anti radicalaire dans la prévention Traitements combinés: angiogenèse/Hypoxie et MAPKinase …………………. MÉLANOME ET OUTILS D’ETUDE IN VITRO ET IN VIVO Les modèles cellulaires Les lignées Les modèles animaux Modèles expérimentaux : souris, poissons (Zebrafish, …) Modèles naturels ou spontanés (chien, porc, cheval) Modèles Cellulaires et Lignées d’étude in vitro (I) Modèles Cellulaires 2D •Mélanocytes immortalisés (spontanément) de souris: Melan-a (D. Bennett) •Mélanocytes humains immortalisés. #p16-/-, hTERT (E. Sviderskaya), #hTERT/CDK4(R24C)/p53DD (D. Fisher) •Etude de l’initiation, progression, métastase •Lignées cellulaires établies de mélanomes (homme, souris), + 100 lignées •Lignées cellulaire à court terme, à partir de tumeurs humaines •Etude progression, métastase •Avantages: Manipulation facile. Etude et manipulations moléculaires. Highthrouput screening •Limitations: Pas de structure 3D. Pas d’interactions cellulaires hétérotypiques. Accumulation d’altérations génétiques ou épigénétiques en culture. •Autres Modèles: •Mélanocytes Humains Normaux; Cellules de mélanomes fraichement isolées Avantages et limitations. Manipulation plus difficile, pas d’artéfact dû à la culture •Co-culture 2D mélanomes-kératinocytes; -fibroblastes ( ou MAF);- cellules endothéliales ou immunitaires. Trans-migration/ sur monocouche de cellules endothéliales. Intègre en partie les interactions des mélanomes avec autres cellules Modèles Cellulaires et Lignées d’étude in vitro (II II)) Modèles Cellulaires 3D Sphéroïdes, Mélanosphères Support: Méthylcellulose /poly-HEMA / agarose/ collagène. Milieu conditionné de cellules souches. Etude migration, invasion 3D, propriétés cellules souches ou initiatrices de tumeur Avantages: Croissance en suspension, interactions cellulaires Mélanosphère homotypiques, Mise en place facile, Etudes et manipulations moléculaires Limitations: pas d’interaction avec fibroblastes ou cellules endothéliales Combinaison 3D, 2D; Mélanosphère sur monocouche cellules endothéliales Cellules endothéliales Epidermes reconstruits: Support: Derme mort, Collagène +/- Fibroblastes (ou MAF) Etude initiation, croissance horizontale, verticale, première étapes de l’invasion Avantages: Récapitulation du microenvironnement et de la structure Limitations: Mise en place et manipulation moléculaire difficiles Kératinocytes + Mélanomes Matrice +/- fibroblastes Milieu culture Invasion du derme par les cellules de mélanomes Modèle Animal: la Souris Reverse Genetics known gene -> unknown phenotype Mutagenesis by insertion : A fragment of exogenous DNA is inserted into a locus to induce a phenotype (known virus, injection of DNA in pronucleus, gene trap, etc…) Homologous Recombination : a specific gene is modified in a pre-established manner (full knock-out, point mutation, conditional and spatial/temporal mutation, etc…) Modèle Animal: la Souris Pourquoi la souris ? Génome similaire à l’homme Mutations génétiques spécifiques réalisables Organes et physiologie comparables Bases moléculaires et cellulaires de tumorogénèse similaires: Turn over court: 3 mois Animal petit et non agressif Grandes portées Objectifs? 2 Identification de gènes de mélanomes « relevant » Rôle des gènes impliqués dans le mélanome Modèle in vivo pour l’induction de mélanome UV-induit Modèle in vivo pour comprendre les interactions entre gènes Analyses diagnostiques et approches thérapeutiques Larue and Beermann, 2007 Modèles Animal: le Poisson Pour le week end Phase d’induction, du mélanome, screening des gènes et screening molécules Modèle d’ initiation melanoma melanosis Mutation x GFR Xiphophorus 1 Modèles animaux «spontanés » Intérêt du chien – races de chiens prédisposées 1. Spontanés 2. Races prédisposées 3. Fortes fréquences (quelques %) 4. Formes identiques à l’Homme: - localisations anatomiques - présentation clinique, histologie - progression, traitement 5. Accès aux chiens atteints via le vétérinaire Chien = patient 1. Intérêt en génétique - Races prédisposées génétique constitutive : identification de gènes de prédisposition - Progression tumorale semblable à l’Homme -> identification d’altérations somatiques - Transfert des connaissances aux mélanomes humains homologues 2. Intérêt en thérapie -Identification de voies métaboliques nouvelles -> développement de thérapies -Identification de voies métaboliques identiques -> réalisation d’essais thérapeutiques sur des tumeurs « naturelles » à tout grade Principaux investigateurs: C. André et coll (UMR6290 CNRS/Univ-Rennes1: Collaborations: MD. Galibert; F Demenais; B. Vergier Mélanomes chez le chien Homme Buccal: Chien Cutané: 90% schnauzer scottish terrier rottweiler 3-5% labrador 3-5% golden retriever 30% 3-5% Oculaire : boxer Ungueal : caniche 65 % 1-2 % golden 2-3% Prédispositions raciales par localisation ---> gènes de prédisposition C.André-CNRS-2012 Mélanomes chez le chien Histologie: mélanomes Corrélation avec la pigmentation : dermique Phototypes et voies métaboliques homologues B. Vergier (CHU Bordeaux) ; J. Abadie (Vet School of Nantes) Photo :B. Vergier Conclusion : Intérêt en génétique et thérapie: - Intérêt pour explorer les voies « non UV dépendantes » des mélanomes humains Intérêt pour les mélanomes d’origine dermique, les mélanomes muqueux …. Corrélations avec voies de la pigmentation MC1R …. Recherche des gènes et voies métaboliques, transfert a l’Homme. Essais cliniques C.André-CNRS-2012 Modèles animaux «spontanés » In horses: dermal and mucosal melanoma mucosal melanoma: under the tail skin melanoma “animal type”. Photo: R. Harang: born brown, graying Horses with the “grey causing mutation” have more chance to develop melanoma: 70% of Gray horses (mostly Lipizzaner), > 15 years, have melanoma Conclusion : Horse melanoma (ref : Pielberg et al., 2005 ; 2008) - To explore the correlation between the pigmentation pathway and melanoma « graying» (STX17 mutation) and melanoma Dermal origin melanoma, similarly to dogs C.André-CNRS-2012 Modèles animaux «spontanés » Intérêt du porc – lignée MeLiM maintenue à l’INRA MeLiM: Melanoblastoma-bearing Libechov Minipig Miniporcs développant des mélanomes cutanés héréditaires - Mélanomes surviennent spontanément in utero - Tumeurs multiples cutanées, - Métastases: ganglions lymphatiques et organes internes - Régression spontanée des tumeurs et dépigmentation cutanée Vincent-Naulleau et al., Pigment Cell Res, 2004 Intérêts du modèle: - Lignée prédisposées génétique constitutive : identification de gènes de prédisposition - Modèle de régression tumorale / réponse immunitaire - Transfert des connaissances aux mélanomes humains homologues Principaux investigateurs: E. Bourneuf et S. Vincent-Naulleau: Collaborations: F Demenais (INSERM U946 ); C André (CNRS UMR6290) Mélanome et outils d’étude in vitro et in vivo Des questions qui demeurent…… Autres modèles Cellulaires ? Interaction cellule mélanique et micro environnement Place du microscope confocal Autre modèle que la peau reconstruite ? Matrice extra cellulaire, modèle endothéliale ? Lignées cellulaires phénotypées Autre type d’animal ? Le phénotype des cellules souches tumorales mélaniques est façonné par le micro environnement 1 à 5% des cellules d’une tumeur Prolifération lente (marqueur JARID1B, CD133, CXCR6) Forment des colonies Interviennent dans la progression tumorale plus que l’initiation Augmentées par l’hypoxie Phénotype variable chez différentes souris Melanoma Res. 2012 Jun;22(3):215-24. Sphere formation and self-renewal capacity of melanoma cells is affected by the microenvironment Les futurs outils du micro environnement Les techniques classiques utilisées pour les expériences impliquant des cellules souches manquent d'évolutivité et de reproductibilité et ont une mauvaise représentation du microenvironnement. Les nouvelles plates-formes de « lab-on-a-chip » peuvent beaucoup mieux imiter la complexité du milieu tissulaire in vivo (tension en oxygène, pH, température, forces mécaniques ).
